JPH0350760B2 - - Google Patents
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は、ヒト白血病ウイルス(Adult T−
cell leukemia Virus;ATLV又はHuman T−
cell leukemia Virus;HTLV)に関連する新規
なペプチドであり、かかるウイルス感染ならびに
成人T細胞白血病、皮膚型T細胞リンパ腫などの
成熟T細胞白血病・リンパ腫に関連するペプチド
に関する。 本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護
基、活性基、核酸塩基、その他に関して略号で表
示する場合はIUPAC、IUBの規定或いは当該分
野における慣用記号に従うものとし、その例を次
に挙げる。またアミノ酸等に関しては光学異性体
がありうる場合は、特に明記しなければL体を示
すものとする。 Ser;セリン Leu;ロイシン Thr;スレオニン Asn;アスパラギン Gln;グルタミン Glu;グルタミン酸 Lys;リジン Pro;プロリン Val;バリン Trp;トリプトフアン His;ヒスチジン Asp;アスパラギン酸 Gly;グリシン Ile;イソロイシン Ala;アラニン Tyr;チロシン Met;メチオニン Phe;フエニルアラニン Arg;アルギニン Cys;シスチン A;アデニン T;チミン G;グアニン C;シトシン Tos;p−トルエンスルホニル基 Boc;第3級ブトキシカルボニル基 ONP;p−ニトロフエノキシ基 Bzl;ベンジル基 OBzl;ベンジルオキシ基 Cl2−Bzl;2,6−ジクロルベンジル基 Cl−Z;2−クロルベンジルオキシカルボニル基 ヒト白血病ウイルスは、成人T細胞白血病
(ATL)より分離され、該疾患との関連が注目さ
れているウイルスである。本発明者の吉田、菅野
は、遺伝子工学的手段をもちい、宿主細胞の
DNAに組込まれたプロウイルス遺伝子をクロー
ニング(cloning)し、その全塩基配列を決定し
た。これに基づいて該疾患ならびに該ウイルス感
染の診断・治療・予防の基礎を確立し、さきに特
許申請を行なつた(特願昭57−214287号)。 本発明は、上記の基礎的な情報を基にし完成さ
れたものであり、該ウイルス感染の診断を目的と
した該ウイルス関連ペプチド、ならびにそれ等に
対する特異抗体の作製と測定法に関する。決定さ
れた上記ウイルス遺伝子のコア(ギヤグ)蛋白前
駆体をコードする塩基配列を下記第1表に示す。
cell leukemia Virus;ATLV又はHuman T−
cell leukemia Virus;HTLV)に関連する新規
なペプチドであり、かかるウイルス感染ならびに
成人T細胞白血病、皮膚型T細胞リンパ腫などの
成熟T細胞白血病・リンパ腫に関連するペプチド
に関する。 本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護
基、活性基、核酸塩基、その他に関して略号で表
示する場合はIUPAC、IUBの規定或いは当該分
野における慣用記号に従うものとし、その例を次
に挙げる。またアミノ酸等に関しては光学異性体
がありうる場合は、特に明記しなければL体を示
すものとする。 Ser;セリン Leu;ロイシン Thr;スレオニン Asn;アスパラギン Gln;グルタミン Glu;グルタミン酸 Lys;リジン Pro;プロリン Val;バリン Trp;トリプトフアン His;ヒスチジン Asp;アスパラギン酸 Gly;グリシン Ile;イソロイシン Ala;アラニン Tyr;チロシン Met;メチオニン Phe;フエニルアラニン Arg;アルギニン Cys;シスチン A;アデニン T;チミン G;グアニン C;シトシン Tos;p−トルエンスルホニル基 Boc;第3級ブトキシカルボニル基 ONP;p−ニトロフエノキシ基 Bzl;ベンジル基 OBzl;ベンジルオキシ基 Cl2−Bzl;2,6−ジクロルベンジル基 Cl−Z;2−クロルベンジルオキシカルボニル基 ヒト白血病ウイルスは、成人T細胞白血病
(ATL)より分離され、該疾患との関連が注目さ
れているウイルスである。本発明者の吉田、菅野
は、遺伝子工学的手段をもちい、宿主細胞の
DNAに組込まれたプロウイルス遺伝子をクロー
ニング(cloning)し、その全塩基配列を決定し
た。これに基づいて該疾患ならびに該ウイルス感
染の診断・治療・予防の基礎を確立し、さきに特
許申請を行なつた(特願昭57−214287号)。 本発明は、上記の基礎的な情報を基にし完成さ
れたものであり、該ウイルス感染の診断を目的と
した該ウイルス関連ペプチド、ならびにそれ等に
対する特異抗体の作製と測定法に関する。決定さ
れた上記ウイルス遺伝子のコア(ギヤグ)蛋白前
駆体をコードする塩基配列を下記第1表に示す。
【表】
【表】
A−Tyr−OH (イ)
↓
A−Try−R1 (ロ)
↓
H−Try−R1 (ハ)
↓ A−Pro−OH (ニ)
A−Pro−Try−R1 (ホ)
↓↓↓
A−Val−Val−Gln−Pro−Lys−Lys−Pro
−Pro−Pro−Tyr−R1 (ヘ)
↓
H−Val−Val−Gln−Pro−Lys−Lys−Pro
−Pro−Pro−Tyr−OH (1)
〔式中Aはアミノ基の保護基及びR1は不溶性担
体を示す。〕 上記において、Aの好ましいものとしては
Boc、ベンジルオキシカルボニル基、p−メトキ
シベンジルオキシカルボニル基等を、またR1の
好ましいものとしてはクロロメチル化ポリスチレ
ン等をそれぞれ例示することができる。 また、各反応において、使用するアミノ酸が反
応に関与しない側鎖官能基を有する場合は、常法
どうり、前述した保護基により、保護され、これ
は不溶性担体R1の脱離と同時に脱離される。 上記方法において、アミノ基(イ)と不溶性担体
