JPS6028993A - ヒト白血病ウイルス関連ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト白血病ウィルス（ＡｄｕｌｔＴ−ｃｅｌ
ｌ　Ｌｅｕｋｅａ＋ｉａ　Ｖｉｒｕｓ：　ＡＴＬＶ又は
ＨｕｍａｎＴ−ｃｅｌｌ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕ
ｓ：ＨＴＬＶ）に関連する新規なペプチドであり、かか
るウィルス感染ならびに成人Ｔ１Ｂ胞白白病、皮膚型Ｔ
ｌ１ｌ胞リンパ腫などの成熟Ｔ細胞白血病・リンパ腫に
関連するペプチドに関する。

本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護基、活性
基、核酸塩基、その他に関して略号で表示する場合はＩ
ＵＰ−ＡＣ，ＩＬＪＢの規定或いは当該分野における慣
用記号に従うものとし、その例を次に挙げる。またアミ
ノ酸等に関して光学異性体がありうる場合は、特に明記
しなければＬ体を示すものとする。

Ｓｅｒ　；セリン　１−ｅｕ；ロイシンＴｈｒ：スレオ
ニン　ＡＳｎ；アスパラギンＱｌｎ；グルタミン　Ｇｌ
ｕ：グルタミン酸ＬＩＳ：リジン　ｐｒｏ；プＯｊＪン Ｔ　Ｖｒ　：チロシン　Ｔｒｐ：）−リプトファンＨｌ
ｓ：ヒスチジン　Ａｓｐ；アスパラギン酸ＧＩＶニゲリ
シン　Ｉｌｅ：イソロイシンＡｌａ；アラニン　Ｐｈｅ
；フェニルアラニンＡ　ｒＱ　；アルギニン− ＴＯ３：Ｄ−ｔ”ルエンスルホニル基 ＢＯＣ：第３級ブトキシカルボニル基 ＯＮＰ；ｐ−ニトロフェノキシ基 ３ｚｌ　；ベンジル基 ０Ｂｚｌ；ベンジルオキシ基 Ｃｌ　２　Ｂｚｌ；　２，６〜ジクロルベンジル基ＣＩ
−Ｚ：２−クロルベンジルオキシカルボニルヒト白血病
ウィルスは、成人Ｔ細胞白血病（、ＡＴＬ）より分離さ
れ、該疾患との関連が注目されているウィルスである。

本発明者の吉田、菅野は、遺伝子工学的手法をもらい、
宿主絹゛胞のＤＮＡに組込まれたプロウィルス遺伝子を
クローニング（ｃｌｏｎｉｎｇ　）　Ｌ／、その全塩基
配列を決定した。これに基づいて該疾患ならびに該ウィ
ルス感染の診断・治療・予防の基礎を確立した。本発明
は、上記の基礎的な情報を基にし完成されたものであり
、該ウィルス感染の診断を目的としたウィルス関連ペプ
チドに関し、またそれ等に対する特異抗体の作製と測定
法を提供する。決定された上記ウィルス遺伝子の外殻（
エンフ）蛋白前駆体をコードする塩基配列は知られてお
り（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ　、　Ａｃａｄ　、　Ｓｃｉ．　、　ＵＳＡ．
　８０＜　１　９８３）　、Ｂｊｏｃｈｅｉｉｓｔｒｙ
　、　Ｄ　３６２　１　）、該外殻蛋白前駆体は、４８
８個のアミノ酸から成る。

本発明者等は、上記ヒト白血病ウィルスの関連蛋白（外
殻蛋白）のハプテンとなり得る特定のペプチドを見い出
し、ここに本発明を完成するに至った。

即ち本発明は式 ％式％ （１） で表わされるペプチド、式 Ｈ　−　Ｐ　ｒｏ−　Ａ　ｓｎ−　Ａ　ｒｏ　−　Ａ　
ｓｎ−　Ｇ　Ｉｙ　−　Ｇ　Ｉｙ　−　Ｇ　Ｉｙ−Ｔｙ
ｒ−ＯＨ　（２） で表わされるペプチド、式 ％式％ （３） で表わされるペプチド、式 Ｈ−Ｇｌｙ　−　Ｌｅｕ−Ａｓｐ　−　Ｌｅｕ　−　ｃ
ｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−　Ｇ　ｌｕ−　Ｇ　Ｉｎ−　Ｇ
　Ｉｙ　−　Ｇ　ｌｙ　−　Ｌ　ｅｕ−　Ｔ　ｖｒ−Ｏ
　Ｈ（４） で表わされるペプチド及び式 ％式％ （５） で表わされるペプチドからなる群より選ばれたヒト白血
病ウィルス関連ペプチドに係る。

本発明の上記式（１）〜（５）で表わされるペプチドは
、いずれも入手容易な市販のアミノ酸を利用して、簡申
な操作で容易に合成することができ、各ペプチドからは
、これらをハプテンとして用いて抗原を作成でき、かく
して得られる抗原からはウィルス関連蛋白に特異反応性
を有する抗体を収得することができる。該特異抗体はこ
れを例えばアフィニティークロマトグラフィー用担体と
結合させて、該りＯマドグラフに利用する等によりウィ
ルス関連蛋白の精製に用いることができ、また該ウィル
ス関連蛋白の各種免疫測定法におけ、る特異抗体として
使用でき、ヒト白血病ウィルス感染の診断、ひいては、
成人下細胞白血病、皮膚型Ｔ細胞リンパ腫等の成熟Ｔ細
胞白面病・リンパ腫ならびに関連する疾患の診断、研究
等に有用である。

本発朔の式（１）〜（５）で表わされるペプチドは、通
常のペプチド合成法、具体的には「ザペプチド（Ｔｈｅ
　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　）　Ｊ第１巻（１９６６年）　（
　３ｃｈｒｏｄｅｒ　ａｎｄ　Ｌｕｈｋｅ著、Ａ　ｃａ
ｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ，　Ｎ　ｅｗ　Ｙ　ｏｒｋ．　
Ｕ　Ｓ　Ａ　）或いは「ペプチド合成」　（東屋ら著、
丸善株式会社（１９７５年）〕に記載される如き方法に
従い、例えばアジド法、クロライド法、酸無水物法、混
酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法（ｐ−ニトロフ
ェニルエステル法、Ｎ−ヒドロキシコへり酸イミドエス
テル法、シアノメチルエステル法等）、ウッドワード試
薬Ｋを用いる方法、カルボジイミダゾール法、酸化還元
法、Ｄｃｃ／アディティブ（ＨＯＮＢ、ＨＯＢｔ　、Ｈ
Ｏ３ｕ　）法等により製造できる。上記方法においては
、同相合成法及び液相合成法のいずれをも適用できる。

通常本発明のペプチドは、上記した一般のポリペプチド
の合成法に従い、例えば末端アミノ酸に順次１個づつア
ミノ酸を縮合させる所謂ステップワイズ法により、又は
数個のフラグメントに分けてカップリングさせていく方
法により製造される。より詳細には、例えば同相合成法
を採用する場合、Ｃ末端アミノ酸をそのカルボキシル基
によって、不溶性担体に結合させる。不溶性担体として
は、反応性カルボキシル基と結合性を有するものであれ
ば特に限定はなく、例えばクロロメチル樹脂、ブロモメ
チル樹脂等のハロゲノメチル樹脂やヒドロキシメチル樹
脂、フェノール樹脂、ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボ
ニルヒドラジド化樹脂等を使用できる。

