JPS61118399A - ペプチドホルモンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 直１」３１殻ｊ」ソし 本発明は医薬として有用なペプチド、詳しくはセクレチ
ン（５ｅｃｒｅｔｌｎ）　−Ｖ　Ｉ　Ｐ　（ｖａｓｏａ
ｃｔｉｖｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　　ｐｅｐｔｉｄｅ　
）　７アミリーに関連するペプチドホルモン及びその誘
導体の製造法に関する。

Ｌ１東１１ 最近のペプチドホルモンに関する研究の進歩により、消
化管に存在するペプチドホルモンの多くは、脳にも存在
し、逆に脳で発見されたホルモンの多数が消化管にも認
められることが判り、これらのホルモンは脳−腸管ペプ
チド（Ｂ　ｒａｉｎ　−ｇｕｔｐｅｐｔｉｄｅ　）と呼
称され、２等ホルモンに関する研究が神経内分秘中とし
て脚光を浴びている。

従来よりセクレチン−ＶＩＰファミリーに属するペプチ
ドホルモンとしては、セクレチン（Ｍｕｔｔ、Ｖ、　ｅ
ｔ　　ａｌ、　Ｅｕｒ、　　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、
上り。

５１３　（１９７０））、ＶＩＰ　（Ｍｕｔｔ、Ｖ、ｅ
ｔａｌ、　　Ｅｕｒ、　　Ｊ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、
４２．　５８１（１９７４）　）　、ＰＨＩ　（ｐｅｐ
ｔｉｄｅ　ｈｉｓｔｉｄｉｎｅｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）
　　（Ｔａｔｅｓｏｔｏ、に、　ｅｔ　　ａｌ、　Ｐｒ
ｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、　Ｖｏｌ、　
７８．　Ｎｏ。

１１．６６０３　（１９８１））及びＰＨＭ（ｐｅｐｔ
ｉｄｅ　ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ　ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）
　　（Ｎｏｂｕｙｕｋｉ。

１．ｅｔ　　ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖａｔ、３０４，５
４７（１９８３））が知られている。

また、最近本発明者等によって、ドクトカゲ（Ｇ　ｌｌ
ａ　ｍｏｎｓｔｅｒ　）の毒液（ｖｅｎｏ膳）に由来す
るペプチドホルモン、ヘロデルミン（ｈｅｌｏｄｅｒ■
ｉｎ）が報告され、哺乳動物以外のセクレチン−ＶＩＰ
ファミリー関連ペプチドとして、その生理作用と共に注
目されている（ＦＥＢＳ　　Ｌｅｔｔ、、Ｖｏｌ。

１６６　、Ｎｏ、２．２７３−２７６　（１９８４）：
同上、Ｖｏｌ、１６６、Ｎｏ、２．２７７−２８２（１
９８４）：同上、　Ｖｏｌ、　１７２．　ＮＯ，１。

５５−５８　（１９８４））。

が解決しようとする　照点 上記へロデルミンは、ドクトカゲの毒液に存在するもの
であり、該１１１Ｍよりゲル濾過法、抽出法、イオン交
換クロマトグラフィー、高精度液体クロマトグラフィー
等の物理、化学的手段により得られているが、今だその
化学構造、アミノ酸配列は究明されていない。

本発明はこのペプチドホルモン、ヘロデルミン及びそれ
と同等の生理作用を有するペプチドを、化学合成手段に
よって、より容易に高純度でしかも大量に製造する方法
を提供することを目的とする。

問題　を解　するための手 本発明によれば、一般式 ％式％ 〔式中Ｒ１は水素原子又はＨ−Ｈｉｓ　−Ｓ　ｅｒ　−
Ａ　５Ｄ−Ａｌａ　−Ｉ　Ｉｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌ
ｎ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−３ｅｒ　−Ｌｌ／Ｓ　−Ｌｅｕ　
−Ｌｅｔｌ−Ａ　Ｉａ　−Ｌｙｓ−１−ｅｕ−Ａｌａ−
１−ａｌｌ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−基を示す。

またＲ２は水酸基又はアミノ基を示す。〕で表わされる
アミノ酸配列を有するペプチドを、アミノ酸の縮合反応
により化学合成することを特徴とするペプチドホルモン
及びその誘導体の製造法が提供される。

本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護基、活性
基、その他に関して略号で表示する場合はＩＬＪＰＡＣ
，ＩＬＪＢの規定或いは当該分野における慣用記号に従
うものとし、その例を次に挙げる。またアミノ酸等に関
して光学異性体がありうる場合は、特に明記しなければ
０体、Ｌ体又はラセミ体を示すものとする。

