JPH04352797A - ヒトプレプローｔｒｈ関連ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトプレプロ−ＴＲＨ
（Ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　　ｈ
ｏｒｍｏｎｅ；甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン）関連
ペプチドに関し、該ペプチドはこれを利用してヒトプレ
プロ−ＴＲＨ抗原を作成でき、該抗原を哺乳動物に投与
することによって得られるＴＲＨ抗体は、甲状腺機能低
下の診断に利用でき、またヒトプレプロ−ＴＲＨの単離
精製に有利に利用できる。

【０００２】

【従来の技術】ＴＲＨ（甲状腺刺激ホルモン放出ホルモ
ン）は、１９６９年にギルマン（Ｇｕｉｌｌｅｍｉｎ）
やシャーリー（Ｓｃｈａｌｌｙ）の２つのグループによ
り、それぞれウシ、ブタの視床下部から分離精製された
、３つのアミノ酸（グルタミン、ヒスチジン及びプロリ
ン）を構成アミノ酸とするペプチドである。該ＴＲＨは
、現在視床下部に限らず、大脳皮質や小脳等の脳内に広
く分布することが知られているが、当初下垂体からＴＳ
Ｈ（Ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ）を分泌させる作用を有す
ることから、上記の通りＴＲＨと命名された［Ｇｕｉｌ
ｌｅｍｉｎ，Ｒ．，ｅｔ　　ａｌ．，Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．，２６９，１８７０（１９６９）；Ｓｃｈａ
ｌｌｙ，Ａ．Ｖ．，ｅｔ　　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．
　　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　　Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，　
　３７，７０５（１９６９）］。

【０００３】その後、該ＴＲＨはプロラクチンをも分泌
させることが判り、その作用は神経伝達物質や神経修飾
物質として多岐に亘ることが明らかにされている［Ｊａ
ｃｋｓｏｎ，Ｉ．Ｍ．Ｄ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ
．，３０６，１４５−１５５（１９８２）］。その他に
も、ＴＲＨは覚醒作用、抗うつ作用、自発行動の増強作
用、体温上昇、過呼吸、流涙、立毛等の作用を有するこ
とが知られており［中井康充，生体の科学，３７，２１
０（１９８６）］、臨床的には、下垂体ＴＳＨ分泌能の
検査に常用され、下垂体機能不全の診断に、また甲状腺
機能亢進症、甲状腺機能低下症等の確定診断にもしばし
ば用いられている。

【０００４】近年、分子生物学的手法により、上記ＴＲ
Ｈの遺伝子構造やその合成、分泌機序等について種々研
究がなされ、その結果、ラットＴＲＨは５個の分子を含
む大きなプロ−ＴＲＨとして合成され、プロセッシング
によりＴＲＨとなり分泌されることが判明した。リーチ
ャン（Ｌｅｃｈａｎ）らは、１９８６年にカエルのｃＤ
ＮＡから明らかとなったプロ−ＴＲＨのアミノ酸配列か
ら、プロ−ＴＲＨに対する抗体を作成し、このプロ−Ｔ
ＲＨ抗体を用いてラットのプロ−ＴＲＨｃＤＮＡのクロ
ーニングを行ない、プロ−ＴＲＨのｍＲＮＡが約１７０
０塩基対からなり、プロ−ＴＲＨが２５５個のアミノ酸
からなると報告した［Ｌｅｃｈａｎ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ　
　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３１，１５９（１９８６
）］。またリー（Ｌｅｅ）らは、ラットの遺伝子ライブ
ラリーからＴＲＨのｃＤＮＡとその合成プライマーとを
用いて、ＴＲＨ遺伝子のクローニングに成功し、該遺伝
子が３つのエクソンと２つのイントロンからなり、転写
領域が２．６ｋｂｐであると報告した［Ｌｅｅ，Ｓ．Ｉ
．，ｅｔ　　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６
３，１６６０４（１９８８）］。更に、ヤマダ（Ｙａｍ
ａｄａ）らは、ヒト肺線維芽細胞のゲノムＤＮＡライブ
ラリーからラットのプレプロ−ＴＲＨｃＤＮＡ断片を用
いてヒトプレプロ−ＴＲＨをコードする遺伝子の単離に
成功し、これがラットのＴＲＨ遺伝子と同様に３つのエ
クソンと２つのイントロンからなり、転写領域が３．３
ｋｂｐであること、約１０５０塩基対と６５０塩基対と
の２つのイントロンによって中断されたほぼラットと同
様の遺伝子構造を保有すること、第３エクソンでの残り
のペプチドでラットＴＲＨ遺伝子が５つのコピーを有す
るのに対してヒトＴＲＨ遺伝子は６つのＴＲＨ配列を保
有すること、ヒトプレプロ−ＴＲＨのペプチド構造は、
ラットのそれが２５５アミノ酸残基からなるのに対して
２４２アミノ酸残基からなること、ラットのプレプロ−
ＴＲＨとの相同性は核酸レベル及びアミノ酸レベルでそ
れぞれ７３．３％及び５９．５％であること等を報告し
た［Ｙａｍａｄａ，Ｍ．，ｅｔ　　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，４（４）５５１−５５６（１９
９０）］。上記ヒトプレプロ−ＴＲＨのアミノ酸配列は
、配列番号：１に示される通りである。

【０００５】また、ＴＲＨは甲状腺ホルモン分泌の点か
ら、下垂体に対してはポジティブに、甲状腺ホルモンか
らはネガティブに相互作用していると推測される。セガ
ーソン（Ｓｅｇｅｒｓｏｎ）らは、プレプロ−ＴＲＨｃ
ＤＮＡ・プロ−ＴＲＨ抗体を用いた研究の結果、甲状腺
ホルモンとＴＲＨ分泌との関係につき、甲状腺ホルモン
が視床下部ＴＲＨの転写・翻訳にフィードバックをかけ
ることを明らかにした［Ｓｅｇｅｒｓｏｎ，Ｔ．Ｐ．，
ｅｔ　　ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｇｙ，１２１，
９８（１９８７）］。該報文中においてはまた、甲状腺
機能低下ラットでは正常ラットに比し、プロ−ＴＲＨｍ
ＲＮＡが２倍に増加しており、この増加は甲状腺ホルモ
ンの投与により抑制されることが示されている。更にそ
の後の研究（ブラント（Ｂｕｌａｎｔ）らによる、ラッ
トＴＲＨ遺伝子のＴＲＨをコードする配列間の１６０−
１６９プレプロ−ＴＲＨ（１６０−１６９）の合成ペプ
チドに対する抗体を使用した試験）から、ラットプレプ
ロ−ＴＲＨのプロセッシングによって、１分子当り５分
子のＴＲＨが遊離すると同時に、１分子のプレプロ−Ｔ
ＲＨ（１６０−１６９）が遊離し、これがＴＲＨの作用
を促進させていることが明らかとなった［Ｂｕｌａｎｔ
，Ｍ．，ｅｔ　　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２６３，１７１８９（１９８８）；Ｒｏｕｓｓｅｌ，Ｊ
．Ｐ．，ｅｔ　　ａｌ．，１８ｔｈ　　Ａｎｎｕａｌ　
　ｍｅｅｔｉｎｇ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｅｕｒｏｐｅ
ａｎ　　Ｔｈｙｒｏｉｄ　　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　
　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，１４８（１９８９）］。また、
プロ−ＴＲＨは、細胞内でプロテアーゼの作用により、
ＴＲＨアミノ酸配列の前後に存在するＬｙｓ−Ａｒｇ，
Ａｒｇ−Ａｒｇのベーシックアミノ酸部分を切断されて
、ＴＲＨ又はその結合ペプチドとして遊離されることも
明らかとなったが、これが細胞内のどの部位でどのよう
なプロテアーゼにより行なわれるのかは未だ不明である
。

【０００６】以上の現状より、本発明者らはヒトプレプ
ロ−ＴＲＨがＴＲＨ及びＴＲＨ結合ペプチドの分泌及び
生物活性の調節に強く関与すると考え、この観点より上
記ヒトプレプロ−ＴＲＨとＴＲＨとの関係を解明するべ
く研究を重ねる過程において、上記関係の解明に最も重
要な要素の一つとしてヒトプレプロ−ＴＲＨに対して特
異的に反応する抗体を開発することが急務であり、該抗
体の作成のためのヒトプレプロ−ＴＲＨ関連ペプチドの
開発が必要であるとの知見を得た。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
はヒトプレプロ−ＴＲＨに対して特異的に反応する抗体
の作成のための抗原、殊にそのハプテンとなり得るヒト
プレプロ−ＴＲＨ関連ペプチドを確立することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記目的は、配列番号：
２で表わされるアミノ酸配列を有することを特徴とする
ヒトプレプロ−ＴＲＨ関連ペプチド、配列番号：３で表
わされるアミノ酸配列を有することを特徴とするヒトプ
レプロ−ＴＲＨ関連ペプチド、配列番号：４で表わされ
るアミノ酸配列を有することを特徴とするヒトプレプロ
−ＴＲＨ関連ペプチド、配列番号：５で表わされるアミ
ノ酸配列を有することを特徴とするヒトプレプロ−ＴＲ
Ｈ関連ペプチド、配列番号：６で表わされるアミノ酸配
列を有することを特徴とするヒトプレプロ−ＴＲＨ関連
ペプチド、配列番号：７で表わされるアミノ酸配列を有
することを特徴とするヒトプレプロ−ＴＲＨ関連ペプチ
ド及び配列番号：８で表わされるアミノ酸配列を有する
ことを特徴とするヒトプレプロ−ＴＲＨ関連ペプチドに
より達成される。

