JPH0361680B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト白血病ウイルス（Adult Ｔ−
cell Leukemin Virus；ATLV又はHuman Ｔ−
cell Leukemia Virus；HTLV）に関連する新
規なペプチドであり、かかるウイルス感染ならび
に成人細胞白血病、皮膚型Ｔ細胞リンパ腫などの
成熟Ｔ細胞白血病・リンパ腫に関連するペプチド
に関する。 本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護
基、活性基、核酸塩基、その他に関して略号で表
示する場合はIUPAC，IUBの規定或いは当該分
野における慣用記号に従うものとし、その例を次
に挙げる。またアミノ酸等に関して光学異性体が
ありうる場合は、特に明記しなければＬ体を示す
ものとする。 Ser；セリン Leu；ロイシン Lys；リジン Pro；プロリン Tyr；チロシン Tos；ｐ−トルエンスルホニル基 Boc；第３級ブトキシカルボニル基 ONP；ｐ−ニトロフエノキシ基 Bzl；ベンジル基 OBzl；ベンジルオキシ基 Cl₂−Bzl；２，６−ジクロルベンジル基 Cl−Ｚ；２−クロルベンジルオキシカルボニル
基 ヒト白血病ウイルスは、成人Ｔ細胞白血病
（ATL）より分離され、該疾患との関連が注目さ
れているウイルスである。本発明者の吉田、管野
は、遺伝子工学的手法をもちい、宿主細胞の
DNAに組込まれたプロウイルス遺伝子をクロー
ニング（cloning）し、その全塩基配列を決定し
た。これに基づいて該疾患ならびに該ウイルス感
染の診断・治療・予防の基礎を確立した。本発明
は、上記の基礎的な情報を基にし完成されたもの
であり、該ウイルス感染の診断を目的としたウイ
ルス関連ペプチドに関し、またそれ等に対する特
異抗体の作製と測定法を提供する。決定された上
記ウイルス遺伝子の外殻（エンフ）蛋白前駆体を
コードする塩基配列は知られており〔Proc.Natl.
Acad.Sci.，USA，80（1983）、Biochemistry，
p3621）、該外殻蛋白前駆体は、488個のアミノ酸
から成る。 本発明者等は、上記ヒト白血病ウイルスの関連
蛋白（外殻蛋白）のハプテンとなり得る特定のペ
プチドを見い出し、ここに本発明を完成するに至
つた。 即ち本発明は式 Ｈ−Tyr−Ser−Leu−Ile−Lys−Pro−Glu−Ser
−Ser−Leu−OH (1) で表わされるペプチドであるヒト白血病ウイルス
関連ペプチドに係る。 本発明の上記式(1)で表わされるペプチドは入手
容易な市販のアミノ酸を利用して、簡単な操作で
容易に合成することができ、該ペプチドからは、
これをハプテンとして用いて抗原を作成でき、か
くして得られる抗原からはウイルス関連蛋白に特
異反応性を有する抗体を収得することができる。
該特異抗体はこれを例えばアフイニテイークロマ
トグラフイー用担体と結合させて、該クロマトグ
ラフに利用する等によりウイルス関連蛋白の精製
に用いることができ、また該ウイルス関連蛋白の
各種免疫測定法における特異抗体として使用で
き、ヒト白血病ウイルス感染の診断、ひいては、
成人Ｔ細胞白血病、皮膚型Ｔ細胞リンパ腫等の成
熟Ｔ細胞白血病・リンパ腫ならびに関連する疾患
の診断、研究等に有用である。 本発明の式(1)で表わされるペプチドは、通常の
ペプチド合成法、具体的には「ザペプチド（The
Peptides）」第１巻（1966年）〔Schroder and
Luhke著、Ａ cademic press，New York，
USA〕或いは「ペプチド合成」〔泉屋ら著、丸善
株式会社（1975年）〕に記載される如き方法に従