Ｌ　ｅｕ　；ロイシン　　　Ａｌａ：アラニン３　ｅｒ
　；セリン　　　　ｉｌｅ：イソロイシンＧｌｙニゲリ
シン　　　Ａ　ｒＯ：アルギニンＴｈｒ：スレオニン　
　ｐ　ｒｏ　；プロリンＨｉｓ：ヒスチジン　　Ａ　Ｓ
Ｄ　：アスパラギン酸Ｑｌｎ；グルタミン　　Ｐ　ｈｅ
　：フェニルアラニンＴｙｒ；チロシン　　　Ｌｙｓ：
リジンＴｏｓ；ｐ−トルエンスルホニル基 ９　ｏｃ　：第３級ブトキシカルボニル基［３２１：ベ
ンジル基 ０Ｂｚｌ：ベンジルオキシ基 ＣＩ　、−Ｂｚｌ：　２，６−ジクロルベンジル基ＣＩ
−Ｚ；２−りＯルベンジルオキシ力ルボニル基 上記一般式（１）で表わされるペプチド中、Ｒ１がＨ−
Ｈｉｓ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉ　ｌａ−Ｐｈｅ−
Ｔ　ｈｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｓ
　ｅｒ　−Ｌ　ＶＳ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ−Ａ　Ｉ
ａ　−Ｌ　ＹＳ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｅｕ
−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｙｓ−Ｔ　ｙｒ−基を示し、且つＲ
２がアミノ基であるペプチドは、前記したヘロデルミン
である。

一般式（１）で表わされるペプチドは、いずれもそのホ
ルモン作用（生理作用）に基づき、例えば血管拡張作用
、血流増加作用、膵液の分泌促進作用、平滑箭弛緩作用
、アデニレート　サイクラーゼ活性の刺激によるｃ　−
ＡＭＰレベルの上昇作用等を有し、例えば、血流改善剤
、血管拡張剤、気管支拡張剤等として有用である。

本発明によれば上記一般式（１）で表わされるペプチド
を、入手容易な市販のアミノ酸を利用して、簡単な操作
で容易にしかも高純度且つ大量に製造することができる
。

以下、本発明の化学合成法につき詳述する。

アミノ酸の綜合反応を利用したペプチドの化学合成法は
、それ自体公知であり、本発明においても基本的には公
知のペプチド合成法をいずれも採用することができる。

その具体例としては、例えハ「サ　　ペプチド（Ｔｈｅ
　　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　）　Ｊ第１巻（１９６６年）　
　（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ　ａｎｄ　Ｌｕｈｋｅ著、Ａｃａ
ｄｅｍｉｃｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）
或いは「ペプチド合成」　〔東屋ら著、丸善株式会社（
１９７５年）〕に記載される如き方法、例えばアジド法
、クロライド法、ａ！無無水演法混酸無水物法、ＤＣＣ
法、活性エステル法（ｐ−ニトロフェニルエステル法、
Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル法、シアノメチ
ルエステル法等）、ウッドワード試薬Ｋを用いる方法、
カルボジイミダゾール法、酸化還元法、ＤＣＣ／アディ
ティブ（ＨＯＮＢ、ＨＯＢｔ　、ＨＯ８ｕ　）法等を例
示できる。上記においては、固相合成法及び液相合成法
のい゛ずれをも適用できる。本発明においては、上記し
た一般のポリペプチドの合成法に従い、例えば、末端ア
ミノ酸に順次１個づつアミノ酸を縮合させる所謂ステッ
プワイズ法により、又は数個のフラグメントに分けてカ
ップリングさせていく方法により、一般式（１）で表わ
されるアミノ酸配列を有する所望のペプチドを製造する
ことができる。

より詳細には、例えば固相合成法はメリフィールド（Ｍ
ｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　、　Ｒ，Ｂ、　）の方法（Ｓｏｌ
ｉｄＤｈａＳｅ　　Ｉ）ｅｐｔｉｄｅ　　５ｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ、Ｊ　　、　　Ａｌｅｒ、Ｃｈｅｍ。

Ｓａｃ、、８５．２１４９〜２１５９（１９６３））に
従い、以下の如（して行なうことができる。即ち、Ｃ末
端アミノ酸（アミノ基を保護したもの）をそのカルボキ
シル基によって、不溶性担体に結合させ、次いでアミノ
保護基を除去した後、一般式（１１′で表わされるアミ
ノ酸配列に従い順次アミノ基保護アミノ酸を、その反応
性アミノ基及び反応性カルボキシル基との縮合反応によ
り結合させ、一段階ずつ合成し、全配列を合成した後、
ペプチドを不溶性担体からはずすことにより製造される
。ここで用いられる不溶性担体は、反応性カルボキシル
基との結合性を有する各種のもののいずれでもよく、例
えばクロロメチル樹脂、ブロモメチル樹脂等のハロゲノ
メチル樹脂やヒドロキシメチル樹脂、フェノール樹脂、
ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニルヒドラジド化樹脂
等及び脱離によリアミドを与える例えばベンズヒドリル
アミン系樹脂等を用いることができる。