R1との反応は、常法に従いアミノ酸(イ)の反応性
カルボキシル基を利用して、これをR1と結合さ
せることによつて行なわれる。該反応は例えばク
ロロメチル化ポリスチレンを使用する場合は適当
な溶媒中、例えばトリエチルアミン、カリウム
tert−ブトキシド、炭酸セシウム、水酸化セシウ
ム等の塩基性化合物の存在下に行なわれる。溶媒
としては、例えばジメチルホルムアミド
(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ビ
リジン、クロロホルム、ジオキサン、ジクロロメ
タン、テトラヒドロフラン、N−メチルピロリド
ン、ヘキサメチルリン酸トリアミド等又はこれら
の混合溶媒等を例示することができる。上記反応
は、通常0〜85℃、好ましくは25〜80℃程度、数
分〜24時間程度で終了する。アミノ酸と不溶性担
体との使用割合は通常後者1当量に対して前者を
過剰量、一般に1〜3倍当量とするのがよい。 かくして得られる一般式(ロ)の固相化アミノ酸の
保護基Aの脱離反応は、常法により行なわれる。
該方法としては例えばパラジウム、パラジウム黒
等の触媒を用いる水素添加、液体アンモニア中金
属ナトリウムによる還元等の還元的方法、トリフ
ルオロ酢酸、塩化水素酸、弗化水素、メタンスル
ホン酸、臭化水素酸等の強酸によるアシドリシス
等を例示することができる。上記触媒を用いる水
素添加は、例えば水素圧1気圧、0〜40℃にて行
ない得る。触媒の使用量としては通常100mg〜1
g程度とするのがよく、一般に1〜48時間程度で
反応は終了する。また上記アジドリシスは、無溶
媒下、通常0〜30℃程度、好ましくは0〜20℃程
度で約15分〜1時間程度を要して行なわれる。酸
の使用量は原料化合物に対し通常5〜10倍量程度
とするのがよい。該アシドリシスにおいて保護基
Aのみを脱離する場合は酸としてトリフルオロ酢
酸又は塩化水素酸を使用するのが好ましい。更に
上記液体アンモニア中金属ナトリウムによる還元
は、反応液がパーマネントブルーに30秒〜10分間
程度呈色しているような量の金属ナトリウムを用
い、通常−40℃〜−70℃程度にて行ない得る。 次いで得られる一般式(ハ)の固相化アミノ酸とア
ミノ酸(ニ)(もしくはそのカルボキシル基の活性化
されたもの)との反応は、溶媒の存在下に行なわ
れる。該溶媒としては、ペプチド縮合反応に慣用
される公知の各種のもの、例えば無水ジメチルホ
ルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、
クロロホルム、ジオキサン、ジクロロメタン、テ
トラヒドロフラン、酢酸エチル、N−メチルピロ
リドン、ヘキサメチルリン酸トリアミド或いはこ
れらの混合溶媒等を例示することができる。また
該反応は、必要に応じて、通常のペプチド結合形
成反応に用いられる試薬、例えばN,N−ジシク
ロヘキシルカルボジイミド(DCC)、N−エチル
−N′−ジメチルアミノカルボジイミド、1−エ
チル−3−ジイソプロピルアミノカルボジイミ
ド、1−シクロヘキシル−3−(2−モルホリニ
ル−4−エチル)カルボジイミド等のカルボジイ
ミド類等の脱水縮合剤の存在下に行なうことがで
きる。アミノ酸(ハ)とアミノ酸(ニ)との使用割合とし
ては、特に限定はないが、通常前者に対して後者
を等モル量〜10倍モル量、好ましくは等モル量〜
5倍モル量とするのがよい。脱水縮合剤の使用量
も特に限定はなく、通常アミノ酸(ニ)に対して、好
ましくは等モル量程度使用される。反応温度はペ
プチド結合形成反応に使用される通常の範囲、一
般には約−40℃〜約60℃、好ましくは約−20℃〜
約−40℃の範囲から適宜選択される。反応時間は
一般に数分〜30時間程度とされる。 かくして得られる一般式(ホ)のペプチドは、上記
と同様に保護基Aの脱離後、一般式(1)で表わされ
るアミノ酸配列に従い、A−Pro−OH、A−Pro
−OH、A−Lys−OH、A−Lys−OH、A−Pro
−OH、A−Gln−OH、A−Val−OH、A−Val
−OHの各アミノ酸もしくは側鎖官能基を保護さ
れたもの乃至そのカルボキシ基を活性化されたも
のと順次縮合反応させることにより行なわれ、斯
くして一般式(ヘ)で表わされるペプチドに誘導する
ことができる。これら縮合反応及び保護基Aの脱
離反応は、それぞれ前記した方法と同様にして行
なわれる。 また得られるペプチド(ヘ)は、同様にして保護基
Aの脱離、アミノ酸の側鎖官能基の保護基の脱離
及び不溶性担体R1の脱離により、式(1)で表わさ
れるペプチドに誘導される。ここで側鎖官能基の
保護基及び不溶性担体R1の脱離反応は、保護基
Aの脱離反応と同様に行ない得、この場合酸とし
て弗化水素又は臭化水素酸を用いるのが好まし
い。尚、上記方法において使用される各アミノ酸
は、いずれも公知の市販品でよい。 以上のようにして製造された式(1)の本発明ペプ
チドは、反応混合物からペプチドの分離手段例え
ば抽出、分配、カラムクロマトラフイー等により
単離精製される。 かくして得られる本発明のペプチドは、これに
125I、131I等の放射性物質、パーオキシダーゼ
(POX)、キモトリプシノーゲン、プロカルボキ
シペプチダーゼ、グリセロアルデヒド−3−リン
酸脱水素酵素、アミラーゼ、ホスホリラーゼ、D
−Nase、P−Nase、β−ガラクトシダーゼ、グ
ルコース−6−フオスフエートデハイドロゲナー
ゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等の各種酵素
試薬等を導入することにより、ラジオイムノアツ
セイ(RIA)法又はエンザイムイムノアツセイ
(EIA)法において用いられる標識抗原として利
用できる。上記放射性物質の導入は、通常の方法
により実施できる。例えば放射性ヨードは、クロ
ラミンTを用いる酸化的ヨード化法〔W.M.