い、例えばアジド法、クロライド法、酸無水物
法、混酸無水物法、DCC法、活性エステル法
（ｐ−ニトロフエニルエステル法、Ｎ−ヒドロキ
シコハク酸イミドエステル法、シアノメチルエス
テル法等）、ウツドワード試薬Ｋを用いる方法、
カルボジイミダゾール法、酸化還元法、DCC／
アデイテイブ（HONB、HOBt、HOSu）法等に
より製造できる。上記方法においては、固相合成
法及び液相合成法のいずれをも適用できる。通常
本発明のペプチドは、上記した一般のポリペプチ
ドの合成法に従い、例えば末端アミト酸に順次１
個づつアミノ酸を縮合させる所謂ステツプワイズ
法により、又は数個のフラグメントに分けてカツ
プリングさせていく方法により製造される。より
詳細には、例えば固相合成法を採用する場合、Ｃ
末端アミノ酸をそのカルボキシル基によつて、不
溶性担体に結合させる。不溶性担体としては、反
応性カルボキシル基と結合性を有するものであれ
ば特に限定はなく、例えばクロロメチル樹脂、ブ
ロモメチル樹脂等のハロゲノメチル樹脂やヒドロ
キシメチル樹脂、フエノール樹脂、tert−アルキ
ルオキシカルボニルヒドラジド化樹脂等を使用で
きる。 次いでアミノ保護基を除去した後、式(1)で表わ
されるアミノ酸配列に従い順次アミノ基保護アミ
ノ酸を、その反応性アミノ基及び反応性カルボニ
ル基との縮合反応により結合させ、一段階ずつ合
成し、全配列を合成した後、ペプチドを不溶性担
体からはずすことにより製造される。 上記においてTyr，Glu，Lys及びSerの各アミ
ノ酸は、その側鎖官能基を保護しておくのが好ま
しく、これは通常の保護基により保護され、反応
終了後該保護基は脱離される。また反応に関与す
る官能基は、通常活性化される。これら各反応方
法は、公知であり、それらに用いられる試薬等も
公知のものから適宜選択される。 アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオ
キシカルボニル、Boc、tert−アミルオキシカル
ボニル、イソボルニルオキシカルボニル、ｐ−メ
トキシベンジルオキシカルボニル、Cl−Ｚ、アダ
マンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチ
ル、フタリル、ホルミル、ｏ−ニトロフエニルス
ルフエニル、ジフエニルホスフイノチオイル基等
が挙げられる。 Serの水酸基の保護基としては、例えば、Bzl、
tert−ブチル、アセチル、テトラヒドロピラニル
基等が挙げられる。 Tyrの水酸基の保護基としては、例えばBzl、
Cl₂−Bzl、ベンジルオキシカルボニル、アセチ
ル、Tos基等が挙げられる。 Lysのアミノ基の保護基としては、例えばベン
ジルオキシカルボニル、Cl−Ｚ、Cl₂−Bzl、
Boc、Tos基等が挙げられる。 Gluのカルボキシル基の保護基としては、例え
ばベンジルアルコール、メタノール、エタノー
ル、tert−ブタノール等とのエステル化により行
なわれる。 カルボキシル基の活性化されたものとしては、
例えば対応する酸クロライド、酸無水物又は混合
酸無水物、アジド、活性エステル（ペンタクロロ
フエノール、ｐ−ニトロフエノール、Ｎ−ヒドロ
キシサクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンズトリ
アゾール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−
２，３−ジカルボキシイミド等とのエステル）等
が挙げられる。尚ペプチド結合形成反応は、縮合
剤例えばジシクロヘキシルカルボジイミド、カル
ボジイミダゾール等のカルボジイミド試薬やテト
ラエチルピロホスフイン等の存在下に実施し得る