またＮ末端アミノ酸をそのアミノ基によって、該アミノ
基との結合性を有する通常の不溶性担体に結合させ、同
様にして合成することもできる。

この場合及び液相法を利用する場合において、一般式（
１）中Ｒ２がアミノ基を示すペプチドを合成するときに
は、Ｃ末端アミノ酸即ちｐｒｏは、常法に従い例えばク
イツト等の方法（Ｐ、　Ｑｕｉｔｔｅｔ　　ａｔ、　Ｈ
ｅ１ｂ、Ｃｈｉｉ、Ａｃｔａ、４６　．３２７（１９６
３））に準じてプロリンアミドとして使用される。

上記各種方法において側鎖官能基を有する各アミノ酸、
例えばＨｉｓ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ａｒ
Ｑ及びＳｅｒは、その側鎖官能基を保護しておくのが好
ましく、これは通常の保護基により保護され、反応終了
後該保護基は脱離される。また反応に関与する官能基は
、通常活性化される。これら各反応方法は、公知であり
、それらに用いられる試薬等も公知のものから適宜選択
される。

アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカル
ボニル、Ｂｏｃ、ｔｅｒｔ−アミルオキシカルボニル、
イソボルニルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジル
オキシカルボニル、ＣＩ−Ｚ、アダマンチルオキシカル
ボニル、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、
０−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィ
ノチオイル基等が挙げられる。

Ｈｉｓのイミノ基の保護基としては、例えばＴ　Ｏ３゜
８２１、ベンジルオキシカルボニル、トリチル基等が挙
げられる。

Ｓｅｒ及びＴｈトの水酸基は、例えばエステル化又はエ
ーテル化によって保護することができるが、必ずしも保
護する必要はない。このエステル化に適する基としては
、アセチル等の低級アルカノイル基、ベンゾイル等のア
ロイル基、ベンゾイルオキシカルボニル、エチルオキシ
カルボニル等の炭酸から誘導される基等が挙げられる。

またエーテル化に適する基としては、Ｂｚｌ、テトラヒ
ドロピラニル、ｔｅｒｔ−ブチル基等を例示できる。

Ｔｙｒの水酸基の保護基としては、例えばＢｚｌ、Ｃｌ
　２−ＢＺＩ、ベンジルオキシカルボニルチル、Ｔｏｓ
基等が挙げられる。

Ｌｙｓのアミノ基の保護基としては、例えばベンジルオ
キシカルボニル、ＣＩ　−Ｚ，　Ｃｌ　ｔ　　Ｂｚｌ、
ＢｏｏＳＴＯＳ基等が挙げられる。

ＡＳＩ）のカルボキシル基の保護は、例えばベンジルア
ルコール、メタノール、エタノール、ｔｅｒｔ−ブタノ
ール等によるエステル化により行なわれる。

ＡｒＯのグアニジノ基の保護基としては、例えばＴ　ｏ
ｓ，ニトロ、ベンジルオキシカルボニル、アミルオキシ
カルボニル基等が挙げられる。

カルボキシル基の保護基としては、例えばアルキルエス
テル（メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔｅｒｔ−
ブチル等）、Ｂｚ１エステル、ｐ−ニトロベンジルエス
テル、ＭＢＺＩエステル、ｐ−クロロベンジルエステル
、ベンズヒドリルエステル、カルボベンゾキシヒドラジ
ド、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルヒドラジド、ト
リチルヒドラジド等を形成し得る基を例示できる。

カルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば対
応する酸クロライド、酸無水物又は混合酸無水物、アジ
ド、活性エステル（ペンタクロロフェノール、ｐ−ニト
ロフェノール、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド、Ｎ−ヒ
トＯキシベンズトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノ
ルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド等とのエステ
ル）等が挙げられる。

上記方法において反応性アミノ基と反応性カルボキシル
基との縮合反応（ペプチド結合形成反応）は、溶媒の存
在下に行ない得る。溶媒としては、ペプチド結合形成に
使用し得ることが知られている各種のもの、例えば無水
または含水のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチ
ルスルホキシド（ＤＭＳＯ）　、ピリジン、クロロホル
ム、ジオキサン、ジクロルメタン、テトラヒドロフラン
（ＴＨＦ）、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、ヘキ
サメチルリン酸トリアミド（ＨＭＰＡ）ｔいはこれらの
混合溶媒等を用い得る。同原料化合物の使用割合は、特
に限定はないが、通常一方に対して他方を等モルｍ−５
倍モル量、好ましくは等モル量〜１．５倍モル量とする
のがよい。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され
る通常の範囲、一般には約−４０’Ｃ〜約６０℃、好ま
しくは約−２０℃〜約４０℃の範囲から適宜選択される
。

反応時間は一般に数分〜３０時間程度である。

混合酸無水物法は、適当な溶媒中、塩基性化合物の存在
下、クロロａｍメチル、ブロモ蟻酸メチル、クロ０１１
！！エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル
等のアルキルハロカルボン酸を用いて行なわれる。塩基
性化合物としては、例えばトリエチルアミン、トリメチ
ルアミン、ピリジン、ジメチルアニリン、Ｎ−メチルモ
ルホリン、１、５−ジアザビシクロ（４．３，Ｏ）ノネ
ン−５　（ＤＢＮ）、１．５−ジアザビシクロ（５．４
。