Hunter andF.C.Greenwood;Nature、194、495
(1962)、BiochemJ.89、144、(4963)参照〕等に
より行なわれ、酵素試薬の導入は、通常のカツプ
リング法例えばエルランガー(B.F.Erlanger)
らの方法〔Acta.Endocrinol.Suppl.、168、206
(1972)〕及びカロール(M.H.Karol)らの方法
〔Proc.Natl.Acad.Sci.、USA.、57、713(1967)〕
等の公知の方法によつて行なうことができる。 以下、本発明のペプチドをハプテンとして利用
した抗原の製造方法につき詳述する。 上記抗原は本発明ペプチドをハプテンとし、こ
れをハプテン−担体結合試薬の存在下に、適当な
担体と反応させることにより製造される。上記に
おいてハプテンに結合される担体としては、通常
抗原の作成に当り慣用される高分子の天然もしく
は合成の蛋白質を広く使用できる。該担体として
は例えば馬血清アルブミン、牛血清アルブミン、
ウサギ血清アルブミン、人血清アルブミン、ヒツ
ジ血清アルブミン等の動物の血清アルブミン類;
馬血清グロブリン、牛血清グロブリン、ウサギ血
清グロブリン、人血清グロブリン、ヒツジ血清グ
ロブリン等の動物の血清グロブリン類;馬チログ
ロブリン、牛チログロブリン、ウサギチログロブ
リン、人チログロブリン、ヒツジチログロブリン
等の動物のチログロブリン類;馬ヘモグロブリ
ン、牛ヘモグロブリン、ウサギヘモグロブリン、
人ヘモグロブリン、ヒツジヘモグロブリン等の動
物のヘモグロブリン類;キーホールリンペツトヘ
モシアニン(KLH)等の動物のヘモシアニン
類;回虫より抽出された蛋白質(アスカーリス抽
出物、特開昭56−16414号公報、J.Immun.、111、
260〜268(1973)、J.Immun.、122、302〜308
(1979)、J.Immun.、98、893〜900(1967)及び
Am.J.Physiol.、199、575〜578(1960)に記載さ
れたもの又はこれらを更に精製したもの);ポリ
リジン、ポリグリタミン酸、リジン−グルタミン
酸共重合体、リジン又はオルニチンを含む共重合
体等を挙げることができる。 ハプテン−担体結合試薬としては、通常抗原の
作成に当り慣用されているものを広く使用でき
る。具体的にはチロシン、ヒスチジン、トリプト
フアンを架橋結合させる、例えばビスジアゾタイ
ズドベンジジン(BDB)、ビスジアゾタイズド−
3,3′−ジアニシジン(BDD)等のジアゾニウ
ム化合物;アミノ基とアミノ基とを架橋結合させ
る、例えばグリオキサール、マロンジアルデヒ
ド、グルタールアルデヒド、スクシンアルデヒ
ド、アジポアルデヒド等の脂肪族ジアルデヒド
類;チオール基とチオール基とを架橋結合させ
る、例えばN,N′−0−フエニレンジマレイミ
ド、N,N′−m−フエニレンジマレイミド等の
ジマレイミド化合物;アミノ基とチオール基とを
架橋結合させる、例えばメタマレイミドベンゾイ
ル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、4
−(マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カ
ルボキシル−N′−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル等のマレイミドカルボキシル−N−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル類;アミド基とカル
ボキシル基とをアミド結合させる通常のペプチド
結合形成反応に用いられる試薬、例えばN−Nジ
シクロヘキシルカルボジイミド、N−エチル−
N′−ジメチルアミノカルボジイミド、1−エチ
ル3−3ジイソプロピルアミノカルボジイミド、
1−シクロヘキシル−3−(2−モルホリニル−
4−エチル)カルボジイミド等のマルボジイミド
類等の脱水縮合剤等を挙げることができる。また
上記ハプテン−担体結合試薬としては、p−ジア
ゾニウムフエニル酢酸等のジアニウムアリールカ
ルボン酸類と通常のペプチド結合形成反応試薬、
例えば上記脱水縮合剤とを組合せたものも使用可
能である。 上記抗原の製造反応は、例えば水溶液もしくは
PH7〜10の通常の緩衝液中、好ましくはPH8〜9
の緩衝液中、0〜40℃、好ましくは室温付近で行
なわれる。該反応は通常約1〜24時間、好ましく
は3〜5時間で完結する。上記において用いられ
る代表的緩衝液としては、次のものを例示でき
る。 0.2N水酸化ナトリウム−0.2Mホウ酸−0.2M塩
化カリウム緩衝液、 0.2M炭酸ナトリウム−0.2Mホウ酸−0.2M塩化
カリウム緩衝液、 0.5M四ホウ酸ナトリウム−0.2Mホウ酸−
0.05M塩化ナトリウム緩衝液、 0.1Mリン酸二水素カリウム−0.05M四ウ酸ナ
トリウム緩衝液 上記においてハプテン、ハプテン−担体結合試
薬及び担体の使用割合は、適宜に決定できるが、
通常ハプテンに対して担体を1〜6倍重量程度、
好ましくは1〜5倍重量程度、及びハプテン−担
体結合試薬を5〜10倍モル程度用いるのがよい。
上記反応によりハプテン−担体結合試薬を仲介さ
せて担体とハプテンとが結合したペプチド−担体
複合体からなる所望の抗原が収得される。 反応終了後得られる抗原は常法に従い、例えば
透析法、ゲル過法、分別沈澱法等により容易に
単離精製できる。 斯くして得られる抗原は、通常蛋白質1モルに
対してペプチドが平均5〜60モル結合したもので
あり、いずれも引き続き該抗原に対して特異性の
高い抗体の製造を可能とするものである。 該抗原による抗体の製造は、上記抗原を哺乳動
物に投与し、生体内に所望抗体を産生させ、これ