次いでアミノ保護基を除去した後、式（１）〜（５）で
表わされるアミノ酸配列に従い順次アミノ基保護アミノ
酸を、その反応性アミノ基及び反応性カルボキシル基と
の綜合反応により結合させ、一段階ずつ合成し、全配列
を合成した後、ペプチドを不溶性担体からはずすことに
より製造される。

上記におイＴＡｒＯ，Ｔｙｒ、　Ｇｌｕ、　Ｇｌｎ、　
Ｔｈｒ。

ＬｙＳ、ＡＳｌｌ及びＳｅｒの各アミノ酸は、その側鎖
官能基を保護しておくのが好ましく、これは通常の保護
基により保護され、反応終了後該保護基は脱離される。

また反応に関与する官能基は、通常活性化される。これ
ら各反応方法は、公知であり、それらに用いられる試薬
等も公知のものから適宜選択される。

アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカル
ボニル、Ｂｏａｌｔｅｒｔ−アミルオキシカルボニル、
イソボルニルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジル
オキシカルボニル、Ｃ１−Ｚ、アダマンチルオキシカル
ボニル チル、フタリル、ホルミル、０−ニトロフェニルスルフ
ェニル、ジフェニルホスフィノチオイル基等が挙げられ
る。

Ａｒｉｌｌの保護基としては、Ｔｏｓ，ニトロ、ベンジ
ルオキシカルボニル、アミルオキシカルボニル基等が挙
げられる。

３ｅｒ及びＴｈｒの水酸基の保護基としては、例えば、
Ｂｚｌ、ｔｅｒｔ−ブチル、アセチル、テトラヒドロピ
ラニル基等が挙げられる。

Ｔｙｒの水酸基の保護基としては、例えばＢｚｌ、ＣＩ
２　ＢＺＩ，ベンジルオキシカルボニル、アセチル、Ｔ
ｏｓ基等が挙げられる。

ＬＶＳの７ミノ基の保護基としては、例えばベンジルオ
キシカルボニル、ＣＩ　Ｚ−ＣＩ２　ＢＺＩ、Ｂｏａ，
Ｔｏｓ基等が挙げられる。

Ｑｌｕ及びＡＳｌｌのカルボキシル基の保護基としては
、例えばベンジルアルコール、メタノール、エタノール
、ｔｅｒｔ−ブタノール等とのエステル化により行なわ
れる。

カルポーキシル基の活性化されたものとしては、例えば
対応する酸クロライド、酸無水物又は混合酸無水物、ア
ジド、活性エステル（ペンタフ００フエノール、ｐ−ニ
トロフェノール、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド、Ｎ−
ヒドロキシベンズトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ−５−
ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド等とのエス
テル）等が挙げられる。尚ペプチド結合形成反応は、縮
合剤例えばジシクロへキシルカルボジイミド、カルボジ
イミダゾール等のカルボジイミド試薬やテトラエチルピ
ロホスフィン等の存在下に実施し得る場合もある。

以下、本発明ペプチドの製造法につき上記式（５）のペ
プチドを例にとり反応行程式を挙げて具体的に説明する
。

〔反応行程式−１〕 Ａ−Ｌｅｕ−ＯＨ（イ） ↓ Ａ−Ｌｅｕ−Ｒ’　（ｏ） ↓ Ｈ−Ｌｅｕ−Ｒ’　（ハ） ↓　Ａ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）　−ＯＨ　（二）Ａ−Ｓｅｔ
（Ｂｚｌ）　−Ｌｅｕ−Ｒ＋　（ホ）１１ ↓　↓　↓ Ａ−Ｔｙｒ（Ｃｌ　２−Ｚ）−８ｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｌｅ
ｕ−１１ｅ−Ｌｙｓ（ＣＩ　−Ｚ）　−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ
（ＯＢｚｌ）−８ｅｒ（Ｂｚｌ）−８ｅｒ（Ｂｚｌ）−
１ｅｕ−Ｒ１（へ） ↓ Ｈ−Ｔｙｒ−８ｅ’ｒ−Ｌｅｕ　−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｕ−８ｅｒ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−ＯＨ（５）〔
式中Ａはアミノ基の保護基及びＲ１は不溶性担体を示す
。〕 上記において、Ａの好ましいものとしてはＢｏｃ、ベン
ジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジルオキシ
カルボニル基等を、またＲ１の好ましいものとしてはク
ロロメチル化ポリスチレン等をそれぞれ例示することが
できる。

また、各反応において、使用するアミノ酸が反応に関与
しない側鎖官能基を有する場合は、常法通り、前述した
保護基により保護され、これは不溶性担体Ｒ１のｆｌ１
２＠と同時に脱離される。

上記方法において、アミノ酸（イ）と不溶性担体Ｒ１と
の反応は、常法に従いアミノ酸（イ）の反応性カルボキ
シル基を利用して、これをＲ１と結合させることによっ
て行なわれる。該反応Ｉよ例えばクロロメチル化ポリス
チレンを使用する場合は適当な溶媒中、例えばトリエチ
ルアミン、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、炭酸セシウ
ム、水酸化セシウム等の塩基性化合物の存在下に行なわ
れる。

溶媒としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ピリジン、クロ
ロホルム、ジオキサン、ジクロロメタン、テトラヒドロ
フラン、Ｎ−メチルビｐ−ｔノドン、ヘキサメチルリン
酸トリアミド等又はこれらの混合溶媒等を例示すること
ができる。上記反応は、通常Ｏ〜８５℃、好ましくは２
５〜８０℃程度、数分〜２４時間程度で終了する。アミ
ノ酸と不溶性担体との使用割合は通常後者１当量に対し
て前者を過剰量、一般に１〜３倍当量とするのがよい。

かくして得られる一般式（ロ）の同相化アミノ酸の保護
基への説１１反応は、常法により行なわれる。該方法と
しては例えばパラジウム、パラジウム黒等の触媒を用い
る水素添加、液体アンモニア中金属ナトリウムによる還
元等の還元的方法、トリフルオロ酢酸、塩化水素酸、弗
化水素、メタンスルホン酸、臭化水素酸等の強酸による
アシドリシス等を例示することができる。上記触媒を用
いる水素添加は、例えば水素圧１気圧、０〜４０℃にて
行ない得る。触媒の使用量としては通常１００１１１〜
１ｇ程度とするのがよく、一般に１〜４８時間程度で反
応は終了する。また上記アシドリシスは、無溶媒下、通
常Ｏ〜３０℃程度、好ましくはＯ〜２０℃程度で約１５
分〜１時間程度を要して行なわれる。酸の使用量は原料
化合物に対し通常５〜１０倍量程度とするのがよい。該
アシドリシスにおいて保護基Ａのみを脱離する場合は酸
としてトリフルオロ酢酸又は塩化水素酸を使用するのが
剪ましい。更に上記液体アンモニア中金属ナトリウムに
よる還元は、反応液がパーマネントブルーに３０秒〜１
０分間程度呈色しているよ一７０℃程度にて行ない得る
。