場合もある。 以下、本発明ペプチドの製造法につき反応行程
式を挙げて具体的に説明する。 〔反応行程式−１〕 Ａ−Leu−OH (イ) ↓ Ａ−Leu−R¹ (ロ) ↓ Ｈ−Leu−R¹ (ハ) ↓ Ａ−Ser（Bzl）−OH (ニ) Ａ−Ser（Bzl）−Leu−R¹ (ホ) ↓↓↓ Ａ−Tyr（Cl₂−Ｚ）−Ser（Bzl）−Leu−Ile−Lys
（Cl−Ｚ）−Pro−Glu（OBzl）−Ser（Bzl）−Ser
（Bzl）−Leu−R¹ (ヘ) ↓ Ｈ−Tyr−Ser−Leu−Ile−Lys−Pro−Glu−Ser
−Ser−Leu−OH (1) 〔式中Ａはアミノ基の保護基及びR¹は不溶性
担体を示す。〕 上記において、Ａの好ましいものとしては
Boc、ベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキ
シベンジルオキシカルボニル基等を、またR¹の
好ましいものとしてはクロロメチル化ポリスチレ
ン等をそれぞれ例示することができる。 また、各反応において、使用するアミノ酸が反
応に関与しない側鎖官能基を有する場合は、常法
通り、前述した保護基により保護され、これは不
溶性担体R¹の脱離と同時に脱離される。 上記方法において、アミノ酸(イ)と不溶性担体
R¹との反応は、常法に従いアミノ酸(イ)の反応性
カルボキシ基を利用して、これをR¹と結合させ
ることによつて行なわれる。該反応は例えばクロ
ロメチル化ポリスチレンを使用する場合は適当な
溶媒中、例えばトリエチルアミン、カリウムtert
−ブトキシド、炭酸セシウム、水酸化セシウム等
の塩基性化合物の存在下に行なわれる。溶媒とし
ては、例えばジメチルホルムアミド（DMF）、ジ
メチルスルホキシド（DMSO）、ピリジン、クロ
ロホルム、ジオキサン、ジクロロメタン、テトラ
ヒドロフラン、Ｎ−メチルピロリドン、ヘキサメ
チルリン酸トリアミド等又はこれらの混合溶媒等
を例示することができる。上記反応は、通常０〜
85℃、好ましくは25〜80℃程度、数分〜24時間程
度で終了する。アミノ酸と不溶性担体との使用割
合は通常後者１当量に対して前者を過剰量、一般
に１〜３倍当量とするのがよい。 かくして得られる一般式(ロ)の固相化アミノ酸の
保護基Ａの脱離反応は、常法により行なわれる。
該方法としては例えばパラジウム、パラジウム黒
等の触媒を用いる水素添加、液体アンモニア中金
属ナトリウムによる還元等の還元的方法、トリフ
ルオロ酢酸、塩化水素酸、弗化水素、メタンスル
ホン酸、臭化水素酸等の強酸によるアシドリシス
等を例示することができる。上記触媒を用いる水
素添加は、例えば水素圧１気圧、０〜40℃にて行
ない得る。触媒の使用量としては通常100mg〜１
ｇ程度とするのがよく、一般に１〜48時間程度で
反応は終了する。また上記アシドリシスは、無溶
媒下、通常０〜30℃程度、好ましくは０〜20℃程
度で約15分〜１時間程度を要して行なわれる。酸
の使用量は原料化合物に対し通常５〜10倍量程度
とするのがよい。該アシドリシスにおいて保護基
Ａのみを脱離する場合は酸としてトリフルオロ酢
酸又は塩化水素酸を使用するのが好ましい。更に
上記液体アンモニア中金属ナトリウムによる還元
は、反応液がパーマネントブルーに30秒〜10分間
程度呈色しているような量の金属ナトリウムを用
い、通常−40℃〜−70℃程度にて行ない得る。 次いで得られる一般式(ハ)の固相化アミノ酸とア
ミノ酸(ニ)（もしくはそのカルボキシル基の活性化
されたもの）との反応は、溶媒の存在下に行なわ
れる。該溶媒としては、ペプチド縮合反応に慣用
される公知の各種のもの、例えば無水ジメチルホ
ルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、
