JPH0479356B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト白血病ウイルス（Adult Ｔ−
cell leukemia Virus；ATLV又はHuman Ｔ−
cell leukemia Virus；HTLV）に特異的な新し
い抗体の製造法に関する。 本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護
基、活性基、核酸塩基、その他に関して略号で表
示する場合はIUPAC、IUBの規定或いは当該分
野における慣用記号に従うものとし、その例を次
に挙げる。またアミノ酸等に関して光学異性体が
ありうる場合は、特に明記しなければＬ体を示す
ものとする。 Ser；セリン Leu；ロイシン Thr；スレオニン Asn；アスパラギン Gln；グルタミン Glu；グルタミン酸 Lys；リジン Pro；プロリン Val；バリン Trp；トリプトフアン His；ヒスチジン Asp；アスパラギン酸 Gly；グリシン Ile；イソロイシン Ala；アラニン Tyr；チロシン Met；メチオニン Phe；フエニルアラニン Arg；アルギニン Cys；システイン Ａ；アデニン Ｔ；チミン Ｇ；グアニン Ｃ；シトシン Tos；ｐ−トルエンスルホニル基 Boc；第３級ブトキシカルボニル基 ONP；ｐ−ニトロフエノキシ基 Bzl；ベンジル基 OBzl；ベンジルオキシ基 Cl₂−Bzl；２，６−ジクロルベンジル基 Cl−Ｚ；２−クロルベンジルオキシカルボニル
基 ヒト白血病ウイルスは、成人Ｔ細胞白血病
（ATL）より分離され、該疾患との関連が注目さ
れているウイルスである。本発明者の吉田、菅野
は、遺伝子工学的手法をもちい、宿主細胞の
DNAに組込まれたプロウイルス遺伝子をクロー
ニング（cloning）し、その全塩基配列を決定し
た。これに基づいて該疾患ならびに該ウイルス感
染の診断・治療・予防の基礎を確立し、先に特許
申請を行なつた（特願昭57−214287号）。決定さ
れた上記ウイルス遺伝子のコア（ギヤグ）蛋白前
駆体をコードする塩基配列を下記第１表に示す。 【表】 【表】 【表】 上記第１表より、コア−蛋白前駆体は、429個
のアミノ酸から成ることが示され、既に報告され
ているｐ−24の末端構造〔Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.Vol.79，pp1291〜1294（1982）参照〕から
考えて、該前駆体はさらに切断されてｐ−14，ｐ
−24及びｐ−10のコア−蛋白となることが予想さ
れた。 上記の如き観点にもとづき、本発明者等は、上
記ヒト白血病ウイルスの関連蛋白（コア−蛋白）
のハプテンとなり得る特定のペプチドを見い出
し、これと担体との複合体から成る免疫抗原か
ら、ATLV及びこれに関連するペプチドと特異
反応性を有し、該ATLV関連蛋白等の精製に利
用でき、またATLV感染症の診断等を可能とす
る新しい抗体を収得するに成功し、ここに本発明
を完成するに至つた。 即ち本発明は式 Ｈ−Val−Val−Gln−Pro−Lys−Lys−Pro−
Pro−Pro−Tyr−OH (1) で表わされるペプチド、一般式 Ｒ−Met−Gly−Gln−Ile−Phe−Ser−Arg−
Ser−Ala−Ser−Pro−OH (2) 〔式中Ｒは水素原子又はＨ−Tyr基を示す。〕 で表わされるペプチド、式 Ｈ−Tyr−Pro−Glu−Gly−Thr−Pro−Lys−
Asp−Pro−Ile−Leu−Arg−Ser−Leu−OH
(3) で表わされるペプチド、式 Ｈ−Tyr−Val−Glu−Pro−Thr−Ala−Pro
−Gln−Val−Leu−OH (4) で表わされるペプチド、一般式 Ｒ−Ile−Pro−His−Pro−Lys−Asn−Ser−
Ile−Gly−Gly−Glu−Val−OH (5) 〔式中Ｒは上記に同じ。〕 で表わされるペプチド及び一般式 Ｒ−Thr−Trp−Thr−Pro−Lys−Asp−Lys
−Thr−Lys−Val−Leu−OH (6) 〔式中Ｒは上記に同じ。〕 で表わされるペプチドからなる群より選ばれたヒ
ト白血病ウイルス関連ペプチドと担体との複合体
からなる免疫抗原を哺乳動物体に投与し、生成す
る抗体を採取することを特徴とするヒト白血病ウ
イルス抗体の製造法に係る。 本発明によれば入手容易な市販のアミノ酸を利
用して、簡単な操作で容易に合成することができ
る上記式(1)〜(6)の各ペプチドをハプテンとして用
いて抗原を作成し、該抗原からATLV関連蛋白
に特異反応性を有する所望抗体を、容易に大量に
しかも安定して収得することができる。本発明に
より得られる特異抗体はこれを例えばアフイニテ
イークロマトグラフイー用担体と結合させて、該
クロマトグラフに利用する等によりATLV関連
蛋白の精製に用いることができ、また該ATLV
関連蛋白の各種免疫測定法における特異抗体とし
て使用でき、ヒト白血病ウイルス感染の診断、ひ
いては、成人Ｔ細胞白血病、皮膚型Ｔ細胞リンパ
種等の成熟Ｔ細胞白血病・リンパ種ならびにこれ
等に関連する疾患の診断、研究等に利用できる。 上記式(1)〜(6)で表わされるペプチドは、通常の
ペプチド合成法、具体的には「ザ ペプチド
（The Peptides）」第１巻（1966年）〔Schroder
and Luhke著、Academic press，New York，
USA〕或いは「ペプチド合成」〔泉屋ら著、丸善
株式会社（1975年）〕に記載される如き方法に従
い、例えばアジド法、クロライド法、酸無水物
法、混酸無水物法、DCC法、活性エステル法
（ｐ−ニトロフエニルエステル法、Ｎ−ヒドロキ
シコハク酸イミドエステル法、シアノメチルエス
テル法等）、ウツドワード試薬Ｋを用いる方法、
カルボジイミダゾール法、酸化還元法、DCC／
アデイテイブ（HONB、HOBt、HOSu）法等に
より製造できる。上記方法においては、固相合成
法及び液相合成法のいずれをも適用できる。通常
本発明に利用するペプチドは、上記した一般のポ
リペプチドの合成法に従い、例えば末端アミノ酸
に順次１個づつアミン酸を縮合させる所謂ステツ
プワイズ法により、又は数個のフラグメントに分
けてカツプリングさせていく方法により製造され
る。より詳細には、例えば固相合成法を採用する
場合、Ｃ末端アミノ酸をそのカルボキシル基によ
つて、不溶性担体に結合させる。不溶性担体とし
ては、反応性カルボキシル基と結合性を有するも
のであれば特に限定はなく、例えばクロロメチル
樹脂、ブロモメチル樹脂等のハロゲノメチル樹脂
やヒドロキシメチル樹脂、フエノール樹脂、tert
−アルキルオキシカルボニルヒドラジド化樹脂等
を使用できる。 次いでアミノ保護基を除去した後、式(1)〜(6)で
表わされるアミノ酸配列に従い順次アミノ基保護
アミノ酸を、その反応性アミノ基及び反応性カル
ボキシル基との縮合反応により結合させ、一段階
ずつ合成し、全配列を合成した後、ペプチドを不
溶性担体からはずすことにより製造される。 上記においてArg、His、Tyr、Glu、Thr、
Lys、Asp及びSerの各アミノ酸は、その側鎖官
能基を保護しておくのが好ましく、これは通常の
保護基により保護され、反応終了後該保護基は脱
離される。また反応に関与する官能基は、通常活
性化される。これら各反応方法は、公知であり、
それらに用いられる試薬等も公知のものから適宜
選択される。 アミノ基の保護基としては、ベンジルオキシカ
ルボニル、Boc、tert−アミルオキシカルボニ
ル、イソボルニルオキシカルボニル、ｐ−メトキ
シベンジルオキシカルボニル、Cl−Ｚ、アダマン
チルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、
フタリル、ホルミル、ｏ−ニトロフエニルスルフ
エニル、ジフエニルホスフイノチオイル基等が挙
げられる。 Argの保護基としては、Tos、ニトロ、ベンジ
ルオキシカルボニル等が挙げられる。 Hisのイミノ基の保護基としては、Tos、Bzl、
ベンジルオキシカルボニル、トリチル基等が挙げ
られる。 Ser及びThrの水酸基の保護基としては、Bzl、
tert−ブチル、アセチル、テトラヒドロピラニル
基等が挙げられる。 Tyrの水酸基の保護基としては、Bzl、Cl₂−
Bzl、ベンジルオキシカルボニル、アセチル、
Tos基等が挙げられる。 Lysのアミノ基の保護基としては、ベンジルオ