次いで得られる一般式（ハ）の固相化アミノ酸とアミノ
酸（ニ）（もしくはそのカルボキシル基の活性化された
もの）との反応は、溶媒の存在下に行なわれる。該溶媒
としては、ペプチド綜合反応に慣用される公知の各種の
もの、例えば無水ジメチルホルムアミド、ジメチルスル
ホキシド、とリジン、クロロホルム、ジオキサン、ジク
ロロメタン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、Ｎ−メ
チルビＯリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミド或いは
これらの混合溶媒等を例示することができる。また該反
応は、必要に応じて、通常のペプチド結合形成反応に用
いられる試薬、・例えばＮ　、Ｎ−ジシクロへキシルカ
ルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−エチル−Ｎ′−ジメチル
アミノカルボジイミド、１−エチル−３−ジイソプロピ
ルアミノカルポジイミド、１−シクロヘキシル−３−（
２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド等のカ
ルボジイミド類等の脱水縮合剤の存在下に行なうことが
できる。アミノｌ（ハ）とアミノ酸に）との使用割合と
しては、特に限定はないが、通常前者に対して後者を等
モル量〜１０倍モル量、好ましくは等モル９〜５倍モル
量とするのがよい。

脱水縮合剤の使用量も特に限定はなく、通常アミノ酸（
ニ）に対して、好ましくは等モル母程度使用される。反
応温度はペプチド結合形成反応に使用される通常の範囲
、一般には約−４０℃〜約６０℃、好ましくは約−２０
℃〜約４０℃の範囲から適宜選択される。反応時間は一
般に数分〜３０ｖｆ間程度とされる。

かくして得られる一般式（ホ）のペプチドは、上記と同
様に保護基Ａの脱離後、式（５）で表わされるアミノ酸
配列に従い、Ａ　−Ｓ　ｅｒ−ＯＨ５Ａ−Ｇｌｕ−ＯＨ
，Ａ−Ｐｒｏ−０）１．　Ａ−Ｌｙｓ−ＯＨ１Ａ−ｌ１
ｅ−ＯＨ，Ａ−Ｌｅｕ−Ｏｆ−１１Ａ−８ｅｒ−ＯＨ，
Ａ−Ｔｙｒ−ＯＨの各アミノ酸もしくは側鎖官能基を保
護されたもの乃至そのカルボキシ基を活性化されたもの
と順次縮合反応させることにより行なわれ、かくして一
般式（へ）で表わされるペプチドに誘導することができ
る。これら縮合反応及び保護基ＡのＩＩＲＩＩＩＩ反応
は、それぞれ前記した方法と同様にして行なわれる。

また得られるペプチド（へ）は、同様にして保護基Ａの
脱離、アミノ酸の側鎖官能基の保護基の脱離及び不溶性
担体Ｒ１の脱離により、式（５）で表わされるペプチド
に誘導される。ここで側鎖官能基の保護基及び不溶性担
体Ｒ１の脱離反応は、保護基Ａの脱離反応と同様に行な
い得、この場合酸として弗化水素又は臭化水素酸を用い
るのが好ましい。尚、上記方法において使用される各ア
ミノ酸は、いずれも公知の市販品でよい。

以上のようにして製造された式（５）の本発明ペプチド
は、反応混合物からペプチドの分離手段例えば抽出、分
配、カラムクロマトグラフィー等により単離精製される
。

また、一般式（１）乃至（４）で表わされる各ペプチド
も、上記に準じて製造される。

かくして得られる本発明のペプチドは、これに１２５１
．１３１　１等の放射性物質、パーオキシダーゼ（ＰＯ
Ｘ）、キモトリプシノーゲン、プロカルボキシペプチダ
ーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ア
ミラーゼ、ボスポリラーゼ、Ｄ−Ｎａｓｅ　１Ｐ−Ｎａ
ｓｅ　、　Ｂ−ｊｊう’ｙトシダーゼ、グルコース−６
−７オスフエートデハイドロゲナーゼ、オルニチンデカ
ルボキシラーゼ等の各種酵素試薬等を導入することによ
り、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）ｌ又はエンザイム
イムノアッセイ（ＥＩＡ＞法において用いられる標識抗
原として利用できる。上記放射性物質の導入は、通常の
方法により実施できる。例えば放射性ヨードは、り０ラ
ミンＴを用いる酸化的ヨード化法（Ｗ、　Ｍ、　）ｌｕ
ｎｔｅｒ　ａｎｄ　Ｆ、　Ｃ，Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ：Ｎ
ａｔｕｒｅ、１９４　．４９５　（１９６２）　、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍＪ、８９　．１４４　、（１９６３）参照〕
等により行なわれ、酵素試薬の導入は、通常のカップリ
ング法例えばエルランガー（Ｂ、　Ｆ、　Ｅｒｌａｎｇ
ｅｒ　）らの方法−（Ａ　ｃｔａ、　Ｅ　ｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌ、ｓ　ｕｐｐｌ、、　１６８　。

２０６　（１９７２））及びカ０−ル（Ｍ、Ｈ。

Ｋａｒｏｌ）らの方法（Ｐ　ｒｏｃ、Ｎ　ａｔｌ、Ａ　
ｃａｄ、ｓ　ｃｉ、。

ＵＳＡ、、５７　．７１３　（１９６７））等の公知の
方法によって行なうことができる。

以下、本発明のペプチドをハプテンとして利用した抗原
の製造方法につき詳述する。

上記抗原は本発明ペプチドをハプテンとし、これをハプ
テン−担体結合試薬の存在下に、適当な担体と反応させ
ることにより製造される。上記においてハプテンに結合
される担体としては、通常抗原の作成に当り慣用される
高分子の天然もしくは合成の蛋白質を広く使用できる。

該担体としては例えば馬血清アルブミン、牛血清アルブ
ミン、ウサギ血清アルブミン、人血清アルブミン、ヒツ
ジ血清アルブミン等の動物の血清アルブミン類；馬血清
グロブリン、牛血清グロブリン、ウサギ自涜グロブリン
、人血清グロブリン、ヒツジ血清グロブリン等の動物の
血清グロブリン類：馬チログロブリン、牛チログロブリ
ン、ウサギチログ０プリン、人チログロブリン、ヒツジ
チログロブリン等の動物のチログロブリン類：馬ヘモグ
ロブリン、牛ヘモグロブリン、ウサギヘモグ０プリン、
人ヘモグ０プリン、ヒツジヘモグロブリン等の動物のヘ
モグロブリン類：キーホールリンペットヘモシアニン（
ＫＬＨ）等の動物のヘモシアニン類二回虫より抽出され
た蛋白質（アスカ−リス抽出物、特開昭５６−１６４１
４号公報、Ｊ　、Ｉｍｍｕｎ、。

１１１　．２６０〜２６８　（１９７３）、Ｊ。

Ｉａｓｕｎ、、１２２　．３０２〜３０８　（１９７９
）　、Ｊ　、　Ｉ　ｕｕｎ、、９−β−，８９３〜９０
０　（１９６７）及びＡｍ、Ｊ、　Ｐｈｙｓｌｏｌ、、
１９９．５７５〜５７８（１９６０）に記載されたもの
又はこれらを更に精製したもの）：ポリリジン、ポリグ
ルタミン酸、リジン−グルタミン酸共重合体、リジン又
はオルニチンを含む共重合体等を挙げることができる。