クロロホルム、ジオキサン、ジクロロメタン、テ
トラヒドロフラン、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロ
リドン、ヘキサメチルリン酸トリアミド或いはこ
れらの混合溶媒等を例示することができる。また
該反応は、必要に応じて、通常のペプチド結合形
成反応に用いられる試薬、例えばＮ，Ｎ−ジシク
ロヘキシルカルボジイミド（DCC）、Ｎ−エチル
−N′−ジメチルアミノカルボジイミド、１−エ
チル−３−ジイソプロピルアミノカルボジイミ
ド、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニ
ル−４−エチル）ガルボジイミド等のカルボジイ
ミド類等の脱水縮合剤の存在下に行なうことがで
きる。アミノ酸(ハ)とアミノ酸(ニ)との使用割合とし
ては、特に限定はないが、通常前者に対して後者
を等モル量〜10倍モル量、好ましくは等モル量〜
５倍モル量とするのがよい。脱水縮合剤の使用量
も特に限定はなく、通常アミノ酸(ニ)に対して、好
ましくは等モル量程度使用される。反応温度はペ
プチド結合形成反応に使用される通常の範囲、一
般には約−40℃〜約60℃、好ましくは約−20℃〜
約40℃の範囲から適宜選択される。反応時間は一
般に数分〜30時間程度とされる。 かくして得られる一般式(ホ)のペプチドは、上記
と同様に保護基Ａの脱離後、式(1)で表わされるア
ミノ酸配列に従い、Ａ−Ser−OH，Ａ−Glu−
OH，Ａ−Pro−OH，Ａ−Lys−OH，Ａ−Ile−
OH，Ａ−Leu−OH，Ａ−Ser−OH，Ａ−Tyr
−OHの各アミノ酸もしくは側鎖官能基を保護さ
れたもの乃至そのカルボキシ基を活性化されたも
のと順次縮合反応させることにより行なわれ、か
くして一般式(ヘ)で表わされるペプチドに誘導する
ことができる。これら縮合反応及び保護基Ａの脱
離反応は、それぞれ前記した方法と同様にして行
なわれる。 また得られるペプチド(ヘ)は、同様にして保護基
Ａの脱離、アミノ酸の側鎖官能基の保護基の脱離
及び不溶性担体R¹の脱離により、式(1)で表わさ
れるペプチドに誘導される。ここで側鎖官能基の
保護基及び不溶性担体R¹の脱離反応は、保護基
Ａの脱離反応と同様に行ない得、この場合酸とし
て弗化水素又は臭化水素酸を用いるのが好まし
い。尚、上記方法において使用される各アミノ酸
は、いずれも公知の市販品でよい。 以上のようにして製造された式(1)の本発明ペプ
チドは、反応混合物からペプチドの分離手段例え
ば抽出、分配、カラムクロマトグラフイー等によ
り単離精製される。 かくして得られる本発明のペプチドは、これに
¹²⁵I，¹³¹I等の放射性物質、パーオキシダーゼ
（POX）、キモトリプシノーゲン、プロカルボキ
シペプチダーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン
酸脱水素酵素、アミラーゼ、ホスホリラーゼ、Ｄ
−Nase、Ｐ−Nase、β−ガラクトシダーゼ、グ
ルコース−６−フオスフエートデハイドロゲナー
ゼ、オルニチンカルボキシラーゼ等の各種酵素試
薬等を導入することにより、ラジオイムノアツセ
イ（RIA）法又はエンザイムイムノアツセイ
（EIA）法において用いられる標識抗原として利
用できる。上記放射性物質の導入は、通常の方法
により実施できる。例えば放射性ヨードは、クロ
ラミンＴを用いる酸化的ヨード化法〔W.M.
Hunter and F.C.Greenwood；Nature，194，
495（1962）、Biochem J.89，144.（1963）参照〕
等により行なわれ、酵素試薬の導入は、通常のカ
ツプリング法例えばエルランガー（B.F.