キシカルボニル、Cl−Ｚ、Cl₂−Bzl、Boc、Tos
基等が挙げられる。 Glu及びAspのカルボキシル基の保護は、ベン
ジルアルコール、メタノール、エタノール、tert
−ブタノール等とのエステル化により行なわれ
る。 カルボキシル基の活性化されたものとしては、
例えば対応する酸クロライド、酸無水物又は混合
酸無水物、アジド、活性エステル（ペンタクロロ
フエノール、ｐ−ニトロフエノール、Ｎ−ヒドロ
キシサクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンズトリ
アゾール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−
２，３−ジカルボキシイミド等とのエステル）等
が挙げられる。尚ペプチド結合形成反応は、縮合
剤例えばジシクロヘキシルカルボジイミド、カル
ボジイミダゾール等のカルボジイミド試薬やテト
ラエチルピロホスフイン等の存在下に実施し得る
場合もある。 以下、上記ペプチドの製造の一例につき反応行
程式を挙げて具体的に説明する。 〔反応行程式−１〕 Ａ−Tyr−OH (イ) ↓ Ａ−Tyr−R¹ (ロ) ↓ Ｈ−Tyr−R¹ (ハ) ↓ Ａ−Pro−OH (ニ) Ａ−Pro−Tyr−R¹ (ホ) ↓↓↓ Ａ−Val−Val−Gln−Pro−Lys−Lys−Pro−
Pro−Pro−Tyr−R¹ (ヘ) ↓ Ｈ−Val−Val−Gln−Pro−Lys−Lys−Pro−
Pro−Pro−Tyr−OH (1) 〔式中Ａはアミノ基の保護基及びR¹は不溶性
担体を示す。〕 上記において、Ａの好ましいものとしては
Boc、ベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキ
シベンジルオキシカルボニル基等を、またR¹の
好ましいものとしてはクロロメチル化ポリスチレ
ン等をそれぞれ例示することができる。 また、各反応において、使用するアミノ酸が反
応に関与しない側鎖官能基を有する場合は、常法
どうり、前述した保護基により、保護され、これ
は不溶性担体R¹の脱離と同時に脱離される。 上記方法において、アミノ酸(イ)と不溶性担体
R¹との反応は、常法に従いアミノ酸(イ)の反応性
カルボキシル基を利用して、これをR¹と結合さ
せることによつて行なわれる。該反応は例えばク
ロロメチル化ポリスチレンを使用する場合は適当
な溶媒中、例えばトリエチルアミン、カリウム
tert−ブトキシド、炭酸セシウム、水酸化セシウ
ム等の塩基性化合物の存在下に行なわれる。溶媒
としては、例えばジメチルホルムアミド
（DMF）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ピ
リジン、クロロホルム、ジオキサン、ジクロロメ
タン、テトラヒドロフラン（THF）、Ｎ−メチル
ピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミド
（HMPA）等又はこれらの混合溶媒等を例示する
ことができる。上記反応は、通常０〜85℃、好ま
しくは25〜80℃程度、数分〜24時間程度で終了す
る。アミノ酸と不溶性担体との使用割合は通常後
者１当量に対して前者を過剰量、一般に１〜３倍
当量とするのがよい。 かくして得られる一般式(ロ)の固相化アミノ酸の
保護基Ａの脱離反応は、常法により行なわれる。
該方法としては例えばパラジウム、パラジウム黒
等の触媒を用いる水素添加、液体アンモニア中、
金属ナトリウムによる還元等の還元的方法、トリ
フルオロ酢酸、塩化水素酸、弗化水素、メタンス
ルホン酸、臭化水素酸等の強酸によるアシドリシ
ス等を例示することができる。上記触媒を用いる
水素添加は、例えば水素圧１気圧、０〜40℃にて
行ない得る。触媒の使用量としては通常100mg〜
1g程度とするのがよく、一般に１〜48時間程度
で反応は終了する。また上記アシドリシスは、無
溶媒下、通常０〜30℃程度、好ましくは０〜20℃
程度で約15分〜１時間程度を要して行なわれる。
酸の使用量は原料化合物に対し通常５〜10倍量程
度とするのがよい。該アシドリシスにおいて保護
基Ａのみを脱離する場合は酸としてトリフルオロ
酢酸又は塩化水素酸を使用するのが好ましい。更
に上記液体アンモニア中金属ナトリウムによる還
元は、反応液がパーマネントブルーに30秒〜10分
間程度呈色しているような量の金属ナトリウムを
用い、通常−40℃〜−70℃程度にて行ない得る。 次いで得られる一般式(ハ)の固相化アミノ酸とア
ミノ酸(ニ)（もしくはそのカルボキシル基の活性化
されたもの）との反応は、溶媒の存在下に行なわ
れる。該溶媒としては、ペプチド縮合反応に慣用
される公知の各種のもの、例えば無水DMF、
DMSO、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、
ジクロロメタン、THF、酢酸エチル、Ｎ−メチ
ルピロリドン、HMPA或いはこれらの混合溶媒
等を例示することができる。また該反応は、必要
に応じて、通常のペプチド結合形成反応に用いら
れる試薬、例えばＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカル
ボジイミド（DCC）、Ｎ−エチル−N′−ジメチル
アミノカルボジイミド、１−エチル−３−ジイソ
プロピルアミノカルボジイミド、１−シクロヘキ
シル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カ
ルボジイミド等のカルボジイミド類等の脱水縮合
剤の存在下に行なうことができる。アミノ酸(ハ)と
アミノ酸(ニ)との使用割合としては、特に限定はな
いが、通常前者に対して後者を等モル量〜10倍モ
ル量、好ましくは等モル量〜５倍モル量とするの
がよい。脱水縮合剤の使用量も特に限定はなく、
通常アミノ酸(ニ)に対して、好ましくは等モル量程
度使用される。反応温度はペプチド結合形成反応
に使用される通常の範囲、一般には約−40℃〜約
60℃、好ましくは約−20℃〜約40℃の範囲から適
宜選択される。反応時間は一般に数分〜30時間程
度とされる。 かくして得られる一般式(ホ)のペプチドは、上記
と同様に保護基Ａの脱離後、式(1)で表わされるア
ミノ酸配列に従い、Ａ−Pro−OH、Ａ−Pro−
OH、Ａ−Lys−OH、Ａ−Lys−OH、Ａ−Pro−
OH、Ａ−Gln−OH、Ａ−Val−OH、Ａ−Val−
OHの各アミノ酸もしくは側鎖官能基を保護され
たもの乃至そのカルボキシ基を活性化されたもの
と順次縮合反応させることにより行なわれ、斯く
して一般式(ヘ)で表わされるペプチドに誘導するこ
とができる。これら縮合反応及び保護基Ａの脱離
反応は、それぞれ前記した方法と同様にして行な
われる。 また得られるペプチド(ヘ)は、同様にして保護基
Ａの脱離、アミノ酸の側鎖官能基の保護基の脱離
及び不溶性担体R¹の脱離により、式(1)で表わさ
れるペプチドに誘導される。ここで側鎖官能基の
保護基及び不溶性担体R¹の脱離反応は、保護基
Ａの脱離反応と同様に行ない得、この場合酸とし
て弗化水素又は臭化水素酸を用いるのが好まし
い。尚、上記方法において使用される各アミノ酸
は、いずれも公知の市販品でよい。 以上のようにして製造された式(1)のペプチド
は、反応混合物からペプチドの分離手段例えば抽
出、分配、カラムクロマトグラフイー等により単
離精製される。 また、式(2)〜(6)で表わされる各ペプチドも、上
記に準じて製造される。 かくして得られる各ペプチド(1)〜(6)は、これら
に¹²⁵I，¹³¹I等の放射性物質、パーオキシダーゼ
（POX）、キモトリプシノーゲン、プロカルボキ
シペプチダーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン
酸脱水素酵素、アミラーゼ、ホスホリラーゼ、Ｄ
−Nase、Ｐ−Nase、β−ガラクトシダーゼ、グ
ルコース−６−フオスフエートデハイドロゲナー
ゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等の各種酵素
試薬等を導入することにより、ラジオイムノアツ
セイ（RIA）法又はエンザイムイムノアツセイ
（EIA）法において用いられる標識抗原として利
用できる。上記放射性物質の導入は、通常の方法
により実施できる。例えば放射性ヨードは、クロ
ラミンＴを用いる酸化的ヨード化法〔W.M.