０〕ウンデセン−５　（ＤＢＵ）、１．４−ジアザビシ
クロ（２．２．２）オクタン（ＯＡＢＧＯ＞等の有機塩
基や炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム
、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基を使用できる。溶媒
としては、混合酸無水物法に慣用の各種溶媒、具体的に
は塩化メチレン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハ
ロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等
の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ＴＨＦ、ジメ
トキシエタン等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸エチル
等のエステル類、ＤＭＦ，ＤＭＳＯ。

ＨＭＰＡ等の非プロトン性極性溶媒等を使用できる。反
応は通常−２０〜１００℃、好ましくは一２０〜５０’
Ｃにおいて行なわれ、反応時間は一般に５分〜１０時間
、好ましくは５分〜２時間である。

またアジド化法は、まず活性化されたカルボキシル基、
例えばメチルアルコール、エチルアルコール、ベンジル
アルコール等のアルコールで活性化されたカルボキシル
基に、ヒドラジン水和物を適当な溶媒中にて反応させる
ことにより行なわれる。溶媒としては例えばジオキサン
、ＤＭＦ。

ＤＭＳＯ又はこれらの混合溶媒等を使用できる。

セトラジン水和物の使用量は、活性化されたカルボキシ
ル基に対して通常５〜２０倍モル量、好ましくは５〜１
０倍モル量とするのがよい。反応は通常５０℃以下、好
ましくは一２０〜３０℃にて行なわれる。斯くしてカル
ボキシル基部分がヒドラジンで置換された化合物くヒド
ラジン誘導体）を製造し得る。

カルボキシル基部分がアジドで［換された化合物は、酸
の存在下、適肖な溶媒中、上記で得られるヒドラジン誘
導体と亜硝酸化合物を反応させることにより製造される
。酸としては通常塩酸を、溶媒としてはジオキサン、Ｄ
ＭＦ、ＤＭＳＯ又はこれらの混合溶媒等を、また亜硝酸
化合物としては亜硝酸ナトリウム、亜硝酸イソアミル、
塩化ニトロシル等を各々使用することができる。斯かる
亜硝酸化合物は、ヒドラジン誘導体に対して通常等モル
〜２倍モル量、好ましくは等モル−１，５倍モル量用い
られる。反応は通常−２０〜０℃、好ましくは−２０〜
−１０℃にて行なわれ、一般に５〜１０分程度で反応は
終了する。

尚、ペプチド結合形成反応は、縮合剤例えばジシクロへ
キシルカルボジイミド（ＤＣＣ）　、カルボジイミダゾ
ール等のカルボジイミド試薬やテトラエチルピロホスフ
ィン等の存在下に実施することもできる。

上記の各反応行程及び最終行程において、保護基の脱離
を要する場合、これは通常の脱離反応に従って行なわれ
る。該方法としては例えばパラジウム、パラジウム黒等
の触媒を用いる水素添加、液体アンモニア中金属ナトリ
ウムによる還元等の還元的方法、トリフルオロ酢酸、塩
化水素脛、弗化水素、メタンスルホン酸、臭化水素酸等
の強酸によるアシドリシス等を例示することができる。

上記触媒を用いる水素添加は、例えば水素圧１気圧、０
〜４０℃にて行ない得る。触媒の使用量は通常１００１
１ｇ〜１ｇ程度とするのがよく、一般に１〜４８時間程
度で反応は終了する。また上記アシドリシスは、無溶媒
下、通常０〜３０℃程度、好ましくは０〜２０℃程度で
約１５分〜１時間程度を要して行なわれる。酸の使用量
は原料化合物に対し通常５〜１０倍量程度とするのがよ
い。該アシドリシスにおいてアミノ基の保護基のみを脱
離する場合は、酸としてトリフルオロ酢酸又は塩化水素
酸を使用するのが好ましい。更に上記液体アンモニア中
金属ナトリウムによる還元は、反応液がパーマネントブ
ルーに３０秒〜１０分間程度呈色しているような量の金
属ナトリウムを用い、通常−４０℃〜−７０℃程度にて
行ない得る。

上記のようにして製造された一般式（１）のペプチドは
反応混合物からペプチドの分離手段例えば抽出、分配、
カラムクロマトグラフィー等により単！ｌｙ＃製される
。

かくして得られる一般式（１）のペプチドは、薬理的に
許容される酸性化合物又は塩基性化合物と塩を形成させ
ることができる。かかる酸性化合物としては、例えば塩
酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸等の無りｌ酸、フマール
酸、マレイン酸、酢酸、シュウ酸、リンゴ酸、クエン酸
等の有灘酸を、また塩基性化合物としては、例えば水酸
化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭
酸ナトリウム、炭酸水素カリウム等を挙げることができ
る。