Erlanger）らの方法〔Acta.Endocrinol.Suppl.，
168，206（1972）〕及びカロール（M.H.Karol）
らの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，57，
713（1967）〕等の公知の方法によつて行なうこと
ができる。 以下、本発明のペプチドをハプテンとして利用
した抗原の製造方法につき詳述する。 上記抗原は本発明ペプチドをハプテンとし、こ
れをハプテン−担体結合試薬の存在下に、適当な
担体と反応させることにより製造される。上記に
おいてハプテンに結合される担体としては、通常
抗原の作成に当り慣用される高分子の天然もしく
は合成の蛋白質を広く使用できる。該担体として
は例えば馬血清アルブミン、牛血清アルブミン、
ウサギ血清アルブミン、人血清アルブミン、ヒツ
ジ血清アルブミン等の動物の血清アルブミン類；
馬血清グロブリン、牛血清グロブリン、ウサギ血
清グロブリン、人血清グロブリン、ヒツジ血清グ
ロブリン等の動物の血清グロブリン類；馬チログ
ロブリン、牛チログロブリン、ウサギチログロブ
リン、人チログロブリン、ヒツジチログロブリン
等の動物のチログロブリン類；馬ヘモグロブリ
ン、牛ヘモグロブリン、ウサギヘモグロブリン、
人ヘモグロブリン、ヒツジヘモグロブリン等の動
物のヘモグロブリン類；キーホールリンペツトヘ
モシアニン（KLH）等の動物のヘモシアニン
類；回虫より抽出された蛋白質（アスカーリス抽
出物、特開昭56−16414号公報、J.Immun.，111，
260〜268（1973）、J.Immun.，122，302〜308
（1979）、J.Immun.，98，893〜900（1967）及び
Am.J.Physiol.，199，575〜578（1960）に記載さ
れたもの又はこれを更に精製したもの）；ポリリ
ジン、ポリグルタミン酸、リジン−グルタミン酸
共重合体、リジン又はオルニチンを含む共重合体
等を挙げることができる。 ハプテン−担体結合試薬としては、通常抗原の
作成に当り慣用されているものを広く使用でき
る。具体的にはチロシン、ヒスチジン、トリブト
フアンを架橋結合させる、例えばビスジアゾタイ
ズドベンジジン（BDB）、ビスジアゾタイズド−
３，3′−ジアニシジン（BDD）等のジアゾニウ
ム化合物；アミノ基とアミノ基とを架橋結合させ
る、例えばグリオキサール、マロンジアルデヒ
ド、グルタールアルデヒド、スクシンアルデヒ
ド、アジポアルデヒド等の脂肪族ジアルデヒド
類；チオール基とチオール基とを架橋結合させ
る、例えばＮ，N′−ｏ−フエニレンジマレイミ
ド、Ｎ，N′−ｍ−フエニレンジマレイミド等の
ジマレイミド化合物；アミノ基とチオール基とを
架橋結合させる。例えばメタマレイミドベンゾイ
ル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４
−（マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カ
ルボキシル−N′−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル等のマレイミドカルボキシル−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル類；アミノ基とカル
ボキシル基とをアミド結合させる通常のペプチド
結合形成反応に用いられる試薬、例えばＮ，Ｎ−
ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−エチル−
N′−ジメチルアミノカルボジイミド、１−エチ
ル−３−ジイソプロピルアミノカルボジイミド、
１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−