Hunter and F.C.Greenwood；Nature.194，495
（1962）、Biochem.J.89，144，（1963）参照〕等
により行なわれ、酵素試薬の導入は、通常のカツ
プリング法例えばエルランガー（B.F.Erlanger）
らの方法〔Acta.Endocrinol.Suppl.，168，206
（1972）〕及びカロール（M.H.Karol）らの方法
〔Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，57，713（1967）〕
等の公知の方法によつて行なうことができる。 以下、上記で得られるペプチド(1)〜(6)をハプテ
ンとして利用した抗原の製造方法につき詳述す
る。 上記抗原はペプチド(1)〜(6)のいずれかをハプテ
ンとし、これをハプテン−担体結合試薬の存在下
に、適当な担体と反応させることにより製造され
る。上記においてハプテンに結合される担体とし
ては、通常抗原の作成に当り慣用される高分子の
天然もしくは合成の蛋白質を広く使用できる。該
担体としては例えば馬血清アルブミン、牛血清ア
ルブミン、ウサギ血清アルブミン、人血清アルブ
ミン、ヒツジ血清アルブミン等の動物の血清アル
ブミン類；馬血清グロブリン、牛血清グロブリ
ン、ウサギ血清グロブリン、人血清グロブリン、
ヒツジ血清グロブリン等の動物の血清グロブリン
類；馬チログロブリン、牛チログロブリン、ウサ
ギチログロブリン、人チログロブリン、ヒツジチ
ログロブリン等の動物のチログロブリン類；馬ヘ
モグロブリン、牛ヘモグロブリン、ウサギヘモグ
ロブリン、人ヘモグロブリン、ヒツジヘモグロブ
リン等の動物のヘモグロブリン類；キーホールリ
ンペツトヘモシアニン（KLH）等の動物のヘモ
シアニン類；回虫より抽出された蛋白質（アスカ
ーリス抽出物、特開昭56−16414号公報、J.
Immun.，111，260〜268（1973）、J.Immun.，
122，302〜308（1979）、J.Immun.，98，893〜900
（1967）及びAm.J.Physiol.，199，575〜578
（1960）に記載されたもの又はこれらを更に精製
したもの）；ポリリジン、ポリグルタミン酸、リ
ジン−グルタミン酸共重合体、リジン又はオルニ
チンを含む共重合体等を挙げることができる。 ハプテン−担体結合試薬としては、通常抗原の
作成に当り慣用されているものを広く使用でき
る。具体的にはTyr、His、Trpを架橋結合させ
る、例えばビスジアゾタイズドベンジジン
（BDB）、ビスジアゾタイズド−３，3′−ジアニ
ジジン（BDD）等のジアゾニウム化合物；アミ
ノ基とアミノ基とを架橋結合させる、例えばグリ
オキサール、マロンジアルデヒド、グルタールア
ルデヒド、スクシンアルデヒド、アジポアルデヒ
ド等の脂肪族ジアルデヒド類；チオール基とチオ
ール基とを架橋結合させる、例えばＮ，N′−ｏ
−フエニレンジマレイミド、Ｎ，N′−ｍ−フエ
ニレンジマレイミド等のジマレイミド化合物；ア
ミノ基とチオール基とを架橋結合させる、例えば
メタマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル、４−（マレイミドメチル）−
シクロヘキサン−１−カルボキシル−N′−ヒド
ロキシスクシンイミドエステル等のマレイミドカ
ルボキシル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル類；アミノ基とカルボキシル基とをアミド結
合させる通常のペプチド結合形成反応に用いられ
る試薬、例えばDCC、Ｎ−エチル−N′−ジメチ
ルアミノカルボジイミド、１−エチル−３−ジイ
ソプロピルアミノカルボジイミド、１−シクロヘ
キシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）
カルボジイミド等のカルボジイミド類等の脱水縮
合剤等を挙げることができる。また上記ハプテン
−担体結合試薬としては、ｐ−ジアゾニウムフエ
ニル酢酸等のジアゾニウムアリールカルボン酸類
と通常のペプチド結合形成反応試薬、例えば上記
脱水縮合剤とを組合せたものも使用可能である。 上記抗原の製造反応は、例えば水溶液もしくは
PH７〜10の通常の緩衝液中、好ましくはPH８〜９
の緩衝液中、０〜40℃、好ましくは室温付近で行
なわれる。該反応は通常約１〜24時間、好ましく
は３〜５時間で完結する。上記において用いられ
る代表的緩衝液としては、次のものを例示でき
る。 0.2N水酸化ナトリウム−0.2Mホウ酸−0.2M塩
化カリウム緩衝液、 0.2M炭酸ナトリウム−0.2Mホウ酸−0.2M塩化
カリウム緩衝液、 0.05M四ホウ酸ナトリウム−0.2Mホウ酸−
0.05M塩化ナトリウム緩衝液、 0.1Mリン酸二水素カリウム−0.05M四ウ酸ナ
トリウム緩衝液 上記においてハプテン、ハプテン−担体結合試
薬及び担体の使用割合は、適宜に決定できるが、
通常ハプテンに対して担体を１〜６倍重量程度、
好ましくは１〜５倍重量程度、及びハプテン−担
体結合試薬を５〜10倍モル程度用いるのがよい。
上記反応によりハプテン−担体結合試薬を仲介さ
せて担体とハプテンとが結合したペプチド−担体
複合体からなる所望の抗原が収得される。 反応終了後得られる抗原は常法に従い、例えば
透析法、ゲル過法、分別沈澱法等により容易に
単離精製できる。 斯くして得られる抗原は、通常蛋白質１モルに
対してペプチドが平均５〜60モル結合したもので
あり、いずれも引き続き該抗原に対して特異性の
高い抗体の製造を可能とするものである。 本発明方法に従う上記抗原からの抗体の製造
は、上記抗原を哺乳動物に投与し、生体内に所望
抗体を産生させ、これを採取することにより実施
される。 抗体の製造に供せられる哺乳動物としては、特
に制限はないが、通常ウサギやモルモツトを用い
るのが好ましい。抗体の産生に当つては、上記に
より得られる抗原の所定量を生理食塩水で適当濃
度に希釈し、フロインドの補助液（Complete
Freund′s Adjuvant）と混合して懸濁液を調整
し、これを哺乳動物体に投与すればよい。例えば
ウサギに上記懸濁液を皮内注射（抗原の量として
0.1〜５mg／回）し、以後２週間毎に２〜10ケ月、
好ましくは４〜６ケ月間投与し免疫化させればよ
い。抗体の採取は、上記懸濁液の最終投与の１〜
２週間経過後、免疫化れた動物から採血し、これ
を遠心分離後、血清を分離することにより行なわ
れる。上記によれば、用いる抗原に対して優れた
特異性を有する抗体を収得でき、これはRIA法、
EIA法等に利用してヒト白血病ウイルス関連蛋白
の定量に用い得る。 以下本発明を更に詳しく説明するため、式(1)〜
(6)で表わされる各ペプチドの製造例及びこれによ
り得られるペプチドからの抗原の製造例を挙げ、
次いで本発明の抗体の製造例を挙げるが、本発明
はこれらに限定されるものではない。 尚、各製造例におけるRf値はシリカゲル上の
薄層クロマトグラフイーにて下記混合溶媒を用い
