JPH08333276A - ペプチド及び気管支拡張剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 下記一般式(1) ： H-His-Ser-Asp-Ａ -Ｂ -Phe-Thr-Asp-Ｃ -Tyr-Ｄ -Arg-Ｅ -Arg-Ｆ -Gln-Ｇ -Ala-Val-Ｉ -Ｊ -Tyr-Leu-Ｋ -Ｌ -Ｍ -Leu-Ｎ (1) （Ａは、Ala 又はGly ；Ｂは、Ile 又はVal ；Ｃは、As
n 又はSer ；Ｄは、Thr又はSer ；Ｅは、Leu 又はTyr
；Ｆ、Ｉ及びＪは、それぞれLys 又はArg を示すが、
Ｆ、Ｉ及びＪの少なくとも一つはArg ；Ｇは、Met 、Le
u 又はｎLeu ；Ｋは、Asn 又はAla ；Ｌは、Ser 又はAl
a ；Ｍは、Ile 又はVal ；Ｎは、-NH ₂ 又はAsn-NH₂ 。
但し、同時に、ＡがAla 、ＢがVal 、ＣがAsn 、ＤがTh
r 、ＥがLeu、ＫがAsn 、ＬがSer 、ＭがIle 及びＮがA
sn-NH₂ になることはない。）で表されるペプチド又は
その薬学的に許容される塩。 【効果】 平滑筋弛緩作用による気管支拡張作用の持続
性に優れている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規ペプチド及びその
薬学的に許容される塩に関する。該ペプチドは、気管支
拡張剤として有用である。

【０００２】

【従来の技術】ＶＩＰ（血管作動性腸管ペプチド（Vaso
active Intestinal Peptide)）は、脳−腸管ペプチドと
呼ばる、血流促進、血圧低下作用をもつ生理活性ペプチ
ドの一種である。このＶＩＰは、1970年にブタ腸管から
抽出されており、28個のアミノ酸残基からなる（S.I.Sa
id，V.Mutt Science,169,1217(1970))。また、ＰＡＣＡ
Ｐ（下垂体アデニレートサイクラーゼ活性化ペプチド(P
ituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptid
e)）は、1989年、羊の視床下部から下垂体培養細胞のア
デニレ−トサイクラ−ゼを活性化させるバイオアッセイ
系を指標にして単離され構造決定された38個のアミノ酸
残基よりなるペプチドである(A.Miyata, A.Arimura et
al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 164, 567(198
9)) 。このＰＡＣＡＰのＮ末端側から27残基がＰＡＣＡ
Ｐの活性を有しており、この27個のアミノ酸配列は、Ｖ
ＩＰと極めて類似した構造を有する。ＶＩＰ及びＰＡＣ
ＡＰのアミノ酸配列はセクレチン、グルカゴン等に類似
していることから、グルカゴンファミリ−に属するペプ
チドとされており、その強い血管拡張、血流促進作用か
ら、潰瘍、しもやけ、インポテンツ、発毛あるいは育毛
などの効果が期待されている。また、ＶＩＰ及びＰＡＣ
ＡＰは、呼吸器系においては気管支平滑筋への弛緩作用
が非常に強く、アセチルコリン、ヒスタミン、セロトニ
ン等の刺激物質によって惹起された平滑筋収縮を緩解す
る作用がある。かかる弛緩作用は、アドレナリンβ₂ レ
セプタ−を介して作用する一般の気管支拡張による弛緩
作用とは異なり、β₂ レセプタ−刺激剤が有効に作用し
ない難治性の喘息発作に対しても効果が期待されてい
る。

【０００３】また、気管支拡張作用・降圧作用、育毛作
用を有する28〜31個のアミノ酸残基からなるペプチドが
知られている（特開昭６２−２４６５９５号公報、特開
昭６４−８３０１２号公報及び特開平４−２９７４９８
公報参照。）。しかしながら、ＶＩＰ及びＰＡＣＡＰ
や、従来公知の上記ペプチドよりも気管支拡張作用の持
続性に優れたペプチドの開発が望まれている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、気管
支拡張作用の持続性に優れたペプチド及び気管支拡張剤
を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決すべく鋭
意研究を重ねた結果、本発明者らは、ＶＩＰやＰＡＣＡ
Ｐよりも持続性のある気管支拡張作用を有する新規ペプ
チドを合成することに成功し、本発明を完成した。本発
明は、下記一般式(1) ： H-His-Ser-Asp-Ａ -Ｂ -Phe-Thr-Asp-Ｃ -Tyr- Ｄ -Arg-Ｅ -Arg-Ｆ -Gln-Ｇ -Ala-Val-Ｉ - (1) Ｊ -Tyr-Leu-Ｋ -Ｌ -Ｍ -Leu-Ｎ （式中、Ａは、Ala 又はGly を示し；Ｂは、Ile 又はVa
l を示し；Ｃは、Asn 又はSer を示し；Ｄは、Thr 又は
Ser を示し；Ｅは、Leu 又はTyr を示し；Ｆ、Ｉ及びＪ
は、同一でも異なってもよく、それぞれLys 又はArg を
示すが、Ｆ、Ｉ及びＪの少なくとも一つはArg をであ
り；Ｇは、Met 、Leu 又はｎLeu を示し；Ｋは、Asn 又
はAla を示し；Ｌは、Ser 又はAla を示し；Ｍは、Ile
又はVal を示し；Ｎは、-NH₂又はAsn-NH₂ を示す。但
し、同時に、ＡがAla 、ＢがVal 、ＣがAsn 、ＤがThr
、ＥがLeu 、ＫがAsn 、ＬがSer 、ＭがIle 及びＮがA
sn-NH₂ になることはない。）又は、下記一般式(2) ： H-His-Ser-Asp-Ａ -Ｂ -Phe-Thr-Asp-Ｃ -Tyr- Ｄ -Arg-Ｅ -Arg-Ｆ -Gln-Ｇ -Ala-Val-Ｉ - (2) Ｊ -Tyr-Leu-Ｋ -Ｌ -Ｍ -Leu-Ｐ -Gly-Ｑ -Ｒ （式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ
及びＭは、前記のとおりである。但し、Ｆ、Ｉ及びＪの
少なくとも一つはArg である。Ｐは、Asn 又は化学結合
を示し、Ｑは、Lys 、Arg 、Lys-Arg 、Arg-Arg 又は化
学結合を示し、Ｒは-OH 又は-NH₂を示す。）で表される
ペプチド又はその薬学的に許容される塩を提供する。