４−エチル）カルボジイミド等のカルボジイミド
類等の脱水縮合剤等を挙げることができる。また
上記ハプテン−担体結合試薬としては、ｐ−ジア
ゾニウムフエニル酢酸等のジアゾニウムアリール
カルボン酸類と通常のペプチド結合形成反応試
薬、例えば上記脱水縮合剤とを組合せたものも使
用可能である。 上記抗原の製造反応は、例えば水溶液もしくは
PH７〜10の通常の緩衝液中、好ましくはPH８〜９
の緩衝液中、０〜40℃、好ましくは室温付近で行
なわれる。該反応は通常約１〜24時間、好ましく
は３〜５時間で完結する。上記において用いられ
る代表的緩衝液としては、次のものを例示でき
る。 0.2N水酸化ナトリウム−0.2Mホウ酸−0.2M塩
化カリウム緩衝液、 0.2M炭酸ナトリウム−0.2Mホウ酸−0.2M塩化
カリウム緩衝液、 0.05M四ホウ酸ナトリウム−0.2Mホウ酸−
0.05M塩化ナトリウム緩衝液、 0.1Mリン酸二水素カリウム−0.05M四ウ酸ナ
トリウム緩衝液 上記においてハプテン、ハプテン−担体結合試
薬及び担体の使用割合は、適宜に決定できるが、
通常ハプテンに対して担体を１〜６倍重量程度、
好ましくは１〜５倍重量程度、及びハプテン−担
体結合試薬を５〜10倍モル程度用いるのがよい。
上記反応によりハプテン−担体結合試薬を仲介さ
せて担体とハプテンとが結合したペプチド−担体
複合体からなる所望の抗原が収得される。 反応終了後得られる抗原は常法に従い、例えば
透析法、ゲル過法、分別沈殿法等により容易に
単離精製できる。 かくして得られる抗原は、通常蛋白質１モルに
対してペプチドが平均５〜60モル結合したもので
あり、いずれも引き続き該抗原に対して特異性の
高い抗体の製造を可能とするものである。 該抗原による抗体の製造は、上記抗原を哺乳動
物に投与し、生体内に所望抗体を産生させ、これ
を採取することにより実施される。 抗体の製造に供せられる哺乳動物としては、特
に制限はないが、通常ウサギやモルモツトを用い
るのが好ましい。抗体の産生に当つては、上記に
より得られる抗原の所定量を生理食塩水で適当濃
度に希釈し、フロインドの補助液（Complete
Freund′s Adjuvant）と混合して懸濁液を調整
し、これを哺乳動物体投与すればよい。例えばウ
サギに上記懸濁液を皮内注射（抗原の量として
0.1〜５mg／回）し、以後２週間毎に２〜10ケ月、
好ましくは４〜６ケ月間投与し免疫化させればよ
い。抗原の採取は、上記懸濁液の最終投与の１〜
２週間経過後、免疫化された動物から採血し、こ
れを遠心分離後、血清を分離することにより行な
われる。上記によれば、用いる抗原に対して優れ
た特異性を有する抗体を収得でき、これはRIA
法、EIA法等に利用してヒト白血病ウイルス関連
蛋白の定量に用い得る。 以下本発明を更に詳しく説明するため、式(1)で
表わされる本発明ペプチドの製造例及びこれによ
り得られるペプチドからの抗原及び抗体の製造例
を挙げるが、本発明はこれらに限定されるもので
はない。 尚、各製造例におけるRf値はシリカゲル上の
薄層クロマトグラフイーにて下記混合溶媒を用い
て測定したものである。 Rf¹…ｎ−ブタノール−酢酸−水（４：１：５） Rf²…ｎ−ブタノール−ピリジン−酢酸−水 （30：20：６：24） 〈ペプチドの製法〉 製造例 １ カリウム tert−ブトキシドのDMSO溶液に
Boc−Leu−OHを溶解し、クロロメチル化ポ
リスチレン樹脂（財団法人蛋白質研究奨励会、
２％ジビニルベンゼン、メツシユ200〜400）を
加えて、80℃で30分間反応させ、樹脂を
DMSO、エタノール、50％酢酸、水、エタノ
ール及び塩化メチレンで順次充分に洗浄し、減
圧乾燥してBoc−Leu−樹脂（0.425ミリモル／