を採取することにより実施される。 抗体の製造に供せられる哺乳動物としては、特
に制限はないが、通常ウサギやモルモツトを用い
るのが好ましい。抗体の産生に当つては、上記に
より得られる抗原の所定量を生理食塩水で適当濃
度に希釈し、フロインドの補助液(Complete
Freund′s Adjuvant)と混合して懸濁液を調整
し、これを哺乳動物体に投与すればよい。例えば
ウサギに上記懸濁液を皮内注射(抗原の量として
0.1〜5mg/回)し、以後2週間毎に2〜10ケ月、
好ましくは4〜6ケ月間投与し免疫化させればよ
い。抗体の採取は、上記懸濁液の最終投与の1〜
2週間経過後、免疫化された動物から採血し、こ
れを遠心分離後、血清を分離することにより行な
われる。上記によれば、用いる抗原に対して優れ
た特異性を有する抗体を収得でき、これはRIA
法、EIA法等に利用してヒト白血病ウイルス関連
蛋白の定量に用い得る。 以下本発明を更に詳しく説明するため、一般式
(1)で表わされる本発明ペプチドの製造例及びこれ
により得られるペプチドからの抗原及び抗体の製
造例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。 尚、各製造例におけるRf値はシリカゲル上の
薄層クロマトグラフイーにて下記混合溶媒を用い
て測定したものである。 Rf1…n−ブタノール−酢酸−水(4:1:5) Rf2…n−ブタノール−酢酸−ビリジン−水
(15:3:10:12) <ペプチドの製造> 製造例 カリウム tert−ブトキシド15.33ミリ当量の
DMSO溶液42mlにBoc−Tyr(Cl2−Bzl)−OH
の7.53gを溶解し、クロロメチル化ポリスチレ
ン樹脂(財団法人蛋白質研究奨励会)10gを加
えて、80℃で30分間反応させる。樹脂を
DMSO、50%酢酸/クロロホルム、塩化メチ
レンの順に、充分に洗浄し、減圧乾燥して12g
のBoc−Tyr(Cl2−Bzl)−樹脂を得る。 一部を加水分解後アミノ酸分析を行なつた結
果アミノ酸0.31mmol/g樹脂であつた。 上記で得たBoc−Tyr(Cl2−Bzl)−樹脂
1.70gをクロロホルム30mlで3回洗浄後、50%
トリフルオロ酢酸(TFA)のクロロホルム溶
液30mlに加え、室温で20分間反応させる。樹脂
をクロロホルム30mlで1回、塩化メチレン30ml
で5回、10%トリエチルアミンの塩化メチレン
溶液30mlで3回、次いで塩化メチレン30mlで6
回それぞれ洗浄してH−Tyr(Cl2−Bzl)−樹脂
を得る。 Boc−Pro−OHの0.28gを塩化メチレンに溶
かした溶液25mlに上記H−Tyr(Cl2−Bzl)−樹
脂を加え、次いでDCCの0.27gを塩化メチレン
に溶かした溶液5mlを加え室温で2時間反応さ
せる。樹脂を塩化メチレン30mlで6回洗浄後、
Boc−Pro−OHの0.28g及び1−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール0.55gの塩化メチレン25mlに
加え、次いでDCCの0.27gを塩化メチレンに溶
かした溶液5mlを加えて再度同様に反応させる
(二重カツプリング法)。樹脂を塩化メチレンで
充分に洗浄してBoc−Pro−Tyr(Cl2−Bzl)−
樹脂を得る。 上記と同様にして、Boc−Pro−Tyr(Cl2
−Bzl)−樹脂の脱Boc化を行ない、次いで下記
アミノ酸、側鎖官能基保護アミノ酸又はカルボ
キシル基の活性化されたアミノ酸を順次縮合及
び脱Boc反応に付す。 Boc−Pro−OH 0.28g Boc−Pro−OH 0.28g Boc−Lys(Cl−Z)−OH 0.55g Boc−Lys(Cl−Z)−OH 0.55g Boc−Pro−OH 0.28g Boc−Gln−ONP 0.48g Boc−Val−OH 0.29g Boc−Val−OH 0.29g 斯くしてH−Val−Val−Gln−ProLys−(Cl
−Z)−Lys(Cl−Z)−Pro−Pro−Pro−Tyr
(Cl2−Bzl)−樹脂の2.57gを得る。このうち
1.20gをアニソール2ml及び弗化水素20mlに溶
かし、−20℃で30分間、次いで0℃で30分間イ
ンキユベーシヨンさせた後、過剰の弗化水素を
減圧留去し、残渣を10%酢酸にて抽出し、エー
テルにて洗浄する。水層を凍結乾燥し、次いで
セフアデツクスG−25(フアルマシア社、溶出
液1M酢酸)によるゲル過、さらにCM−
23・セルロース(ワツトマン社、0.04M酢酸ア
ンモニウム、PH7.2)を用い精製して目的ペプ
チド162mgを得る。以下このペプチドを「ペプ
チドA」と呼ぶ。 Rf値: Rf1=0.01 Rf2=0.27 元素分析値: (C56H89O13N13・3CH3CO2H・4H2Oとして) C(%) H(%) N(%) 理論値 53.02 7.82 12.96 分析値 52.94 8.06 12.74 アミノ酸分析値:(日立835型にて分析) 分析値 Gln(1) 1.05 Lys(2) 2.17 Pro(4) 4.02 Tyr(1) 1.05 Val(2) 1.69 <抗原の製造> 製造例 0.2N−HClの20mlとDMFの3mlとの混合溶
媒にベンジジン83.25mgを加え、氷冷下に撹拌
し、該溶液に亜硝酸ナトリウム87.03mgの蒸溜
水2mlを徐々に加え、30分間撹拌してBDB溶
液を調整した。 ペプチドA5.17mg及びKLH8.03mgを0.13M
NaClの0.16Mホウ酸塩緩衝液(PH=9.0)1ml
に溶解し、4℃にて静かに撹拌する。該溶液に
上記のBDB溶液0.5mlを徐々に滴下する。反
応溶液を0.5N NaOHにてPH=9.0に調整し、さ
らに4℃で2時間反応する。その後反応混合物
を一夜蒸溜水で4℃下に透析し、凍結乾燥し
て、目的抗原12.76mgを得る。以下この抗原を