て測定したものである。 Rf¹…ｎ−ブタノール−酢酸−水（４：１：５） Rf²…ｎ−ブタノール−酢酸−ピリジン−水
（15：３：10：12） 〈ペプチドの製造〉 製造例 １ カリウムtert−ブトキシド15.33ミリ当量の
DMSO溶液42mlにBoc−Tyr（Cl₂−Bzl）−OH
の7.53gを溶解し、クロロメチル化ポリスチレ
ン樹脂（財団法人蛋白質研究奨励会）10gを加
えて、80℃で30分間反応させる。樹脂を
DMSO、50％酢酸／クロロホルム、塩化メチ
レンの順に、充分に洗浄し、減圧乾燥して12g
のBoc−Tyr（Cl₂−Bzl）−樹脂を得る。 一部を加水分解後アミノ酸分析を行なつた結
果アミノ酸0.31mmol／ｇ樹脂であつた。 上記で得たBoc−Tyr（Cl₂−Bzl）−樹脂
1.70gをクロロホルム30mlで３回洗浄後、50％
トリフルオロ樹脂（TFA）のクロロホルム溶
液30mlに加え、室温で20分間反応させる。樹脂
をウロロホルム30mlで１回、塩化メチレン30ml
で５回、10％トリエチルアミンの塩化メチレン
溶液30mlで３回、次いで塩化メチレン30mlで６
回それぞれ洗浄してＨ−Tyr（Cl₂−Bzl）−樹脂
を得る。 Boc−Pro−OHの0.28gを塩化メチレンに溶
かした溶液25mlに上記Ｈ−Tyr（Cl₂−Bzl）−樹
脂を加え、次いでDCCの0.27gを塩化メチレン
に溶かした溶液５mlを加え室温で２時間反応さ
せる。樹脂を塩化メチレン30mlで６回洗浄後、
Boc−Pro−OHの0.28g及び１−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール0.55gの塩化メチレン25mlに
加え、次いでDCCの0.27gを塩化メチレンに溶
かした溶液５mlを加えて再度同様に反応させる
（二重カツプリング法）。樹脂を塩化メチレンで
充分に洗浄してBoc−Pro−Tyr（Cl₂−Bzl）−
樹脂を得る。 上記と同様にして、Boc−Pro−Tyr（Cl₂
−Bzl）−樹脂の脱Boc化を行ない、次いで下記
アミノ酸、側鎖官能基保護アミノ酸又はカルボ
キシル基の活性化されたアミノ酸を順次縮合及
び脱Boc反応に付す。 Boc−Pro−OH 0.28g Boc−Pro−OH 0.28g Boc−Lys（Cl−Ｚ）−OH 0.55g Boc−Lys（Cl−Ｚ）−OH 0.55g Boc−Pro−OH 0.28g Boc−Gln−ONP 0.48g Boc−Val−OH 0.29g Boc−Val−OH 0.29g 斯くしてＨ−Val−Val−Gln−Pro−Lys（Cl−
Ｚ）−Lys（Cl−Ｚ）−Pro−Pro−Pro−Tyr（Cl₂−
Bzl）−樹脂の2.57gを得る。このうち1.20gをアニ
ソール２ml及び弗化水素20mlに溶かし、−20℃で
30分間、次いで０℃で30分間インキユベーシヨン
させた後、過剰の弗化水素を減圧留去し、残渣を
10％酢酸にて抽出し、エーテルにて洗浄する。水
層を凍結乾燥し、次いでセフアデツクスＧ−25
（フアルマシア社、溶出液1M酢酸）によるゲル
過、さらにCM−23・セルロース（ワツトマン
社、0.04M酢酸アンモニウム、PH7.2）を用い精
製してＨ−Val−Val−Gln−Pro−Lys−Lys−
Pro−Pro−Pro−Tyr−OH162mgを得る。以下こ
のペプチドを「ペプチドＡ」と呼ぶ。 Rf値： Rf¹＝0.01 Rf²＝0.27 元素分析値： （C₅₆H₈₉O₁₃N₁₃・3CH₃CO₂Ｈ・4H₂Ｏとして） Ｃ（％） Ｈ（％） Ｎ（％） 理論値 53.02 7.82 12.96 分析値 52.94 8.06 12.74 アミノ酸分析値：（日立835型にて分析） 分析値 Gln(1) 1.05＊ Lys(2) 2.17 Pro(4) 4.02 Tyr(1) 1.05 Val(2) 1.69 ＊ Gluとして検出。 製造例 ２ 製造例１のと同様にして得たBoc−Pro−樹
脂（0.44mmol／ｇ樹脂）1.20gに、製造例１の
及びと同様にして、以下の各アミノ酸又はその
誘導体を順次縮合及び脱Boc化反応させる。 Boc−Ser（Bzl）−OH 0.39g Boc−Ala−OH 0.25g Boc−Ser（Bzl）−OH 0.39g Boc−Arg（Tos）−OH 0.56g Boc−Ser（Bzl）−OH 0.39g Boc−Phe−OH 0.35g Boc−Ile−OH・１／2H₂Ｏ 0.32g Boc−Gln−ONP 0.49g Boc−Gly−OH 0.23g Boc−Met−OH 0.33g 斯くして、Ｈ−Met−Gly−Gln−Ile−Phe−
Ser（Bzl）−Arg（Tos）−Ser（Bzl）−Ala−Ser
（Bzl）−Pro−樹脂1.58gを得る。このうち０，
40gを弗化水素10ml、１，２−エタンジチオール
0.5ml及びアニソール１mlと混合し、−20℃で30分
間、次いで０℃で30分間インキユベーシヨンした
後、過剰の弗化水素を減圧留去して10％酢酸にて
抽出し、エーテル洗浄を経て、凍結乾燥する。 次いでセフアデツクスＧ−25（フアルマシア社、
溶出液1M酢酸）によるゲル過、さらにCM−
セルロース23（ワツトマン社、0.1→0.5M酢酸ア
ンモニウム、PH＝5.0直線濃度勾配）によつて、
精製して、Ｈ−Met−Gly−Gln−Ile−Phe−Ser
−Arg−Ser−Ala−Ser−Pro−OH32mgを得る。
以下このペプチドを「ペプチドＢ」と呼ぶ。 Rf値： Rf¹＝0.01 Rf²＝0.50 元素分析値： （C₅₀H₈₁O₁₆N₁₅Ｓ・CH₃CO₂Ｈ・5H₂Ｏとし
て） Ｃ（％） Ｈ（％） Ｎ（％） 理論値 46.94 7.20 15.79 分析値 47.01 7.32 15.66 アミノ酸分析値：（日立835型にて分析） 分析値 Ala(1) 1.07 Arg(1) 1.07 Gln(1) 1.00＊ Gly(1) 1.00 Ile(1) 0.91 Met(1) 0.94 Phe(1) 0.93 Pro(1) 1.07 Ser(3) 2.98 ＊ Gluとして検出。 製造例 ３ 前記製造例２で得た、Ｈ−Met−Gly−Gln−
Ile−Phe−Ser（Bzl）−Arg（Tos）−Ser（Bzl）−
Ala−Ser（Bzl）−Pro−樹脂の0.41gに、Boc−
Tyr（Cl₂−Bzl）−OHの0.47gを前記製造例１−
と同様にして二重カツプリング反応させる。次い
でトリフルオロ酢酸でBoc基を脱離して、Ｈ−
Tyr（Cl₂−Bzl）−Met−Gly−Gln−Ile−Phe−
Ser（Bzl）−Arg（Tos）−Ser（Bzl）−Ala−Ser
（Bzl）−Pro−樹脂を得る。これを弗化水素10ml、
アニソール１ml及び１，２−エタンジチオール
0.5mlと混合し、−30℃で30分間、次いで０℃で30
分間インキユベーシヨンし、過剰の弗化水素を減
圧留去した後、10％酢酸で抽出し、エーテルで洗
浄し、凍結乾燥した。次いでセフアデツクスＧ−
25（フアルマシア社、溶出液1M酢酸）によるゲル