【０００９】本明細書において、アミノ酸、ペプチド、
保護基、活性基、その他に関する略号による表示は、Ｉ
ＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定、当該分野での慣用記号及び／
又は「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成
のためのガイドライン」（特許庁調整課審査基準室編）
に従うものであり、その例を次に挙げる。また、アミノ
酸等に関して光学異性体があり得る場合、特に明示しな
ければＬ体を示すものとする。

【００１０】Ｇｌｙ；グリシン、Ａｌａ；アラニン、Ｖ
ａｌ；バリン、Ｌｅｕ；ロイシン、Ｉｌｅ；イソロイシ
ン、Ｓｅｒ；セリン、Ｔｈｒ；スレオニン、Ａｓｐ；ア
スパラギン酸、Ｇｌｕ；グルタミン酸、Ａｓｎ；アスパ
ラギン、Ｇｌｎ；グルタミン、Ｌｙｓ；リジン、Ａｒｇ
；アルギニン、Ｃｙｓ；システイン、Ｍｅｔ；メチオニ
ン、Ｐｈｅ；フェニルアラニン、Ｔｙｒ；チロシン、Ｔ
ｒｐ；トリプトファン、Ｈｉｓ；ヒスチジン、Ｐｒｏ；
プロリン、Ｂｒ−Ｚ；ｏ−ブロムベンジルオキシカルボ
ニル基、ｃＨｅｘ；シクロヘキシル基、４−ＣＨ３Ｂｚ
ｌ；４−メチルベンジル基、Ｂｚｌ；ベンジル基、ＣＨ
Ｏ；ホルミル基、Ｂｏｍ；ベンジルオキシメチル基、Ｃ
ｌ−Ｚ；ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル基、Ｔｏ
ｓ；ｐ−トルエンスルホニル基、Ｂｏｃ；第３級ブトキ
シカルボニル基。

【００１１】本発明ペプチドは、ヒトプレプロ−ＴＲＨ
に関連するものでり、該ヒトプレプロ−ＴＲＨに対して
特異的に反応する抗体の作成のためのハプテンとして有
用である。即ち、本発明ペプチドは例えばこれを適当な
担体と結合させて複合体とすることにより、ヒトプレプ
ロ−ＴＲＨ及びその関連蛋白と特異反応性を有する抗体
を製造するための免疫抗原を作成でき、該抗原を利用し
て得られる抗体は、例えばこれをアフィニティクロマト
グラフィー用担体と結合させて該クロマトグラフに利用
して、ヒトプレプロ−ＴＲＨ乃至その関連蛋白の精製に
利用できる。また上記抗体はヒトプレプロ−ＴＲＨの各
種免疫測定法における特異抗体としても利用でき、この
方法によってヒト−ＴＲＨ関連疾患、例えば下垂体機能
不全、甲状腺疾患、精神神経疾患等の診断が行ない得る
。更に上記抗体はヒト−ＴＲＨの研究にも有用である。 また本発明のヒトプレプロ−ＴＲＨ関連ペプチドは、こ
れを標識することによって標識ペプチドとして、生体内
のヒトプレプロ−ＴＲＨの分布やＴＲＨ関連酵素等の研
究にも利用することができる。

【００１２】以下、本発明ペプチドにつきその製造方法
を詳述すれば、該ペプチドは、入手容易な市販のアミノ
酸を利用して簡単な操作で容易に合成することができる
。この合成は、通常のペプチド合成法、より具体的には
「ザ　　ペプチド（Ｔｈｅ　　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」，
第１巻（１９６６年）Ｓｃｈｒｏｄｅｒ　　ａｎｄ　　
Ｌｕｈｋｅ著，Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅ
ｗ　　Ｙｏｒｋ，Ｕ．Ｓ．Ａ．や「ペプチド合成」，泉
屋ら著，丸善株式会社（１９７５年）に記載される如き
方法に従って、例えばアジド法、クロライド法、酸無水
物法、ＤＣＣ法、活性エステル法（ｐ−ニトロフェニル
エステル法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル法
、シアノメチルエステル法等）、カルボジイミダゾール
法、酸化還元法、ＤＣＣ／アディティブ（ＨＯＮＢ，Ｈ
ＯＢｔ，ＨＯＳｕ）法等により実施することができる。 上記各方法においては、固相合成法及び液相合成法のい
ずれをも適用できる。上記方法に従うペプチドの合成は
、一般的なペプチド自動合成機を用いて行ない得る。該
合成機の具体例としては、固相合成法に適用されるアプ
ライド・バイオシステム社製のアプライドバイオシステ
ム・モデル４３０Ａ−ペプチドシンセサイザー等を例示
できる。

【００１３】上記ペプチド合成は、一般的には末端アミ
ノ酸に順次１個ずつアミノ酸を縮合させていく所謂ステ
ップワイズ法により、又は数個のフラグメントに分けて
之等を合成後カップリングさせていく方法により、それ
ぞれ行なうことができる。より詳しくは、例えば固相合
成法を採用する場合、まず予めアミノ基を保護されたＣ
末端アミノ酸を、そのカルボキシル基によって、不溶性
担体に結合させる。ここで不溶性担体としては、反応性
カルボキシル基と結合性を有するものであれば特に制限
はなく、例えばクロロメチル樹脂、ブロモメチル樹脂等
のハロゲノメチル樹脂やヒドロキシメチル樹脂、フェノ
ール樹脂、ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニルヒドラ
ジド化樹脂等を使用できる。次いで、上記アミノ酸より
アミノ保護基を除去した後、配列番号：２〜配列番号：
８で表わされるアミノ酸配列に従って、Ｃ末端から２番
目以降のアミノ基保護アミノ酸を順次、それらのそれぞ
れの反応性アミノ基と反応性カルボキシル基とを利用し
て縮合反応させて、一段ずつペプチドを合成し、全配列
を合成した後、最終的に所望のペプチドを不溶性担体か
らはずす。

【００１４】上記方法において、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｇｌ
ｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ
、Ａｓｐ、Ｍｅｔ及びＳｅｒの各アミノ酸は、上記縮合
反応に先立ってそれらの側鎖官能基を保護しておくのが
好ましく、これは通常の保護基により保護され、該保護
基は縮合反応後に脱離される。また、各アミノ酸の縮合
反応に関与する官能基は、通常活性化される。之等保護
、脱離及び活性化反応はそれぞれよく知られており、之
等の各反応に用いられる試薬も公知の一般的なものから
適宜選択できる。

【００１５】アミノ基の保護基としては、例えばベンジ
ルオキシカルボニル、Ｂｏｃ、ｔｅｒｔ−アミルオキシ
カルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、ｐ−メト
キシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、アダマンチ
ルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタリル
、ＣＨＯ、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニ
ルホスフィノチオイル基等を例示できる。カルボキシル
基の保護基としては、例えばアルキルエステル（メチル
、エチル、プロピル、ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル等のエ
ステル基）、ベンジルエステル基、ｐ−ニトロベンジル
エステル基、ｐ−メトキシベンジルエステル基、ｐ−ク
ロロベンジルエステル基、ベンズヒドリルエステル基、
カルボベンゾキシヒドラジド基、トリチルヒドラジド基
等を例示できる。Ａｒｇの保護基としては、例えばＴｏ
ｓ、ニトロ、ベンジルオキシカルボニル、アミルオキシ
カルボニル基等を例示できる。Ｓｅｒ及びＴｈｒの水酸
基の保護基としては、例えばＢｚｌ、ｔｅｒｔ−ブチル
、アセチル、テトラヒドロピラニル基等を例示できる。 Ｔｙｒの水酸基の保護基としては、例えばＢｚｌ、Ｂｒ
−Ｚ、アセチル、ベンジルオキシカルボニル、Ｔｏｓ基
等を例示できる。Ｌｙｓのアミノ基の保護基としては、
例えばＣｌ−Ｚ、Ｂｏｃ、Ｔｏｓ、ベンジルオキシカル
ボニル基等を例示できる。Ｈｉｓは例えばＢｏｍ、ベン
ジルオキシカルボニル基等により、Ｃｙｓは４−ＣＨ３
Ｂｚｌ基等により、またＴｒｐはＣＨＯ基等によりそれ
ぞれ保護される。Ｇｌｕ及びＡｓｐのカルボキシル基の
保護は、例えばベンジルアルコール、メタノール、エタ
ノール、ｃＨｅｘ、ｔｅｒｔ−ブタノール等とのエステ
ル化により行ない得る。Ｍｅｔはまたスルホキサイド等
の形で保護することもできる。更にアミノ酸原料のカル
ボキシル基の活性化されたものとしては、例えば対応す
る酸クロライド、酸無水物、混合酸無水物等の他、アジ
ド、活性エステル（メタノール、エタノール、ベンジル
アルコール、ペンタクロロフェノール、ｐ−ニトロフェ
ノール、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド、Ｎ−ヒドロキ
シベンズトリアゾール、１−ヒドロキシベンズトリアゾ
ール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジ
カルボキシイミド等とのエステル）等を例示できる。

【００１６】尚、上記ペプチド結合形成反応は、適当な
縮合剤、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド、カル
ボジイミダゾール等のカルボジイミド試薬やテトラエチ
ルピロホスファイト等の存在下に実施し得る場合もある
。

【００１７】以下、本発明のヒトプレプロ−ＴＲＨ関連
ペプチドの製造法につき、配列番号：４のペプチドを例
にとり、上記方法を反応工程式を挙げて詳述する。 ［反応工程式］