「抗原」と言う。抗原はKLH1モルに対し
てペプチドAが平均25モル結合したものであ
る。 <抗体の製造> 製造例 抗原の製造例で得た抗原のそれぞれ100μg
を1.5mlの生理食塩水に溶解後、これにフロイン
ドの補助液1.5mlを加えて調整した懸濁液を、そ
れぞれ3羽のウサギ(New−Zealand white
rabbits)(2.5〜3.0Kg)に皮下投与し、2週間毎
に6回同量を投与する。更にその後1ケ月毎に3
回、最初に投与した量と同量を投与する。最終投
与後7日経過してのち試験動物から採血し、遠心
分離して抗血清を採取して、目的抗体を得る。
体を示す。〕 上記において、Aの好ましいものとしては
Boc、ベンジルオキシカルボニル基、p−メトキ
シベンジルオキシカルボニル基等を、またR1の
好ましいものとしてはクロロメチル化ポリスチレ
ン等をそれぞれ例示することができる。 また、各反応において、使用するアミノ酸が反
応に関与しない側鎖官能基を有する場合は、常法
どうり、前述した保護基により、保護され、これ
は不溶性担体R1の脱離と同時に脱離される。 上記方法において、アミノ基(イ)と不溶性担体
R1との反応は、常法に従いアミノ酸(イ)の反応性
カルボキシル基を利用して、これをR1と結合さ
せることによつて行なわれる。該反応は例えばク
ロロメチル化ポリスチレンを使用する場合は適当
な溶媒中、例えばトリエチルアミン、カリウム
tert−ブトキシド、炭酸セシウム、水酸化セシウ
ム等の塩基性化合物の存在下に行なわれる。溶媒
としては、例えばジメチルホルムアミド
(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ビ
リジン、クロロホルム、ジオキサン、ジクロロメ
タン、テトラヒドロフラン、N−メチルピロリド
ン、ヘキサメチルリン酸トリアミド等又はこれら
の混合溶媒等を例示することができる。上記反応
は、通常0〜85℃、好ましくは25〜80℃程度、数
分〜24時間程度で終了する。アミノ酸と不溶性担
体との使用割合は通常後者1当量に対して前者を
過剰量、一般に1〜3倍当量とするのがよい。 かくして得られる一般式(ロ)の固相化アミノ酸の
保護基Aの脱離反応は、常法により行なわれる。
該方法としては例えばパラジウム、パラジウム黒
等の触媒を用いる水素添加、液体アンモニア中金
属ナトリウムによる還元等の還元的方法、トリフ
ルオロ酢酸、塩化水素酸、弗化水素、メタンスル
ホン酸、臭化水素酸等の強酸によるアシドリシス
等を例示することができる。上記触媒を用いる水
素添加は、例えば水素圧1気圧、0〜40℃にて行
ない得る。触媒の使用量としては通常100mg〜1
g程度とするのがよく、一般に1〜48時間程度で
反応は終了する。また上記アジドリシスは、無溶
媒下、通常0〜30℃程度、好ましくは0〜20℃程
度で約15分〜1時間程度を要して行なわれる。酸
の使用量は原料化合物に対し通常5〜10倍量程度
とするのがよい。該アシドリシスにおいて保護基
Aのみを脱離する場合は酸としてトリフルオロ酢
酸又は塩化水素酸を使用するのが好ましい。更に
上記液体アンモニア中金属ナトリウムによる還元
は、反応液がパーマネントブルーに30秒〜10分間
程度呈色しているような量の金属ナトリウムを用
い、通常−40℃〜−70℃程度にて行ない得る。 次いで得られる一般式(ハ)の固相化アミノ酸とア
ミノ酸(ニ)(もしくはそのカルボキシル基の活性化
されたもの)との反応は、溶媒の存在下に行なわ
れる。該溶媒としては、ペプチド縮合反応に慣用
される公知の各種のもの、例えば無水ジメチルホ
ルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、
クロロホルム、ジオキサン、ジクロロメタン、テ
トラヒドロフラン、酢酸エチル、N−メチルピロ
リドン、ヘキサメチルリン酸トリアミド或いはこ
れらの混合溶媒等を例示することができる。また
該反応は、必要に応じて、通常のペプチド結合形
成反応に用いられる試薬、例えばN,N−ジシク
ロヘキシルカルボジイミド(DCC)、N−エチル
−N′−ジメチルアミノカルボジイミド、1−エ
チル−3−ジイソプロピルアミノカルボジイミ
ド、1−シクロヘキシル−3−(2−モルホリニ
ル−4−エチル)カルボジイミド等のカルボジイ
ミド類等の脱水縮合剤の存在下に行なうことがで
きる。アミノ酸(ハ)とアミノ酸(ニ)との使用割合とし
ては、特に限定はないが、通常前者に対して後者
を等モル量〜10倍モル量、好ましくは等モル量〜
5倍モル量とするのがよい。脱水縮合剤の使用量
も特に限定はなく、通常アミノ酸(ニ)に対して、好
ましくは等モル量程度使用される。反応温度はペ
プチド結合形成反応に使用される通常の範囲、一
般には約−40℃〜約60℃、好ましくは約−20℃〜
約−40℃の範囲から適宜選択される。反応時間は
一般に数分〜30時間程度とされる。 かくして得られる一般式(ホ)のペプチドは、上記
と同様に保護基Aの脱離後、一般式(1)で表わされ
るアミノ酸配列に従い、A−Pro−OH、A−Pro
−OH、A−Lys−OH、A−Lys−OH、A−Pro
−OH、A−Gln−OH、A−Val−OH、A−Val
−OHの各アミノ酸もしくは側鎖官能基を保護さ
れたもの乃至そのカルボキシ基を活性化されたも
のと順次縮合反応させることにより行なわれ、斯
くして一般式(ヘ)で表わされるペプチドに誘導する
ことができる。これら縮合反応及び保護基Aの脱
離反応は、それぞれ前記した方法と同様にして行
なわれる。 また得られるペプチド(ヘ)は、同様にして保護基
Aの脱離、アミノ酸の側鎖官能基の保護基の脱離
及び不溶性担体R1の脱離により、式(1)で表わさ
れるペプチドに誘導される。ここで側鎖官能基の