過、さらにデベロジルカラムを用いたHPLC
（ケムコ社、溶出液0.1M NaH₂PO₄：アセトニト
リル＝80：20）によつて精製した後、セフアデツ
クスＧ−25（フアルマシア社、溶出液1M酢酸）で
脱塩してＨ−Tyr−Met−Gly−Gln−Ile−Phe−
Ser−Arg−Ser−Ala−Ser−Pro−OH9.23mgを
得る。以下このペプチドを「ペプチドＣ」とす
る。 Rf値： Rf¹＝0.01 Rf²＝0.52 元素分析値： （C₅₉H₉₀O₁₈N₁₆Ｓ・CH₃CO₂Ｈ・6H₂Ｏとし
て） Ｃ（％） Ｈ（％） Ｎ（％） 理論値 48.47 7.07 14.82 分析値 48.63 7.01 14.77 アミノ酸分析値：（日立835型にて分析） 分析値 Ala(1) 1.03 Met(1) 1.00 Arg(1) 1.07 Phe(1) 1.09 Gln(1) 1.03＊ Pro(1) 0.99 Gly(1) 1.14 Ser(3) 2.68 Ile(1) 1.03 Tyr(1) 1.03 ＊ Gluとして検出。 製造例 ４ 製造例１のと同様にしてBro−Leu−樹脂の
0.27mmol／ｇ樹脂を製造し、その2gに、前記製
造例１の及びと同様にして、以下のアミノ酸
又はその誘導体を順次二重カツプリング反応及び
脱Boc化反応させる。 Boc−Ser−OH 0.40g Boc−Arg（Tos）−OH 0.58g Boc−Leu−OH・H₂Ｏ 0.34g Boc−Ile−OH・１／2H₂Ｏ 0.32g Boc−Pro−OH 0.29g Boc−Asp（OBzl）−OH 0.44g Boc−Lys（Cl−Ｚ）−OH 0.56g Boc−Pro−OH 0.29g Boc−Thr（Bzl）−OH 0.39g Boc−Gly−OH 0.24g Boc−Glu（OBzl）−OH 0.46g Boc−Pro−OH 0.29g Boc−Tyr（Cl₂−Bzl）−OH 0.57g 斯くしてBoc−Tyr（Cl₂−Bzl）−Pro−Glu
（OBzl）−Gly−Thr（Bzl）−Pro−Lys（Cl−Ｚ）−
Asp（OBzl）−Pro−Ile−Leu−Arg（Tos）−Ser−
Leu−樹脂2.62gを得る。 その1.62gを弗化水素20ml及びアニソール２ml
に溶かし、−20℃で30分間、次いで０℃で30分間
反応させ、過剰の弗化水素を減圧留去し、10％酢
酸にて抽出し、エーテルにて洗浄後、凍結乾燥す
る。次いでセフアデツクスＧ−25（1M酢酸）でゲ
ル過し更にデベロジルカラムを用いたHPLC
（溶出液、0.1Mホスフアイトバツフアー：アセト
ニトリル＝80：20）を用いて精製して、Ｈ−Tyr
−Pro−Glu−Gly−Thr−Pro−Lys−Asp−Pro
−Ile−Leu−Arg−Ser−Leu−OHのペプチド
104mgを得る。以下これを「ペプチドＤ」と呼ぶ。 Rf値： Rf¹＝0.01 Rf²＝0.42 元素分析値： （C₇₂H₁₁₆O₂₂N₁₈・CH₃CO₂Ｈ・7H₂Ｏとして） Ｃ（％） Ｈ（％） Ｎ（％） 理論値 50.16 7.62 14.23 分析値 49.87 7.60 14.29 アミノ酸分析値：（日立835型にて分析） 分析値 Asp(1) 0.96 Lys(1) 1.13 Arg(1) 1.02 Pro(3) 2.79 Glu(1) 1.05 Ser(1) 0.92 Gly(1) 1.03 Thr(1) 0.99 Ile(1) 0.99 Tyr(1) 0.97 Leu(2) 2.11 製造例 ５ 製造例４において、Boc−Ser−OH0.40gの代
りにBoc−Ser−（Bzl）−OHの0.58gを用いて同様
にして、同一の物性を示すペプチドＤを120mg得
た。 製造例 ６ カリウムtert−ブトキシド5.88ミリ当量の
DMSO溶液14mlにBoc−Leu−OHの1.54gを溶
解し、クロロメチル化ポリスチレン樹脂（財団
法人蛋白質研究奨励会）5gを加えて80℃で30
分間反応させる。樹脂をDMSO、50％酢酸／
クロロホルム、塩化メチレンの順に、充分に洗
浄し、減圧乾燥して5.06gのBoc−Leu−樹脂を
得る。 一部を加水分解後、アミノ酸分析を行なつた
結果、アミノ酸0.30mmol／ｇ樹脂であつた。 上記で得たBoc−Leu−樹脂2.17gをクロロ
ホルム30mlで３回洗浄後、50％トリフルオロ酢
酸（TFA）のクロロホルム溶液30mlに加え、
室温で20分間反応させる。樹脂をクロロホルム
30mlで１回、塩化メチレン30mlで５回、10％ト
リエチルアミンの塩化メチレン溶液30mlで３
回、次いで塩化メチレン30mlで６回それぞれ洗
浄してＨ−Leu−樹脂を得る。 Boc−Val−OH−の0.35gを塩化メチレンに
溶かした溶液25mlの上記Ｈ−Leu−樹脂を加
え、次いでDCCの0.33gを塩化メチレンに溶か
した溶液５mlを加え室温で２時間反応させる。
樹脂を塩化メチレン30mlで６回洗浄後、Boc−
Val−OHの0.35g及び１−ヒドロキシベンゾト
リアゾール0.55gの塩化メチレン溶液25mlに加
え、次いでDCCの0.33gを塩化メチレンに溶か
した溶液５mlを加えて再度同様に反応させる
（二重カツプリング法）。樹脂を塩化メチレンで
充分に洗浄してBoc−Val−Leu−樹脂を得る。 上記と同様にして、Boc−Val−Leu−樹
脂の脱Boc化を行ない、次いで下記アミノ酸、
側鎖官能基保護アミノ酸又はカルボキシル基の
活性化されたアミノ酸を順次縮合及び脱Boc反
応に付す。 Boc−Gln−ONP 0.59g Boc−Pro−OH 0.35g Boc−Ala−OH 0.31g Boc−Thr（Bzl）−OH 0.50g Boc−Pro−OH 0.35g Boc−Glu（OBzl）−OH 0.55g Boc−Val−OH 0.35g Boc−Tyr（Cl₂−Bzl）−OH 0.71g 斯くしてＨ−Tyr（Cl₂−Bzl）−Val−Glu
（OBzl）−Pro−Thr（Bzl）−Ala−Pro−Gln−
Val−Leu−樹脂の2.65gを得る。このうち1.35g
をアニソール３ml及び弗化水素30mlに溶かし、−
20℃で30分間、次いで０℃で30分間インキユベー
シヨンさせた後、過剰の弗化水素を減圧留去し、
残渣を10％酢酸にて抽出し、エーテルにて洗浄す
る。水層を凍結乾燥し、次いでセフアデツクスＧ
−10（フアルマシア社、溶出液10％酢酸）による
ゲル過、次いでセフアデツクスＧ−25（フアル
マシア社、溶出液BuOH：AcOH：H₂Ｏ＝４：
１：５）によるパーテインシヨンクロマトグラフ
イ、更にLH−20（フアルマシア社、溶出液、
１／1000N−HCl）にて精製して、Ｈ−Tyr−
Val−Glu−Pro−Thr−Ala−Pro−Gln−Val−
Leu−OHを得る。以下このペプチドを「ペプチ