【０００６】また、本発明は、上記のペプチド又はその
薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、気管
支拡張剤を提供する。本明細書において、アミノ酸、ペ
プチド、保護基、溶媒その他に関して略号で表示する場
合、国際純正及び応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）、国際生
化学連合（ＩＢＵ）の規定或いは該当分野における慣用
記号に従うものとする。ただしアミノ酸等に関し光学異
性体がありうる場合は、特に明示しなければＬ体を示す
ものとする。以下、その例を示す。 His ；ヒスチジン残基 Ser ；セリン残基 Asp ；アスパラギン酸残基 Ala ；アラニン残基 Val ；バリン残基 Phe ；フェニルアラニン残基 Thr ；スレオニン残基 Tyr ；チロシン残基 Asn ；アスパラギン残基 Leu ；ロイシン残基 Arg ；アルギニン残基 Lys ；リジン残基 Gln ；グルタミン残基 Met ；メチオニン残基 Ile ；イソロイシン残基 Gly ；グリシン残基 ｎLeu ；ノルマルロイシン残基 Ｂｏｃ；t-ブトキシカルボニル基 Ａｏｃ；t-アミルオキシカルボニル基 Ｂｚｌ；ベンジル基 Ｚ ；ベンジルオキシカルボニル基 Ｔｏｓ；p-トルエンスルホニル基 ＯＢｕｔ；t-ブチルエステル ＯＭｅ；メチルエステル ＯＢｚ；ベンジルエステル ＯＮＰ；p-ニトロフェニルエステル Ｂｏｍ；ベンジルオキシメチル基 ＴＦＡ；トリフルオロ酢酸 ＴＨＦ；テトラヒドロフラン ＤＣＭ；ジクロロメタン ＤＭＦ；ジメチルホルムアミド ＤＣＣ；ジシクロヘキシルカルボジイミド ＷＳＣ；Ｎ-エチル-Ｎ’-ジメチルアミノプロピル-カルボジイミド ＯＳｕ；Ｎ-ヒドロキシコハク酸イミドエステル ＨＯＳｕ；Ｎ-ヒドロキシコハク酸イミド ＨＯＢｔ；1-ヒドロキシベンゾトリアゾール ＤＩＥＡ；ジイソプロピルエチルアミン 本発明のペプチドは，公知のペプチド合成の常法手段に
従って合成できる。例えば「ザ．ペプチド(The Peptide
s)」第1巻(1966年)[Schreder and Luhke著、Academic P
ress ,New York,U.S.A.]、あるいは「ペプチド合成」
［泉屋ら著、丸善株式会社(1975年)］に記載されている
方法に従って、例えばアジド法、酸クロライド法、酸無
水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法
（P-ニトロフェニルエステル法、Ｎ−ヒドロキシコハク
酸イミドエステル法、シアノメチルエステル法等）、ウ
ッドワ−ド試薬Ｋを用いる方法、カルボイミダゾ−ル
法、酸化還元法、ＤＣＣ−アデイテイブ（ＨＯＮＢ、Ｈ
ＯＢｔ、ＨＯＳｕ）法等により合成することができる。
これらの方法は、固相合成法及び液相合成法のいずれも
適用できる。本発明のペプチドは、上記のような一般的
なポリペプチドの合成法により、例えば、Ｃ末端アミノ
酸に、アミノ酸配列にしたがって順次１個ずつアミノ酸
を縮合させるいわゆるステップワイズ伸長法によって、
又は数個のフラグメントに分けて各フラグメントを合成
し、それらをカップリングさせるフラグメント縮合法に
よって製造することができる。

【０００７】より詳細には、例えば、ステップワイズ伸
長法により固相合成する場合には、メリフィ−ルド（ M
errifield.R.B.）の方法［Solid phase peptide synthe
sis,J.Amer.Chem.Soc., 85, 2149-2159 (1963) ］に従
って行うことができる。まず、カルボキシル基と結合可
能な官能基を有する不溶性樹脂に、目的とするペプチド
のアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸をアミノ基を保護し
た状態で結合させ、次いで該Ｃ末端アミノ酸のアミノ基
の保護基を除去して得られた遊離のアミノ基に、目的と
するペプチドのアミノ酸配列（本発明においては上記一
般式(1) 又は一般式(2) のアミノ酸配列）に従って、カ
ルボキシル基を活性化させたアミノ基保護アミノ酸を一
つずつ順次ペプチド結合させてはアミノ基の保護基の除
去を繰り返し、１位のヒスチジン残基までアミノ酸残基
を延長し、続いて得られたペプチドを前記樹脂から脱離
させることにより製造することができる。

【０００８】上記の方法において、アミノ酸のペプチド
結合に関与するアミノ基への保護基の結合及び該保護基
の脱離、並びにアミノ酸のペプチド結合に関与するカル
ボキシル基の活性化が必要である。また、必要に応じて
アミノ酸の側鎖の官能基にも保護基を結合する。アミノ
基を保護する場合に用いる保護基としては、通常用いら
れているものを挙げることができ、例えばベンジルオキ
シカルボニル（Ｚ）、 t-ブトキシカルボニル（Ｂo
c）、t-アミルオキシカルボニル（Ａoc）、イソボルニ
ルオキシカルボニル、p-メトキシベンジルオキシカルボ
ニル、2-クロル-ベンジルオキシカルボニル、アダマン
チルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロ
イル、ホルミル、o-ニトロフェニルスルフェニル、ジフ
ェニルホスフィノチオイルなどの基が挙げられる。

【０００９】また、本発明のグルカゴンの製造におい
て、カルボキシル基を保護する場合に用いる保護基とし
ては、通常用いられているものを挙げることができ、例
えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエス
テル、ブチルエステル、tert−ブチルエステル等のアル
キルエステル、ベンジルエステル、p-ニトロベンジルエ
ステル、メチルベンジルエステル、p-クロロベンジルエ
ステル、ベンズヒドリルエステル、ベンジルオキシカル
ボニルヒドラジド、tert-ブチルオキシカルボニルヒド
ラジド、トリチルヒドラジド等が挙げられる。

【００１０】ペプチド結合に関与するカルボキシル基の
活性化も、上記のような従来公知の方法にて行うことが
でき、用いられる試薬等も公知のものから適宜選択し得
る。例えば、カルボキシル基を活性化するために、該カ
ルボキシル基と種々の試薬を反応させて、例えば、対応
する酸クロライド、酸無水物又は混合酸無水物、アジ
ド、活性エステル（例えば、ペンタクロロフェノ−ル、
p-ニトロフェノ−ル、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、
Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾ−ル、Ｎ−ヒドロキシ−
５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等との
エステル）等を形成させればよい。