保護基及び不溶性担体R1の脱離反応は、保護基
Aの脱離反応と同様に行ない得、この場合酸とし
て弗化水素又は臭化水素酸を用いるのが好まし
い。尚、上記方法において使用される各アミノ酸
は、いずれも公知の市販品でよい。 以上のようにして製造された式(1)の本発明ペプ
チドは、反応混合物からペプチドの分離手段例え
ば抽出、分配、カラムクロマトラフイー等により
単離精製される。 かくして得られる本発明のペプチドは、これに
125I、131I等の放射性物質、パーオキシダーゼ
(POX)、キモトリプシノーゲン、プロカルボキ
シペプチダーゼ、グリセロアルデヒド−3−リン
酸脱水素酵素、アミラーゼ、ホスホリラーゼ、D
−Nase、P−Nase、β−ガラクトシダーゼ、グ
ルコース−6−フオスフエートデハイドロゲナー
ゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等の各種酵素
試薬等を導入することにより、ラジオイムノアツ
セイ(RIA)法又はエンザイムイムノアツセイ
(EIA)法において用いられる標識抗原として利
用できる。上記放射性物質の導入は、通常の方法
により実施できる。例えば放射性ヨードは、クロ
ラミンTを用いる酸化的ヨード化法〔W.M.
Hunter andF.C.Greenwood;Nature、194、495
(1962)、BiochemJ.89、144、(4963)参照〕等に
より行なわれ、酵素試薬の導入は、通常のカツプ
リング法例えばエルランガー(B.F.Erlanger)
らの方法〔Acta.Endocrinol.Suppl.、168、206
(1972)〕及びカロール(M.H.Karol)らの方法
〔Proc.Natl.Acad.Sci.、USA.、57、713(1967)〕
等の公知の方法によつて行なうことができる。 以下、本発明のペプチドをハプテンとして利用
した抗原の製造方法につき詳述する。 上記抗原は本発明ペプチドをハプテンとし、こ
れをハプテン−担体結合試薬の存在下に、適当な
担体と反応させることにより製造される。上記に
おいてハプテンに結合される担体としては、通常
抗原の作成に当り慣用される高分子の天然もしく
は合成の蛋白質を広く使用できる。該担体として
は例えば馬血清アルブミン、牛血清アルブミン、
ウサギ血清アルブミン、人血清アルブミン、ヒツ
ジ血清アルブミン等の動物の血清アルブミン類;
馬血清グロブリン、牛血清グロブリン、ウサギ血
清グロブリン、人血清グロブリン、ヒツジ血清グ
ロブリン等の動物の血清グロブリン類;馬チログ
ロブリン、牛チログロブリン、ウサギチログロブ
リン、人チログロブリン、ヒツジチログロブリン
等の動物のチログロブリン類;馬ヘモグロブリ
ン、牛ヘモグロブリン、ウサギヘモグロブリン、
人ヘモグロブリン、ヒツジヘモグロブリン等の動
物のヘモグロブリン類;キーホールリンペツトヘ
モシアニン(KLH)等の動物のヘモシアニン
類;回虫より抽出された蛋白質(アスカーリス抽
出物、特開昭56−16414号公報、J.Immun.、111、
260〜268(1973)、J.Immun.、122、302〜308
(1979)、J.Immun.、98、893〜900(1967)及び
Am.J.Physiol.、199、575〜578(1960)に記載さ
れたもの又はこれらを更に精製したもの);ポリ
リジン、ポリグリタミン酸、リジン−グルタミン
酸共重合体、リジン又はオルニチンを含む共重合
体等を挙げることができる。 ハプテン−担体結合試薬としては、通常抗原の
作成に当り慣用されているものを広く使用でき
る。具体的にはチロシン、ヒスチジン、トリプト
フアンを架橋結合させる、例えばビスジアゾタイ
ズドベンジジン(BDB)、ビスジアゾタイズド−
3,3′−ジアニシジン(BDD)等のジアゾニウ
ム化合物;アミノ基とアミノ基とを架橋結合させ
る、例えばグリオキサール、マロンジアルデヒ
ド、グルタールアルデヒド、スクシンアルデヒ
ド、アジポアルデヒド等の脂肪族ジアルデヒド
類;チオール基とチオール基とを架橋結合させ
る、例えばN,N′−0−フエニレンジマレイミ
ド、N,N′−m−フエニレンジマレイミド等の
ジマレイミド化合物;アミノ基とチオール基とを
架橋結合させる、例えばメタマレイミドベンゾイ
ル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、4
−(マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カ
ルボキシル−N′−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル等のマレイミドカルボキシル−N−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル類;アミド基とカル
ボキシル基とをアミド結合させる通常のペプチド
結合形成反応に用いられる試薬、例えばN−Nジ
シクロヘキシルカルボジイミド、N−エチル−
N′−ジメチルアミノカルボジイミド、1−エチ
ル3−3ジイソプロピルアミノカルボジイミド、
1−シクロヘキシル−3−(2−モルホリニル−
4−エチル)カルボジイミド等のマルボジイミド
類等の脱水縮合剤等を挙げることができる。また
上記ハプテン−担体結合試薬としては、p−ジア
ゾニウムフエニル酢酸等のジアニウムアリールカ
ルボン酸類と通常のペプチド結合形成反応試薬、
例えば上記脱水縮合剤とを組合せたものも使用可
能である。 上記抗原の製造反応は、例えば水溶液もしくは
PH7〜10の通常の緩衝液中、好ましくはPH8〜9
の緩衝液中、0〜40℃、好ましくは室温付近で行
なわれる。該反応は通常約1〜24時間、好ましく
は3〜5時間で完結する。上記において用いられ
る代表的緩衝液としては、次のものを例示でき