ハプテン−担体結合試薬としては、通常抗原の作成に当
り慣用されているものを広く使用できる。

具体的にはチロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架
橋結合させる、例えばビスジアゾタイズドベンジジーン
（ＢＤＢ）、ビスジアゾタイズド−３゜３′−ジアニシ
ジン（ＢＤＤ）等のジアゾニウム化合物；アミノ基とア
ミノ基とを架橋結合させる、例えばグリオキサール、マ
ロンジアルデヒド、ゲルタールアルデヒド、スクシンア
ルデヒド、アジボアルデヒド等の脂肪族ジアルデヒド類
：チオール基とチオール基とを架橋結合させる、例えば
ＮＮｌ　、−フェニレンジマレイミド、Ｎ　、Ｎ’−ｍ
−フェニレンジマレイミド等のシマレイミド化合物二ア
ミノ基とチオール基とを架橋結合させる、例えばメタマ
レイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル、４−（マレイミドメチル）−シフ０ヘキサンー
１−カルボキシル−Ｎ’　−ヒドロキシスクシンイミド
エステル等のマレイミドカルボキシル− ンイミドエステル類二アミノ基とカルボキシル基とをア
ミド結合させる通常のペプチド結合形成反応に用いられ
る試薬、例えばＮ　、Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド チルアミノカルボジイミド イソプロピルアミノカルボジイミド ヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カル
ボジイミド等のカルボジイミド類等の脱水縮合剤等を挙
げることができる。また上記ハプテン−担体結合試薬と
しては、ｐ−ジアゾニウムフェニル酢酸等のジアゾニウ
ムアリールカルボン酸類と通常のペプチド結合形成反応
試薬、例えば上記脱水縮合剤とを組合せたものも使用可
能である。

上記抗原の製造反応は、例えば水溶液もしくはＤＨ７〜
１０の通常の緩衝液中、好ましくはＥｌｆ−１８〜９の
緩衝液中、０〜４０’Ｃ、好ましくは室温付近で行なわ
れる。該反応は通常約１〜２４時間、好ましくは３〜ｓ
ＦＲ間で完結する。上記において用いられる代表的緩衝
液としては、次のものを例示できる。

０、２Ｎ水酸化ナトリウム−０．２Ｍホウ酸−０．２Ｍ
塩化カリウム緩衝液、 ０、２Ｍ．＃２！ナトＩＪー’７ムー０．２Ｍ＊’７ｆ
ｌ−０、２Ｍ塩化カリウム緩衝液、 ０、０５Ｍ四ホウ酸ナトリウムー０．２’Ｍホウ酸−６
．−ｏｓＭ塩化ナトリウム緩衝液、０、１Ｍリン酸二水
素カリウム−０．０５Ｍ四つ酸ナトリウム緩衝液 上記においてハプテン、ハプテン−担体結合試薬及び担
体の使用割合は、適宜に決定できるが、通常ハプテンに
対して担体を１〜６倍重量程度、好ましくは１〜５倍重
量程度、及びハプテン−担体結合試薬を５〜１０倍モル
程度用いるのがよい。

上記反応によりハプテン−担体結合試薬を仲介させて担
体とハプテンとが結合したペプチド−担体複合体からな
る所望の抗原が収得される。

反応終了後行られる抗原は常法に従い、例えば透析法、
ゲルか適法、分別沈澱法等により容易に単離精製できる
。

かくして得られる抗原は、通常蛋白質１モルに対してペ
プチドが平均５〜６０モル結合したものであり、いずれ
も引き続き該抗原に対して特異性の高い抗体の製造を可
能とするものである。

該抗原による抗体の製造は、上記抗原を哺乳動物に投与
し、生体内に所望抗体を産生させ、これを採取すること
により実施される。

抗体の製造に供せられる哺乳動物としては、特に制限は
ないが、通常ウサギやモルモットを用いるのが好ましい
。抗体の産生に当っては、上記により得られる抗原の所
定量を生理食塩水で適当濃度に希釈し、フロイントの補
助液（ＣｏｍｐｌｅｔｅＦｒｅｕｎｄ　’　ｓ　Ａｄｊ
ｕｖａｎｔ　）と混合して懸濁液を調整し、これを哺乳
動物体に投与すればよい。例えばウサギに上記懸８１１
１１を皮肉注射（抗原の山としてｏ、ｉ〜５　ｌａ／回
）し、以後２週間毎に２〜１０ケ月、好ましくは４〜６
ケ月間投与し免疫化させればよい。抗体の採取は、上記
懸濁液の最終投与の１〜２３１１間経過後、免疫化され
た動物から採血し、これを遠心分離後、血清を分離する
ことにより行なわれる。上記によれば、用いる抗原に対
して優れた特異性を有する抗体を収得でき、これはＲＩ
Ａ法、ＥＴＡ法等に利用してヒト自白病ウィルス関連蛋
白の定量に用い得る。

以下本発明を更に詳しく説明するため、式（１）乃至（
５）で表わされる本発明ペプチドの製造例及びこれによ
り得られるペプチドからの抗原及び抗体の製造例を挙げ
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。

尚、各製造例におけるＲｆｉｍはシリカゲル上のＩＩ！
クロマトグラフィーにて下記混合ｍ＊を用いて測定した
ものである。

Ｒｒ’−ｎ−ブタノール−酢酸−水（４：１：５）Ｒｆ
２・・・ｎ−ブタノール−ピリジン−酢酸−水（３０：
２０：６：２４） 〈ペプチドの製造〉 製造例　１ ■　カリウム　ｔｅｒｔ−ブトキシド４７１ミリ当量の
ＤＭＳＯ溶液３６．７１１ｆｌにＢｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＩ
　−Ｚ）−０Ｈの７．９２１１１を溶解し、り００メチ
ル化ポリスチレン樹脂＜ＶＳ団法人蛋白質研究奨励会、
２％ジビニルベンゼン、メツシュ２００〜４００）１４
．４６０を加えて、８０℃で３０分間反応させる。樹脂
をＤＭＳＯ、エタノール、５０％酢酸、水、エタノール
及び塩化メチレンの順に、充分に洗浄し、減圧乾燥して
１６．０ｉｌｌのＢｏｃ−［ｙｓ（ＣＩ−Ｚ）−樹脂を
得る。

一部を加水分解後アミノ酸分析を行なった結果アミノ酸
０．２７２１１１ｏ１１０樹脂であツタ。

■　上記■で得たＢｏａ−Ｌｙｓ（ＣＩ−Ｚ）−樹脂３
．０ｇをクロロホルム３０Ｉｌｌ１２で３回洗浄後、５
０％トリフルオロ酢ＩＩＩ（ＴＦＡ）のクロロホルム溶
液３０−に加え、室温で２０分間反応させる。