【００１８】

【化１】

【００１９】［式中Ａはアミノ基の保護基を、Ｒ１は不
溶性担体を示す。］上記Ａの好ましいものとしては、Ｂ
ｏｃ、ベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベン
ジルオキシカルボニル基等を、Ｒ１の好ましいものとし
ては、クロロメチル化ポリスチレン等をそれぞれ例示で
きる。また、原料として使用するアミノ酸が反応に関与
しない側鎖官能基を有する場合は、該基は常法に従い、
前述した保護基により保護され、これは不溶性担体Ｒ１
の脱離反応と同時に脱離されるのがよい。

【００２０】上記反応工程式に示す方法において、アミ
ノ基保護アミノ酸（イ）と不溶性担体Ｒ１との反応は、
常法に従い該アミノ酸（イ）の反応性カルボキシル基を
利用して行なうことができる。該反応は例えばクロロメ
チル化ポリスチレンを使用する場合は、適当な溶媒中、
例えばトリエチルアミン、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシ
ド、炭酸セシウム、水酸化セシウム等の塩基性化合物の
存在下に行なわれる。溶媒としては、例えばジメチルホ
ルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ）、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、ジクロロ
メタン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、Ｎ−メチルピ
ロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミド等や之等の混
合溶媒を例示することができる。上記反応は、通常０〜
８５℃程度、好ましくは２５〜８０℃程度、数分〜２４
時間程度で終了する。アミノ基保護アミノ酸と不溶性担
体との使用割合は、通常後者１当量に対して前者を過剰
量、一般には１〜３倍当量とするのがよい。

【００２１】かくして得られる一般式（ロ）の固相化ア
ミノ酸の保護基Ａの脱離反応は、常法に従って行ない得
る。該方法としては、例えばパラジウム、パラジウム黒
等の触媒を用いる水素添加、液体アンモニア中金属ナト
リウムによる還元等の還元的方法、トリフルオロ酢酸、
塩化水素酸、弗化水素、メタンスルホン酸、臭化水素酸
等の強酸によるアシドリシス等を例示することができる
。上記触媒を用いる水素添加は、例えば水素圧１気圧、
０〜４０℃程度にて行ない得る。触媒の使用量は、通常
１００ｍｇ〜１ｇ程度とするのがよく、一般に１〜４８
時間程度で反応は完結する。また上記アシドリシスは、
無溶媒下、通常０〜３０℃程度、好ましくは０〜２０℃
程度で、約１５分〜１時間程度を要して行なわれる。酸
の使用量は、原料化合物に対して通常５〜１０倍程度と
するのがよい。該アシドリシスにおいて、保護基Ａのみ
を脱離する場合は、酸としてトリフルオロ酢酸又は塩化
水素酸を使用するのが好ましい。更に上記液体アンモニ
ア中金属ナトリウムによる還元は、反応液がパーマネン
トブルーに３０秒〜１０分間程度呈色しているような量
の金属ナトリウムを用いて、通常−４０℃〜−７０℃程
度の温度条件下にて行なうことができる。

【００２２】次いで、得られる一般式（ハ）の固相化ア
ミノ酸とアミノ基保護アミノ酸（ニ）（もしくはそのカ
ルボキシル基の活性化されたもの）との反応は、溶媒の
存在下に行なわれる。該溶媒としては、ペプチド縮合反
応に慣用される公知の各種のもの、例えば無水ジメチル
ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、クロ
ロホルム、ジオキサン、ジクロロメタン、テトラヒドロ
フラン、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、ヘキサメ
チルリン酸トリアミド等や之等の混合溶媒を使用するこ
とができる。また該反応は、必要に応じて、通常のペプ
チド結合形成反応に用いられる試薬、例えばＮ，Ｎ−ジ
シクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−エチル
−Ｎ′−ジメチルアミノカルボジイミド、１−シクロヘ
キシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボ
ジイミド等のカルボジイミド類等の脱水縮合剤の存在下
に行なうことができる。固相化アミノ酸（ハ）とアミノ
基保護アミノ酸（ニ）との使用割合は、特に限定はない
が、通常前者に対して後者を等モル量〜１０倍モル量程
度、好ましくは等モル量〜５倍モル量程度とするのがよ
い。脱水縮合剤の使用量も特に限定はなく、通常アミノ
基保護アミノ酸（ニ）に対して好ましくは等モル量程度
とされるのがよい。反応温度はペプチド結合形成反応に
使用されている通常の範囲、一般には約−４０℃〜約６
０℃程度、好ましくは約−２０℃〜約４０℃程度の範囲
から適宜選択される。反応時間は一般に数分〜３０時間
程度とされるのが適当である。

【００２３】かくして得られる一般式（チ）のペプチド
は、上記と同様に保護基Ａの脱離反応後、配列番号：４
で表わされるアミノ酸配列に従って、Ａ−Ｐｒｏ−ＯＨ
、Ａ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ａ−Ｓｅｒ−ＯＨ、Ａ−Ｔｒｐ−
ＯＨ、Ａ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ａ−Ａｌａ−ＯＨ及びＡ−Ｔ
ｙｒ−ＯＨの各アミノ基保護アミノ酸もしくは側鎖官能
基を保護された上記各アミノ酸乃至それらのカルボキシ
ル基を活性化されたものと、順次縮合反応に供され、か
くして一般式（リ）で表わされるペプチドを誘導するこ
とができる。

【００２４】之等の縮合反応及び保護基Ａの脱離反応は
、それぞれ前記した方法と同様にして行ない得る。また
得られるペプチド（リ）は、同様にして保護基Ａの脱離
、アミノ酸の側鎖官能基の保護基の脱離、及び不溶性担
体Ｒ１の脱離の各反応に供され、かくして所望の配列番
号：４で表わされるペプチド（４）に誘導できる。ここ
で側鎖官能基の保護基及び不溶性担体Ｒ１の脱離反応は
、保護基Ａの脱離反応と同様にして行なうことができ、
この場合は酸として弗化水素又は臭化水素酸を用いるの
が好ましい。尚、上記方法において使用される各アミノ
酸は、いずれも公知の市販品でよい。

【００２５】以上のようにして、製造された配列番号：
４のペプチド（本発明ペプチド（４））は、反応混合物
からペプチドの分離手段、例えば抽出、分配、カラムク
ロマトグラフィー等により単離精製することができる。

【００２６】配列番号：２、配列番号：３、配列番号：
５〜配列番号：８で表わされる各ペプチドも、上記方法
に準じて製造できる。

【００２７】また本発明ペプチドは、フェニルアセタミ
ドメチル樹脂の入った反応管の中で活性化されたＢｏｃ
−アミノ酸誘導体を、Ｃ末端より順次縮合反応させる固
相合成法を利用した自動ペプチド合成機により容易に短
時間で製造することができる。

【００２８】上記に従い、合成されたペプチドのアミノ
酸分析は、例えば６Ｎ塩酸で減圧下、１００℃、２０時
間加水分解後、市販のアミノ酸分析機を利用して行ない
得る。即ち上記加水分解物をアルカリ条件下でフェニル
イソチオシアネート（ＰＩＴＣ）をカップリングさせた
後、ＰＴＣ化されたアミノ酸誘導体をＨＰＬＣで分析す
ることにより、各アミノ酸の分析が行ない得る。

【００２９】かくして所望の本発明ヒトプレプロ−ＴＲ
Ｈ関連ペプチドを収得できる。

【００３０】本発明ペプチドは、これに例えば１２５Ｉ
、１３１Ｉ等の放射性物質、キモトリプシノーゲン、グ
リセロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、グルコアミ
ラーゼ、パーオキシダーゼ（ＰＯＸ）、Ｄ−Ｎａｓｅ、
Ｐ−Ｎａｓｅ、グルコース−６−フォスフェートデハイ
ドロゲナーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラク
トシダーゼ等の各種酵素、オルニチンデカルボキシラー
ゼ等の酵素系試薬等を導入することにより、ラジオイム
ノアッセイ（ＲＩＡ）法やエンザイムイムノアッセイ（
ＥＩＡ）法において用いられる標識抗原として利用する
ことができる。

【００３１】上記放射性物質の導入は、通常の方法に従
い実施できる。例えば放射性ヨードの導入は、クロラミ
ンＴを用いた酸化的ヨード法［Ｗ．Ｍ．Ｈｕｎｔｅｒ　
　ａｎｄ　　Ｆ．Ｃ．Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，Ｎａｔｕｒ
ｅ，１９４，　　４９５（１９６２）；Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｊ．，８９，１４４（１９６３）等参照］等に従って
行ない得る。この方法は、例えば０．２Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）等の適当な溶媒中で、クロラミンＴの存
在下に、室温付近にて、１０〜３０秒程度を要して行な
い得る。用いられるペプチド、放射性ヨード及びクロラ
ミンＴの使用割合は、例えばペプチド中のチロシン１分
子に放射性ヨード１個を導入する場合は、チロシン分子
１ナノモル当り放射性ヨード１ミリキュリー程度とすれ
ばよく、クロラミンＴは同１０〜１００ナノモル程度用
いられるのがよい。またチロシン１分子当りに放射性ヨ
ードを２個導入する場合は、チロシン分子１ナノモル当
り放射性ヨードを２ミリキューリー程度用い、またクロ
ラミンＴを１０〜１００ナノモル程度用いるのがよい。

【００３２】上記酵素試薬の導入は、通常のカップリン
グ法、例えばエルランガー（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒ
）らの方法［Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒ，ｅｔ　　ａｌ
．，Ａｃｔａ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．ｓｕｐｐｌ．，
１６８，）２０６（１９７２）］やカロール（Ｍ．Ｈ．
Ｋａｒｏｌ）らの方法［Ｍ．Ｈ．Ｋａｒｏｌ，ｅｔ　　
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ
．Ｓ．Ａ．，５７，７１３（１９６７）］等の公知の方
法により行なうことができる。かくして製造される放射
性ヨードにより標識されたペプチドは、通常の分離手段
、例えば抽出、分配、カラムクロマトグラフィー、透析
、二抗体法等により単離、精製することができる。また
このようにして得られるペプチドは、必要に応じて凍結
乾燥させて保存しておくこともできる。