る。 0.2N水酸化ナトリウム−0.2Mホウ酸−0.2M塩
化カリウム緩衝液、 0.2M炭酸ナトリウム−0.2Mホウ酸−0.2M塩化
カリウム緩衝液、 0.5M四ホウ酸ナトリウム−0.2Mホウ酸−
0.05M塩化ナトリウム緩衝液、 0.1Mリン酸二水素カリウム−0.05M四ウ酸ナ
トリウム緩衝液 上記においてハプテン、ハプテン−担体結合試
薬及び担体の使用割合は、適宜に決定できるが、
通常ハプテンに対して担体を1〜6倍重量程度、
好ましくは1〜5倍重量程度、及びハプテン−担
体結合試薬を5〜10倍モル程度用いるのがよい。
上記反応によりハプテン−担体結合試薬を仲介さ
せて担体とハプテンとが結合したペプチド−担体
複合体からなる所望の抗原が収得される。 反応終了後得られる抗原は常法に従い、例えば
透析法、ゲル過法、分別沈澱法等により容易に
単離精製できる。 斯くして得られる抗原は、通常蛋白質1モルに
対してペプチドが平均5〜60モル結合したもので
あり、いずれも引き続き該抗原に対して特異性の
高い抗体の製造を可能とするものである。 該抗原による抗体の製造は、上記抗原を哺乳動
物に投与し、生体内に所望抗体を産生させ、これ
を採取することにより実施される。 抗体の製造に供せられる哺乳動物としては、特
に制限はないが、通常ウサギやモルモツトを用い
るのが好ましい。抗体の産生に当つては、上記に
より得られる抗原の所定量を生理食塩水で適当濃
度に希釈し、フロインドの補助液(Complete
Freund′s Adjuvant)と混合して懸濁液を調整
し、これを哺乳動物体に投与すればよい。例えば
ウサギに上記懸濁液を皮内注射(抗原の量として
0.1〜5mg/回)し、以後2週間毎に2〜10ケ月、
好ましくは4〜6ケ月間投与し免疫化させればよ
い。抗体の採取は、上記懸濁液の最終投与の1〜
2週間経過後、免疫化された動物から採血し、こ
れを遠心分離後、血清を分離することにより行な
われる。上記によれば、用いる抗原に対して優れ
た特異性を有する抗体を収得でき、これはRIA
法、EIA法等に利用してヒト白血病ウイルス関連
蛋白の定量に用い得る。 以下本発明を更に詳しく説明するため、一般式
(1)で表わされる本発明ペプチドの製造例及びこれ
により得られるペプチドからの抗原及び抗体の製
造例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。 尚、各製造例におけるRf値はシリカゲル上の
薄層クロマトグラフイーにて下記混合溶媒を用い
て測定したものである。 Rf1…n−ブタノール−酢酸−水(4:1:5) Rf2…n−ブタノール−酢酸−ビリジン−水
(15:3:10:12) <ペプチドの製造> 製造例 カリウム tert−ブトキシド15.33ミリ当量の
DMSO溶液42mlにBoc−Tyr(Cl2−Bzl)−OH
の7.53gを溶解し、クロロメチル化ポリスチレ
ン樹脂(財団法人蛋白質研究奨励会)10gを加
えて、80℃で30分間反応させる。樹脂を
DMSO、50%酢酸/クロロホルム、塩化メチ
レンの順に、充分に洗浄し、減圧乾燥して12g
のBoc−Tyr(Cl2−Bzl)−樹脂を得る。 一部を加水分解後アミノ酸分析を行なつた結
果アミノ酸0.31mmol/g樹脂であつた。 上記で得たBoc−Tyr(Cl2−Bzl)−樹脂
1.70gをクロロホルム30mlで3回洗浄後、50%
トリフルオロ酢酸(TFA)のクロロホルム溶
液30mlに加え、室温で20分間反応させる。樹脂
をクロロホルム30mlで1回、塩化メチレン30ml
で5回、10%トリエチルアミンの塩化メチレン
溶液30mlで3回、次いで塩化メチレン30mlで6
回それぞれ洗浄してH−Tyr(Cl2−Bzl)−樹脂
を得る。 Boc−Pro−OHの0.28gを塩化メチレンに溶
かした溶液25mlに上記H−Tyr(Cl2−Bzl)−樹
脂を加え、次いでDCCの0.27gを塩化メチレン
に溶かした溶液5mlを加え室温で2時間反応さ
せる。樹脂を塩化メチレン30mlで6回洗浄後、
Boc−Pro−OHの0.28g及び1−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール0.55gの塩化メチレン25mlに
加え、次いでDCCの0.27gを塩化メチレンに溶
かした溶液5mlを加えて再度同様に反応させる
(二重カツプリング法)。樹脂を塩化メチレンで
充分に洗浄してBoc−Pro−Tyr(Cl2−Bzl)−
樹脂を得る。 上記と同様にして、Boc−Pro−Tyr(Cl2
−Bzl)−樹脂の脱Boc化を行ない、次いで下記
アミノ酸、側鎖官能基保護アミノ酸又はカルボ
キシル基の活性化されたアミノ酸を順次縮合及
び脱Boc反応に付す。 Boc−Pro−OH 0.28g Boc−Pro−OH 0.28g Boc−Lys(Cl−Z)−OH 0.55g Boc−Lys(Cl−Z)−OH 0.55g Boc−Pro−OH 0.28g Boc−Gln−ONP 0.48g Boc−Val−OH 0.29g Boc−Val−OH 0.29g 斯くしてH−Val−Val−Gln−ProLys−(Cl
−Z)−Lys(Cl−Z)−Pro−Pro−Pro−Tyr
(Cl2−Bzl)−樹脂の2.57gを得る。このうち
1.20gをアニソール2ml及び弗化水素20mlに溶
かし、−20℃で30分間、次いで0℃で30分間イ
ンキユベーシヨンさせた後、過剰の弗化水素を
減圧留去し、残渣を10%酢酸にて抽出し、エー
テルにて洗浄する。水層を凍結乾燥し、次いで
セフアデツクスG−25(フアルマシア社、溶出
液1M酢酸)によるゲル過、さらにCM−
23・セルロース(ワツトマン社、0.04M酢酸ア
ンモニウム、PH7.2)を用い精製して目的ペプ