【００１１】また、アミノ酸の中で、側鎖に官能基を有
するものについては、ペプチド結合形成反応中はその官
能基は保護されているのが好ましく、特に、Ｈis、Ｔy
r、Ｔhr、Ｌys、Ａsp、Ａrg及びＳerについては、その
側鎖の官能基を保護しておくのが好ましい。官能基の保
護は、通常用いられている方法で保護基を結合させるこ
とにより行われる。グルカゴンの合成終了後、それらの
保護基は脱離される。

【００１２】Ｈisのイミノ基の保護基としては、例え
ば、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、トシル（Ｔo
s）、ベンジル（Ｂzl）、ベンジルオキシカルボニル
（Ｚ）、トリチル等の基が挙げられる。Ｓer及びＴhrの
水酸基は、例えば、エステル化又はエ−テル化によって
保護することができるが、必ずしも保護する必要はな
い。エステル化によって導入される保護基としては、例
えば、アセチル等の低級アルカノイル基、ベンゾイル等
のアロイル基、ベンゾイルオキシカルボニル、エチルオ
キシカルボニル等の炭酸から誘導される基等が好適に用
いられる。またエ−テル化によって導入される保護基と
しては、例えば、ベンジル（Ｂzl）、テトラヒドロピラ
ニル、tert−ブチル等の基が好適に用いられる。

【００１３】Ｔyrの水酸基の保護基としては、例えばベ
ンジル（Ｂzl）、ブロモベンジルオキシカルボニル（Ｂ
ｒＺ）、ジクロロベンジル（Ｃｌ₂-Ｂzl）、ベンジルオ
キシカルボニル（Ｚ）、アセチル、トシル（Ｔos）等の
基が挙げられる。Ｌysのアミノ基の保護基としては、例
えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、クロロベンジ
ルオキシカルボニル（Ｃｌ−Ｚ）、ジクロロベンジル
（Ｃｌ₂-Ｂzl）、t-ブトキシカルボニル（Ｂoc）、トシ
ル（Ｔos）等の基が挙げられる。

【００１４】Ａrgのグアニジノ基の保護基としては、例
えば、トシル（Ｔos）、ニトロ、ベンジルオキシカルボ
ニル（Ｚ）、t-アミルオキシカルボニル（Ａoc）基等の
基が挙げられる。Ａspのカルボキシル基の保護は、例え
ば、ベンジルアルコ−ル、メタノ−ル、エタノ−ル、te
rt−ブタノ−ル等によるエステル化により行われる。

【００１５】尚、ペプチド結合の形成反応は、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、カルボジ
イミダゾール等のカルボジイミド試薬やピロリン酸テト
ラエチル、ベンゾトリアゾ−ル−Ｎ−ヒドロキシトリス
ジメチルアミノホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩
（Ｂｏｐ試薬）等の縮合剤の存在下に実施し得る場合も
ある。

【００１６】上記の固相合成において用いる不溶性樹脂
は、カルボキシル基と結合可能な官能基を有する樹脂で
あればいずれのものも使用でき、例えば、ベンズヒドリ
ルアミン樹脂（ＢＨＡ樹脂）、クロルメチル樹脂、オキ
シメチル樹脂、アミノメチル樹脂、p-メチルベンズヒド
リルアミン樹脂（ＭＢＨＡ樹脂）、４−アミノメチルフ
ェノキシメチル樹脂、４−ヒドロキシメチルフェノキシ
メチル樹脂、４−オキシメチルフェニルアセタミドメチ
ル樹脂（ＰＡＭ樹脂）等が挙げられる。樹脂へのアミノ
酸の結合及び合成されたペプチドの樹脂からの脱離は、
従来公知の方法で行うことができる。

【００１７】上記の固相合成に用いる溶媒としては、ペ
プチド結合形成に使用し得ることが知られている各種の
もの、例えば無水又は含水のジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ピリジ
ン、クロロホルム、ジオキサン、ジクロロメタン（ＤＣ
Ｍ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル、Ｎ
−メチルピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミド
（ＨＭＰＡ）等を、１種単独で、あるいは２種以上の混
合溶媒として用いることができる。

【００１８】合成されたペプチドは、通常の方法に従い
脱塩、精製することができる。例えば、ＤＥＡＥ−セル
ロ−ス等のイオン交換クロマトグラフィ−、セファデッ
クスＬＨ−２０、セファデックスＧ−２５等の分配クロ
マトグラフィ−、シリカゲル等の順相クロマトグラフィ
−、ＯＤＳ−シリカゲル等の逆相クロマトグラフィ−、
高速液体クロマトグラフィ−等が挙げられる。

【００１９】本発明のペプチドは、必要に応じて薬学的
に許容される塩、例えば、酢酸塩、塩酸塩、リン酸塩等
にすることができる。また、本発明のペプチド及びその
塩は、気管支拡張作用を有することから気管支拡張剤と
して有用である。従って、本発明のペプチド又はその塩
を有効成分として含有する気管支拡張剤は、喘息等の抑
制及び改善に有効である。

【００２０】本発明のペプチド及びその塩は、そのまま
投与することもできるが、一般には公知の方法により薬
理的に許容され得る種々の担体と混和した上で、液状、
ゲル状、固体状の経口製剤又は非経口製剤として投与さ
れる。投与方法としては、例えば吸入エアゾ−ル剤など
の吸入法、注射投与法、塗布法等が挙げられる。本発明
のペプチドの投与量は、使用目的、患者の症状、年齢、
体重等や、投与方法などにより適宜決定されるが、通常
１人１日当たり１ng〜１mg／Kg程度の範囲で使用するの
が好ましい。

【００２１】

【実施例】以下、本発明を実施例を挙げてより具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。以下の実施例において、得られた純粋ペプチドの同
定は、下記に示す高速液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬ
Ｃ）の保持時間の測定、旋光度の測定及びアミノ酸分析
により行った。 ・高速液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ） 高速液体クロマトグラフィ−分析には、ＬＣ−Ｍｏｄｕ
ｌｅ−１（日本ウォ−タ−ズ・リミテッド社製）を用い
た。

【００２２】（ＨＰＬＣ分析条件） カラム：TSK GEL ODS-120T（4.6×250mm） 溶 媒：0.1%ＴＦＡ−アセトニトリル（アセトニトリル
を20％から50％に毎分１％変化させる直線勾配グラジェ
ント） 流 速：1ml/min 検出波長：２２０ｎｍ ・旋光度 旋光度の測定には、ＤＩＣ−３７０（日本分光工業社
製）を用いた。

