JPH0216997A - γ−ＡＮＰを認識するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、７−ＡＮＰのＮ末端を認識するモノクローナ
ル抗体、該モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドー
マおよび該モノクローナル抗体を用いた７−ＡＮＰの免
疫学的測定法に関する。許らに詳しくは、該モノクロー
ナル抗体はｙ−ＡＮＰのＮ末端の１〜２５番目の２５ア
ミノ酸残基からなる部分（７−ｈＡＮＰ［１−２５］　
：以以下様に記載）を主に認識する。また、該モノクロ
ーナル抗体はヒト７、−　Ａ　Ｎ　Ｐのみならず、ラッ
ト７−ＡＮＰをも認識する。

更米詮韮碧 心房性ナトリウム利尿ポリペプチド（ａｔｒｉａｌｎａ
ｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ、　ＡＮ
Ｐ）は、６男筋細胞により産生きれ顆粒中に含まれる、
強い利尿作用およびナトリウム排泄作用を有するポリペ
プチドである。このようなポリペプチドはヒトのみなら
ずラットにおいても見出されており、それぞれｈＡＮＰ
、ｒＡＮＰと呼ばれる。ｈＡＮＰおよびｒＡＮＰはさら
にα、β、７の３つのタイプに分類される。α−ｈＡＮ
Ｐは２８アミノ酸残基からなり、Ｎ端から７番目のＣｙ
ｓ［７コと２３番目のＣｙ　ｓ　［２３］がジスルフィ
ド結合しており、その間の配列がリング構造をなしてい
る（ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏ
ｍｍｕｎ、　（以下ＢＢＲＣと略記する）１１８．１３
１−１３９．１９８４）。α−ＡＮＰは、α−ｈＡＮＰ
ではＮ端から１２番目の残基がＭ　ｅ　ｔであるのに対
し、α−ｒＡＮＰではＩｌｅである点でのみ異なってい
る（ＢＢＲＣ１１７，８３９−８６５，１９８３）。β
ｈＡＮＰは、α−ｈＡＮＰの逆平行二量体である（特開
昭６０−１８４０９８＞。７−ｈＡＮＰは１２６アミノ
酸残基からなり（第１図参照）、そのＣ端の９９〜１２
６アミノ酸配列がα−ｈＡＮＰに相当する（Ｎａｔｕｒ
ｅ　３１３．３９７　（１９８５））。

ラットの心房抽出物中に強いナトリウム利尿活性、利尿
活性、血圧降下活性が発見（ｄｅ　Ｂｏｌｄ。

Ａ、　Ｊ、　Ｑｔ　ａｌ、　ＬｉｆｃＳｃｉ、　２８．
８９−９４．１９８１）　’ａれて以来、心房性ナトリ
ウム利尿ポリペプチドと呼ばれる一連のペプチドがヒト
およびラット心房組織からｉｍａれており、このペプチ
ドが体液の恒常性および血圧のコントロールに関連して
いることが示唆されている（Ｋａｎｇａｗａ、　Ｋ　ｅ
ｔ　ａｌ、　ＢＢＲＣ１１８、１３１−１３９，１９８
４など）。

α−ＡＮＰ［１７−２８コに対するポリクローナルウサ
ギ抗血清を用いて、α−ｈＡＮＰおよびα−ｒＡＮＰを
等しく認識するＡＮＰに特異的なラジオイムノアッセイ
（ＲＩＡ）が確立され（Ｎａｋａｏ、　Ｋ、　ｅｔ　ａ
ｌ、　ＢＢＲＣ１２４，８１５−８２１゜１９８４）　
、α−ＡＮＰが心臓から分泌きれホルモンとして体内を
循環することが示された（Ｓｕｇａｗａｒａ、　Ａ、　
ｃｔ　ａｌ、　Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ　８　（Ｓｕ
ｐｐｌＩ　）、　ｌ−１５１−１５５，１９８６）。ま
た、ＲＩＡとクロマト分析を用いた研究により、ＡＮＰ
は中枢神経系にも存在しくＭｏｒｉｉ、　Ｎ、　ｅｔ　
ａｌ　、　ＢＢＲＣ１２７，４１３−４１９、１９８５
）　、ラット脳およびを髄に存在するＡＮＰの主要分子
構造はａ−ｒＡＮＰ［４−２８コおよびα−ｒＡＮＰ［
５−２８］であることが明らかになり　（Ｓｈｉｏｎｏ
、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、　ＢＢＲＣ１３５，７２８−７
３４、１９８６，Ｍｏｒｉｉ、　Ｎ、　ａｔ　ａｌ　、
　ＢＢＲＣ１４５，１９６−２０３、１９８７）、神経
ペプチドとしてのＡＮＰの存在様式はホルモンとしての
ＡＮＰのそれとは異なっていることが示された（Ｎａｋ
ａｏ、　Ｎ、　ａｔ　ａｌ、　ＣａｎＪ、　Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　６５．１７５６−１７
６１．１９８７）。