ドＥ」と呼ぶ。 Rf値： Rf¹＝0.12 Rf²＝0.58 元素分析値： （C₅₂H₈₁O₁₆N₁₁・7H₂Ｏとして） Ｃ（％） Ｈ（％） Ｎ（％） 理論値 50.27 7.71 12.40 分析値 50.41 7.83 12.41 アミノ酸分析値：（日立835型にて分析） 分析値 Ala(1) 1.01 Glu(1)＋Glu(1) 2.09＊ Leu(1) 0.99 Pro(2) 2.04 Thr(1) 1.04 Tyr(1) 0.98 Val(2) 1.84 ＊ Gluとして検出。 製造例 ７ 製造例６のと同様にして得たBoc−Val−樹
脂（0.296mmol／ｇ樹脂）1.70gに、製造例６の
及びと同様にして、以下の各アミノ酸又はそ
の誘導体を順次縮合及び脱Boc化反応させる。 Boc−Glu（OBzl）−OH 0.43g Boc−Gly−OH 0.22g Boc−Gly−OH 0.22g Boc−Ile−OH（１／2H₂Ｏ） 0.31g Boc−Ser（Bzl）−OH 0.38g Boc−Asn−ONP 0.46g Boc−Lys（Cl−Ｚ）−OH 0.53g Boc−Pro−OH 0.28g Boc−His（Tos）−OH 0.52g Boc−Pro−OH 0.28g Boc−Ile−OH（１／2H₂Ｏ） 0.31g 斯くして、Ｈ−Ile−Pro−His（Tos）−Pro−
Lys（Cl−Ｚ）−Asn−Ser（Bzl）−Ile−Gly−Gly
−Glu（OBzl）−Val−樹脂2.25gを得る。このうち
0.81gを弗化水素15ml及びアニソール1.5mlと混合
し、−20℃で30分間、次いで０℃で30分間インキ
ユベーシヨンした後、過剰の弗化水素を減圧留去
し、10％酢酸にて抽出し、エーテル洗浄を経て、
凍結乾燥する。 次いでセフアデツクスＧ−25（フアルマシア社、
溶出液1M酢酸）によるゲル過、さらにCM−
セルロース23（ワツトマン社、0.04MAcONH₄、
PH＝7.2）によつて精製して、Ｈ−Ile−Pro−His
−Pro−Lys−Asn−Ser−Ile−Gly−Gly−Glu−
Val−OHを得る。以下このペプチドを「ペプチ
ドＦ」と呼ぶ。 Rf値： Rf¹＝0.01 Rf²＝0.42 元素分析値： （C₅₅H₉₀O₁₇N₁₆・8H₂Ｏとして） Ｃ（％） Ｈ（％） Ｎ（％） 理論値 47.47 7.68 16.10 分析値 47.39 7.71 15.98 アミノ酸分析値：（日立835型にて分析） 分析値 Asn(1) 0.90＊ Gly(2) 1.99 His(1) 1.02 Ile(2) 2.02 Lys(1) 1.01 Pro(2) 1.99 Ser(1) 0.91 Val(1) 1.01 Glu(1) 1.02 ＊ Aspとして検出。 製造例 ８ 前記製造例７で得た、Ｈ−Ile−Pro−His
（Tos）−Pro−Lys（Cl−Ｚ）−Asn−Ser（Bzl）−
Ile−Gly−Gly−Glu（OBzl）−Val−樹脂の0.77g
に、Boc−Tyr（Cl₂−Bzl）−OHの0.19gを前記製
造例６−と同様にして二重カツプリング反応さ
せる。次いでトリフルオロ酢酸でBoc基を脱離し
て、Ｈ−Tyr（Cl₂−Bzl）−Ile−Pro−His（Tos）
−Pro−Lys（Cl−Ｚ）−Asn−Ser（Bzl）−Ile−
Gly−Gly−Glu（OBzl）−Val−樹脂の0.82gを得
た。これを弗化水素15ml及びアニソール1.5mlと
混合し、−20℃で30分間、次いで10℃で30分間イ
ンキユベーシヨンし、過剰の弗化水素を減圧留去
した後、10％酢酸で抽出し、エーテルで洗浄し、
凍結乾燥した。次いでセフアデツクスＧ−25（フ
アルマシア社、溶出液1M酢酸）によるゲル過、
さらにCM−セルロース23（0.04MAcONH₄、PH
＝7.2）によつて精製して、Ｈ−Tyr−Ile−Pro−
His−Pro−Lys−Asn−Ser−Ile−Gly−Gly−
Glu−Val−OHを得る。以下このペプチドを「ペ
プチドＧ」とする。 Rf値： Rf¹＝0.02 Rf²＝0.47 元素分析値： （C₆₄H₉₉O₁₉N₁₇・8H₂Ｏとして） Ｃ（％） Ｈ（％） Ｎ（％） 理論値 49.44 7.46 15.32 分析値 49.43 7.56 15.06 アミノ酸分析値：（日立835型にて分析） 分析値 Asn(1) 0.89＊ Gly(2) 1.99 Glu(1) 1.02 His(1) 1.02 Ile(2) 2.04 Lys(1) 1.02 Pro(2) 2.32 Ser(1) 0.91 Val(1) 1.01 Tyr(1) 1.05 ＊ Aspとして検出。 製造例 ９ 製造例６のと同様にしてBoc−Leu−樹脂を
製造し、その2.17gに、前記製造例６の及び
と同様にして、以下のアミノ酸又はその誘導体を
順次二重カツプリング反応及び脱Boc化反応させ
る。尚Trp含有ペプチドの脱Boc化反応は、エタ
ンジチオールの存在下に行なつた。 Boc−Val−OH 0.35g Boc−Lys（Cl−Ｚ）−OH 0.66g Boc−Thr（Bzl）−OH 0.50g Boc−Lys（Cl−Ｚ）−OH 0.66g Boc−Asp（OBzl）−OH 0.52g Boc−Lys（Cl−Ｚ）−OH 0.66g Boc−Pro−OH 0.35g Boc−Thr（Bzl）−OH 0.50g Boc−Trp−OH 0.49g Boc−Tyr（Bzl）−OH 0.50g 斯くしてＨ−Tyr（Bzl）−Trp−Thr（Bzl）−
Pro−Lys（Cl−Ｚ）−Asp（OBzl）−Lys（Cl−Ｚ）
−Thr（Bzl）−Lys（Cl−Ｚ）−Val−Leu−樹脂
3.01gを得る。 その1.10gを弗化水素15ml、アニソール1.5ml及
びエタンジチオール0.8mlに溶かし、−20℃で30分
間、次いで０℃で30分間反応させ、過剰の弗化水
素を減圧留去し、10％酢酸にて抽出し、エーテル
にて洗浄後、凍結乾燥する。次いでセフアデツク
スＧ−25（1M酢酸）でゲル過し更にCM−セル
ロース23（0.05MAcONH₄、PH＝7.2）及びLH−
20（10^-3NHCl）を用いて精製して、Ｈ−Thr−
Trp−Thr−Pro−Lys−Asp−Lys−Thr−Lys−
Val−Leu−OHを得る。以下これを「ペプチド
Ｈ」と呼ぶ。 Rf値： Rf¹＝0.01 Rf²＝0.44 元素分析値： （C₈₁H₁₀₁O₁₇N₁₅・17H₂Ｏとして） Ｃ（％） Ｈ（％） Ｎ（％） 理論値 45.15 8.39 12.95 分析値 45.12 8.65 12.89 アミノ酸分析値：（日立835型にて分析） 分析値 Asp(1) 0.91 Lys(3) 3.20 Leu(1) 1.00 Pro(1) 1.00 Thr(3) 2.89 Trp(1) 0.93 Val(1) 0.98 製造例 10 前記製造例９で得たＨ−Tyr（Bzl）−Trp−
Thr（Bzl）−Pro−Lys（Cl−Ｚ）−Asp（OBzl）−
Lys（Cl−Ｚ）−Thr（Bzl）−Lys（Cl−Ｚ）−Val−
Leu−樹脂の0.55gに、Boc−Tyr（Cl₂−Bzl）−
OHの0.13gを前記製造例６−と同様にして二重
カツプリング反応させる。次いでエタンジチオー