【００２３】（旋光度測定条件） 光線： Ｎａランプ 589nm 温度： ２０℃ 層長： 100mm 濃度： １％（０．１Ｍ−酢酸中） ・アミノ酸分析 アミノ酸分析は、得られたペプチドを6N-HCl（０．１％
フェノ−ル含有）中で110℃、20時間加水分解した後
に、日立アミノ酸分析装置Ｌ−８５００型（日立製作所
社製）を用いて行った。 〔実施例１〕 下記式 H-His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr- Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg- Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-NH₂ で表されるペプチド１の製造 固相合成装置として Milligen Bioreserch社製ペプチド
シンセサイザ−9600を用いて固相合成を行った。

【００２４】まず、ＭＢＨＡ樹脂（ペプチド研究所社
製、アミノ基0.72mmol/g）694mgをペプチド固相合成用
反応容器に入れ、ＤＣＭ 8ml（４回、各１分）、60％Ｔ
ＦＡ含有ＤＣＭ溶液 8ml（２０分）、ＤＣＭ 4ml（３
回、各１５秒）、ＤＩＥＡ 1ml含有ＤＭＦ溶液 3ml（２
回、各１分）ＤＭＦ 8ml（６回、各４０秒）の順にアル
ゴンガス気流中攪拌下で処理した。尚、各処理毎に濾過
を行った。

【００２５】一方、上記アミノ酸配列の27位のアミノ酸
残基に相当するＢoc−Leu −OH 2mmolをＤＣＭ 4mlに溶
解し、アミノ酸活性化容器中でＤＣＣ（ 0.5Ｍ−ＤＣＭ
溶液） 3ml及びＨＯＢｔ（ 0.5Ｍ−ＤＣＭ溶液） 4mlを
加え、３０分間反応させた。その後、反応混合液を濾過
して濃縮容器に移し、これにＤＭＦ 3mlを加え、アルゴ
ンガス気流下ＤＣＭを留去した。これにＤＭＦ 3mlを加
え、前記のペプチド固相合成用反応容器に移して３０分
間反応させた。ついでＤＣＭ 8mlで洗浄した（６回、各
２０秒）。さらにＢoc−Leu −OH 2mmolをＤＣＭ 4mlに
溶解し、アミノ酸活性化反応容器中で同様の操作を繰り
返した後（いわゆるダブルカップリング法）、濾過して
Ｂoc−Leu −ＭＢＨＡ樹脂を得た。

【００２６】次に、得られたＢoc−Leu −ＭＢＨＡ樹脂
をＤＣＭ 8ml（４回、各１分）で洗浄し、濾過した。こ
れに、60％ＴＦＡ含有ＤＣＭ溶液 8ml（２０分）、ＤＣ
Ｍ 4ml（３回、各１５秒）、ＤＩＥＡ 1ml含有ＤＭＦ溶
液 3ml（２回、各１分）ＤＭＦ 8ml（６回、各４０秒）
の順にアルゴンガス気流中攪拌下で処理し、また、各処
理毎に濾過を行った。

【００２７】さらに、上記アミノ酸配列の26位のアミノ
酸残基に相当するＢoc−Val −OH 2mmolをＤＣＭ 4mlに
溶解し、アミノ酸活性化容器中でＤＣＣ（ 0.5Ｍ−ＤＣ
Ｍ溶液）1. 5mlを加え、７分間反応させた。その後、反
応混合液を濾過して濃縮容器に移し、これにＤＭＦ 3ml
を加え、アルゴンガス気流下ＤＣＭを留去した。これに
ＤＭＦ 3mlを加え、前記のペプチド固相合成用反応容器
に移して３０分間反応させた。ついでＤＣＭ 8ml（６
回、各２０秒）洗浄し、濾過してＢoc−Val −Leu −Ｍ
ＢＨＡ樹脂を得た。

【００２８】以下、次に示すアミノ基保護アミノ酸を用
いて順次25位から１位までのアミノ酸をカップリングし
た。 上記固相合成において、Asn 、Arg 、Gln 、His を用い
た場合はダブルカップリングを行った。

【００２９】このようにして、下記式： Ｂoc−His （Ｂom）−Ser （Ｂzl）−Asp （ＯＢz ）−
Gly-Ile−Phe −Thr（Ｂzl）−Asp （ＯＢz ）−Ser
（Ｂzl）−Tyr （Ｂzl）−Ser （Ｂzl）−Arg（Ｔos）
−Tyr （Ｂzl）−Arg （Ｔos）−Arg （Ｔos）−Gln
−Leu −Ala −Val-Arg(Ｔos）−Arg （Ｔos）−Tyr
（Ｂzl）−Leu −Ala −Ala −Val −Leu−ＭＢＨＡ樹
脂 で表される保護ペプチド−ＭＢＨＡ樹脂2.76ｇを得た。

【００３０】上記の保護ペプチド−ＭＢＨＡ樹脂2.76ｇ
にアニソ−ル 5mlを加え、さらに無水フッ化水素25mlを
加えて、０℃で１時間撹拌した。反応後、無水フッ化水
素を減圧下留去後、残査をエ−テルで洗浄し、これに
0.1Ｍ酢酸 100mlを加えてペプチドを抽出した。抽出液
をアンバ−ライトＩＲ-410の陰イオン交換樹脂20mlとと
もに１５分間撹拌した後、不溶性樹脂を濾過により除去
した。得られた溶液は、0.22μミリポアフィルタ−にて
濾過した後凍結乾燥して 823mgの白色粉末を得た。次に
ＣＭ−セルロ−スカラム（ 2.5×30cm）にかけ0.05Ｍか
ら 0.5Ｍの直線勾配をもったAcONH₄（ pH7.0）で溶出
（10ml/ フラクション）を行い、フラクション69〜82を
集めて目的とするペプチドの部分精製物 382mgを得た。
これをさらに以下に示す条件にて分取用高速液体クロマ
トグラフィ−で精製した。

【００３１】カラム：TSK GEL ODS-120T（21.5×300m
m） 溶 媒：0.1%ＴＦＡ−アセトニトリル（アセトニトリル
を20％から40％に変化させる直線勾配グラジェント） 流 速：10ml/min 目的物質であるピーク相当の溶出液を凍結乾燥し、当該
高速液体クロマトグラフィ−により、上記のペプチドの
部分精製物 100mgに対して精製ペプチド63mgを得た。こ
の精製ペプチドについて、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）の保持時間の測定、旋光度の測定及びアミ
ノ酸分析を行った。その結果を下記に示す。 ・ＨＰＬＣの保持時間：２７．２分 ・ [α] _D ：−５５．８° ・アミノ酸分析 Asp(2) 2.17, Thr(1) 0.98, Ser(3) 2.45, Glu(1) 1.0
9, Gly(1) 1.03, Ala(3) 3.18, Val(2) 2.14, Ile(1)
0.96, Leu(3) 3.07, Tyr(3) 2.73, Phe(1) 0.92,His(1)
1.12, Arg(5) 5.16