ｇ樹脂）を得る。 上記で得たBoc−Leu−樹脂をクロロホル
ムで洗浄後、50％トリフルオロ酢酸（TFA）
のクロロホルム溶液に加え、室温で20分間反応
させ、次に得られる樹脂をクロロホルム、塩化
メチレン及び10％トリエチルアミンの塩化メチ
レン溶液で充分に洗浄してＨ−Leu−樹脂を得
る（脱Boc化）。 かくして得られるＨ−Leu−樹脂２ｇに、
Boc−Ser（Bzl）−OH0.59ｇの塩化メチレン溶
液を加え、次いでDCC0.44ｇの塩化メチレン溶
液を加え、室温で２時間反応させ、樹脂を塩化
メチレンで洗浄後、これをBoc−Ser（Bzl）−
OH0.59ｇと１−ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル0.3ｇとの塩化メチレン溶液に加え、次いで
DCC0.44ｇの塩化メチレン溶液を加えて再度同
様に反応させる（二重カツプリング法）。樹脂
を塩化メチレンで充分に洗浄してBoc−Ser
（Bzl）−Leu−樹脂を得る。 上記と同様にして、Boc−Ser（Bzl）−Leu
−樹脂の脱Boc化を行ない、次いで下記アミノ
酸又はその誘導体を順次二重カツプリング反応
及び脱Boc反応させる。 Boc−Ser（Bzl）−OH 0.59ｇ Boc−Glu（OBzl）−OH 0.72ｇ Boc−Pro−OH 0.46ｇ Boc−Lys（Cl−Ｚ）−OH 0.95ｇ Boc−Ile−OH・１／2H₂O 0.51ｇ Boc−Leu−OH・H₂O 0.53ｇ Boc−Ser（Bzl）−OH 0.59ｇ Boc−Tyr（Cl₂−Ｚ）−OH 1.20ｇ かくしてBoc−Tyr（Cl₂−Ｚ）−Ser（Bzl）−Leu
−Ile−Lys（Cl−Ｚ）−Pro−Glu（OBzl）−Ser
（Bzl）−Ser（Bzl）−Leu−樹脂の3.27ｇを得る。 そのうち0.82ｇを弗化水素10ml及びアニソール
１mlと混合し、−20℃で30分間、次いで０℃で30
分間インキユベーシヨンした後、過剰の弗化水素
を減圧留去し、10％酢酸水溶液にて抽出し、エー
テルにて洗浄後、凍結乾燥する。次いでセフアデ
ツクスＧ−25（フアルマシア社、1M酢酸水溶液）
でゲル過し、更にHPLC（25％アセトニトリ
ル／0.05％三弗化酢酸、カラムODS−120T、4.6
mm×250mm、東洋曹達株式会社）を用いて精製し
て、目的ペプチド（Ｈ−Tyr−Ser−Leu−Ile−
Lys−Pro−Glu−Ser−Ser−Leu−OH）38mgを
得る。以下これを「ペプチドＡ」と呼ぶ。 Rf値： Rf¹＝0.13 Rf²＝0.52 アミノ酸分析値：（日立835型にて分析） 分析値 Ser(3) 2.91 Glu(1) 1.04 Ile(1) 0.96 Leu(2) 2.01 Tyr(1) 0.99 Lys(1) 1.09 Pro(1) 0.98 〈免疫抗原の製造〉 製造例 １ ペプチドの製造例１で得たペプチドＡの５mg
（5.995mmol）及びアスカーリス抽出蛋白10mgを、
0.13M塩化ナトリウムを含む0.16Mホウ酸緩衝液
（PH＝9.0）５mlに加え、この溶液にBDB溶液3.35
mgを加えて４℃で２時間攪拌する。上記BDB溶
液は0.2N塩酸20ml及びジメチルホルムアミド
（DMF）３mlの混合溶媒にベンジジン83.25mgを
加え、氷冷下に攪拌し、これに亜硫酸ナトリウム
87.03mgの蒸留水２ml溶液を徐々に加え、30分間
攪拌することにより調整した。その後反応混合物
を３日間蒸留水で４℃下に透析し、凍結乾燥し
て、免疫抗原87mgを得る。以下この抗原を「抗原
」と言う。抗原はアスカーリス１mgに対して
ペプチドＡが平均0.239μmol結合したものであ
る。 尚、このペプチドとアスカーリスとの結合率
は、得られる抗原を更にセフアデツクスＧ−50
