CN111892657A - 用于检测米田堡血型抗原的抗体及其片段、试剂盒及方法 - Google Patents
用于检测米田堡血型抗原的抗体及其片段、试剂盒及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明的目的是公开一种分离的抗体或其片段，其与米田堡(Miltenberger)血型抗原的表位特异性地结合，其中表位是选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所组成的群组中的氨基酸序列的一部分，且包含氨基酸序列Arg‑Asp‑Thr‑Tyr，抗体或其片段包括重链可变区及轻链可变区。本发明另公开用于检测米田堡血型抗原的试剂盒及方法。
Description
技术领域
本发明是关于一种用于检测米田堡抗原的抗体及其片段、试剂盒及方法。
背景技术
仅次于Rh血型系统，MNS血型系统中有一类特殊的米田堡(Miltenberger)亚血型系 统，其血型抗原是以人类血清免疫抗体所鉴定的一系列低频率抗原组合的红血球表型。米 田堡血型抗原(Miltenberger blood group antigen)极可能是在演化过程中，由序列结构相 似(homologous)的血型糖蛋白A(glycophorin A，GYPA)、血型糖蛋白B(glycophorin B， GYPB)，和血型糖蛋白E(glycophorin E，GYPE)基因重组产生的杂合蛋白(hybrid protein)。 米田堡血型抗原现今已发现11种亚型(subtypes)，包括米田堡血型抗原第一型(Mi.I)至 米田堡血型抗原第十一型(Mi.XI)。米田堡血型抗原第三型(Mi.III)推测是由一段血型糖 蛋白A基因，通过同源重组(homologous recombination)插入血型糖蛋白B。所以米田堡 血型抗原第三型的基因序列呈血型糖蛋白B-A-B混合基因的型态，此B-A-B混合基因转录 出一段具强烈抗原性的Mur肽，因此米田堡血型抗原第三型又称Gp.Mur(参见例如Journal of Molecular Evolution(1995)41:4,478-486)。
在中国台湾，米田堡血型抗原第三型是所有特殊血型里发生频率最高的；尤其在特定 原住民族群，其发生频率高达20至90％。整体而言，中国台湾人约有6.27％米田堡血型抗 原第三型阳性的人口。米田堡血型抗原第三型在特定东南亚国家，其发生频率与中国台湾 相当，例如泰国为9至10％、菲律宾为8.3％、香港为6.3％、印度尼西亚为2.47％及中国 为1.9％。而米田堡血型第三型在高加索白种人(欧、美、澳等)、北方汉人和日本人中的发生频率都小于0.01％。
临床报告证实米田堡血型抗原第三型会导致同种异体免疫性疾病，如输血不良反应、 新生儿溶血症等。因此，在输血前必须判断捐赠者的血液中是否具有米田堡抗原，以避免 前述不良反应发生。然而，目前尚无商售可得的抗米田堡血型抗原的单克隆抗体、试剂，也没有合适且快速的检测方法。
因此，现仍亟需一种用来检测捐赠者样品中，是否具有米田堡血型抗原的抗体、试剂 盒及方法，其能够在输血前确认捐赠者及受赠者的米田堡血型是否匹配，以避免不良反应 的发生。
发明内容
有鉴于上述课题，本发明的目的为提供一种用于检测米田堡血型抗原的抗体及其片 段、试剂盒及方法。在输血前加以应用，用来确认捐赠者的样品中是否具有米田堡血型抗 原，以筛选适合受赠者的捐赠者样品，进而避免将样品输入受赠者后，产生同种异体免疫 性疾病的不良反应。
为达上述目的，本发明提供一种分离的抗体或其片段，抗体或其片段与米田堡(Miltenberger)血型抗原的一表位特异性结合，其中表位是选自SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.6所组成的群组中的氨基酸序列的一部分，且包含氨基酸序列Arg-Asp-Thr-Tyr。抗体或其片段包括：一重链可变区，包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的CDR-H1、具有SEQ IDNO.8氨基酸序列的CDR-H2以及具有SEQ ID NO.9氨基酸序列的CDR-H3；以及一轻 链可变区，包括具有SEQ ID NO.10氨基酸序列的CDR-L1、具有SEQ ID NO.11氨基酸序 列的CDR-L2以及具有SEQ ID NO.12氨基酸序列的CDR-L3。
为达上述目的，本发明更提供一种分离的抗体或其片段，具有一结合结构域包括：一 重链可变区，包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的CDR-H1、具有SEQ ID NO.8氨基酸序列的CDR-H2以及具有SEQ ID NO.9氨基酸序列的CDR-H3；以及一轻链可变区，包括具 有SEQID NO.10氨基酸序列的CDR-L1、具有SEQ ID NO.11氨基酸序列的CDR-L2以及 具有SEQ IDNO.12氨基酸序列的CDR-L3。
在一实施例中，重链可变区具有SEQ ID NO.13的氨基酸序列。
在一实施例中，轻链可变区具有SEQ ID NO.14的氨基酸序列。
在一实施例中，重链可变区是由SEQ ID NO.15核苷酸序列所编码的。
在一实施例中，轻链可变区是由SEQ ID NO.16核苷酸序列所编码的。
在一实施例中，抗体或其片段是选自单克隆抗体、人源化抗体、重组抗体、人类抗体、 抗体的生物活性片段、抗体模拟物及其任何组合所组成的群组。