【００３３】以下、本発明のヒトプレプロ−ＴＲＨ関連
ペプチドをハプテンとして利用した免疫抗原の製造方法
につき詳述すれば、該免疫抗原は本発明ペプチド（配列
番号：２〜配列番号：８の各ペプチド）をハプテンとし
て、これをハプテン−担体結合試薬の存在下に、適当な
担体と反応させることにより製造することができる。上
記において、ハプテンに結合される担体としては、通常
抗原の作成に当り慣用される高分子の天然もしくは合成
の蛋白質を広く使用できる。該担体としては、例えば各
種動物の血清アルブミン類、血清グロブリン類、チログ
ロブリン類、ヘモグロブリン類、ヘモシアニン類や回虫
より抽出された蛋白質（アスカーリス抽出物、特公昭６
１−６１３５０号公報等参照）の他、ポリリジン、ポリ
グルタミン酸、リジン−グルタミン酸共重合体、リジン
又はオルニチンを含む共重合体等を挙げることができる
。

【００３４】ハプテン−担体結合試薬としては、通常抗
原の作成に当り慣用されているものを広く使用できる。 具体的にはチロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架
橋結合させる、例えばビスジアゾタイズドベンジジン（
ＢＤＢ）、ビスジアゾタイズド−３，３′−ジアニシジ
ン（ＢＤＤ）等のジアゾニウム化合物；アミノ基とアミ
ノ基とを架橋結合させる、例えばグリオキサール、マロ
ンジアルデヒド、グルタールアルデヒド、スクシンアル
デヒド、アジポアルデヒド等の脂肪族アルデヒド類、チ
オール基とチオール基とを架橋結合させる、例えばＮ，
Ｎ′−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ，Ｎ′−ｍ−フ
ェニレンジマレイミド等のジマレイミド化合物、アミノ
基とチオール基とを架橋結合させる、例えばメタマレイ
ミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル、４−（マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−
カルボキシル−Ｎ′−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル等のマレイミドエステル類、アミノ基とカルボキシル
基とをアミド結合させる通常のペプチド結合形成反応に
用いられる試薬、例えばＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカル
ボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ′−ジメチルアミノカルボ
ジイミド、１−エチル−３−ジイソプロピルアミノカル
ボジイミド、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリ
ニル−４−エチル）カルボジイミド等のカルボジイミド
類、アミノ基とカルボキシル基とをアミド結合させる通
常のジイミド類等の脱水縮合剤等を挙げることができる
。また上記ハプテン−担体結合試薬としては、ｐ−ジア
ゾニウムフェニル酢酸等のジアゾニウムアリールカルボ
ン酸類と通常のペプチド結合形成反応試薬、例えば上記
脱水縮合剤とを組み合わせたものも使用可能である。

【００３５】上記免疫抗原の製造は、例えば水溶液もし
くはｐＨ７〜１０の通常の緩衝液中、好ましくはｐＨ８
〜９の緩衝液中、０〜４０℃程度、好ましくは室温付近
で行ない得る。該反応は通常１〜２４時間程度、好まし
くは２〜５時間程度で完結する。上記において用いられ
る代表的緩衝液としては、例えば０．２Ｎ水酸化ナトリ
ウム−０．２Ｍホウ酸−０．２Ｍ塩化カリウム緩衝液、
０．２Ｍ炭酸ナトリウム−０．２Ｍホウ酸−０．２Ｍ塩
化カリウム緩衝液、０．０５Ｍ四ホウ酸ナトリウム−０
．２Ｍホウ酸−０．０５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液、０．
１Ｍリン酸二水素カリウム−０．０５Ｍ四ホウ酸ナトリ
ウム緩衝液等を例示できる。

【００３６】上記においてハプテン、ハプテン−担体結
合試薬及び担体の使用割合は、適宜決定できるが、通常
ハプテンに対して担体を２〜６倍重量程度、好ましくは
３〜５倍重量程度、及びハプテン−担体結合試薬を５〜
１０倍モル程度用いるのがよい。上記反応によりハプテ
ン−担体結合試薬を仲介させて担体とハプテンとが結合
したペプチド−担体複合体からなる所望のヒトプレプロ
−ＴＲＨの免疫抗原が収得される。

【００３７】反応終了後、得られる抗原は常法に従い、
例えば透析法、ゲル濾過法、分別沈殿法等により容易に
単離精製できる。また、得られた抗原は通常の凍結乾燥
法により保存できる。

【００３８】かくして得られる免疫抗原は、通常蛋白質
１モルに対してハプテンとしてのペプチドが平均５〜２
０モル程度結合したものであり、いずれも引き続き再現
性よく、該抗原に対して特異性の高い抗ヒトプレプロ−
ＴＲＨ抗体の製造を可能とするものである。特に、上記
蛋白質に対するペプチドの結合モル比が１：８〜１５の
範囲にあるものは、特異性が一層高く、高力価、高感度
の抗体を作成可能とするものであり好ましい。

【００３９】上記抗原を用いて所望抗体を製造するには
、常法に従い、上記免疫抗原を哺乳動物に投与して生体
内に所望抗体（ポリクローナル抗体）を産生させてこれ
を採取する方法を採用できる。また上記免疫抗原で免疫
した哺乳動物の形質細胞（免疫細胞）と哺乳動物のミエ
ローマ細胞との融合細胞（ハイブリドーマ、ｈｙｂｒｉ
ｄｏｍａ）を作成し、これより所望抗体産生クローンを
選択し、該クローンを培養することにより、モノクロー
ナル抗体を製造、採取することもできる。上記各方法に
おける、操作等はいずれも公知である［Ｈａｎｆｌａｎ
ｄ，Ｐ．，Ｃｈｅｍ．　　Ｐｈｙｓ．　　Ｌｉｐｉｄｓ
，１５，１０５（１９７５）；Ｈａｎｆｌａｎｄ，Ｐ．
，Ｃｈｅｍ．　　Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ，１０，２０
１（１９７６）；Ｋｏｓｃｉｅｌａｋ，Ｊ．，Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３７，２１４（１９７８）等参
照］。

【００４０】上記ポリクローナル抗体の製造に当り、免
疫抗原で免疫される哺乳動物としては、特に制限はなく
、各種のものをいずれも使用できるが、通常家兎やモル
モット等が有利に用いられる。また免疫は一般的方法に
より、例えば上記免疫抗原の所定量を生理食塩水含有リ
ン酸緩衝液（ＰＢＳ）や生理食塩水等で適当濃度に希釈
し、これにフロインドの補助液（完全フロインドアジュ
バント：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　　Ｆｒｅｕｎｄ′ｓ　　Ａ
ｄｊｕｖａｎｔ）と混合して懸濁液を調製し、これを哺
乳動物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内注射等により投与
すればよい。より具体的には、兎に上記懸濁液を皮内投
与（抗原量として約０．５〜５ｍｇ／回）し、以後２〜
４週間毎に２〜１０ケ月、好ましくは４〜６ケ月間投与
して免疫化させればよい。抗体の採取は、上記懸濁液の
最終投与後、抗体が多量産生される時期、通常上記最終
投与の１〜２週間後に、免疫された動物から採血するこ
とにより実施でき、この血液から例えば遠心分離等によ
り血清を分離採取して、所望の抗体を収得できる。上記
方法によれば、用いる抗原の特殊性に基づいて、常に安
定してヒトプレプロ−ＴＲＨに対して非常に優れた特異
性を有し、しかも高力価、高感度の抗体を再現性よく収
得できる利点がある。

【００４１】上記のごとくして得られる抗体は、殊にヒ
トプレプロ−ＴＲＨに特異反応性を有するものであり、
斯界で要望されているＲＩＡ法によるヒトプレプロ−Ｔ
ＲＨの定量を高精度で可能とするものである。また該抗
体は、これを酵素や蛍光物質で標識することによってエ
ンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）法、フローレッセン
スイムノアッセイ（ＦＩＡ）法等にも使用できる。更に
該抗体は公知の不溶化物質と反応させて不溶化抗体とす
ることもできる。

【００４２】

【発明の効果】本発明によればヒトプレプロ−ＴＲＨ関
連ペプチドを提供でき、その利用によれば、ヒトプレプ
ロ−ＴＲＨに特異的な抗体の作成のための免疫抗原を作
成でき、該抗原を用いて得られる抗体は、甲状腺機能低
下の診断や、ヒトプレプロ−ＴＲＨの単離精製に有効に
利用できる。

【００４３】

【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため、配
列番号：２乃至配列番号：８で示される本発明ペプチド
の製造例を実施例として挙げ、次いで得られた各ペプチ
ドからの免疫抗原の製造例及び該抗原からの抗体の製造
例を参考例として挙げるが、本発明は之等に限定される
ものではない。