樹脂をクロロホルム３０１１ｆｌで１回、塩化メチレン
３０ｍ１２で５回、１０％トリエチルアミンの塩化メチ
レン溶液３０−で３回、次いで塩化メチレン３０１ｆｌ
ｒｅ回それぞれ洗浄してＨ−Ｌｙｓ（ＣＩ−２）−樹脂
を得る。

Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）　−ＯＨの０．６３ＣＩを塩
化メチレンに溶かした溶液２５ＩＩｌ１２を上記Ｈ−Ｌ
ｙｓ（ＣＩ−Ｚ）−ｔＭＮに加え、次いでＤｃｃの０．
４２０を塩化メチレンに溶がした溶液５ｍＧを加え室温
で２時間反応させる。樹脂を塩化メチレン３０７２で６
回洗浄後、Ｂｏａ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）　−ＯＨの０．６
３０及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾールｏ、３ｉａ
の塩化メチレン２５−に加え、次いでＤ℃Ｃの　０．４
２０を塩化メチレンに溶かした溶液５ＩＩＩＩ２を加え
て再度同様に反応させるに１カツプリング法）。樹脂を
塩化メチレンで充分に洗浄してＢｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ
）　−Ｌｙｓ、（Ｃｌ−２＞−樹脂を得る。

■　上記■と同様にして、Ｂｏａ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）　
−Ｌｙｓ（ＣＩ−Ｚ）−樹脂（７）Ｉｔ２　Ｂ　ｏｃ化
ｔ−行す＆Ｎ、次いで下記アミノ酸、側鎖官能基保護ア
ミノ酸又はカルボキシル基の活性化されたアミノ酸を順
次縮合及び脱１３ｏｃ反応に付す。

Ｂｏａ−Ｔｒｉ）−ＯＨ０，６２Ｑ Ｂｏａ−Ｈｉｓ−ＯＨＯ，Ｂ４Ｑ Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ０，４４１Ｊ Ｂｏａ−Ｐｈｅ−ＯＨ０，５４Ｑ Ｂｏａ　−Ｌｅｕ−ＯＨ−Ｈ２Ｏ０，，５１ｇＢｏａ−
Ｔｙｒ（Ｃｌ　２　Ｂｚｌ）　−０ＨＯ，９６０ Ｂｏａ　−Ｌｅｕ−ＯＨ”　Ｈ２００，５１０Ｂｏｃ−
３ｅｒ（Ｂｚｌ）　−ＯＨＯ，５７０Ｂｏａ−Ｔｙｒ（
Ｃｌ　２　Ｂｚｌ）　−０Ｈ０，９６＜１ かくしてＨ−Ｔｙｒ（Ｃｌ　２−ＢＺＩ）　−８ｅｒ（
Ｂｚｌ）　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ（Ｃ１１！　−３ｚｌ）−Ｌ
ｅｕ　−Ｐｈｅ　−Ｐｒｏ　−Ｈｉｓ　−Ｔｒｐ　−Ｔ
ｈｒ　（Ｂｚｌ）　−Ｌｙｓ＜ＣＩ−Ｚ）樹脂の５．２
ｏ＠得る。このうち１．３０＋＋をアニソール１．５−
１１，２−エタンジチオール０．７５ＷｔＩ及び弗化水
素１５−に溶かし、−２０℃で３０分間、次いで０℃で
３０分間インキュベーションさせた後、過剰の弗化水素
を減圧留去し、残渣を１０％酢酸にて抽出し、エーテル
にて洗浄する。水層を凍結乾燥し、次いでセファデック
スＧ−２５（ファルマシア社、溶出液５０％酢酸）によ
るゲルか過、更にセファデックスＬＨ−２０（ファルマ
シア社製、１ｍＭＨＣｌ！　）で２回分離を行なって１
ｉ製して目的ペプチド５８■ｇを得る。以下このペプチ
ドを「ペプチドＡ」と呼ぶ。

Ｒｆ値： Ｒ，ｆｌ−０，０３Ｒｆ２−０．５８ アミノ酸分析値：（日立８３５型にて分析）分析値 Ｔｈｒ（１）　０．９６ Ｓｅｒ（１）　０．９４ Ｌｅｕ（２）　２．０３ １ｒ（２）　２．１１ Ｐｈｅ（１）　１．０２ Ｔｒｐ（１）　０．９３ Ｌｙｓ（１）　１．０２ Ｈｉｓ（１）　１．０１ Ｐｒｏ（１）　０．９７ 尚上記アミノ酸分析値は、６Ｎ−塩酸による加水分解後
に測定した結果であり、以下の各側においても同様であ
る。従って各側で得られるペプチド中にＡｓｎ及びＧｌ
ｎが存在する場合、之等は夫々Ａｓｐ及びＧｌｕとして
定箔される。

製造例　２ 製造例１の■と同様にして得たＢ、ｏｃ−Ｔｙｒ（ＣＩ
　２−’；ｌ）−樹脂（０，２９４１１１１０１１０樹
脂）３ｇに、製造例１の■と同様にして、以下の各アミ
ノ酸又はその誘導体を順次綜合及び脱Ｂｏｃ化反応させ
る。

Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ０，３９゜ Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ０，３９０ Ｂｏａ−Ｇｌｙ−ＯＨ０，３９ａ Ｂｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｏｓ）−ＯＨ０，７８すＢｏａ−Ａ
ｒｅ（Ｔｏｓ）−ＯＨ０，９５゜Ｂｏａ−Ａｓｎ（Ｔｏ
ｓ）−ＯＨ０，７８ａＢｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ０，４８（
１ かくして、Ｈ−ＰｒＯ−Ａ８ｎ（ＴＯ３）−Ａｒ！Ｊ（
Ｔｏｓ）−Ａｓｎ（Ｔｏｓ）　−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−ＴＶｒ（Ｃ１２Ｚ）−樹脂３．１４ａ　ｌ！る。こ
のうち１．０ｇを弗化水素１〇四及びアニソールＩｗｌ
ｌと混合し、−２０℃で３０分間、次いで０℃で３０分
間インキュベーションした後、過剰の弗化水素を減圧留
去して１０％酢酸にて抽出し、エーテル洗浄を経て、凍
結乾燥する。

次いでセファデックスＧ−２５（ファルマシア社、溶出
液１Ｍ酢酸）によるゲル濾過、さらにＨＰＬＣ（１０％
アセトニトリル１０．０５％三弗化酢酸、流速１．０Ｉ
ＩＱ／分、０ＤＳ１２０Ｔ。

４　、６　ｘ−２５０ｇｍ、東洋曹達株式会社）によっ
て精製して、目的ペプチド３６１Ｂｉ１１を得る。以下
このペプチドを「ペプチドＢ」と呼ぶ。

Ｒｆ値： Ｒｆｌ＝０．０１　Ｒｆ２−０．２６ アミノ酸分析値＝（日立８３５型にて分析）分析値 Ｐｒｏ（１）　０．９８ ＡＳｔｌ（２）　１．８９ Ａｒｏ（１）　１．０４ Ｇｌｙ（３）　３．１０ ＴＶｒ（１）　０．９９ 製造例　３ 製造例１の■と同様にして３ｏｃ−Ａｒａ（Ｔｏｓ）−
樹脂の０．０７５ｍｍｏｌ／ｇ樹脂ヲ製３！ｌ、ソノ５
ｇに、前記製造例１の■及び■と同様にして、以下のア
ミノ酸又はその誘導体を順次二重カップリング反応及び
ｆ１１２ＢＯＣ化反応させる。