【００３２】〔実施例２〕実施例１と同様の方法で、下
記式： H-His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr- Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg- Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-NH₂ で表される精製ペプチド２を得た。この精製ペプチドの
収量を下記に示す。また、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）の保持時間の測定、旋光度の測定及びアミ
ノ酸分析を行った。その結果を下記に示す。 ・収量73mg ・ＨＰＬＣの保持時間：２７．６分 ・ [α] _D ：−５３．２° ・アミノ酸分析 Asp(2) 2.10, Thr(1) 0.97, Ser(3) 2.46, Glu(1) 0.9
7, Gly(2) 1.97, Ala(3) 3.15, Val(2) 2.13, Ile(1)
1.00, Leu(3) 3.08, Tyr(3) 2.75, Phe(1) 0.98,His(1)
0.99, Arg(5) 4.54

【００３３】〔実施例３〕実施例１と同様の方法で、下
記式： H-His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr- Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg- Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-NH₂ で表される精製ペプチド３を得た。この精製ペプチドの
収量を下記に示す。また、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）の保持時間の測定、旋光度の測定及びアミ
ノ酸分析を行った。その結果を下記に示す。 ・収量88mg ・ＨＰＬＣの保持時間：２７．０分 ・ [α] _D ：−５２．８° ・アミノ酸分析 Asp(2) 2.11, Thr(1) 0.95, Ser(3) 2.56, Glu(1) 0.9
7, Gly(2) 2.00, Ala(3) 3.15, Val(2) 2.10, Ile(1)
1.00, Leu(3) 3.08, Tyr(3) 2.75, Phe(1) 0.98,His(1)
1.03, Arg(5) 5.14, Lys(1) 1.01

【００３４】〔実施例４〕実施例１と同様の方法で、下
記式： H-His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr- Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg- Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-NH₂ で表される精製ペプチド４を得た。この精製ペプチドの
収量を下記に示す。また、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）の保持時間の測定、旋光度の測定及びアミ
ノ酸分析を行った。その結果を下記に示す。 ・収量84mg ・ＨＰＬＣの保持時間：２５．１分 ・ [α] _D ：−５４．３° ・アミノ酸分析 Asp(2) 2.09, Thr(1) 0.96, Ser(3) 2.44, Glu(1) 0.9
7, Gly(2) 2.01, Ala(3) 3.11, Val(2) 2.03, Ile(1)
1.02, Leu(3) 3.08, Tyr(3) 2.74, Phe(1) 0.97,His(1)
1.05, Arg(6) 6.10

【００３５】〔実施例５〕実施例１と同様の方法で、下
記式： H-His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr- Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg- Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-NH₂ で表される精製ペプチド５を得た。この精製ペプチドの
収量を下記に示す。また、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）の保持時間の測定、旋光度の測定及びアミ
ノ酸分析を行った。その結果を下記に示す。 ・収量76mg ・ＨＰＬＣの保持時間：２４．４分 ・ [α] _D ：−５２．２° ・アミノ酸分析 Asp(2) 2.11, Thr(1) 0.96, Ser(3) 2.47, Glu(1) 1.0
1, Gly(2) 2.00, Ala(3) 3.03, Val(2) 2.03, Ile(1)
1.02, Leu(3) 3.03, Tyr(3) 2.70, Phe(1) 0.97,His(1)
1.07, Arg(6) 6.15, Lys(1) 1.02

【００３６】〔実施例６〕実施例１と同様の方法で、下
記式： H-His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr- Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg- Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Arg-NH₂ で表される精製ペプチド６を得た。この精製ペプチドの
収量を下記に示す。また、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）の保持時間の測定、旋光度の測定及びアミ
ノ酸分析を行った。その結果を下記に示す。 ・収量85mg ・ＨＰＬＣの保持時間：２３．６分 ・ [α] _D ：−５３．７° ・アミノ酸分析 Asp(2) 2.09, Thr(1) 0.94, Ser(3) 2.51, Glu(1) 1.0
5, Gly(2) 2.00, Ala(3) 3.03, Val(2) 2.01, Ile(1)
1.02, Leu(3) 3.03, Tyr(3) 2.77, Phe(1) 0.97,His(1)
1.07, Arg(7) 7.11

【００３７】〔実施例７〕樹脂として、Ｃ末端アミノ酸
残基に相当するアミノ酸残基が結合したBoc-Arg(Tos)-P
AM樹脂（ペプチド研究所社製、アミノ基含有量：0.68mm
ol／ｇ）704mg を用いた以外は実施例１と同様の方法
で、下記式： H-His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr- Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg- Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-OH で表される精製ペプチド７を得た。この精製ペプチドの
収量を下記に示す。また、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）の保持時間の測定、旋光度の測定及びアミ
ノ酸分析を行った。その結果を下記に示す。 ・収量84mg ・ＨＰＬＣの保持時間：２３．８分 ・ [α] _D ：−５６．７° ・アミノ酸分析 Asp(2) 2.12, Thr(1) 0.96, Ser(3) 2.47, Glu(1) 1.0
1, Gly(2) 2.00, Ala(3) 3.03, Val(2) 2.03, Ile(1)
1.02, Leu(3) 3.03, Tyr(3) 2.70, Phe(1) 0.97,His(1)
1.03, Arg(6) 6.10, Lys(1) 1.02

【００３８】〔実施例８〕実施例１と同様の方法で、下
記式： H-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr- Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg- Arg-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-Gly-NH₂ で表される精製ペプチド８を得た。この精製ペプチドの
収量を下記に示す。また、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）の保持時間の測定、旋光度の測定及びアミ
ノ酸分析を行った。その結果を下記に示す。 ・収量68mg ・ＨＰＬＣの保持時間：２６．９分 ・ [α] _D ：−５８．７° ・アミノ酸分析 Asp(5) 5.11, Thr(2) 1.72, Ser(2) 1.61, Glu(1) 1.1
0, Ala(2) 2.00, Val(2) 2.00, Ile(1) 1.02, Leu(4)
4.15, Tyr(2) 1.86, Phe(1) 0.99, His(1) 0.95,Arg(5)
4.75