【００４４】

【実施例１】ヒトプレプロ−ＴＲＨ（Ｔｙｒ−ｈＴＡＰ
−５：Ｔｙｒ−１９２−２２４）ペプチドの合成保護ペ
プチドの合成は、自動合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｏｄｅｌ　　４３０Ａ　　Ｐｅｐ
ｔｉｄｅ　　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて、固相
合成法にて次の通り行なった。即ち、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（
ＯｃＨｅｘ）を結合させた４−フェニルアセタミドメチ
ル（Ｐａｍ）樹脂（０．５ミリモル）の入った反応管の
中で活性化されたＢｏｃ−アミノ酸誘導体［Ｎα−アミ
ノ基の保護基としてＢｏｃ基を側鎖官能基として後述の
ものを用いたアミノ酸］をＣ末端側より順次縮合させた
。 縮合法としては、Ａｒｇ及びＧｌｎの場合にはＤＣＣ／
ＨＯＢ法を、その他のアミノ酸の場合には対称酸無水物
法を採用した。側鎖官能基保護基としては、ＡｒｇはＴ
ｏｓ基を、Ａｓｐ及びＧｌｕはｃＨｅｘ基を、Ｃｙｓは
４−ＣＨ３Ｂｚｌ基を、ＳｅｒはＢｚｌ基を、またＴｙ
ｒはＢｒ−Ｚ基をそれぞれ用いた。

【００４５】かくして得られた保護ペプチド樹脂（１ｇ
）をアニソール（１ｍｌ）及びｐ−クレゾール（１ｍｌ
）の存在下に−２℃〜０℃にて１時間無水弗化水素（Ｈ
Ｆ）（１０ｍｌ）で処理し、樹脂からのペプチドの脱離
と脱保護基反応を行なった。

【００４６】減圧下にＨＦを除去し、残存物を凍結乾燥
させた収量は、約５０ｍｇであった。上記のようにして
得られた粗ペプチドをＣ１８シリカゲルを担体とする逆
相ＨＰＬＣ［カラム：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　　５Ｃ１８
’４ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ、溶出：０．１％ＴＦＡ
（アセトニトリルの１０％〜６０％直線濃度勾配法によ
る）、流速：１ｍｌ／分、検出：Ｏ．Ｄ．２２０ｎｍ］
、により精製して、目的とするペプチドを得た。この結
果、得られたペプチドの純度は９７％であり、収量は３
０ｍｇであった。

【００４７】またカラムの溶出パターン（縦軸：Ｏ．Ｄ
．２２０、横軸：時間（分）］を図１に示す。

【００４８】次に、上記で合成したペプチドの均一性を
みるために、０．１％ＴＦＡを溶媒として、アセトニト
リルの１０％〜６０％直線濃度勾配により溶出させる、
ＹＭＣ−パックＡカラム（４×１５０ｍｍ、ＹＭＣ社製
）を用いたＨＰＬＣを行なって分析した。更に、６Ｎ塩
酸で減圧下に１１０℃で２２時間加水分解を行ない、こ
れをＰＩＣＯ−ＴＡＧシステム（ウォーターズミリポア
守勢）を用いてフェニルチオカルバメート法によってア
ミノ酸組成の解析を行なった。ペプチドのアミノ酸配列
はガス相−シークエンサー（アプライド・バイオシステ
ムズ社製）で測定し、フェニルチオヒダントイン誘導体
は、アプライド・バイオシステムズ１２０Ａフェニルチ
オヒダントイン分析機（アプライド・バイオシステムズ
社製）により同定した。尚、得られたペプチド中にＡｓ
ｎ及びＧｌｎが存在する場合、之等はそれぞれＡｓｐ及
びＧｌｕとして定量される。その結果を後記表１に示す
。

【００４９】表１より本発明で合成したペプチドのアミ
ノ酸分析結果は、理論値とよく一致することが判る。

【００５０】上記で得られたペプチド（配列番号：８で
表わされるもの）の分子量は、３９０３．２と計算され
、該ペプチドの外観は無色の非結晶性粉末であった。 この合成ペプチドを、以下「Ｔｙｒ−ｈＴＡＰ−５」と
略称する。

【００５１】

【実施例２】ヒトプレプロ−ＴＲＨ（ｈＴＡＰ−１；９
０−１１１）のペプチドの合成 保護ペプチドの合成は、自動合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　
　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｏｄｅｌ　　４３０Ａ　　
Ｐｅｐｔｉｄｅ　　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて
、固相合成法にて次の通り行なった。即ち、Ｂｏｃ−Ｈ
ｉｓ（Ｂｏｍ）を結合させた４−フェニルアセタミドメ
チル（Ｐａｍ）樹脂（０．５ミリモル）の入った反応管
の中で活性化されたＢｏｃ−アミノ酸誘導体［Ｎα−ア
ミノ基の保護基としてＢｏｃ基を側鎖官能基として後述
のものを用いたアミノ酸］をＣ末端側より順次縮合させ
た。縮合法としては、Ｇｌｎの場合にはＤＣＣ／ＨＯＢ
法を、その他のアミノ酸の場合には対称酸無水物法を採
用した。 側鎖官能基保護基としては、ＧｌｕはｃＨｅｘ基を、ま
たＨｉｓはＢｏｍ基をそれぞれ用いた。

【００５２】かくして得られた保護ペプチド樹脂（１ｇ
）をアニソール（１ｍｌ）及びｐ−クレゾール（１ｍｌ
）の存在下に−２℃〜０℃にて１時間無水弗化水素（Ｈ
Ｆ）（１０ｍｌ）で処理し、樹脂からのペプチドの脱離
と脱保護基反応を行なった。

【００５３】減圧下にＨＦを除去し、残存物を凍結乾燥
させた収量は、約５０ｍｇであった。上記のようにして
得られた粗ペプチドをＣ１８シリカゲルを担体とする逆
相ＨＰＬＣにより精製して、目的とするペプチドを得た
。この結果、得られたペプチドの純度は９８％であり、
収量は３０ｍｇであった。

【００５４】上記で得られたペプチド（配列番号：２で
表わされるもの）の分子量は、２８０４と計算され、該
ペプチドの外観は無色の非結晶性粉末であった。この合
成ペプチドを、以下「ｈＴＡＰ−１」と略称する。

【００５５】

【実施例３】ヒトプレプロ−ＴＲＨ（ｈＴＡＰ−２；１
２０−１３２）のペプチドの合成 保護ペプチドの合成は、自動合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　
　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｏｄｅｌ　　４３０Ａ　　
Ｐｅｐｔｉｄｅ　　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて
、固相合成法にて次の通り行なった。即ち、Ｂｏｃ−Ｈ
ｉｓ（Ｂｏｍ）を結合させた４−フェニルアセタミドメ
チル（Ｐａｍ）樹脂（０．５ミリモル）の入った反応管
の中で活性化されたＢｏｃ−アミノ酸誘導体［Ｎα−ア
ミノ基の保護基としてＢｏｃ基を側鎖官能基として後述
のものを用いたアミノ酸］をＣ末端側より順次縮合させ
た。縮合法としては、Ｇｌｎの場合にはＤＣＣ／ＨＯＢ
法を、その他のアミノ酸の場合には対称酸無水物法を採
用した。 側鎖官能基保護基としては、Ａｓｐ及びＧｌｕはｃＨｅ
ｘ基を、ＳｅｒはＢｚｌ基を、ＴｒｐはＣＨＯ基を、Ｔ
ｈｒはＢｚｌ基を、またＨｉｓはＢｏｍ基をそれぞれ用
いた。

【００５６】かくして得られた保護ペプチド樹脂（１ｇ
）をアニソール（１ｍｌ）、ｐ−クレゾール（１ｍｌ）
及び１，４−ブタンジオール（０．５ｍｌ）の存在下に
、−２℃〜０℃にて１時間無水弗化水素（ＨＦ）（１０
ｍｌ）で処理し、樹脂からのペプチドの脱離と脱保護基
反応を行なった。

【００５７】減圧下にＨＦを除去し、残存物を凍結乾燥
させた収量は、約５０ｍｇであった。上記のようにして
得られた粗ペプチドを実施例１と同様にしてＣ１８シリ
カゲルを担体とする逆相ＨＰＬＣにより精製して、目的
とするペプチドを得た。この結果、得られたペプチドの
純度は９７％であり、収量は３０ｍｇであった。

【００５８】またカラムの溶出パターンを図１と同様に
して図２に示す。

【００５９】次に、上記で合成したペプチドの均一性を
みるために、実施例１と同様にＨＰＬＣにかけた後、同
様にしてアミノ酸組成及びアミノ酸配列を測定した。そ
の結果を後記表１に示す。

【００６０】表１より本発明で合成したペプチドのアミ
ノ酸分析結果は、理論値とよく一致することが判る。

【００６１】上記で得られたペプチド（配列番号：３で
表わされるもの）の分子量は、１５９９．３と計算され
、該ペプチドの外観は無色の非結晶性粉末であった。 この合成ペプチドを、以下「ｈＴＡＰ−２」と略称する
。

【００６２】

【実施例４】ヒトプレプロ−ＴＲＨ（ｈＴＡＰ−３；１
４１−１４９）のペプチドの合成 保護ペプチドの合成は、自動合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　
　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｏｄｅｌ　　４３０Ａ　　
Ｐｅｐｔｉｄｅ　　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて
、固相合成法にて次の通り行なった。即ち、Ｂｏｃ−Ｐ
ｒｏを結合させた４−フェニルアセタミドメチル（Ｐａ
ｍ）樹脂（０．５ミリモル）の入った反応管の中で活性
化されたＢｏｃ−アミノ酸誘導体［Ｎα−アミノ基の保
護基としてＢｏｃ基を側鎖官能基として後述のものを用
いたアミノ酸］をＣ末端側より順次縮合させた。縮合法
としては、対称酸無水物法を採用した。側鎖官能基保護
基としては、ＳｅｒはＢｚｌ基を、ＴｙｒはＢｒ−ｚ基
をそれぞれ用いた。