このα−ＡＮＰに対する抗血清は、循環血中のＡＮＰと
脳のＡＮＰを識別しないが、免疫組織化学的な研究にも
使用きれた（Ｋａｗａｔａ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ。

Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　１６．５２１−５４６．１
９８５Ｌさらに、ラットにおいて、この抗血清の脳室内
投与により脳内の内因性ＡＮＰの作用が中和きれ水摂取
が促進きれた（Ｋａｔｓｕｕｒａ、　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ
、　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　ＪＰｈａｒｍａｃｏｌ、　　１
２１．２８５−２８７．１９８６＞。このように、ポリ
クローナルウサギ抗血清は多方面で有用であるが、これ
らの抗血清は供給が限定されていること、エピトープが
多様であること、ＡＮＰ以外のものに対する不要な抗体
が混入してくることなど、避＋１られない欠点を有して
いる。

以上のような理由により、ＡＮＰに対するモノクローナ
ル抗体が切望されているが、最近様々な特異性を有する
モノクローナル抗体が報告されてきている（Ｊｏｈｎ、
　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ、　３８．１
９９１−１９９７．　１９８６　　；　　Ｍｉｌｎｅ、
Ｒ，ｅｔ　ａｌ、Ｍｏ１．　　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

２４．１２７−１３２，１９８７　　；　　Ｇｌｅｍｂ
ｏｔｓｋｉ、Ｃ，Ｃ，ｅｔａｌ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ
ｏｇｙ　１２１，８４３−８５２，１９８７　　：Ｎａ
ｏｍｉ、　　Ｓ、　　ｅｔ　ａｌ、　　Ｈｙｂｒｉｄｏ
ｍａ　６．　４３３−４４（Ｌ１９８７）。また、本発
明者らにより、α〜ＡＮＰを認識するモノクローナル抗
体ＫＹ−ＡＮＰ−１゜ＫＹ−ＡＮＰ−ｎが確立きれてい
る（特願昭６２−２１８６６２、特願昭６３−４７２８
（３）。

ＡＮＰの測定法としては既に抗血清を用いたＲＩＡが確
立きれている（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２８．３２３−３２
５．１９８５；　Ｎａｔｕｒｅ　３１４．２６４−２６
６．１９８５；　ＢＢＲＣ１２４８１５−８２１，１９
８４；　ＢＢＲＣ１２４，６６３−６６８，１９８ＣＢ
ＢＲＣ１２５，３１５−３２３，１９８４）。このうち
、抗血清ＣＲ−３はＡＮＰのＣ末端断片［１７−２８１
を認識することが知られている。

抗血清を用いた７−ＡＮＰのＲＩＡは、Ｈｙｐｅｒ−ｔ
ｅｎｓｉｏｎ　Ｖｏｌ　１１．　Ｎｏ　２．　ｌ−５２
−５６，１９８８に報告きれている。

発明が解決しようとする課題 最近、ＡＮＰに対する種々のモノクロルナル抗体が報告
きれており、ラジオイムノアッセイや免疫組織化学的実
験や中和実験に利用されている（Ｊｏｈｎ、　Ａ、　ａ
ｔ　ａｌ、　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ、　３８．１９９１−１
９９７１９８６　；　Ｍｉｌｎｅ　　Ｒ，ｅｔ　ａｌ、
　Ｍｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２４１２７−１３２．
１９８７　；　Ｇｌｅｍｂｏｔｓｋｉ、　Ｃ，Ｃ，ｅｔ
　ａｌ。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１２１．８４３−８５２
．１９８７　；　Ｎａｏｍｉ、　Ｓ。

ｅｔ：　　ａｌ、　　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　　６．　４
３３−４４０．　１９８７　　；　　５ｔａｓｃｈ。