Ｂｏａ−ＡｓｎＯＮＰ　０．３３０ Ｂｏｃ−ＧＩｎＯＮＰ　０．３４０ Ｂｏｃ−ＡＩａ”ＯＨ０，１８Ｑ Ｂｏａ−Ａｌａ−ＯＨ０，１８゜ Ｂｏａ−ＴＶｒ（Ｃ１２Ｚ）　ＯＨ ０，４５ＣＩ かくしてＨ−Ｔｙｒ（Ｃ１２Ｚ）　−Ａｌａ−Ａｌａ−
Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒａ（Ｔｏｓ）−樹脂５．１９ｏを
得る二このうち１．７３＋１を弗化水素２０回及びアニ
ソール２鵬と混合し、−２０℃で３０分間、次いで０℃
で３０分間インキュベーションし、過剰の弗化水素を減
圧留去した後、１０％酢酸水溶液で抽出し、エーテルで
洗浄し、凍結乾燥した。

次いでセファデックスＧ−１０（ファルマシア社、溶出
液１０％酢Ｗりによるゲル濾過、セファデックスＬＨ−
２０（ファルマシア社、溶出液１＋ｎＭ組１、さらにＨ
ＰＬＣ（７，５％アセトニトリル１０．０５％三弗化酢
酸、流速１．０脱／分、カラム０ＤＳ１２０Ｔ、４．６
ｍｍｘ２５０ｆｉ１ｍ、東洋曹達株式会社）によって精
製して目的ペプチド２９Ｉ！１ｇを得る。以下このペプ
チドを「ペプチドＣ」とする。

Ｒｆ（ｉｉ： Ｒｆｌ＝０．０１　Ｒｆ”＝０．２６ アミノ酸分析値：く日立８３５型にて分析）分析値 Ｔｙｒ（１）　０．９８ Ａｌａ（２）　２．０７ Ｇｌｕ（１）　１．０４ Ａｓｐ（１）　０．９２ Ａｒｇ（１）　１．００ 製造例　４ 製造例１の■と同様にしｉ’Ｂｏｃ−’ｒｙｒ　（Ｃｌ
　２−Ｂｚｌ）−樹脂の０　、２９　ｍｍｏ１１０樹脂
を製造し、その３ｇに、前記製造例１の■及び■と同様
にして、以下のアミノ酸又はその誘導体を順次二重カッ
プリング反応及びＷＡ３ｏｃ化反応させる。

Ｂｏａ　−Ｌｅｕ−Ｏｆ−１−１−１２０，０，５５０
Ｂｏａ−Ｇｌｙ−ＯＨ０，３９０ Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−０）−１０，３９゜ Ｂｏｃ−ＧＩｎＯＮ　Ｐ　０．８１　ＱＢｏｃ−Ｇｌｕ
’（ＯＢｚｌ）　−ＯＨ０，７４゜Ｂｏｃ−Ｔｒ＋１−
０Ｈ０，６７’ａ Ｂｏａ−Ｐｈｅ−ＯＨ０，５９゜ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ−Ｈ２００，５５ａＢｏｃ−Ｌｅ
ｕ−ＯＦｌ　−Ｈ２００，５５ｇＢｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢ
ｚｌ）−０Ｈ０，７１゜Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ−Ｈ２０
０，５５゜Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨＯ，３９＋］ かくしてＨ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）　−
ＬｅＬＩ−ＬｅＬＩ−Ｐｈｅ−ＴｒＥｌ−Ｇｌｔｌ（Ｏ
ＢＺＩ）−Ｑｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（
Ｃ１２−Ｚ）−樹脂４．３１（ｌを得る。

その１Ｑを弗化水素１０瞠、アニソール１　ｍＱ及び１
，２−エタンジチオール０．５＋ｆｉＱと混合し、−２
０℃で３０分間、次いで０℃で３０分間インキュベーシ
ョンした後、過、剰の弗化水素を減圧留去し、５０％酢
酸水ｒ８Ｍにて抽出し、エーテルにて洗浄後、凍結乾燥
する。次いでセファデックスＬＨ−２０（ファルマシア
社、１ｓＭ炭酸水素アンモニウム）でゲル濾過し、更に
１−ＩＰＬｃ　（２９％アセトニトリル１０．１１Ｖｌ
波アンモニウム、１）Ｈ−８，０、流速１．０μＱ／分
、カラム０ＤＳ−１２０Ｔ、４．６＋ａｍｘ２５０ｍｍ
、東洋曹達株式会社）を用いて精製して、目的ペプチド
４３ｍｇを得る。以下これを「ペプチドＤ」と呼ぶ。

Ｒｆ値： Ｒｆｌ＝０．０２　Ｒｆ２＝０．６９ アミノ酸分析値＝（日立８３５型にて分析）分析値 Ｔｙｒ（１）　１．０５ Ｌｅｕ（４）　４．０９ Ｇｌｙ（３）　２．８８ Ｇｌｕ（２＞　２．０４ Ｔｒｐ（１）　０．９７ Ｐｈｅ（１）　１．０５ ＡＳＩ）（１）　０．９１ 製造例　５ 製造例１の■と同様にして３　ｏｃ　−１ｅｕ−樹脂の
０、４２５ｍｎ＋ｏｌ／ａ　ｍ脂を製造し、その２ｇに
、前記製造例１の■及び■と同様にして、以下のアミノ
酸又はその誘導体を順次二重カップリング反応及び１ｌ
１２Ｑｏｃ化反応させる。

Ｂｏａ−８ｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ０，５９Ｔ＋Ｂｏｃ−
８ｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ０，５９゜Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ
Ｂｚｌ）−ＯＨ０，７２゜Ｂｏａ−Ｐｒｏ−ＯＨ０，４
６ｇ Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＩ−Ｚ）−ＯＨ０，９５゜Ｂｏｃ−
１ｉｅ−ＯＨ−１／２Ｈ２０ ０、５１（Ｉ Ｂｏａ　−Ｌｅｕ−ＯＨ−）＋２０　０．　５３ａＢｏ
ａ−８ｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ０，５９０Ｂｏａ−Ｔｙｒ
（Ｃ１２−Ｚ）　ＯＨ １，２０ｇ かくしてＢｏａ−ＴＶｒ（Ｃ１２−Ｚ）　５ｅｒ（Ｂｚ
ｌ）−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｌｙｓ（ＣＩ−Ｚ）−Ｐｒ。

−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）　−８ｅｒ（Ｂｚｌ）　−Ｌ　ｅ
ｕ−樹脂の３．２７ａを得る。

そのうちＯ，Ｂ１０を弗化水素１０ｍＧ及びアニソール
１−と混合し、−２０℃で３０分間、次いで０℃で３０
分間インキュベーションした後、過剰の弗化水素を減圧
留去し、１０％酢酸水溶液にて抽出し、エーテルにて洗
浄後、凍結乾燥する。