一般式（１）のペプチド及びその塩は、例えばこれを血
流改善剤として用いるに当り、通常製剤的担体と共に製
剤組成の形態に加工されるが、中でも注射剤の形態に加
工され使用されるのが好ましい。

注射剤として調製される場合、得られる製剤は殺菌され
且つ血液と等張であるのが好ましい。注射剤の形態に成
形するのに際しては、希釈剤としてこの分野に於いて慣
用されているものをすべて使用できる。例えば、水、生
理食塩水等を挙げることができる。なおこの場合等優性
の溶液を：Ｊ製するに充分な量の食塩、あるいはグリセ
リンを注射剤の形態の製剤中に含有せしめてもよい。ま
た上記製剤には通常の！！衝剤、無痛化剤、保存剤等、
更に必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味
剤等や他の医薬品をも含有せしめ得るものである。また
上記有効成分は使用時に注射用蒸溜水に溶解し、溶時溶
解剤としても使用できる。

上記の如くして調製される製剤は、その形態に応じた方
法で投与され得る。注射剤の場合には単独であるいはア
ミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与される。

有効成分の投与量は使用目的、症状等により適宜決定さ
れるが、通常１人１日当り１ｍｇ〜１１ｇ／ｋｇ程度の
範囲で用いるのが好ましく、また１日に２〜４回分割投
与するのが好ましい。

以下、本発明を更に詳しく説明するため、一般式（１）
で表わされるペプチドの製造例を挙げるが、本発明はこ
れらに限定されるものではない。

尚、各製造例において各アミノ酸は１体を示すものとす
る。

製造例　１ ■　塩化メチレン２５−にＢｏａ−Ｐｒｏ−ＯＨの７７
４ｓａを溶解し、ベンズヒドリルアミン樹脂（０，４ミ
リモルＮＨ２１０樹脂：財団法人蛋白質研究奨励会）６
ａを加えて空温で１２０分間反応させる。樹脂を塩化メ
チレン２５ＩＩ１ｇで、１．５分間、６回繰り返し洗浄
し、減圧乾燥して３ｏｃ−Ｐｒｏ−樹脂を得る。

■　上記■で得たＢ　ｏｃ−Ｐ　ｒｏ−樹脂を１％エタ
ンジチオール、２５％トリフルオロ酢１（ＴＦＡ）の塩
化メチレン溶液２５Ｑに加え、空温で３０分間反応させ
る。樹脂を塩化メチレン２５−で６回、１０％トリエチ
ルアミンの塩化メチレン溶液２５−で１．５分間、３回
、次いで塩化メチレン２５−で１．５分間、６回それぞ
れ洗浄してＨ−Ｐ　ｒ。

−樹脂を得る。

Ｂ　ｏｃ　−Ｐ　ｒｏ　−ＯＨの８３７ｓｏを塩化メチ
レンに溶かした溶液２５ｍ２に上記Ｈ−Ｐ　ｒｏ−樹脂
を加え、次いでＤＣＣの７４３　ｗｒｇを塩化メチレン
に溶かした溶Ｒ７，２−を加え空温で２時間反応させる
。

樹脂を塩化メチレン２５−で１．５分間、６回洗浄後、
Ｂ　ｏｃ　−Ｐ　ｒｏ　−ＯＨの８３７１０及び１−ヒ
ドロキシベンゾトリアゾール４８６１Ｂをジメチルホル
ムアミド１０ｍ１２及び塩化メチレン１５ｍ２に溶解し
た溶液に加え、次いでＤＣＣの７４３ｍｇを塩化メチレ
ンに溶かした溶液７．２−を加えて再度同様に反応させ
る（二重カップリング法）。樹脂を塩化メチレンで充分
に洗浄してＢ　ｏｃ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｐ　ｒ。

−樹脂を得る。

■　上記■と同様にして、９　ｏｃ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｐ
　ｒｏ−樹脂の脱３ｏｃ化を行ない、次いで下記アミノ
酸を順次縮合及び脱３ｏｃ反応に付す。

３ｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ８３７ｍＱ Ｂｏａ−８ｅｒ（Ｂｚｌ）−０Ｈ１０６２ｍ１）Ｂｏａ
−Ｔｈｅ（Ｂｚｌ）　−ＯＨ１２０５１ＧＢＯＣ−Ａｒ
ｔ）（ＴＯ８）−０８１６７０Ｊ１１３ｏｃ−８ｅｒ（
８ｚｌ）　−ＯＨ’Ｉｏｅ２ｒａａＢｏａ−ＧＩＶ−ｏ
ｔ−＋　　　　　　　　６３０１１３Ｂｏａ−Ｌｅｕ−
ＯＨ９００１ａ Ｂｏｃ−ｌｌ５−ＯＨ９００ｓａ Ｂｏａ−３ｅｒ（Ｂｚｌ）　−ＯＨ１０６２ｍ！ＩＩ［
３ｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ６８１ｍ。

Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、９００ｍ＋ＩＩ斯くしてＨ−Ｌ
ｅｕ−Ａｌａ−８ｅｒ（Ｂｚｌ）　−１１ｅ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｙ−８ｅｒ（Ｂｚｌ）　−Ａｒ（＋　（Ｔｏｓ）　
−Ｔｈｒ　（Ｂｚｌ）　−Ｓｅｒ　（Ｂｚｌ）　−Ｐｒ
ｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒ。

−ｍａｒを得る。このうち３．５９をアニソール４嘘及
びメチルエチルスルフィド０．７５−を含む弗化水素４
０ｍ１２に溶かし、０℃で６０分間インキュベーション
させた後、過剰の弗化水素を減圧留去し、残渣を酢酸エ
チルで３回洗浄後、３　Ｍｌｆｆ！！！１００１１にて
抽出し、凍結乾燥して粗製品１０２０ｍりを得る。この
５００ｓａをセファデックスＧ−２５（ファルマシア社
、カラム２．４×１４５０１、溶出液１Ｍ酢酸）による
ゲルか過、さらに高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）〔カラム；ＴＳＫ　　ＧＥＬ　　０ＤＳ−１２０Ｔ
（東洋曹達株式会社）　、０．４６Ｘ２５ｃ■、溶出二
０．０１　Ｎ−ＨＣ（１／ＣＨ３０Ｎ−７５／２７→５
５／４５　（３０分）のグラジェント、流速１１Ｉ１２
／分）にて精製して、Ｈ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−３ｅｒ　−
Ｉ　ｌｅ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｓ　ｅｒ　−Ａ
　ｒａ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｓ　ｓｒ　−Ｐ　ｒｏ−Ｐ　ｒ
ｏ−Ｐ　ｒｏ−Ｎ　Ｈ２の１７０ｓａを得る。

製造例　２ 前記製造例１で得たＨ−Ｌｅｔｌ−Ａｌａ−３ｅｒ（Ｂ
ｚｌ）　−１１ｅ　−Ｌｅｕ−’Ｇｌｙ−８ｅｒ（Ｂｚ
ｌ）　−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−８ｅｒ
（Ｂｚｌ）−Ｐ　ｒｏ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｃ
１脂に製造例１と同様にして、以下のアミノ酸を順次縮
合及び脱３ｏｃ化反応させる。

Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（ＣＱ　２−ＢＺＩ）　−ＯＨ６４９ｍ
ａ Ｂｏａ−Ｌｙｓ（Ｃ＋２−Ｚ）　−ＯＨ・（ｔ　−ブチ
ルアンモニウム塩；ＴＢＡ）　　　１７５４ｍｇＢｏａ
−Ｇｌｎ−ＯＨ８８６■ｇ Ｂｏａ−Ｌｅｕ　−ＯＨ９００ｍ！Ｊ Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ６８１１！ＩＩ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ９００１０ Ｓａｃ−Ｌｙｓ（Ｃ＋２−Ｚ）−ＯＨ−ＴＢＡ１７５４
ｍ（ｊ Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ’　６８１ｓａ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ９００ｉ＋。