【００３９】〔実施例９〕実施例１と同様の方法で、下
記式： H-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr- Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg- Arg-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-Gly-Lys-NH₂ で表される精製ペプチド９を得た。この精製ペプチドの
収量を下記に示す。また、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）の保持時間の測定、旋光度の測定及びアミ
ノ酸分析を行った。その結果を下記に示す。 ・収量76mg ・ＨＰＬＣの保持時間：２５．４分 ・ [α] _D ：−５２．９° ・アミノ酸分析 Asp(5) 5.11, Thr(2) 1.83, Ser(2) 1.49, Glu(1) 1.0
9, Gly(1) 1.04, Ala(2) 2.01, Val(2) 2.01, Ile(1)
0.96, Leu(4) 4.19, Tyr(2) 2.03, Phe(1) 1.01,His(1)
1.07, Arg(6) 6.10, Lys(1) 1.05

【００４０】〔実施例10〕実施例１と同様の方法で、下
記式： H-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr- Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg- Arg-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-Gly-Arg-NH₂ で表される精製ペプチド10を得た。この精製ペプチドの
収量を下記に示す。また、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）の保持時間の測定、旋光度の測定及びアミ
ノ酸分析を行った。その結果を下記に示す。 ・収量77mg ・ＨＰＬＣの保持時間：２４．９分 ・ [α] _D ：−５２．５° ・アミノ酸分析 Asp(5) 5.12, Thr(2) 1.83, Ser(2) 1.55, Glu(1) 1.0
8, Gly(1) 1.03, Ala(2) 2.01, Val(2) 2.01, Ile(1)
0.96, Leu(4) 4.17, Tyr(2) 2.03, Phe(1) 1.01,His(1)
1.03, Arg(6) 6.15

【００４１】〔実施例11〕実施例１と同様の方法で、下
記式： H-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr- Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg- Arg-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-Gly-Lys-Arg-NH₂ で表される精製ペプチド11を得た。この精製ペプチドの
収量を下記に示す。また、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）の保持時間の測定、旋光度の測定及びアミ
ノ酸分析を行った。その結果を下記に示す。 ・収量87mg ・ＨＰＬＣの保持時間：２３．５分 ・ [α] _D ：−５５．５° ・アミノ酸分析 Asp(5) 5.11, Thr(2) 1.83, Ser(2) 1.49, Glu(1) 1.0
9, Gly(1) 1.04, Ala(2) 2.01, Val(2) 2.01, Ile(1)
0.96, Leu(4) 4.19, Tyr(2) 2.03, Phe(1) 1.01,His(1)
1.07, Arg(6) 6.10, Lys(1) 1.05

【００４２】〔実施例12〕実施例１と同様の方法で、下
記式： H-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr- Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg- Arg-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-Gly-Arg-Arg-NH₂ で表される精製ペプチド12を得た。この精製ペプチドの
収量を下記に示す。また、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）の保持時間の測定、旋光度の測定及びアミ
ノ酸分析を行った。その結果を下記に示す。 ・収量78mg ・ＨＰＬＣの保持時間：２３．０分 ・ [α] _D ：−５６．２° ・アミノ酸分析 Asp(5) 5.13, Thr(2) 1.84, Ser(2) 1.49, Glu(1) 1.0
8, Gly(1) 1.03, Ala(2) 2.01, Val(2) 2.01, Ile(1)
0.96, Leu(4) 4.19, Tyr(2) 2.03, Phe(1) 1.01,His(1)
1.02, Arg(7) 7.11

【００４３】〔実施例13〕樹脂として、Ｃ末端アミノ酸
残基に相当するアミノ酸残基が結合したBoc-Arg(Tos)-P
AM樹脂 704mgを用いた以外は実施例１と同様の方法で、
下記式： H-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr- Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg- Arg-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-Gly-Lys-Arg-OH で表される精製ペプチド13を得た。この精製ペプチドの
収量を下記に示す。また、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）の保持時間の測定、旋光度の測定及びアミ
ノ酸分析を行った。その結果を下記に示す。 ・収量83mg ・ＨＰＬＣの保持時間：２２．８分 ・ [α] _D ：−５８．６° ・アミノ酸分析 Asp(5) 5.15, Thr(2) 1.83, Ser(2) 1.53, Glu(1) 1.0
9, Gly(1) 1.01, Ala(2) 2.01, Val(2) 2.01, Ile(1)
1.02, Leu(4) 4.10, Tyr(2) 1.86, Phe(1) 1.00,His(1)
0.95, Arg(6) 6.15

【００４４】〔実施例14〕実施例１と同様の方法で、下
記式： H-His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr- Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Met-Ala-Val-Arg- Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-NH₂ で表される精製ペプチド14を得た。この精製ペプチドの
収量を下記に示す。また、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）の保持時間の測定、旋光度の測定及びアミ
ノ酸分析を行った。その結果を下記に示す。 ・収量 64mg ・ＨＰＬＣの保持時間：２５．１分 ・ [α] _D ：−５２．７° ・アミノ酸分析 Asp(2) 2.17, Thr(1) 0.98, Ser(3) 2.55, Glu(1) 1.0
3, Gly(1) 1.03, Ala(3) 3.18, Met(1) 0.96, Val(2)
2.14, Ile(1) 0.96, Leu(2) 2.07, Tyr(3) 2.73,Phe(1)
1.00, His(1) 1.01, Arg(5) 5.15

【００４５】〔実施例15〕実施例１と同様の方法で、下
記式： H-His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr- Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-nLeu-Ala-Val-Arg- Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-NH₂ で表される精製ペプチド15を得た。この精製ペプチドの
収量を下記に示す。また、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）の保持時間の測定、旋光度の測定及びアミ
ノ酸分析を行った。その結果を下記に示す。 ・収量 62mg ・ＨＰＬＣの保持時間：２６．２分 ・ [α] _D ：−５２．５° ・アミノ酸分析 Asp(2) 2.11, Thr(1) 0.95, Ser(3) 2.45, Glu(1) 1.0
4, Gly(1) 1.03, Ala(3) 3.18, Val(2) 2.14, Ile(1)
0.96, Leu(2) 2.10, Tyr(3) 2.73, Phe(1) 0.96,His(1)
1.02, Arg(5) 5.16, nLeu(1) 1.02