次いでセファデックスＧ−２５（ファルマシア社、１Ｍ
酢酸水溶液）でゲル濾過し、更に）（ＰＬＯ（２５％ア
セトニトリル１０．０５％三弗化酢酸、カラム０ＤＳ−
１２０Ｔ、４．６＋ｕｘ２５０ｉ１１゜東洋曹達株式会
社）を用いてｆｉ製して、目的ペプチド３Ｅ３ａＱを得
る。以下これを「ペプチドＥ」と呼ぶ。

Ｒｆ値： Ｒｆｌ−０，１３Ｒｆ”＝０．５２ アミノ酸分析値＝（日立８３５型にて分析）分析値 ５ｅｒ（３）　２．９１ Ｇｌｕ（１）　１．０４ １１ｅ（１）　０．９６ Ｌｅｕ（２）　２．０１ Ｔｙｒ（１）　０．９９ ＬｙＳ（１）　１．０９ Ｐｒｏ（１）　０．９８ 〈免疫抗原の製造〉 製造例　１ ■　ペプチドの製造例１で得たペプチドＡの２１１ｇ（
１、３９２ｍｍｏｌ）及びアスカ−リス抽出蛋白４１ｇ
を、蒸留水３．０−に加え、この溶液にジシクロへキシ
ルカルボジイミド（ＤＣＣ）０．５７ｍｇを加え、室温
で２時間撹拌する。その後反応混合物を３日間蒸留水で
４℃で透析し、凍結乾燥して、免疫抗原５．８ＷａＯを
得る。以下この抗原を［抗原Ｉａ　Ｊと言う。

抗原Ｉａはアスカ−リス１１１０に対してペプチドＡが
平均０．１６４μａ＋ｏｌ結合したものである。

尚このペプチドとアスカ−リスとの結合率は、得られる
抗原を更にセファデックスＧ−５０（ｒＦＪ出液：生理
食塩水、検出：　ＯＤ　２８０ｍｍ、流出速度：３−７
時間、分取量：１−づつ）でゲル濾過した際、未反応の
アスカ−リス及びペプチドの存在は認められないことよ
り、該ゲルか過によってアスカ−リスに結合したペプチ
ドのフラクションと他の生成体（ペプチド２ｍ体）のフ
ラクションとを分’ｌＩＩ［−Ｌ／、ペプチド２饅休の
標準濃度の検０線を作成して、上記２ｍ体の量をめ、こ
れを出発原料として用いたペプチドのＱから差し引いた
値がすべてアスカ−リスに結合してし）るとしてめたも
のである。以下の抗原の製造例においても同様とする。

■　ペプチドＡの３１及びアスカ−リス抽出蛋白６ＩＩ
１ｇを、０．１Ｍリン酸緩衝液（１１Ｈ−７，２）３．
０ｍＧに加え、この溶液に０．１％ゲルタールアルデヒ
ド０．４６−（４，１７６μｌ０１）を加え、室温で２
時間撹拌する。その後反応混合物を３日間蒸留水で４℃
で透析し、凍結乾燥して、免疫抗゛原５．７ｍＱを得る
。以下この抗原を［抗原ＩｂＪと言う。抗原Ｉｂは、ア
スカ−リス１１１ｇに対してペプチドＡが平均０．１４
９μｍｏｌ結合したものである。

製造例　２ ペプチドの製造例２で得たペプチドＢの５ｍ。

（５、９９５＋ｕｏｌ）及びアスカ−リス抽出蛋白１１
０１Ｉ１を、０．１３Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１６
Ｍホウ酸緩衝液（ｐ　）−１＝９．０）５−に加え、こ
の溶液にＢＤＢ溶液３．３５１０を加えて４℃で２時間
撹拌する。上記ＢＤＢ溶液は０．２Ｎ塩１１１２０ｍＧ
及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３−の混合溶媒に
ベンジジン８３．２５１＋１を加え、水冷下に撹拌し、
これに亜硝酸ナトリウム８７．０３ｕの蒸留水２四溶液
を徐々に加え、３０分間撹拌することにより調整した。

その後反応混合物を３日間蒸留水で４℃下に透析し、凍
結乾燥して、免疫抗原１３．７＋ｏを得る。以下この抗
原を「抗原■」と言う。抗原■はアスカ−リスｉｎに対
してペプチドＢが平均０．２６９μｍｏｌ結合したもの
である。

製造例　３ ■　ペプチドＡの代りにペプチドの製造例３で得たペプ
チドＣを使用して、前記抗原の製造例１の■と同様にし
て免疫抗原ＪＬ７ｍｏを得る。以下この抗原を「抗原１
１１ａ　Ｊと言う。抗原■ａはアスカ−リス１■Ｑに対
してペプチドＣが平均０．３７３μ量０１結合したもの
である。

■　ペブーチドＢの代りにペプチドの製造例３で得たペ
プチドＣを使用して、前記抗原の製造例２と同様にして
免疫抗原８．６ｍｏを得る。以下この抗原を「抗原ｎ１
ｂＪと言う。抗原ｍｂはアスカ−リス１１１０に対して
ペプチドＣが平均０．３１３μｓｏｌ結合したものであ
る。

製造例　４ ■　ペプチドＡの代りにペプチドの製造例４で得たペプ
チドＤを使用して、前記抗原の製造例１の■と同様にし
て免疫抗原８．６１１１１１を得る。以下この抗原を［
抗原ＩＶａＪと言う。抗原［％＋ａはアスカ−リスｌｌ
ｌ１ｇに対してペプチドＤが平均０．２６９μ！１１０
１結合したものである。

■　ペプチドＢの代りにペプチドの製造例４で得たペプ
チドＤを使用して、前記抗原の製造例２と同様にして免
疫抗原８．５１１１を得る。以下この抗原を［抗原ｒＶ
ｂＪと言う。抗原ＩＶｂはアスカ−リス１ｍｇに対して
ペプチドＣが平均０．２２４μｓｏｌ結合したものであ
る。

製造例　５ ■　ペプチド日の代りにペプチドの製造例５で得たペプ
チドＥを使用して、前記抗原の製造例２と同様にして免
疫抗原８．７ＨＪ＠得る。以下この抗原を「抗原Ｖ」と
言う。抗原Ｖはアスカ−リス１１Ｉｇに対してペプチド
Ｄが平均０．２３９μｎ＋ｏｌ結合したものである。

く抗体の製造〉 製造例　１ 抗原の製造例５で得た抗原Ｖの１００μｇを１．５１１
２の生理食塩水に溶解後、これに７０インドの補助３１
１’１．５１１２を加えて調整した懸濁液を、２羽のウ
サギ（Ｎｅｗ　−Ｚｅａｌａｎｄ　ｗｈｉｔｅ　ｒａｂ
ｂｉｔｓ　。

２．５〜３．０ｋｇ）に下記免疫スケジュールに示す手
順で、−回の抗原接種量を１ｏｏμＱ　、’ｂｏｄｙと
して皮下投与し、１１週経過してのち試験動物から全採
血し、これを遠心分離して抗血清（ＡＴＬＡ抗体）を得
る。得られた抗体を各ウサギに対してそれぞれ「抗体Ｖ
ａＪ及び「抗体ＶｂＪとする。