チド162mgを得る。以下このペプチドを「ペプ
チドA」と呼ぶ。 Rf値: Rf1=0.01 Rf2=0.27 元素分析値: (C56H89O13N13・3CH3CO2H・4H2Oとして) C(%) H(%) N(%) 理論値 53.02 7.82 12.96 分析値 52.94 8.06 12.74 アミノ酸分析値:(日立835型にて分析) 分析値 Gln(1) 1.05 Lys(2) 2.17 Pro(4) 4.02 Tyr(1) 1.05 Val(2) 1.69 <抗原の製造> 製造例 0.2N−HClの20mlとDMFの3mlとの混合溶
媒にベンジジン83.25mgを加え、氷冷下に撹拌
し、該溶液に亜硝酸ナトリウム87.03mgの蒸溜
水2mlを徐々に加え、30分間撹拌してBDB溶
液を調整した。 ペプチドA5.17mg及びKLH8.03mgを0.13M
NaClの0.16Mホウ酸塩緩衝液(PH=9.0)1ml
に溶解し、4℃にて静かに撹拌する。該溶液に
上記のBDB溶液0.5mlを徐々に滴下する。反
応溶液を0.5N NaOHにてPH=9.0に調整し、さ
らに4℃で2時間反応する。その後反応混合物
を一夜蒸溜水で4℃下に透析し、凍結乾燥し
て、目的抗原12.76mgを得る。以下この抗原を
「抗原」と言う。抗原はKLH1モルに対し
てペプチドAが平均25モル結合したものであ
る。 <抗体の製造> 製造例 抗原の製造例で得た抗原のそれぞれ100μg
を1.5mlの生理食塩水に溶解後、これにフロイン
ドの補助液1.5mlを加えて調整した懸濁液を、そ
れぞれ3羽のウサギ(New−Zealand white
rabbits)(2.5〜3.0Kg)に皮下投与し、2週間毎
に6回同量を投与する。更にその後1ケ月毎に3
回、最初に投与した量と同量を投与する。最終投
与後7日経過してのち試験動物から採血し、遠心
分離して抗血清を採取して、目的抗体を得る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 式 H−Val−Val−Gln−Pro−Lys−Lys− Pro−Pro−Pro−Tyr−OH で表わされるペプチドからなるヒト白血病ウイル
ス関連ペプチド。
Priority Applications (6)
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---|---|---|---|
JP58030096A JPS59155347A (ja) | 1983-02-23 | 1983-02-23 | ヒト白血病ウイルス関連ペプチド |
DE8383109481T DE3380564D1 (en) | 1982-09-30 | 1983-09-23 | Human leukemia virus-related peptides, antibodies of the peptides and a process for production of the antibodies |
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CA000437427A CA1262014A (en) | 1983-01-07 | 1983-09-23 | Human leukemia virus-related peptides, antibodies of the peptides and a process for production of the antibodies |
US06/713,659 US4804746A (en) | 1983-01-07 | 1985-03-19 | Antibodies to human leukemia virus-related peptides and a process for production of the antibodies |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58030096A JPS59155347A (ja) | 1983-02-23 | 1983-02-23 | ヒト白血病ウイルス関連ペプチド |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS59155347A JPS59155347A (ja) | 1984-09-04 |
JPH0350760B2 true JPH0350760B2 (ja) | 1991-08-02 |
Family
ID=12294246
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58030096A Granted JPS59155347A (ja) | 1982-09-30 | 1983-02-23 | ヒト白血病ウイルス関連ペプチド |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS59155347A (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE8900721D0 (sv) | 1989-03-02 | 1989-03-02 | Blomberg Jonas | Methods for detection of antibodies to |
-
1983
- 1983-02-23 JP JP58030096A patent/JPS59155347A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS59155347A (ja) | 1984-09-04 |
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