【００４６】〔実施例16〕上記実施例１〜15で得られた
精製ペプチド１〜15について下記の方法で気管支拡張作
用の効果を評価し、ＶＩＰ及びＰＡＣＡＰと比較した。
体重450-500gの雌のモルモットの頸静脈を切断し、開胸
し、直ちに気管を取り出した。これを直ちにクレブス液
中に入れ、輪状に切断し、軟骨部分同士をスチ−ル性の
糸でつなぎ、鎖状にした。次いで平滑筋部分がつながる
ように平滑筋部分と反対側の軟骨部分を切断した。でき
あがった標本を内容量約10ｍｌの恒温オルガンバスに入
れ上下につるした。下部を固定し、上部を1.4gの負荷を
かけたグラスフォーストランスデューサー(Grass force
transducers) に接続し、弛緩作用を測定した。この標
本には94%酸素と6%炭酸ガスを十分に吹き込み、かつ0.1
μmol/lカルバコ−ルを含有する37℃のクレブス液を0.3
3ml/minの流速で上部より滴下した。この滴下液に加え
た試料の容量に応じて弛緩反応が起こることから、これ
を利用してＶＩＰ及びＰＡＣＡＰと本発明のペプチドに
おける気管支平滑筋に対する弛緩作用を比較した。

【００４７】ＶＩＰ、ＰＡＣＡＰ及び本発明のペプチド
の試料溶液は、オルガンバス内の濃度を調製するため、
最終濃度の１００倍の濃度で作製し、カルバコール滴下
から30分後に１００μlを滴下した。カルバコ−ル無添
加の時の平滑筋の収縮の度合いを０、カルバコ−ル添加
の時の平滑筋の収縮の度合いを100とし、試料を添加し
た時の最も低い収縮の度合い（最大の弛緩値）Ａを求
め、下記式から最大弛緩率Ｂを計算した。

【００４８】最大弛緩率Ｂ（％）＝１００−Ａ また、最大弛緩後、試料添加から最大弛緩値の半分の値
を示すまでの時間（以後、半減時間Ｔという）を求め
た。図１にはＰＡＣＡＰ、図２には実施例５で得られた
ペプチド５、図３にはＶＩＰ、図４には実施例11で得ら
れたペプチド11の、それぞれ添加量 0.3μM、１μM及び
3μMの３用量についての気管支平滑筋の弛緩率の経時変
化を示す。これらの図から、3μMにおけるペプチド５及
びペプチド11の最大弛緩率Ｂは、それぞれ75％及び80％
であり、半減時間Ｔはともに 360分以上となることがわ
かる。したがって、本発明のペプチドは、ＶＩＰやＰＡ
ＣＡＰと同等の弛緩効果を有しながら、ＶＩＰ、ＰＡＣ
ＡＰよりも作用時間が長い、即ち持続性に優れるもので
あることが確認された。表１には、各ペプチドの各用量
における最大弛緩率Ｂと半減期Ｔを示す。

【００４９】

【表１】

【００５０】〔実施例17〕急性毒性試験 実施例１〜15で得られたペプチド１〜15を生理食塩水に
溶解し、マウスに 10mg ／kgの割合で静脈内投与を行っ
たが、死亡例は認められなかった。

【００５１】

【発明の効果】本発明によれば、平滑筋弛緩作用による
気管支拡張作用の持続性に優れたペプチドを提供するこ
とができた。したがって、このペプチド及びその塩は、
気管支拡張剤として有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰＡＣＡＰを添加した場合の気管支平滑筋の弛
緩率の経時変化を示す図である。

【図２】実施例５で得られたペプチド５を添加した場合
の気管支平滑筋の弛緩率の経時変化を示す図である。

【図３】ＶＩＰを添加した場合の気管支平滑筋の弛緩率
の経時変化を示す図である。

【図４】実施例11で得られたペプチド11を添加した場合
の気管支平滑筋の弛緩率の経時変化を示す図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成７年６月１４日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００９

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００９】また、本発明のペプチドの製造において、
カルボキシル基を保護する場合に用いる保護基として
は、通常用いられているものを挙げることができ、例え
ば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステ
ル、ブチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル等のア
ルキルエステル、ベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジ
ルエステル、メチルベンジルエステル、ｐ−クロロベン
ジルエステル、ベンズヒドリルエステル、ベンジルオキ
シカルボニルヒドラジド、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカル
ボニルヒドラジド、トリチルヒドラジド等が挙げられ
る。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１１】また、アミノ酸の中で、側鎖に官能基を有
するものについては、ペプチド結合形成反応中はその官
能基は保護されているのが好ましく、特に、Ｈｉｓ、Ｔ
ｙｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ａｒｇ及びＳｅｒにつ
いては、その側鎖の官能基を保護しておくのが好まし
い。官能基の保護は、通常用いられている方法で保護基
を結合させることにより行われる。ペプチドの合成終了
後、それらの保護基は脱離される。

【手続補正書】

【提出日】平成７年６月１６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００２

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００２】

【従来の技術】ＶＩＰ（血管作動性腸管ペプチド（Ｖａ
ｓｏａｃｔｉｖｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｐｅｐｔｉ
ｄｅ））は、脳−腸管ペプチドと呼ばれる、血流促進、
血圧低下作用をもつ生理活性ペプチドの一種である。こ
のＶＩＰは、１９７０年にブタ腸管から抽出されてお
り、２８個のアミノ酸残基からなる（Ｓ．Ｉ．Ｓａｉ
ｄ，Ｖ．Ｍｕｔｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６９，１２１７
（１９７０））。また、ＰＡＣＡＰ（下垂体アデニレー
トサイクラーゼ活性化ペプチド（ＰｉｔｕｉｔａｒｙＡ
ｄｅｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ Ａｃｔｉｖａｔｉ
ｎｇ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ））は、１９８９年、羊
の視床下部から下垂体培養細胞のアデニレートサイクラ
ーゼを活性化させるバイオアッセイ系を指標にして単離
され構造決定された３８個のアミノ酸残基よりなるペプ
チドである（Ａ．Ｍｉｙａｔａ，Ａ．Ａｒｉｍｕｒａ
ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ
ｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６４，５６７（１９８９））。
このＰＡＣＡＰのＮ末端側から２７残基がＰＡＣＡＰの
活性を有しており、この２７個のアミノ酸配列は、ＶＩ
Ｐと極めて類似した構造を有する。ＶＩＰ及びＰＡＣＡ
Ｐのアミノ酸配列はセクレチン、グルカゴン等に類似し
ていることから、グルカゴンファミリーに属するペプチ
ドとされており、その強い血管拡張、血流促進作用か
ら、潰瘍、しもやけ、インポテンツ、発毛あるいは育毛
などの効果が期待されている。また、ＶＩＰ及びＰＡＣ
ＡＰは、呼吸器系においては気管支平滑筋への弛緩作用
が非常に強く、アセチルコリン、ヒスタミン、セロトニ
ン等の刺激物質によって惹起された平滑筋収縮を緩解す
る作用がある。かかる弛緩作用は、アドレナリンβ_２レ
セプターを介して作用する一般の気管支拡張による弛緩
作用とは異なり、β_２レセプター刺激剤が有効に作用し
ない難治性の喘息発作に対しても効果が期待されてい
る。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００６