〈免疫スケジュール〉 （抗原接種 ０　第１同棲種 ２　第２同棲種 ４　第３同棲種 ６　第４同棲種 ８　第５同棲種 １０　第６回　種 〈標識ペプチドの製造〉 ■　ペプチドの製造例１で得たペプチドＡをクロラミン
Ｔを用いる方法で以下の通り標識化する。

即ち上記ペプチド５μｇの０．５モルリン酸塩ＭＩ液（
Ｅ）Ｈ７，５）１０μ＋ｌにＮａ　〔１２５Ｉ〕（ｃａ
ｒｒｉｅｒ　ｆｒｅｅ　Ｎ、　Ｅ、　Ｎ、　＞　１ミリ
キユーリーの０．５モルリン酸塩緩衝液２０μＱを加え
、つぎにクロラミンＴ２０μＱの０．５モルリン酸塩緩
衝液２０μＱを加える。室温で２５秒間撹拌してメタ重
亜硫酸ナトリウム（Ｎａ　２５２０ｓ　＞１００μｑの
０．５Ｍリン酸塩緩衝液２０μＱを加えることで反応を
終わらせる。次いで反応液に１０％の冷沃化ナトリウム
水溶液１０μＱを加え、反応混合物をセファデックスＧ
−２５のカラム（１，０〜５Ｑｃａ＋、溶出液０．１％
ＢＳＡ及び０．０１％Ｎａ　Ｎ３を含む０．２モル酢酸
アンモニウム１ｌｌｉｌ、ｐ　１−１５．５）ｒｌＦＪ
Ｉ、ｒ”　’　１で標識されたペプチドＡを得る。

該標識ペプチドの放射活性は、２５５μＣＡ／μｇであ
った。

■　ペプチドの製造例２〜５で得たペプチドＢ〜Ｆを上
記標識ペプチドの製造例と同様の方法により＋′■で標
識して標識ペプチドＢ−Ｅを得る。

０力価の測定 上記で得られる抗体の力価を次の通り測定する。

即ち抗体をそれぞれ生理食塩水で１０．１０２．１０３
．１０４．１ｏ５・・・・・・・・倍に希釈し、これら
のそれぞれ１００μＱに、＋２５１標識ペプチド（上記
で得られる標識ペプチドを約９５００ｃｐｓになるよう
に希釈したもの）０．１ｆｆ１９及び０．０５モルリン
酸塩緩衝液　（ｐ　Ｈ＝７．４）（０，２５％ＢＳＡ、
１０ｓ　Ｍ　ＥＤＴＡ及び０．０２％Ｎａ　Ｎ３を含む
）０．２ｍＧを加え、４℃で２４時間インキュベートし
、生成した抗体と１２５１標識抗原との結合体を、デキ
ストラン−活性炭法及び遠心分離法（４℃、３０分間、
３０００ｒｐｍ）ｋ：より未反応＜ＩＩＬない）＋２５
１標識ペプチドから分離し、その放射線をカウントし、
各希釈濃度における抗体のＩＲ５Ｉ標識ペプチドとの結
合率（％）を測定する。縦軸に抗体の１２５■標識ペプ
チドとの結合率（％）及び横軸に抗体の希釈倍率をとり
、各々の濃度において結合率をプロットする。結合が３
０％及び５０％となる抗体の希釈倍率即ち抗体の力価を
める。前記抗体の製造例１で得た抗体Ｖａ及び抗体ｖｂ
に関して得られた結果を下記第２表に示す。

第　２　表 ５０％結合率　３０％結合率 抗体Ｖａ　１８４０　４０４０ 抗体Ｖｂ　１４８０　３２００ （以　上） 手続補正書（０帽 昭和５９年２月１３日 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 昭和５８年特許願第１３４９９５号 ２　発明の名称 ヒト白血病ウィルス関連ペプチド ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 大塚製薬株式会社 （ほか１名） ４代理人 ５　補正命令の日付 自発 ６　補正の対象 明ｌｌ書中「発明の詳細な説明」の項 補　正　の　内　容 １）　明細書第２６頁第８行にｒ　−ｆ−４１ｓ−Ｊと
あるをｒ−Ｈｉｓ（Ｔｏｓ）−Ｊと訂正する。

２）　明細書第２７頁第１１〜１２行に「目的ペプチド
」とあるを次の通り訂正する。

［目的ペプチド（Ｈ−Ｔｙｒ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−ｒｙｒ
−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−
Ｌｙｓ−Ｏｆ−１）　Ｊ ３）　明細書第２９頁第１行及び第３行にｒ　−Ａｓｎ
（Ｔｏｓ）−０ＨＪとあるをそれぞれｒ−Ａｓｎ−ＯＮ
ＰＪと訂正する。

４）　明細書第２９頁第１８行に「目的ペプチド」とあ
るを次の通り訂正する。

「目的ペプチド（Ｈ−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｒ
ａ　−Ａ　ｓｎ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　ｌｙ−Ｔ　
ｙｒ−ＯＨ）　Ｊ５）　明細書第３１頁第１４行に「目
的ペプチドｊとあるを次の通り訂正する。

「目的ペプチド（Ｈ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ
−Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｒｌｌ　−ＯＨ）　Ｊ６）　明細書
第３３頁最下行に「目的ペプチド」とあるを次の通り訂
正する。

［目的ペプチド（Ｈ−Ｇｌｙ　−Ｌｅｕ−Ａｓｐ　−Ｌ
ｅｕ−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｈｅ−Ｔ　ｒｐ　−Ｇ　Ｉｕ　
−Ｇ　Ｉｎ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　１ｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ
−ＯＨ）　Ｊ ７）　明細書第３５頁第１２行にｒ−８ｅｒ（ＢＺＩ）
−Ｌ　ｅｕ　−Ｊとあるをｒ−８ｅｒ（Ｂｚｌ）−８ｅ
ｒ（Ｂｚｌ）　−Ｌｅｕ　−Ｊと訂正する。

８）　明細書第３６頁第３〜４行に「目的ペプチド」と
あるを次の通り訂正する。

［目的ペプチド（Ｈ−Ｔｙｒ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−１ｌｅ
−Ｌ　ｙｓ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｑ　Ｉｕ　−Ｓ　ｅｒ　−
Ｓ　ｅｒ　−Ｌ　ｅｕ　−０Ｈ４）」 （以　上） 第１頁の続き

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ０式 ％式％ で表わされるペプチド、式 Ｈ−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　ｓｎ−Ａ　ｒａ−Ａ　ｓｎ　−Ｇ
   　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　ＩＶ−ＴＹｒ−ＯＨ で表わされるペプチド、式 ％式％ で表わされるペプチド、式 Ｈ−Ｇ’ｌＶ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　５ＥＩ−Ｌ　ｅｕ　
   −Ｌ　ｅｕ−Ｐ　ｈｅ　−Ｔ　ｒＤ−Ｇ　ｌｕ−Ｇ　Ｉ
   ｎ　−Ｇ　＋ｙ−Ｇ　＋ｙ−Ｌ　ｅｕ−Ｔ　Ｖｒ０１−
   １ で表°わ−されるペプチド及び式 ％式％ （ で表わされるペプチドからなる群より選ばれたヒト白血
   病ウィルス関連ペプチド。