【００６３】かくして得られた保護ペプチド樹脂（１ｇ
）をアニソール（１ｍｌ）、ｐ−クレゾール（１ｍｌ）
及び１，４−ブタンジオール（０．５ｍｌ）の存在下に
、−２℃〜０℃にて１時間無水弗化水素（ＨＦ）（１０
ｍｌ）で処理し、樹脂からのペプチドの脱離と脱保護基
反応を行なった。

【００６４】減圧下にＨＦを除去し、残存物を凍結乾燥
させた収量は、約５０ｍｇであった。上記のようにして
得られた粗ペプチドを実施例１と同様にしてＣ１８シリ
カゲルを担体とする逆相ＨＰＬＣにより精製して、目的
とするペプチドを得た。この結果、得られたペプチドの
純度は９８％であり、収量は３０ｍｇであった。

【００６５】またカラムの溶出パターンを図１と同様に
して図３に示す。

【００６６】次に、上記で合成したペプチドの均一性を
みるために、実施例１と同様にＨＰＬＣにかけた後、同
様にしてアミノ酸組成及びアミノ酸配列を測定した。そ
の結果を後記表１に示す。

【００６７】表１より本発明で合成したペプチドのアミ
ノ酸分析結果は、理論値とよく一致することが判る。

【００６８】上記で得られたペプチド（配列番号：４で
表わされるもの）の分子量は、１０６６．４と計算され
、該ペプチドの外観は無色の非結晶性粉末であった。 この合成ペプチドを、以下「ｈＴＡＰ−３」と略称する
。

【００６９】

【実施例５】ヒトプレプロ−ＴＲＨ（ｈＴＡＰ−４；１
５８−１８３）のペプチドの合成 保護ペプチドの合成は、自動合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　
　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｏｄｅｌ　　４３０Ａ　　
Ｐｅｐｔｉｄｅ　　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて
、固相合成法にて次の通り行なった。即ち、Ｂｏｃ−Ｇ
ｌｕ（ＯｃＨｅｘ）を結合させた４−フェニルアセタミ
ドメチル（Ｐａｍ）樹脂（０．５ミリモル）の入った反
応管の中で活性化されたＢｏｃ−アミノ酸誘導体［Ｎα
−アミノ基の保護基としてＢｏｃ基を側鎖官能基として
後述のものを用いたアミノ酸］をＣ末端側より順次縮合
させた。 縮合法としては、Ａｒｇ及びＧｌｕの場合にはＤＣＣ／
ＨＯＢ法を、その他のアミノ酸の場合には対称酸無水物
法を採用した。側鎖官能基保護基としては、ＡｒｇはＴ
ｏｓ基を、Ａｓｐ及びＧｌｕはｃＨｅｘ基を、Ｓｅｒは
Ｂｚｌ基を、ＴｒｐはＣＨＯ基を、またＬｙｓはＣｌ−
Ｚ基をそれぞれ用いた。

【００７０】かくして得られた保護ペプチド樹脂（１ｇ
）をアニソール（１ｍｌ）、ｐ−クレゾール（１ｍｌ）
及び１，４−ブタンジオール（０．５ｍｌ）の存在下に
、−２℃〜０℃にて１時間無水弗化水素（ＨＦ）（１０
ｍｌ）で処理し、樹脂からのペプチドの脱離と脱保護基
反応を行なった。

【００７１】減圧下にＨＦを除去し、残存物を凍結乾燥
させた収量は、約５０ｍｇであった。上記のようにして
得られた粗ペプチドを実施例１と同様にしてＣ１８シリ
カゲルを担体とする逆相ＨＰＬＣにより精製して、目的
とするペプチドを得た。この結果、得られたペプチドの
純度は９６％であり、収量は３０ｍｇであった。

【００７２】またカラムの溶出パターンを図１と同様に
して図４に示す。

【００７３】次に、上記で合成したペプチドの均一性を
みるために、実施例１と同様にＨＰＬＣにかけた後、同
様にしてアミノ酸組成及びアミノ酸配列を測定した。そ
の結果を後記表１に示す。

【００７４】表１より本発明で合成したペプチドのアミ
ノ酸分析結果は、理論値とよく一致することが判る。

【００７５】上記で得られたペプチド（配列番号：５で
表わされるもの）の分子量は、３５４３．４と計算され
、該ペプチドの外観は無色の非結晶性粉末であった。 この合成ペプチドを、以下「ｈＴＡＰ−４」と略称する
。

【００７６】

【実施例６】ヒトプレプロ−ＴＲＨ（Ｔｙｒ−ｈＴＡＰ
−４；Ｔｙｒ−１５８−１８３）ペプチドの合成保護ペ
プチドの合成は、自動合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｏｄｅｌ　　４３０Ａ　　Ｐｅｐ
ｔｉｄｅ　　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて、固相
合成法にて次の通り行なった。即ち、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（
ＯｃＨｅｘ）を結合させた４−フェニルアセタミドメチ
ル（Ｐａｍ）樹脂（０．５ミリモル）の入った反応管の
中で活性化されたＢｏｃ−アミノ酸誘導体［Ｎα−アミ
ノ基の保護基としてＢｏｃ基を側鎖官能基として後述の
ものを用いたアミノ酸］をＣ末端側より順次縮合させた
。 縮合法としては、Ａｒｇ及びＧｌｕの場合はＤＣＣ／Ｈ
ＯＢ法を、その他のアミノ酸の場合は対称酸無水物法を
採用した。側鎖官能基保護基としては、ＡｒｇはＴｏｓ
基を、Ａｓｐ及びＧｌｕはｃＨｅｘ基を、ＳｅｒはＢｚ
ｌ基を、ＴｒｐはＣＨＯ基を、またＬｙｓはＣｌ−Ｚ基
をそれぞれ用いた。

【００７７】かくして得られた保護ペプチド樹脂（１ｇ
）をアニソール（１ｍｌ）、ｐ−クレゾール（１ｍｌ）
及び１，４−ブタンジオール（０．５ｍｌ）の存在下に
、−２℃〜０℃にて１時間無水弗化水素（ＨＦ）（１０
ｍｌ）で処理し、樹脂からのペプチドの脱離と脱保護基
反応を行なった。

【００７８】減圧下にＨＦを除去し、残存物を凍結乾燥
させた収量は、約５０ｍｇであった。上記のようにして
得られた粗ペプチドを実施例１と同様にしてＣ１８シリ
カゲルを担体とする逆相ＨＰＬＣにより精製して、目的
とするペプチドを得た。この結果、得られたペプチドの
純度は９７％であり、収量は３０ｍｇであった。

【００７９】またカラムの溶出パターンを図１と同様に
して図５に示す。

【００８０】次に、上記で合成したペプチドの均一性を
みるために、実施例１と同様にＨＰＬＣにかけた後、同
様にしてアミノ酸組成及びアミノ酸配列を測定した。そ
の結果を後記表１に示す。

【００８１】表１より本発明で合成したペプチドのアミ
ノ酸分析結果は、理論値とよく一致することが判る。

【００８２】上記で得られたペプチド（配列番号：４で
表わされるもの）の分子量は、３８４１．９と計算され
、該ペプチドの外観は無色の非結晶性粉末であった。 この合成ペプチドを、以下「Ｔｙｒ−ｈＴＡＰ−４」と
略称する。

【００８３】

【実施例７】ヒトプレプロ−ＴＲＨ（ｈＴＡＰ−５；１
９２−２２４）のペプチドの合成 保護ペプチドの合成は、自動合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　
　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｏｄｅｌ　　４３０Ａ　　
Ｐｅｐｔｉｄｅ　　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて
、固相合成法にて次の通り行なった。即ち、Ｂｏｃ−Ｇ
ｌｕ（ＯｃＨｅｘ）を結合させた４−フェニルアセタミ
ドメチル（Ｐａｍ）樹脂（０．５ミリモル）の入った反
応管の中で活性化されたＢｏｃ−アミノ酸誘導体［Ｎα
−アミノ基の保護基としてＢｏｃ基を側鎖官能基として
後述のものを用いたアミノ酸］をＣ末端側より順次縮合
させた。 縮合法としては、Ａｒｇ及びＧｌｕの場合にはＤＣＣ／
ＨＯＢ法を、その他のアミノ酸の場合には対称酸無水物
法を採用した。側鎖官能基保護基としては、ＡｒｇはＴ
ｏｓ基を、Ａｓｐ及びＧｌｕはｃＨｅｘ基を、Ｓｅｒは
Ｂｚｌ基を、ＴｙｒはＢｒ−Ｚ基をそれぞれ用いた。

【００８４】かくして得られた保護ペプチド樹脂（１ｇ
）をアニソール（１ｍｌ）及びｐ−クレゾール（１ｍｌ
）の存在下に、−２℃〜０℃にて１時間無水弗化水素（
ＨＦ）（１０ｍｌ）で処理し、樹脂からのペプチドの脱
離と脱保護基反応を行なった。

【００８５】減圧下にＨＦを除去し、残存物を凍結乾燥
させた収量は、約５０ｍｇであった。上記のようにして
得られた粗ペプチドを実施例１と同様にしてＣ１８シリ
カゲルを担体とする逆相ＨＰＬＣにより精製して、目的
とするペプチドを得た。この結果、得られたペプチドの
純度は９８％であり、収量は３０ｍｇであった。

【００８６】またカラムの溶出パターンを図１と同様に
して図６に示す。

【００８７】次に、上記で合成したペプチドの均一性を
みるために、実施例１と同様にＨＰＬＣにかけた後、同
様にしてアミノ酸組成及びアミノ酸配列を測定した。そ
の結果を下記表１に示す。