Ｊ、　Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ、　
Ｐｈａｒｍｃｏｌ、　１２９．１６５１６８．１９８６
）。しかし、これらの対象はほとんど全てα−ＡＮＰで
あり、７−ＡＮＰを特異的に認識するモノクローナル抗
体は得られていなかった。また、本抗体をＲＩＡなどに
用いれば非常に高感度な７−ＡＮＰの測定が可能である
。きらに、７−ＡＮＰ［９９−１２６］はα−ＡＮＰに
対応するため、本抗体と公知のα−ＡＮＰを認識する抗
体、例えば、ＣＲ−３，１１Ａ−Ａｌ　ｌ、ＫＹ−ＡＮ
Ｐ−１，ＫＹ−ＡＮＰ−Ｉ［を組合わせれば、極めて高
感度な７−ＡＮＰのサンドインチェンザイムイムノアッ
セイ（ＥＩＡ）が可能にな隈Ｍａｌ穎汲工ｊＪ」戸列１
我 本発明者らはｙ−ｈＡＮＰを特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体を創製ずへく鋭意研究を行なった結果、７−
ＡＮＰのＮ末端を特異的に認識し親和性の高いモノクロ
ーナル抗体を得、それを利用するｙ−ｈＡＮＰの高感度
測定法を完成するに至った。さらに詳細には、本発明の
モノクローナル抗体は７−ｈＡＮＰ［１−２５コに含ま
れる部分を認識しているものと考えられ、さらに、７−
ｒＡＮＰも認識する。

（１）　　モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調
製 ７−ｈＡＮＰにおいては、７−ｈＡＮＰ［９９−１２６
］は、α−ｈＡＮＰ［１−２８］と同一であるため、７
−ｈＡＮＰに特異的な抗体を調製するためには、抗原と
して７−ｈＡＮＰ［１−９８］に含まれる部分を用いれ
ばよい。それらを抗原として用いるためには牛血清アル
ブミン、牛チログロブリンなどと結合させる。得られた
複合体は、フロイントの完全アジュバント等の適当なア
ジュバント番で乳濁し、マウスの免疫に用いる。

免疫は、」二記乳濁液を数週間おきにマウスの腹腔、皮
下または静脈に数回繰り返し接種することにより行なう
。最終免疫後３日ないし７日後に肺臓を取り出し、抗体
産生細胞として使用する。この時同時に抗体産生細胞と
融合許せてハイブリドーマを得るための親細胞として、
ヒボキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ−）あるいはチミジンキナー
ゼ欠損（ＴＫ−）の様な適切なマーカーを持つミエロー
マ細胞株を用意し、これと抗体産生細胞とを融合さゼて
ハイブリドーマを作製する。

ハイブリドーマ作製における培地として、イーグルＭＥ
Ｍ、ダルベツコ変法培地、ＲＰＭＩ−１６４０などの通
常良く使用されているものに、適宜約１５％の牛ｎθ児
血清（ＦＣ５，ｆｅｔａｌ　ｃａｌｆｓｅｔｕｍ　）を
加えて用いる。

まず、親細胞であるミエローマと肺細胞を約１：１０の
割合で用意する。融合剤としてはよく用いられているポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）の５０％を用いるのが
融合率が高いとされている。融合株はＨＡＴＩ択法によ
り選択する。生じるハイブリドーマのスクリーニングは
培養上清を用い、膜螢光抗体法、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚ
ｙｍｅＬｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａ
ｓ５ａｙ）、免疫組織染色法、ＲＩＡ法など既知の方法
により行ない、目的の免疫グロブリンを分泌しているハ
イブリドーマのクローンを選択する。ハイブリドーマの
単一性を吟味するため、９６穴のマイクロウェルにフィ
ーダーレイヤー（ｆｅｅｄｅｒ　１ａｙｏｒ　）として
正常な肺細胞を蒔いた上にハイブリドーマを１穴に１個
より多くならないように蒔き、生育してくるクローンに
ついて再びスクリーニングを行なう。このサブクローニ
ングを繰り返すことにより、単一性のハイブリドーマを
得る。