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００６】また、本発明は、上記のペプチド又はその
薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、気管
支拡張剤を提供する。本明細書において、アミノ酸、ペ
プチド、保護基、溶媒その他に関して略号で表示する場
合、国際純正及び応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）、国際生
化学連合（ＩＵＢ）の規定或いは該当分野における慣用
記号に従うものとする。ただしアミノ酸等に関し光学異
性体がありうる場合は、特に明示しなければＬ体を示す
ものとする。以下、その例を示す。 Ｈｉｓ；ヒスチジン残基 Ｓｅｒ；セリン残基 Ａｓｐ；アスパラギン酸残 基 Ａｌａ；アラニン残基 Ｖａｌ；バリン残基 Ｐｈｅ；フェニルアラニン 残基 Ｔｈｒ；スレオニン残基 Ｔｙｒ；チロシン残基 Ａｓｎ；アスパラギン残基 Ｌｅｕ；ロイシン残基 Ａｒｇ；アルギニン残基 Ｌｙｓ；リジン残基 Ｇｌｎ；グルタミン残基 Ｍｅｔ；メチオニン残基 Ｉｌｅ；イソロイシン残基 Ｇｌｙ；グリシン残基 ｎＬｅｕ；ノルマルロイシン残基 Ｂｏｃ；ｔ−ブトキシカルボニル基 Ａｏｃ；ｔ−アミルオキシカルボニル 基 Ｂｚｌ；ベンジル基 Ｚ ；ベンジルオキシカルボニル基 Ｔｏｓ；ｐ−トルエンスルホニル基 ＯＢｕｔ；ｔ−ブチルエステル ＯＭｅ；メチルエステル ＯＢｚ；ベンジルエステル ＯＮＰ；ｐ−ニトロフェニルエステル Ｂｏｍ；ベンジルオキシメチル基 ＴＦＡ；トリフルオロ酢酸 ＴＨＦ；テトラヒドロフラン ＤＣＭ；ジクロロメタン ＤＭＦ；ジメチルホルムアミド ＤＣＣ；ジシクロヘキシルカルボジイミド ＷＳＣ；Ｎ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノプロピル−カルボジイミド ＯＳｕ；Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル ＨＯＳｕ；Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド ＨＯＢｔ；１−ヒドロキシベンゾトリアゾール ＤＩＥＡ；ジイソプロピルエチルアミン 本発明のペプチドは，公知のペプチド合成の常法手段に
従って合成できる。例えば「ザ．ペプチド（Ｔｈｅ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ）」第１巻（１９６６年）［Ｓｃｈｒｅ
ｄｅｒ ａｎｄ Ｌｕｈｋｅ著、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｕ．Ｓ．Ａ．］、あるい
は「ペプチド合成」［泉屋ら著、丸善株式会社（１９７
５年）］に記載されている方法に従って、例えばアジド
法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、Ｄ
ＣＣ法、活性エステル法（Ｐ−ニトロフェニルエステル
法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル法、シアノ
メチルエステル法等）、ウッドワード試薬Ｋを用いる方
法、カルボイミダゾール法、酸化還元法、ＤＣＣ−アデ
イテイブ（ＨＯＮＢ、ＨＯＢｔ、ＨＯＳｕ）法等により
合成することができる。これらの方法は、固相合成法及
び液相合成法のいずれも適用できる。本発明のペプチド
は、上記のような一般的なポリペプチドの合成法によ
り、例えば、Ｃ末端アミノ酸に、アミノ酸配列にしたが
って順次１個ずつアミノ酸を縮合させるいわゆるステッ
プワイズ伸長法によって、又は数個のフラグメントに分
けて各フラグメントを合成し、それらをカップリングさ
せるフラグメント縮合法によって製造することができ
る。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式(1) ： H-His-Ser-Asp-Ａ -Ｂ -Phe-Thr-Asp-Ｃ -Tyr- Ｄ -Arg-Ｅ -Arg-Ｆ -Gln-Ｇ -Ala-Val-Ｉ - (1) Ｊ -Tyr-Leu-Ｋ -Ｌ -Ｍ -Leu-Ｎ （式中、Ａは、Ala 又はGly を示し；Ｂは、Ile 又はVa
   l を示し；Ｃは、Asn 又はSer を示し；Ｄは、Thr 又は
   Ser を示し；Ｅは、Leu 又はTyr を示し；Ｆ、Ｉ及びＪ
   は、同一でも異なってもよく、それぞれLys 又はArg を
   示すが、Ｆ、Ｉ及びＪの少なくとも一つはArg をであ
   り；Ｇは、Met 、Leu 又はｎLeu を示し；Ｋは、Asn 又
   はAla を示し；Ｌは、Ser 又はAla を示し；Ｍは、Ile
   又はVal を示し；Ｎは、-NH₂又はAsn-NH₂ を示す。但
   し、同時に、ＡがAla 、ＢがVal 、ＣがAsn 、ＤがThr
   、ＥがLeu 、ＫがAsn 、ＬがSer 、ＭがIle 及びＮがA
   sn-NH₂ になることはない。）又は、下記一般式(2) ： H-His-Ser-Asp-Ａ -Ｂ -Phe-Thr-Asp-Ｃ -Tyr- Ｄ -Arg-Ｅ -Arg-Ｆ -Gln-Ｇ -Ala-Val-Ｉ - (2) Ｊ -Tyr-Leu-Ｋ -Ｌ -Ｍ -Leu-Ｐ -Gly-Ｑ -Ｒ （式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ
   及びＭは、前記のとおりである。但し、Ｆ、Ｉ及びＪの
   少なくとも一つはArg である。Ｐは、Asn 又は化学結合
   を示し、Ｑは、Lys 、Arg 、Lys-Arg 、Arg-Arg 又は化
   学結合を示し、Ｒは-OH 又は-NH₂を示す。）で表される
   ペプチド又はその薬学的に許容される塩。
2. 【請求項２】 請求項１記載のペプチド又はその薬学的
   に許容される塩を有効成分として含有する、気管支拡張
   剤。