ルの存在下にトリフルオロ酢酸でBoc基を脱離し
て、Ｈ−Tyr（Cl₂−Bzl）−Trp−Thr（Bzl）−Pro
−Lys（Cl−Ｚ）−Asp（OBzl）−Lys（Cl−Ｚ）−
Thr（Bzl）−Lys（Cl−Ｚ）−Val−Leu−樹脂の
0.59gを得た。これを弗化水素15ml、アニソール
1.5ml及びエタンジチオール0.8mlと混合し、−20
℃で30分間、次いで０℃で30分間インキユベーシ
ヨンし、過剰の弗化水素を減圧留去した後、10％
酢酸で抽出し、エーテルで洗浄し、凍結乾燥し
た。次いでCM−セルロース23（0.05MAcONH₄、
PH＝7.2）及びLH−20（10^-3NHCl）によつて精製
して、Ｈ−Tyr−Thr−Trp−Thr−Pro−Lys−
Asp−Lys−Thr−Lys−Val−Leu−OHを得る。
以下このペプチドを「ペプチドＩ」とする。 Rf値： Rf¹＝0.01 Rf²＝0.47 元素分析値： （C₇₀H₁₁₀O₁₉N₁₆・17H₂Ｏとして） Ｃ（％） Ｈ（％） Ｎ（％） 理論値 47.08 8.13 12.55 分析値 46.89 8.34 12.54 アミノ酸分析値：（日立835型にて分析） 分析値 Asp(1) 0.91 Lys(3) 3.20 Leu(1) 1.02 Pro(1) 1.20 Thr(3) 2.85 Trp(1) 0.92 Val(1) 0.93 〈抗原の製造〉 製造例 １ ペプチドの製造例６で得たペプチドＥの５mg及
びKLH（シグマ社）12mgを、0.05Mリン酸塩緩衝
液（PH＝7.0）3.0mlに加え、この溶液に２％グル
タルアルデヒド溶液（GA）0.2mlを滴下し、室温
で３時間撹拌する。その後反応混合物を一夜蒸留
水で４℃で透析し、凍結乾燥して、目的抗原16.5
mgを得る。以下この抗原を「抗原Ａ」と言う。 抗原ＡはKLH1モル（平均分子量を10万とした
場合）に対してペプチドＥが平均10モル結合した
ものである。尚このペプチドＥとKLHとの結合
率は、得られる抗原Ａを更にセフアデツクスＧ−
50（溶出液：生理食塩水、検出：OD280nm、流出
速度：３ml／時間、分取量：１mlづつ）でゲル
過した際、未反応のKLH及びペプチドＥの存在
は認められないことより、該ゲル過によつて
KLHに結合したペプチドＥのフラクシヨンと他
の生成体（ペプチドＥの２量体）のフラクシヨン
とを分離し、ペプチド２量体の標準濃度の検量線
を作成して、上記２量体の量を求め、これを出発
原料として用いたペプチドＥの量から差し引いた
値がすべてKLHに結合しているとして求めたも
のである。以下の抗原の製造例においても同様と
する。 製造例 ２ 0.2N−HClの20mlとDMFの３mlとの混合溶
媒にベンジジン83.25mgを加え、氷冷下に撹拌
し、該溶液に亜硝酸ナトリウム87.03mgの蒸留
水２mlを徐々に加え、30分間撹拌してBDB溶
液を調整した。 ペプチドI5.08mg及びKLH8.07mgを0.13M
NaClの0.16Mホウ酸塩緩衝液（PH＝9.0）１ml
に溶解し、４℃にて静かに撹拌する。該溶液に
上記のBDB溶液１mlを徐々に滴下する。反
応溶液を0.5N NaOHにてPH＝9.0に調整し、さ
らに４℃で２時間反応する。その後反応混合物
を一夜蒸留水で４℃下に透析し、凍結乾燥し
て、目的抗原12.27mgを得る。以下この抗原を
「抗原Ｂ」と言う。抗原ＢはKLH1モルに対し
てペプチドＩが平均35モル結合したものであ
る。 製造例 ３ ペプチドG5.17mg及びKLH8.03mgを使用して、
前記製造例２と同様にして目的抗原12.74mgを得
る。以下この抗原を「抗原Ｃ」と言う。抗原Ｃは
KLH1モルに対してペプチドＧが平均42モル結合
したものである。 製造例 ４ 担体としてアスカーリス抽出物（ASC、平均
分子量を10万とする）を用い、前記抗原の製造例
１〜３に準じて、下記第２表の免疫抗原を得る。 【表】 製造例 ５ ペプチドの製造例２で得たペプチドＢの5.09mg
及びKLH（シグマ社）25.10mgを、0.05Mリン酸塩
緩衝液（PH＝7.0）3.0mlに加え、この溶液に２％
グルタルアルデヒド溶液0.2mlを滴下し、室温で
３時間撹拌する。その後反応混合物を一夜蒸留水
で４℃で透析し、凍結乾燥して、目的抗原26.49
mgを得る。以下この抗原を「抗原Ｊ」と言う。 抗原ＪはKLH1モルに対してペプチドＢが平均
10モル結合したものである。 製造例 ６ ペプチドD5.13mg及びKLH8.10mgを0.13M
NaClの0.16Mホウ酸塩緩衝液（PH＝9.0）１mlに
溶解し、４℃にて静かに撹拌する。該溶液に
BDB溶液0.5mlを徐々に滴下する。反応溶液を
0.5N NaOHにてPH＝9.0に調整し、さらに４℃で
２時間反応する。その後反応混合物を一夜蒸留水
で４℃下に透析し、凍結乾燥して、目的抗原
12.76mgを得る。以下この抗原を「抗原Ｋ」と言
う。抗原ＫはKLH1モルに対してペプチドＤが平
均18モル結合したものである。 製造例 ７ ペプチドA5.17mg及びKLH8.03mgを使用して、
前記製造例６と同様にして目的抗原12.74mgを得
る。以下この抗原を「抗原Ｌ」と言う。抗原Ｌは
KLH1モルに対してペプチドＡが平均25モル結合
したものである。 製造例 ８ 前記抗原の製造例５〜７に準じて、下記第３表
の免疫抗原を得る。 【表】 〈抗体の製造〉 製造例 １ 抗原の製造例１〜３で得た抗原Ａ，Ｂ及びＣの
それぞれ100μgを1.5mlの生理食塩水に溶解後、こ
れにフロインドの補助液1.5mlを加えて調整した
懸濁液を、それぞれ数羽のウサギ（New−
Zealand white rabbits）（2.5〜3.0Kg）に皮下投
与し、２週間毎に６回同量を投与する。更にその
後１ケ月毎に３回、最初に投与した量と同量を投
与する。最終投与後７日経過してのち試験動物か
ら採血し、遠心分離して抗血清を採取して、それ
ぞれ目的抗体を得る。 抗原Ａを投与したウサギより得られる抗体を
「抗体Ａ」とする。抗原Ｂを投与したウサギ（５
羽）より得られる抗体を、各ウサギ毎に「抗体
Ｂ」、「抗体Ｃ」、「抗体Ｄ」、「抗体Ｅ」及び「抗体
Ｆ」とする。また抗原Ｃを投与したウサギ（５
羽）より得られる抗体を、各ウサギ毎に「抗体
Ｇ」、「抗体Ｈ」、「抗体Ｉ」、「抗体Ｊ」及び「抗体
Ｋ」とする。 製造例 ２ 前記抗原の製造例４で得た各抗原の500μgをウ
サギに投与して、上記抗体の製造例１と同様にし
て、各ウサギ毎に下記第４表の抗体をそれぞれ得
る。 【表】 製造例 ３ 抗原の製造例５〜７で得た抗原Ｊ，Ｋ及びＬの
それぞれ100μgを1.5mlの生理食塩水に溶解後、こ
れにフロインドの補助液1.5mlを加えて調整した
懸濁液を、それぞれ数羽のウサギ（New−
Zealand white rabbits）（2.5〜3.0Kg）に皮下投
与し、２週間毎に６回同量を投与する。更にその
後１ケ月毎に３回、最初に投与した量と同量を投
与する。最終投与後７日経過してのち試験動物か
ら採血し、遠心分離して抗血清を採取して、それ