【００８８】

【表１】

【００８９】表１より本発明で合成したペプチドのアミ
ノ酸分析結果は、理論値とよく一致することが判る。

【００９０】上記で得られたペプチド（配列番号：７で
表わされるもの）の分子量は、３７８１．２と計算され
、該ペプチドの外観は無色の非結晶性粉末であった。 この合成ペプチドを、以下「ｈＴＡＰ−５」と略称する
。

【００９１】

【参考例１】■ヒトプレプロ−ＴＲＨ免疫抗原（Ｔｙｒ
−ｈＴＡＰ−５ａｇ）の製造 実施例１で得られた本発明ペプチドＴｙｒ−ｈＴＡＰ−
５の７ｍｇ及び牛血清アルブミン（ＢＳＡ）３０ｍｇを
０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．８
ｍｌに溶かした。この溶液に０．０２Ｍグルタールアル
デヒド溶液０．５５ｍｌを加えて混合し、暗所で４℃下
に２４時間攪拌した。その後、反応混合物を４８時間、
４℃下に水に対して透析した。上記透析中水を５回交換
した。その後、ペプチド−蛋白質複合体を含有する溶液
を凍結乾燥して、ヒトプレプロ−ＴＲＨ免疫抗原６ｍｇ
を得た。以下、これを「Ｔｙｒ−ｈＴＡＰ−５ａｇ」と
略称する。

【００９２】■各ヒトプレプロ−ＴＲＨ免疫抗原の製造
実施例２〜７で得られた各ペプチドのそれぞれ７ｍｇ及
び牛血清アルブミン（ＢＳＡ）３０ｍｇを０．１Ｍ酢酸
アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．８ｍｌに溶かし
た。この溶液に０．０２Ｍグルタールアルデヒド溶液０
．５５ｍｌを加えて混合し、暗所で４℃下に２４時間攪
拌した。その後、反応混合物を４８時間、４℃下に水に
対して透析した。上記透析中水を５回交換した。その後
、ペプチド−蛋白質複合体を含有する溶液を凍結乾燥し
て、各ヒトプレプロ−ＴＲＨ免疫抗原のそれぞれ６ｍｇ
を得た。以下、これらをそれぞれ「ｈＴＡＰ−１ａｇ」
、「ｈＴＡＰ−２ａｇ」、「ｈＴＡＰ−３ａｇ」、「ｈ
ＴＡＰ−４ａｇ」、「Ｔｙｒ−ｈＴＡＰ−４ａｇ」及び
「ｈＴＡＰ−５ａｇ」と略称する。

【００９３】

【参考例２】■ヒトプレプロ−ＴＲＨ抗体（Ｔｙｒ−ｈ
ＴＡＰ−５Ａｂ）の製造 参考例１で得られた免疫抗原Ｔｙｒ−ｈＴＡＰ−５ａｇ
の１００μｇを生理食塩水１ｍｌに溶解して乳化後、こ
れにフロインドの完全アジュバント１ｍｌを加えて懸濁
液を作成した。この懸濁液を４羽の家兎（Ｎｅｗ−Ｚｅ
ａｌａｎｄ　　Ｗｈｉｔｅ　　Ｒａｂｂｉｔ、体重３．
０〜３．５ｋｇ）に皮下投与し、４週間間隔で３回同量
を投与して追加免疫した。最終投与の１０日後に、供試
動物から採血し、得られた血液を遠心分離して抗血清を
採取して、ヒトプレプロ−ＴＲＨ抗体を得た。以下、こ
れを「Ｔｙｒ−ｈＴＡＰ−５Ａｂ」と略称する。

【００９４】■各ヒトプレプロ−ＴＲＨ抗体の製造参考
例２〜７で得られた各免疫抗原のそれぞれ１００μｇを
生理食塩水１ｍｌに溶解して乳化後、これにフロインド
の完全アジュバント１ｍｌを加えて懸濁液を作成した。 この懸濁液を４羽の家兎に皮下投与し、４週間間隔で３
回同量を投与して追加免疫した。最終投与の１０日後に
、供試動物から採血し、得られた血液を遠心分離して抗
血清を採取して、各ヒトプレプロ−ＴＲＨ抗体を得た。 以下、これらを「ｈＴＡＰ−１Ａｂ」、「ｈＴＡＰ−２
Ａｂ」、「ｈＴＡＰ−３Ａｂ」、「ｈＴＡＰ−４Ａｂ」
、「Ｔｙｒ−ｈＴＡＰ−４Ａｂ」及び「ｈＴＡＰ−５Ａ
ｂ」と略称する。

【００９５】

【参考例３】■標識ペプチド（Ｉ１２５Ｔｙｒ−ｈＴＡ
Ｐ−５）の製造 配列番号：８で表わされるアミノ酸配列を有する本発明
ペプチドＴｙｒ−ｈＴＡＰ−５（実施例１で得られたも
の）を、クロラミンＴを用いて、以下の通り標識した。

【００９６】即ち、上記ペプチド５μｇを溶解させた０
．５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）２０μｌに、［１
２５Ｉ］Ｎａ（ＮＥＮ）を１ｍＣｉ（ミリキューリー）
含む０．２Ｍリン酸塩緩衝液を加え、次に２０μｌのク
ロラミンＴを含む０．５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４
）を加えた。混合物を室温で３０秒間攪拌し、次に１０
０μｌのソジウムメタジサルフェート（ＳＮＣ）を含む
０．５Ｍリン酸塩緩衝液の２０μｌを加えて反応を停止
させた。反応混合物をＮｕｃｌｅｏｓｉｌ　　５Ｃ１８
カラム（０．４×２５ｃｍ）にかけ、０．１％ＴＦＡ、
１０％〜６０％アセトニトリルの直線濃度勾配により溶
出させる逆相ＨＰＬＣを行なって精製された標識ペプチ
ドを得た。以下これを「Ｉ１２５Ｔｙｒ−ｈＴＡＰ−５
」と略称する。得られた精製ペプチドはアッセイ用緩衝
液［０．３％ＢＳＡを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）］にて希釈し、−２５℃にて保存した。

【００９７】■各標識ペプチドの製造 実施例２〜７で得られた本発明ペプチドｈＴＡＰ−１、
ｈＴＡＰ−２、ｈＴＡＰ−３、ｈＴＡＰ−４、Ｔｙｒ−
ｈＴＡＰ−４及びｈＴＡＰ−５のそれぞれを、上記■と
同様にして１２５Ｉで標識して、標識ペプチドＩ１２５
ｈＴＡＰ−１、Ｉ１２５ｈＴＡＰ−２、Ｉ１２５ｈＴＡ
Ｐ−３、Ｉ１２５ｈＴＡＰ−４、Ｉ１２５Ｔｙｒ−ｈＴ
ＡＰ−４及びＩ１２５ｈＴＡＰ−５のそれぞれを得た。 之等を上記と同様にして希釈後、−２５℃にて保存した
。

【００９８】

【参考例４】各抗体力価の測定 参考例２で得られた各抗体の力価を以下の通り測定した
。即ち、各抗体をそれぞれ生理食塩水で１０、１０２、
１０３、１０４、１０５…倍に希釈し、之等のそれぞれ
１００μｌに、参考例３で得られた各Ｉ１２５標識ペプ
チド（参考例３で得られた各標識ペプチドを約１０４ｃ
ｐｍになるように希釈したもの）０．１ｍｌ及び０．１
Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）［０．１％ＢＳＡ、０
．１５Ｍ塩化ナトリウム及び０．０１％ＮａＮ３を含む
］０．２ｍｌを加え、４℃で２４時間インキュベートし
、生成した各抗体と各Ｉ１２５標識ペプチドとのそれぞ
れの結合体を、デキストラン−活性炭法及び遠心分離法
（４℃、１５分間、３０００ｒｐｍ）により、未反応（
未結合）Ｉ１２５標識ペプチドを分離し、その遠心分離
上清の放射能をカウントし、各希釈濃度における各抗体
の各Ｉ１２５標識ペプチドとのそれぞれの結合率（％）
を測定した。縦軸にＩ１２５標識ペプチドとの結合率（
％）を、横軸に抗体の希釈倍率をとり、それぞれの濃度
において結合率をプロットし、そのグラフより、上記結
合率が５０％となる各抗体の希釈倍率、即ち抗体の力価
を求めた。得られた結果を下記表２に示す。

【００９９】

【表２】

【０１００】

【参考例５】■ｈＴＡＰ−５Ａｂのヒトプレプロ−ＴＲ
Ｈ特異性試験 上記アッセイ用緩衝液０．５ｍｌを入れたポリスチレン
チューブ中で、以下の通りＲＩＡを実施した。供試試料
として各種濃度の本発明ペプチドｈＴＡＰ−５（配列番
号：７で表わされるもの、実施例１で得られたもの）を
用いた。また、標準希釈剤として０．１％ＢＳＡ、０．
１５Ｍ塩化ナトリウム及び０．０１％ＮａＮ３を含む０
．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を使用し
た。