Ｂｏａ−Ｌｅｕ−ＯＨ９００膳り Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＱ−Ｚ）−ＯＨ−ＴＢＡ７５４ｗａ Ｂｏａ−８ｅｒ（Ｂｚｌ）　−ＯＨ１０６２１０Ｂｏａ
−ＴＶｒ（ＣＱｚ　　−８２１）　　−ＯＨ１６４９１
０８ｏｃ−Ｇｉｎ−ＯＨ８８６膳り ３ｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ８８６ｍｇ ３ｏｃ−下ｈｒ（Ｂｚｌ）　−ＯＨ１２０５１ｇ３ｏｃ
−Ｐｈｅ−ＯＨ９５４ｍ！Ｊ ３ｏｃ−１ｉｅ−ＯＨ９００ｍａ Ｂｏａ−Ａｌａ−ＯＨ６８１ｓａ Ｂｏｃ−Ａｓｐ（８ｚｌ）−ＯＨ１１６３■すＢｏａ−
５ｅｒ（Ｂｚｌ）　　−ＯＨ１０６２園ｇＢｏｃ−Ｈ１
ｓ（Ｔｏｓ）　　−ＯＨ１４７３１り斯りシテ、Ｈ−Ｈ
ｉｓ（Ｔｏｓ）−３ｅｒ（Ｂｚｌ）−ＡＳＤ（ＢＺＩ）
−Ａｌａ−Ｉ　　１ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ｇ
ｌｎ−Ｇｉｎ−Ｔｙｒ（ＣＱ２　−ＢＺＩ）　　−３ｅ
ｒ（Ｂｚｌ）−Ｌｙｓ（ＣＱ−Ｚ）　　−Ｌｅｕ−Ｌｅ
ｕ−Ａｌａ−ＬＶＳ（Ｃ２−Ｚ）−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｎ−ＬｙＳ（Ｃ１２Ｚ）　　　ＴＶｒ（ＣＱ
２２　　Ｂｚｌ）　　　Ｌｅｕ−Ａｌａ−８ｅｒ（Ｂｚ
ｌ）　　−１Ｉｓ−１−ｅｕ−Ｑｌｙ−３ｅｒ（Ｂｚｌ
）ｌ５−１−ｅｕ−Ｑｌｙ−３ｅｒ（Ｂｚｌ）−Ａｒ　
Ｂｚｌ）　−Ｐｒｏ　−Ｐｒｏ　−Ｐｒｏ−１１１ｉを
得る。このうち１．００を用い前記製造例１と同様にし
て、保Ｉ！基及び樹脂の脱離を行ない、ついでｗｉ製し
て１２０１１１！ＩＩのＨ−Ｈｉｓ−３ｅｒ−Ａｓｐ−
Ａｌａ　−ｒ　Ｉｅ　−Ｐ　ｈｅ−Ｔ　ｈｒ−Ｇ　Ｉｎ
−Ｇ　Ｉｎ−Ｔ　ｙｒ−Ｓ　ｅｒ−Ｌ　ｙｓ　−Ｌｅｕ
　−Ｌｅｕ　−Ａ　Ｉａ　−ＬＶｓ　−Ｌｅｕ　−Ａ　
Ｉａ　−Ｌｅｕ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｙｓ−Ｔ　ｙｒ　
−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　Ｉａ　−Ｓ　ｅｒ　−１１ｅ　−Ｌ
　ｅｕ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｓ　ｅｒ　−Ａ　ｒｏ　−Ｔ　
ｈｒ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｐ　ｒＱ　−Ｐ　ｒ
Ｑ　−Ｎ　Ｈ２を得る。

ＨＰＬＣ結果； （μ９ｏｎｄａｐａｋ　Ｃ−１８カラム（Ｗ　ａｔｅｒ
ｓＡｓｓｏｃ、、Ｍ　ｌ１ｆｏｎｄ、　ＭＡ　；　３　
、８　ｘ　３００ｓＩｍ）、０．０１　Ｎ−ＨＣＱ／Ｃ
Ｈ３０Ｎ−０／１００〜４５／１００　（４５分）のグ
ラジェント、流速１−７分による〉 保持時間；４１．４分 尚、天然品（ＦＥＢＳ　　Ｌｅｔｔ、、　Ｖａｔ、　１
６６（２）、２７３−２７６　（１９８４））を同一条
件にて展開した結果、溶出位置は上記と一致した。

アミノ酸分析： ４％チオグリコール酸を含む６Ｎ−ＨＣ（ｌにて１１０
℃、２４時間加水分解後、ニンヒドリン又は０−フタル
アルデヒド（ＯＰＡ）により、アミノ酸分析計８３５型
（日立製作所）を用いて分析した。結果を次表に示す。

分　　　析　　　値 アミノ　　　　　ニンヒドリン　　０ＰＡＡｓｐ（１）
　　　　０．９５　　　　０．９２Ｔｈｒ（２）　　　
　１．９５　　　　１．９８Ｓｅｒ（５）　　　　４．
６０　　　　４．７０Ｇｌ１３）　　　　２．７８　　
　　２．８６Ｇｌｙ（１）　　　　１．１０　　　　１
．１１Ａｌａ（４）　　　　３．９９　　　　４．０６
１１ｅ（２）　　　　２．０２　　　　２．０２Ｌｅｕ
（６）　　　　６．３３　　　　６．１９Ｔｙｒ（２）
　　　　１．９４　　　　１．９６Ｐｈｅ（１）　　　
　０．９１　　　　０．９０Ｌｙｓ（３）　　　　３．
００　　　　２．９２Ｈｉｓ（１）　　　　０．９１　
　　　１．００Ａｒｌｌｌ（１）　　　　１．１１　　
　　１．０９製造例　３ 前記製造例１において、ベンズヒドリルアミン樹脂に代
えてクロロメチル化ポリスチレン樹脂（財団法人蛋白質
研究奨励金、２％ジビニルベンゼン、メツシュ２００〜
４００）の８ｇを用いる以外は、同様にしてＨ−Ｌｅｕ
−Ａｌａ−８ｅｒ−１１ｅ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　ｌｙ　−Ｓ
　ｅｒ　−Ａ　ｒａ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｐ　
ｒｏ−Ｐ　ｒｏ　−Ｐ　ｒｏ　−ＯＨの１５０■０を得
る。