ぞれ目的抗体を得る。 抗原Ｊを投与したウサギより得られる抗体を
「抗体Ｚ」とする。抗原Ｋを投与したウサギ（５
羽）より得られる抗体を、各ウサギ毎に「抗体
AA」、「抗体AB」、「抗体AC」、「抗体AD」及び
「抗体AE」とする。また抗原Ｌを投与したウサギ
より得られる抗体を「抗体AF」とする。 製造例 ４ 前記抗原の製造例８で得た各抗原の500μgをウ
サギに投与して、上記抗体の製造例３と同様にし
て、各ウサギ毎に下記第５表の抗体をそれぞれ得
る。 【表】 〈標識ペプチドの製造〉 ペプチドＡ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｇ及びＩをクロラミ
ンＴを用いる方法で以下の通り標識化する。 即ち上記各ペプチドのそれぞれ5μgの0.5モルリ
ン酸塩緩衝液（PH7.5）10μにNa〔¹²⁵I〕（carrier
free N.E.N.）１ミリキユーリーの0.5モルリン酸
塩緩衝液20μを加え、つぎにクロラミンT20μ
の0.5モルリン酸塩緩衝液20μを加える。室温で
25秒間撹拌してメタ重亜硫酸ナトリウム（Na₂S₂
O₅）100μgの0.5Mリン酸塩緩衝液20μを加える
ことで反応を終わらせる。次いで反応液に10％の
冷沃化ナトリウム水溶液10μを加え、反応混合
物をセフアデツクスＧ−25のカラム（1.0〜50cm）
にかけ（溶出液0.1％BSA及び0.01％NaN₃を含
む。0.2モルアンモニウムアセテート緩衝液、PH
5.5）、¹²⁵Iで標識された各ペプチドを得る。 得られた各標識ペプチドの放射活性は、いずれ
も1000μCi／μg以上であつた。 Γ 力価の測定 上記で得られる抗体の力価を次の通り測定す
る。即ち抗体をそれぞれ生理食塩水で10，10²，
10³，10⁴，10⁵……倍に希釈し、これらのそれぞ
れ100μに、約9500cpmに希釈した標識ペプチド
（抗体Ａ，Ｌ〜Ｎ及びＲ〜Ｔの場合は標識ペプチ
ドＥを、抗体Ｇ〜Ｋ及びＵ〜Ｘの場合は標識ペプ
チドＧを、抗体Ｂ〜Ｆ，Ｏ〜Ｑ及びＹの場合は標
識ペプチドＩを、抗体AF及びAQ〜AUの場合は
標識ペプチドＡを、抗体Ｚ，AG〜AJ，AVの場
合は標識ペプチドＣを、並びに抗体AA〜AE，
AK〜APの場合は標識ペプチドＤをそれぞれ使
用する）0.1ml及び0.05モルリン酸塩緩衝液（PH
＝7.4）〔0.25％BSA、10mM EDTA及び0.02％
NaN₃を含む〕0.2mlを加え、４℃で24時間インキ
ユベートし、生成した抗体と¹²⁵I標識ペプチドと
の結合体を、デキストラン−活性炭法及び遠心分
離法（４℃、30分間、3000rpm）により未反応
（結合しない）¹²⁵I標識ペプチドから分離し、その
放射線をカウントし、各希釈濃度における抗体の
¹²⁵I標識ペプチドとの結合率（％）を測定する。
縦軸に抗体の¹²⁵I標識ペプチドとの結合率（％）
及び横軸に抗体の希釈倍率をとり、各々の濃度に
おいて結合率をプロツトする。結合率が50％とな
る抗体の希釈倍率即ち抗体の力価を求める。結果
を下記第６表に示す。 【表】 【表】 Γ 抗体のATLA特異性試験 供試試料として各種濃度のペプチドＡ，Ｅ又は
Ｉ及び下記ATLA（ATL−associated antigen）
サンプルを使用する。 ATLAサンプル：ATLA陽性細胞株 YAM〔Science，217，p737〜739（1982）〕の培
養細胞５×10⁹個に生理食塩水30mlを加えてホモ
ジナイズし、次いで１時間遠心分離（105000×
ｇ）して上清を採取し、PBSで蛋白量を10mg／
ml（この蛋白量は、大塚アツセイ研究所製の総蛋
白定量試薬である「トネイン−TP」を用いた発
色法により測定した）に調整する（以下これを
「YAM上清」とする）。 また標準希釈剤として0.25％BSA、５ミリモル
EDTA及び0.02％のNaN₃を含む0.05モルリン酸
塩緩衝液（PH7.4）を使用する。 各々の試験管に、標準希釈剤0.2ml、供試試料
0.1ml、抗体の製造例で得た抗体Ｌ，Ｏ又はAT
（最終、力価に相当するように希釈したもの）0.1
ml及び上記各抗体に対応する¹²⁵I標識ペプチド
（上記で得られる標識ペプチドＡ，Ｅ又はＩを約
10000cpmになるように希釈したもの）0.1mlを入
れ、４℃で72時間インキユベーシヨンした後、ノ
ーマルブタ血清（normal porcine serum）の0.1
mlを加え、次いでデキストランで被膜した活性炭
の懸濁液0.5mlを加え、４℃で30分間放置し、次
に４℃、3000rpmの条件下に30分間遠心分離を行
ない、抗体と¹²⁵I標識ペプチドとの結合体(B)を、
未反応（結合しない）125I標識ペプチド(F)から分
離し、その放射線をカウントし、各供試試料の濃
度及び希釈率における(B)の百分率を求める。得ら
れる結果を第１図〜第３図に示す。 各図中縦軸は結合％（Ｂ／Bo×100；但し、
Boは供試試料濃度を０とした時の(B)の百分率）
を、横軸は供試試料濃度（ペプチドＡ，Ｅ又はＨ
の濃度及びYAM上清の蛋白濃度）を示す。また
第１図において曲線イはペプチドＥを、曲線ロは
YAM上清をそれぞれ示し、第２図において曲線
イはペプチドＨを、曲線ロはYAM上清を示し、
第３図において曲線イはペプチドＡを、曲線ロは
YAM上清を示す。各図より、本発明により得ら
れる抗体がATLA反応性を有することが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第３図はそれぞれペプチドＥ，Ｈ及び
Ａ並びにATLAサンプルと本発明により得られ
る抗体との親和性を示す曲線である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式 Ｈ−Val−Val−Gln−Pro−Lys−Lys−Pro−
   Pro−Pro−Tyr−OH で表わされるペプチド、一般式 Ｒ−Met−Gly−Gln−Ile−Phe−Ser−Arg−
   Ser−Ala−Ser−Pro−OH 〔式中Ｒは水素原子又はＨ−Tyr基を示す。〕 で表わされるペプチド、式 Ｈ−Tyr−Pro−Glu−Gly−Thr−Pro−Lys−
   Asp−Pro−Ile−Leu−Arg−Ser−Leu−OH で表わされるペプチド、式 Ｈ−Tyr−Val−Glu−Pro−Thr−Ala−Pro
   −Gln−Val−Leu−OH で表わされるペプチド、一般式 Ｒ−Ile−Pro−His−Pro−Lys−Asn−Ser−
   Ile−Gly−Gly−Glu−Val−OH 〔式中Ｒは上記に同じ。〕 で表わされるペプチド及び一般式 Ｒ−Thr−Trp−Thr−Pro−Lys−Asp−Lys
   −Thr−Lys−Val−Leu−OH 〔式中Ｒは上記に同じ。〕 で表わされるペプチドからなる群より選ばれたヒ
   ト白血病ウイルス関連ペプチドと担体との複合体
   からなる免疫抗原を哺乳動物体に投与し、生成す
   る抗体を採取することを特徴とするヒト白血病ウ
   イルス抗体の製造法。