【０１０１】各試験管に、標準希釈剤０．４ｍｌ、供試
試料液０．１ｍｌ、参考例２の■で得た抗体ｈＴＡＰ−
５Ａｂ０．２ｍｌ及びＩ１２５標識ペプチド（参考例３
で得た標識ペプチドを約１００００ｃｐｍになるように
希釈したもの）０．２ｍｌを入れ、これにノーマルヒツ
ジ血清（ｎｏｒｍａｌ　　ｓｈｅｅｐｓｅｒｕｍ）（１
／２００）０．１ｍｌを加え、４℃で４８時間インキュ
ベートした。次に、希釈抗ウサギ・ヒツジ抗体（獣内分
泌研究所若林先生より供与）２００μｌ（アッセイ用緩
衝液の２％溶液）を加えて、更に４℃で４８時間インキ
ュベートした。次いで、デキストランで被膜した活性炭
の懸濁液０．５ｍｌを加え、４℃で３０分間放置し、次
に４℃、３０００ｒｐｍの条件下に３０分間遠心分離を
行ない、抗体とＩ１２５標識ペプチドとの結合体及び未
反応（未結合）Ｉ１２５標識ペプチドを分離し、その放
射能をγカウンターでカウントし、用いた抗体の力価に
相当する結合率（Ｂ０）を１００％として、各供試試料
の濃度及び希釈倍率における抗体とＩ１２５標識ペプチ
ドとの結合体（Ｂ）の百分率を求めた。

【０１０２】得られた結果を図７に示す。

【０１０３】図中、縦軸は結合％（Ｂ０／Ｂ×１００）
を、横軸は供試試料の濃度を示す。

【０１０４】また、配列番号：２、配列番号：３、配列
番号：４、配列番号：５及び配列番号：８のそれぞれの
本発明ペプチド及びプロ−ＴＲＨペプチドにつき、之等
のそれぞれを入れた試験管に、上記と同様にして標準希
釈剤０．４ｍｌ及び供試試料０．１ｍｌを加えて、同一
試験を行ない、供試試料と上記各ペプチドとの交叉反応
性を調べた。

【０１０５】尚、プロ−ＴＲＨペプチド（Ｌｙｓ−Ａｒ
ｇ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
）は、実施例１に準じて合成して使用した。

【０１０６】その結果、ｈＴＡＰ−５Ａｂは、配列番号
：２、配列番号：３、配列番号：４及び配列番号：５の
本発明ペプチドならびにプロ−ＴＲＨペプチドとは交叉
反応性を示さなかったが、配列番号：７（ｈＴＡＰ−５
）のペプチドとは１００％の交叉反応性を示した。また
配列番号：８（Ｔｙｒ−ｈＴＡＰ−５）とは１０．２７
％の交叉反応性を示した。

【０１０７】■ｈＴＡＰ−１Ａｂのヒトプレプロ−ＴＲ
Ｈ特異性試験 供試試料として配列番号：２で表わされる本発明ペプチ
ドｈＴＡＰ−１を用いて、上記■と同様の方法によって
、ｈＴＡＰ−１Ａｂのヒトプレプロ−ＴＲＨ特異性試験
を行なった。

【０１０８】得られた結果を図８に示す。

【０１０９】更に、配列番号：３、配列番号：４、配列
番号：５及び配列番号：７のそれぞれの本発明ペプチド
及びプロ−ＴＲＨペプチドとの交叉反応性を上記■と同
様にして検討した。

【０１１０】その結果、ｈＴＡＰ−１Ａｂと配列番号：
３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：７の各本
発明ペプチド及びプロ−ＴＲＨペプチドとの交叉反応性
は、ｈＴＡＰ−１（配列番号：２のペプチド）との交叉
反応性を１００％として、認められなかった。

【０１１１】■ｈＴＡＰ−２Ａｂのヒトプレプロ−ＴＲ
Ｈ特異性試験 供試試料として配列番号：３で表わされる本発明ペプチ
ドｈＴＡＰ−２を用いて、上記■と同様の方法によって
、ｈＴＡＰ−２Ａｂのヒトプレプロ−ＴＲＨ特異性試験
を行なった。

【０１１２】得られた結果を図９に示す。

【０１１３】更に、配列番号：２、配列番号：４、配列
番号：５及び配列番号：７のそれぞれの本発明ペプチド
及びプロ−ＴＲＨペプチドとの交叉反応性を上記■と同
様にして検討した結果、ｈＴＡＰ−２Ａｂと配列番号：
２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：７の各本
発明ペプチド及びプロ−ＴＲＨペプチドとの交叉反応性
は、ｈＴＡＰ−２（配列番号：３のペプチド）との交叉
反応性を１００％として、認められなかった。

【０１１４】■ｈＴＡＰ−３Ａｂのヒトプレプロ−ＴＲ
Ｈ特異性試験 供試試料として配列番号：４で表わされる本発明ペプチ
ドｈＴＡＰ−３を用いて、上記■と同様の方法によって
、ｈＴＡＰ−２Ａｂのヒトプレプロ−ＴＲＨ特異性試験
を行なった。

【０１１５】得られた結果を図１０に示す。

【０１１６】更に、配列番号：２、配列番号：３、配列
番号：５及び配列番号：７のそれぞれの本発明ペプチド
及びプロ−ＴＲＨペプチドとの交叉反応性を上記■と同
様にして検討した結果、ｈＴＡＰ−２Ａｂと配列番号：
２、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７の各本
発明ペプチド及びプロ−ＴＲＨペプチドとの交叉反応性
は、ｈＴＡＰ−３（配列番号：４のペプチド）との交叉
反応性を１００％として、認められなかった。

【０１１７】■ｈＴＡＰ−４Ａｂのヒトプレプロ−ＴＲ
Ｈ特異性試験 供試試料として配列番号：５で表わされる本発明ペプチ
ドｈＴＡＰ−４を用いて、上記■と同様の方法によって
、ｈＴＡＰ−４Ａｂのヒトプレプロ−ＴＲＨ特異性試験
を行なった。

【０１１８】得られた結果を図１１に示す。

【０１１９】更に、配列番号：２、配列番号：３、配列
番号：４及び配列番号：７のそれぞれの本発明ペプチド
及びプロ−ＴＲＨペプチドとの交叉反応性を上記■と同
様にして検討した結果、ｈＴＡＰ−４Ａｂと配列番号：
２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７の各本
発明ペプチド及びプロ−ＴＲＨペプチドとの交叉反応性
は、ｈＴＡＰ−４（配列番号：５のペプチド）との交叉
反応性を１００％として、認められなかった。また配列
番号：６のペプチド（Ｔｙｒ−ｈＴＡＰ−４）とは９２
．３％の交叉反応性が認められた。

【配列表】

【０１２０】

【０１２１】

【０１２２】

【０１２３】

【０１２４】

【０１２５】

【０１２６】

【０１２７】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明実施例１に従うヒトプレプロ−ＴＲＨ（
Ｔｙｒ−ｈＴＡＰ−５：Ｔｙｒ−１９２−２２４）関連
ペプチドの逆相ＨＰＬＣによる精製時の溶出パターンを
示すグラフである。

【図２】本発明実施例３に従うプレプロ−ＴＲＨ（ｈＴ
ＡＰ−２；１２０−１３２）関連ペプチドの逆相ＨＰＬ
Ｃによる精製時の溶出パターンを示すグラフである。

【図３】本発明実施例４に従うプレプロ−ＴＲＨ（ｈＴ
ＡＰ−３；１４１−１４９）関連ペプチドの逆相ＨＰＬ
Ｃによる精製時の溶出パターンを示すグラフである。

【図４】本発明実施例５に従うプレプロ−ＴＲＨ（ｈＴ
ＡＰ−４；１５８−１８３）関連ペプチドの逆相ＨＰＬ
Ｃによる精製時の溶出パターンを示すグラフである。

【図５】本発明実施例６に従うプレプロ−ＴＲＨ（Ｔｙ
ｒ−ｈＴＡＰ−４；Ｔｙｒ−１５８−１８３）関連ペプ
チドの逆相ＨＰＬＣによる精製時の溶出パターンを示す
グラフである。

【図６】本発明実施例７に従うプレプロ−ＴＲＨ（ｈＴ
ＡＰ−５；１９２−２２４）関連ペプチドの逆相ＨＰＬ
Ｃによる精製時の溶出パターンを示すグラフである。

【図７】本発明参考例５の■に従うｈＴＡＰ−５Ａｂの
ヒトプレプロ−ＴＲＨ特異性試験の結果を示すグラフで
ある。

【図８】本発明参考例５の■に従うｈＴＡＰ−１Ａｂの
ヒトプレプロ−ＴＲＨ特異性試験の結果を示すグラフで
ある。

【図９】本発明参考例５の■に従うｈＴＡＰ−２Ａｂの
ヒトプレプロ−ＴＲＨ特異性試験の結果を示すグラフで
ある。

【図１０】本発明参考例５の■に従うｈＴＡＰ−３Ａｂ
のヒトプレプロ−ＴＲＨ特異性試験の結果を示すグラフ
である。

【図１１】本発明参考例５の■に従うｈＴＡＰ−４Ａｂ
のヒトプレプロ−ＴＲＨ特異性試験の結果を示すグラフ
である。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を
   有することを特徴とするヒトプレプロ−ＴＲＨ関連ペプ
   チド。
2. 【請求項２】配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を
   有することを特徴とするヒトプレプロ−ＴＲＨ関連ペプ
   チド。
3. 【請求項３】配列番号：４で表わされるアミノ酸配列を
   有することを特徴とするヒトプレプロ−ＴＲＨ関連ペプ
   チド。
4. 【請求項４】配列番号：５で表わされるアミノ酸配列を
   有することを特徴とするヒトプレプロ−ＴＲＨ関連ペプ
   チド。
5. 【請求項５】配列番号：６で表わされるアミノ酸配列を
   有することを特徴とするヒトプレプロ−ＴＲＨ関連ペプ
   チド。
6. 【請求項６】配列番号：７で表わされるアミノ酸配列を
   有することを特徴とするヒトプレプロ−ＴＲＨ関連ペプ
   チド。
7. 【請求項７】配列番号：８で表わされるアミノ酸配列を
   有することを特徴とするヒトプレプロ−ＴＲＨ関連ペプ
   チド。