（以　上） 手続補正書（方側 昭和６０年３月１９日 昭和５９年特許願第２３９８９３号 ２　発明の名称 ペプチドホルモンの製造法 ３　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 大塚製薬株式会社 ４代理人 大阪市東区平野町２の１０　沢の鶴ピル昭和６０年２月
２６日 ６　補正の対象 明１ｌＩＩｌ中「発明の詳細な説明」の欄７　補正の内
容 別紙添付の通り 補　　正　　の　　内　　容 １　明細書第２頁第１３行〜第３頁第３行に「セクレチ
ン・・・・・・が知られている。」とあるを次の通り訂
正する。

「セクレチン〔ムット　ブイら、ユーロ、ジ工−、バイ
オケーム、　　（Ｍｕｔｔ、Ｖ、　ｅｔ　　ａｌ、　Ｅ
ｕｒ。

Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１５．５１３　（１９７０）
）ＶｉＰ（同上（Ｍｕｔｔ、Ｖ、　ｅｔ　　ａｌ、　Ｅ
ｕｒ、　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｇｔ、）、４２．５８１　（１９７４））
、ＰＨ１（ペプチド　ヒスチジン　イソロイシン、ｐｅ
ｐｔｉｄｅ　ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ　ｌ５ｏｌｅｕｃｉｎ
ｅ）　（タテモトケーら、ブロック、ナアットル、アカ
デ、ソサイ、ニーニスニー（Ｔａｔｅｍｏｔｏ、に、　
ｅｔ　　ａｌ。

Ｐ　ｒｏｃ、Ｎ　ａｔｌ、Ａ　ｃａｄ、ｓ　ｃｆ、、Ｕ
　Ｓ　Ａ　）　、　Ｖ　ｏｆ。

７８、Ｎｏ、１１．６６０３　（１９８１））及びＰＨ
Ｍ　（ペプチド　ヒスチジン　メチオニン、ｐｅｐｔｉ
ｄｅ　ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ　ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）　
　（ノブユキアイら、ネーチャー（Ｎ　ｏｂｕｙｕｋｉ
、　Ｉ　、　ａｔ　　ａｌ。

Ｎａｔｕｒｅ　）　Ｖｏｌ、　３０４．５４７　（１９
８３）　）が知られている。」 ２　明細書第３頁第９行にｒＦＥＢｓ　　ＬｅｔｔＪと
あるを、［フエプス　レット（ＦＥＢＳＩＪｔｔ）Ｊと
訂正する。

３　明細書第７頁第４〜５行にｒ　Ｓ　ｃｈｒｏｄｅｒ
　・−−−−−ＵＳＡＪとあるを「シューレーダー　ア
ンドリューケ（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ　ａｎｄ　Ｌｕｈｋｅ
）著、アカデミツク　プレス　ニューヨーク　ニーニス
ニー（Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ　、　Ｎｅｗ　Ｙ
ｏｒｋ、ＬｊＳＡＪと訂正する。

４　明細書第８頁第５〜７行に「（Ｓｏｌｉｄ・・・・
・・（１９６３））Ｊとあるを次の通り訂正する。

「〔ソリッド　フェーズ　ペプチド　シンセシス（Ｓｏ
ｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ　）　、ジエー、アメル、ケーム、ソック、　　（
Ｊ、　Ａｍｅｒ。

Ｃｈｅｗ、Ｓｏｃ、　）　、　８５．２１４９〜２１５
９（１９６３））Ｊ ５　明細書第９頁第１１〜１３行に「方法・・・・・・
（１９６３））Ｊとあるを次の通り訂正する。

「方法（ビー　クイツトら、ヘルプ、キーム。

アクタ、　　（Ｐ、　Ｑｕｉｔｔ　　ｅｔ　　ａｌ、、
Ｈｅ１ｂ、Ｃｈｉｍ。

Ａｃｔａ、４６，３２７　　（１９６３））Ｊ６　明細
書第２５頁第９〜１０行に ｒ　ｕ　Ｂ　ｏｎｄａｐａｋ　・−・−３００ｉ＋ｎ）
　Ｊとあるを次の通り訂正する。

「マイクロボンダーバック（μＢｏｎｄａｐａｋ　）　
Ｃ−１８カラム〔ウォーターズ社＜　ｗ　ａｔｅｒｓＡ
　５ｓｏｃ、、ミルホント　エム　ｘ　−（Ｍ　１ｌｆ
ｏｏｄ。

ＭＡ）：３．８ｘ３００１ｓ）Ｊ ７　明細書第２５頁第１５行にｒＦＥＢｓＬｅｔｔＪと
あるを、「フェツス　レット（ＦＥＢＳ　　Ｌｅｔｔ　
）　Ｊ　ト訂正ｔル。

（ｊＸ　　上）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式 Ｒ＾１−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇ
   ｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒ
   ｏ−Ｐｒｏ−Ｒ＾２ （式中Ｒ＾１は水素原子又はＨ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓ
   ｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ
   −Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−
   Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔ
   ｙｒ−基を示す。またＲ＾２は水酸基又はアミノ基を示
   す。〕 で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドを、アミノ
   酸の縮合反応により化学合成することを特徴とするペプ
   チドホルモン及びその誘導体の製造法。