■　モノクローナル抗体の産生 次に、本発明のモノクローナル抗体を製造するために、
上記で得られたハイブリドーマを培養容型中（ｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏ）または動物体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で培養す
る。ｉｎ　ｖｉｔ、ｒｏ系で＠養する場合、培地は先に
述べた通常培地にＦＣ５を添加したものでよく、この培
地で３から５日培養の後、培養上清からモノクローナル
抗体を得る。ｉｎ　ｖｉｖｏ系の培養では、ハイブリド
ーマを哺乳動物の腹腔に接種し、７ないし１４日後に腹
水を採取し、これよりモノクローナル抗体を得る。ｉｎ
　ｖｉｖｏ系での培養の場合、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ系での
培養に比べて道かに大量の抗体を効率的に取得しうるの
で好ましい。

こうして得られた培養上清または腹水からのモノクロー
ナル抗体の精製は、硫安分画、ＤＥＡＥセファロースカ
ラム等の既知の方法を適宜組み合わせて行なうことがで
きる。

本発明者らは、７−ｈＡＮＰに対するモノクローナル抗
体Ｋ　Ｙ　−Ａ　Ｎ　Ｐ　−１１ｒを確立しその特性を
調べた。得られたモノクローナル抗体はｙ−ｈＡＮＰに
対して高い親和性を示し、Ｋａは５．３Ｘ１ｏｈＭ−１
であった。また、このモノクローナル抗体の特異性の分
析においては、７−ｈＡＮＰ［１２５］および７−ｈＡ
ＮＰ［１−７２コに強い交差反応性が見られたが、７−
ｈＡＮＰ［１−１０］および７−ｈＡＮＰ［１７−２５
］とは殆ど反応せず、７−ｈＡＮＰの最初の２５アミノ
酸が抗体の結合に最も重要であることを示している。

また、本抗体は、７−ｒＡＮＰにも交差反応性を示した
。

本発明のモノクローナル抗体ＫＹ−ＡＮＰ−１［を産生
するハイブリドーマＫＹ−ＡＮＰ−１［［は１９８８年
５月１８日から茨城県つくば宙乗１丁目１番３号の工業
技術院微生物工業技術研究所に、Ｍｏｕｓｅ　ｈｙｂｒ
ｉｄｏｍａ　ＫＹ−ＡＮＰ−Ｎ、微工研条寄第１８８７
号（ＦＥＲＭ　　ＥＰ−１８８７）として、ブダペスト
条約に基づいて寄託きれている。

本発明のモノクローナル抗体ＫＹ−ＡＮＰ−ＩＩ＋を用
いるｙ−ＡＮＰの免疫学的測定法としては、−抗体法に
よるＲＩＡやサンドイッチＥＩＡを挙げることができる
。ＲＩＡに関しては、実施例に示すとおり、試料または
標準７−ＡＮＰと一定量のアイソト−プｍＪｔｌした７
−ＡＮＰとを本抗体と結合きゼ、抗体に結合した放射能
を測定する競合法が」＝（ずられる。サントイ・ンチＥ
ＩＡとしては、前述のα−ＡＮＰを認識する抗血清ＣＲ
−３、ＫＹ−ＡＮＰ−Ｉ、ＫＹ−ＡＮＰ−１１などは７
−ＡＮＰ［９９−１２６］と反応するので、これらと組
み合わせた方法が可能であり、以下の様にして測定でき
る。

抗体を固定化する同相としては、”通常の免疫測定法に
使用される市販の抗原抗体反応用担体、例えば、ガラス
または合成樹脂製の粒状物（ビズ）あるいは球状物（ボ
ール）、チューブ、ブレトなどを用いることができる。

これらの担体に、α−ＡＮＰまたは７−ＡＮＰを認識す
る抗体を吸着せしめる。吸着は通常リン酸バッファー中
、ｐＩ（６〜１ｏ、好ましくは中性付近で室温下に一夜
放置することにより行なう。抗体を吸着した担体は、ア
ジ化ナトリウムなどの防腐剤の存在下、冷所に保存する
。

モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体について
、同様の処理で担体に結合せしめることができる。

抗体を含む腹水または抗血清は硫酸ナトリウムで分画し
、次いで、ＤＥＡＥ−セルロースのカラムを通すことに
よりＩｇＧを調製する。得られたＩｇＧをペプシンで消
化してＦ（ａｂ’）、断片とし、更にこれを２−メルカ
プトエチルアミンで還元すれば、抗α−ＡＮＰＦａｂ’
または抗７−ＡＮＰＦａｂ　’が得られる。ＩｇＧから
Ｆａｂ　’の調製については、ジャーナル・才プ・イム
ノアッセイ［Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　］、４．２０９〜３２７（１
９８３）に詳細な説明があり、本発明においても、同様
の手法を利用することができる。