（溶出液：生理食塩水、検出：OD280nm、流出速
度：３ml／時間、分取量：１mlづつ）でゲル濾過
した際、未反応のアスカーリス及びペプチドの存
在は認められないことより、該ゲル濾過によつて
アスカーリスに結合したペプチドのフラクシヨン
と他の生成体（ペプチド２量体）のフラクシヨン
とを分離し、ペプチド２量体の標準濃度の検量線
を作成して、上記２量体の量を求め、これを出発
原料として用いたペプチドの量から差し引いた値
がすべてアスカーリスに結合しているとして求め
たものである。 〈抗体の製造〉 製造例 １ 抗原の製造例１で得た抗原の100μｇを1.5ml
の生理食塩水に溶解後、これにフロインドの補助
液1.5mlを加えて調整した懸濁液を、２羽のウサ
ギ（New−Zealand white rabbits、2.5〜3.0Kg）
に下記免疫スケジユールに示す手順で、一回の抗
原接種量を100μｇ／bodyとして皮下投与し、11
週経過してのち試験動物から全採血し、これを遠
心分離して抗血清（ATLA抗体）を得る。得ら
れた抗体を各ウサギに対してそれぞれ「抗体
ａ」及び「抗体ｂ」とする。 〈免疫スケジユール〉 期間（週） 抗原接種 ０ 第１回接種 ２ 第２回接種 ４ 第３回接種 ６ 第４回接種 ８ 第５回接種 10 第６回接種 〈標識ペプチドの製造〉 ペプチドの製造例１で得たペプチドＡをクロ
ラミンＴを用いる方法で以下の通り標識化す
る。 即ち上記ペプチド5μｇの0.5モルリン酸塩緩衝
液（PH7.5）10μにNa〔¹²⁵〕（carrier free N.
E.N.）１ミリキユーリーの0.5モルリン酸塩緩衝
液20μを加え、つぎにクロマミンT20μの0.5
モルリン酸緩衝液20μを加える。室温で25秒間
攪拌してメタ重亜硫酸ナトリウム（Na₂S₂O₅）
100μｇの0.5Mリン酸塩緩衝液20μを加えること
で反応を終わらせる。次いで反応液に10％の冷沃
化ナトリウム水溶液10μを加え、反応混合物を
セフアデツクスＧ−25のカラム（1.0〜50cm、溶
出液0.1％BSA及び0.01％NAN₃を含む0.2モル酢
酸アンモニム緩衝液、PH5.5）で精製して¹²⁵で
標識されたペプチドＡを得る。 Γ 力価の測定 上記で得られる抗体の力価を次の通り測定す
る。即ち本体をそれぞれ生理食塩水で10，10²，
10³，10⁴，10⁵………倍に希釈し、これらのそれ
ぞれ100μに、¹²⁵標識ペプチド（上記で得られ
る標識ペプチドを約9500cpmになるように希釈し
たもの）0.1ml及び0.05モルリン酸塩緩衝液（PH
＝7.4）〔0.25％BSA、10mM EDTA及び0.02％
NaN₃を含む〕0.2mlを加え、４℃で24時間インキ
ユベートし、生成した抗体と¹²⁵標識抗原との
結合体を、デキストラン−活性炭法及び遠心分離
法（４℃、30分間、3000rpm）により未反応（結
合しない）¹²⁵標識ペプチドから分離し、その放
射線をカウントし、各希釈濃度における抗体の
¹²⁵標識ペプチドとの結合率（％）を測定する。
縦軸に抗体の¹²⁵標識ペプチドとの結合率（％）
及び横軸に抗体の希釈倍率をとり、各々の濃度に
おいて結合率をプロツトする。結合が30％及び50
％となる抗体の希釈倍率即ち抗体の力価を求め
る。前記抗体の製造例１で得た抗体ａ及び抗体
ｂに関して得られた結果を下記第２表に示す。 第 ２ 表 50％結合率 30％結合率 抗体ａ 1840 4040 抗体ｂ 1480 3200

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式 Ｈ−Tyr−Ser−Leu−Ile−Lys−Pro−Glu−
   Ser−Ser−Leu−OH で表わされるペプチドであるヒト白血球ウイルス
   関連ペプチド。