□抗体の標識酵素としては、アルカリ性ボスファターゼ
、β−Ｄ−・ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、グ
ルツースオキシダーゼなどが利用可能であるが、本発明
においては、特に西洋わさびペルオキシダーゼが好まし
く用いられる。また、架橋剤トしては、Ｎ、Ｎ’−ｏ−
フエニレンジマレイミド、４−（Ｎ−マレイミドメチル
）シクロヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、６
−マレイミドヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル
、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸・Ｎ−スク
シンイミドエステル、４．４″−ジチオジピリジン、そ
の他公知の架橋剤が利用可能である。これらの架橋側止
酵素および抗体との反応は、それぞれの架橋剤の性質に
応じて、既知の方法に従って行なえばよい。また、抗体
としては、場合によっては、そのフラグメント、例えば
Ｆａｂ　’、Ｆａｂ、　Ｆ（ａｂ’）＋を用いる。また
、ポリクロナル、モノクローナル抗体にかかわらず同様
の処理により酵素標識体を得ることができる。上記架橋
剤を用いて得られる酵素標識抗体はアフィニテイ・クロ
マトグラフィーなどにより精製すれば、更に感度の高い
免疫測定系が可能となる。精製した酵素標識抗体は、安
定剤としてチメロサールまたはグリセリンを加えて、あ
るいは凍結乾燥して冷暗所に保存する。

上記で、ｔｌ！ｉｔされた免疫学的測定試薬を用いて７
ＡＮＰを測定する際の抗体の組合わせとしては、７−Ａ
ＮＰのＮ端側を認識する抗体を固定化した場合にはα−
ＡＮＰを認識する抗体を酵素標識抗体とし、α−ＡＮＰ
を認識する抗体を固定化した場合には７−ＡＮＰのＮ端
側を認識する抗体を酵素標識抗体とすればよい。一般に
は、固定化には比較的大量の抗体が必要であるため安定
的に大量の抗体が得られるモノクローナル抗体が固定化
に適しているが、抗血清から得られるポリクロナル抗体
も不都合なく使用できる。酵素標識する抗体は、モノク
ローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでもよく、
固定化した抗体が認識するのとは異なる部位を認識する
ものであればよい。例えば、固定化抗体として本発明の
ＫＹ−ＡＮＰ−Ｉ［［を用いた場合には酵素標識抗体と
して上述の抗血清ＣＲ−３、ＫＹ−ＡＮＰ−１，ＫＹ−
ＡＮＰ−πなどが適用でき、またこの逆の組合わせでも
よい。

実施例 ハイブリドーマの調製 合成７−ｈＡＮＰ［１−２５１（５，０ｍｇ　）と牛チ
ログロブリン（１０ｍｇ）を１．６ｍ　ｌの蒸留水に溶
解する。この溶液に、蒸留水０．２ｍｌに溶解した１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド２０ｍｇを４℃で１０分かけて滴下し、０°Ｃで
窒素気流下４時間攪拌する。この溶液を、蒸留水１ｊ！
に対して４回、３日間透析する。この透析物を５つに分
注して一２０℃で保存した（ＢＢＲＣ１２４，８１５−
８２１，１９８４参照）。

上記の分注保存した溶液（３００μｇの７−ｈＡＮＰ［
１−２５１を含む）に蒸留水を加え１゜２ｍｌとし、こ
れを１．２ｍｌのフロイントの完全アジュバントに懸濁
した。そのうち約２ｍｌを１０匹のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／
　ｃ雌マウスのａ腔および皮下に注射した（１匹当り２
００μｌ）。その後、約４週間隔で、完全アジュバント
に乳濁した１匹当り７．５〜３０μｇの７−ｈＡＮＰ［
１−２５コの皮下投与を７回繰り返した。３０μｇの７
−ｈＡＮＰ［１−２５］の静脈注射による最終免疫の６
日後、マウスの肺臓を摘出し、細胞融合に用いた。

肺臓細胞とミエローマ細胞Ｘ６３−Ａｇ３．６５３（１
：１（３）をダルベツコ培地中（ＤＭＥＭ）で混合し、
１５００ｒｐｍ、４°Ｃで５分間遠沈した。得られたペ
レットを３７℃に加温し解した後、５０％ＰＥＧ４００
０　（ＰＥＧＩ　ｇ／ＤＭＥＭ１ｍ　ｌ　）１ｍｌを３
７℃で１分間かけて滴下した。３７℃で２分間放置した
後、３７℃のＤＭＥＭｌｏｍｌを５分かけて加え希釈し
、４℃で１５％ＦＣ３ｍ加ＤＭＥＭで遠心洗浄する。

融合後、１５％牛脂児血清を含むＨＡＴ培地中でハイブ
リドーマを選択した。細胞の増殖に伴い、［ＩＩＩＩコ
アーｈＡＮＰ［１−２５］を用いるＲｒＡによって培養
液中の抗体産生を定期的に調べた。はぼ全てのウェルに
おいてハイブリドーマの増殖が観察され、そのうち約０
，８％（３ウエル）が抗体を産生じていた。抗体産生細
胞は、マウス胸腺細胞をフィーダーとして、限界希釈法
によリ２回クローニングした。最も強い反応性を有する
抗体を産生ずるクローン株ＫＹ−ＡＮＰ−Ｉ［［を確立
し、その特性を調べるために増殖許せた。

モノクローナル抗体の調製 ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０．５ｍｌのブリスタンを腹腔
に２回１〜２週間間隔で投与することにより前処理した
。そのマウスの腹腔に、２００μＩｏ′）ＤＭＥＭに懸
濁した５Ｘ１０’個のハイブリドーマＫＹ−ＡＮＰ−１
［［を注射した。得られた腹水をプロティンＡ−セファ
ロースＣＬ−４Ｂカラムで精製し、モノクローナル抗体
ＫＹ−ＡＮＰ−■を得た。

モノクローナル抗体の特性 上記で得られたモノクローナル抗体のアイソタイプをオ
フタロニー法（Ｍｏｕｓｅ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｒｙ
ｐｉｎｇＫｉｔ、Ｍｉｌｅｓ）によって決定した。親和
定数は後記のＲＩＡによるスキャッチャード分析法に従
って決定した。特異性は、７−ｈＡＮＰのＲＩＡにお（
Ｊる各種ＡＮＰ関連ペプチドとの交差反応性を調べるこ
とにより分析した。

得られたモノクローナル抗体は、オフタロ二法によりＩ
ｇＧ、サブクラスに属するものと決定された。スキャッ
チャード法により親和定数を調べたところ、７−ｈＡＮ
Ｐ［１−２５コに対するＫａ値は５．３　Ｘ　１０’　
Ｍ−’であり、高い親和性を示した（第２図参ＷＡ）。

ＲＩＡ モノクローナル抗体を用いたＲＩＡは、Ｈｙｐｅｒ−ｔ
ｅｎｓｉｏｎ、　Ｖｏｌ　１１．　Ｎｏ　２．　ｌ−５
２−５６（１９８ｇ＞に詳述されているポリクローナル
抗血清による方法に従って行なった。

試薬はすべて、０．１％ゼラチン（メルク）、１ｍＭＮ
ａ、ＥＤＴＡ、０．２ｍＭシスチン、０．Ｉ　Ｚ　ｒｒ
ｉｔｏｎ　Ｘ−１００とＯ，ＯＩＸメルテオレイトを含
む０．０５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，４）に溶解し
た。

ＫＹ−ＡＮＰ−ＩＩＩを含む腹水希釈液（１００，００
０倍）１００μｍ、試料または標ｍｙ−ＡＮＰ希釈液１
００μｌ、上記バッファー２００μｍ、［＋ＩＩＩ］７
−ｈＡＮＰｃ　１−２５］（約１０．　ＯＯＯｃｐｍ　
）　１００μｍの混合液を４°Ｃで４８時間反応きせる
。

これをデキストラン−ツーテッド−チャーコール１ｍｌ
と混合し４℃で１５分間反応させる。その後、４℃で３
０分間３０００ｒｐｍにて遠心し、その上清の放射活性
を７−カウンターで測定することにより、サンプル希釈
液中の抗体価を求めた。［１ＩＩＩコアーｈＡＮＰ［１
−２５コの比活性は５７ＯＩＩＣ１／μｇであった。マ
ウス腹水は最終希釈５００、０００倍に希釈して使用で
き、その時のトレイサーとの結合率は約２５％であった
。

上記”Ｊ−７−ｈＡＮＰ　［１−２５１はクロラミンＴ
法によって調製した。即ち、７−ｈＡＮＰ［１−２５コ
（１μｇ）とＮａ”’Ｉ（１ｍ　Ｃｉ　）を混合し、１
０１！ＺｌのクロラミンＴ（５，２５ｍｇ／ｍりを加え
、１０秒後に２０μｍのピロ亜硫酸ナトリウム（４，５
ｍｇ／ｍｌ）を加える。きらに、２％ゼラチン１ｍｌを
加え、５ｅｐ−Ｐａｋ　　Ｃｌ８（Ｗａｔｅｒｓ社製）
で精製する。

このモノクローナル抗体を用いたＲＩＡにおける７−ｈ
ＡＮＰの標準曲線と関連ペプチドの交差反応性を第３図
に示す。

発明の効果 本発明のＫＹ−ＡＮＰ−１［［は、７−ｈＡＮＰを特異
的に認識し、その他の公知のＡＮＰに対する抗体と組み
合わせるなどして、高感度に特異的に７−　ｈＡＮＰを
測定できる。また、７−ｒＡＮＰをも認識するので、そ
の測定も可能である。この７−ｈＡＮＰの測定法の確立
により、心疾患、腎疾患、高血圧症（本態性、二次性）
、ｒ！？肝性疾患（肝硬変、ネフローゼ、突発性浮腫等
）、脱水症等体液バランスの異常を伴う疾患の診断およ
び治療経過の簡便かつ正確な観察が可能になる。

【図面の簡単な説明】

第１図は７−ｈＡＮＰのアミノ酸配列を示す。 第２図は、［Ｉｔ’ｔ］ｙ−ｈＡＮｐ［１−２５コのモ
ノクローナル抗体ＫＹ−ＡＮＰ−ＩＩＩへの結合のスキ
ャッチャードプロットである。ＫＹ−ＡＮＰ−ＩＩ［を
含ｔｒ腹水を［”’１１ｙ−ｈＡＮｐ［１−２５］　　
（１２−８００ｐＭ、５００７１１／１ｕｂｅ）と共に
４℃で４８時間インキュベートし、デキストランフーテ
ッドチトコール法により分離した後、特異的な結合を測
定した。 第３図は、ＫＹ−ＡＮＰ−Ｉ［［を用いたＲＩＡにおけ
る７−ｈＡＮＰの典型的標準曲線と関連ペプチドの交差
反応曲線を示す。［”’Ｉ］７−　ｈ　Ａ　Ｎ　ｐ［１
−２５］と種々の濃度の標準ｙ−ｈＡＮＰまたは関連ペ
プチドをＫＹ−ＡＮＰ−１［と共に４℃で２４時間イン
キュベートした。・はｙ　−ｈＡＮＰ［１−２５コ、　
○は　７　−ｈＡＮＰ［１−７２コ、　ムは　７　−ｈ
ＡＮＰ［１−６７］、△は７−ｈＡＮｐ［ｔ−ｔ６コ、
◆は７−ｈＡＮＰ［１−１０］、◇は７−ｈＡＮｐｃ１
７−２ｓ］、■は７−ｈＡＮＰ、口は７−ｒＡＮＰを示
す。 特許出願人：塩野義製薬株式会社 ロー へ切 く ロコ ロク 一 　ｈ −〇 Ｂ／Ｆ 第 図 ［Ｂ］　（ｘｌ（５ｒ：）Ｍ） Ｂ／Ｂ。 第 図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）γ−ＡＮＰのＮ末端を認識するモノクローナル抗
   体。 （２）γ−ｈＡＮＰ［１−２５］に含まれる部分を認識
   する請求項１に記載のモノクローナル抗体。 （３）モノクローナル抗体にＹ−ＡＮＰ−IIIである請
   求項１または２に記載のモノクローナル抗体。 （４請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗
   体を産生するハイブリドーマ。 （５）ハイブリドーマＫＹ−ＡＮＰ−IIIである請求項
   ４に記載のハイブリドーマ。 （６）請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル
   抗体を用いることを特徴とするγ−ＡＮＰの免疫学的測
   定法。