在一实施例中，抗体或其片段是选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、单结构域抗体及其任何组合所组成的群组。
为达上述目的，本发明更提供一种试剂盒，其用于在一生物体的一样品中检测一米田 堡(Miltenberger)血型抗原，试剂盒包括一如前所述的抗体或其片段。
在一实施例中，样品是全血或分离的红血球。
在一实施例中，生物体是人类。
为达上述目的，本发明更提供一种用于在一生物体中检测一米田堡(Miltenberger)血 型抗原的方法包括：制备生物体的一样品；以及将一如前所述的抗体或其片段加到样品中， 以检测样品中是否具有米田堡(Miltenberger)血型抗原。
在一实施例中，样品是全血或分离的红血球。
在一实施例中，生物体是人类。
承上所述，本发明的功效在于：通过提供一种用于检测米田堡血型抗原的抗体及其片 段、试剂盒及方法，可以确认生物体的样品中是否具有米田堡血型抗原，以筛选适合用于 例如但不限于输血的样品，进而避免将样品输入另一生物体后，产生同种异体免疫性疾病 的不良反应。
附图说明
图1为本发明抗体或其片段与米田堡血型抗原的结合表位分析结果。
具体实施方式
以下将参照相关附图，说明依据本发明用于检测米田堡血型抗原的抗体及其片段、试 剂盒及方法的较佳实施例，其中相同的组件将以相同的参照符号加以说明。
本发明的抗体及其片段、试剂盒及方法能够用来检测生物体的样品中，是否具有米田 堡血型抗原，进而筛选适合另一生物体的样品，以避免同种异体免疫反应性疾病的发生。 以下将以实施例来说明本发明用于检测米田堡血型抗原的抗体及其片段、试剂盒及方法。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的技 术人员理解的相同的含义。尽管在本发明的测试实验中可以使用与本文描述的那些相似或 等同的任何方法和材料，但是本文描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明时， 将使用以下术语。应该理解的是，这里使用的术语的目的仅用于描述特定实施例，而非对 本发明的限制。
术语「抗体」是指源自免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列，其特异性结合抗原上的 特定表位。抗体可以是源自天然来源或来自重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整 免疫球蛋白中的可产生免疫反应部分。可用于本发明的抗体可以以多种形式存在，包括例 如单克隆抗体、人源化抗体、重组抗体、人类抗体、抗体的生物活性片段及抗体模拟物。抗体可以来自天然来源或来自重组来源。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本文所提供的「抗体」包括任何免疫球蛋白类型(例如IgG、IgM、IgD、IgE、IgA及IgY)、任何 种类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亚型(例如IgG2a及IgG2b)的 成员。
术语「抗体片段」是指完整抗体或其重组变异体的至少一部分，并且是指抗原结合结 构域，例如完整抗体的抗原决定可变区、其足以赋予该抗体片段辨别和与目标特异性(例 如抗原)结合的能力。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、单结构域抗体如sdAb(VL或VH)，VHH结构域，和由抗体片段 形成的多特异性抗体。Fab片段(fragment,antigen binding)为用木瓜蛋白酶消化全长免疫 球蛋白所产生的抗体片段，或具有合成产生(例如通过重组方法)的相同结构的片段。Fab 片段含有轻链可变区(含有VL及CL)及含有重链可变区(VH)及重链的一个恒定区(CH1)。 F(ab')2片段为在pH值4.0至4.5下用胃蛋白酶消化免疫球蛋白所产生的抗体片段，或具有 合成产生(例如通过重组方法)的相同结构的片段。F(ab')2片段基本上含有两个Fab片段， 其中每一重链部分含有另外少数氨基酸，包括形成连接两个片段的双硫键键结的半胱氨酸 残基。Fab'片段为含有一半(一个重链及一个轻链)F(ab')2片段的片段。Fv片段为仅含有 抗体分子的轻链可变区(VL)及重链可变区(VH)的片段。scFv片段指含有以任何顺序 由多肽连接体共价连接的轻链可变区(VL)及重链可变区(VH)的抗体片段。该连接体 使得两个可变区连接而不干扰其长度。示例性连接体为(Gly-Ser)n残基，一些Glu或Lys 残基分散于整个残基中以增加溶解性。
术语「重链可变区(VH)」是指包含至少一部分互补决定区(CDR)的功能区及非功能区，其中重链可变区的功能区单独或与另一抗体结构域(例如轻链可变区(VL))组合 可与抗原结合。本发明中重链可变区的示例性功能区为含有CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3 的重链可变区。
术语「轻链可变区(VL)」是指包含至少一部分互补决定区(CDR)的功能区及非功能区(FR)，其中轻链可变区的功能区单独或与另一抗体结构域(例如重链可变区(VH)) 组合可与抗原结合。本发明中轻链可变区的示例性功能区为含有CDR-L1、CDR-L2及 CDR-L3的轻链可变区。
术语「单克隆抗体」是指相同单克隆群体，意谓单克隆抗体群体中的各个别抗体分子 均与其他抗体分子相同。单克隆抗体可通过许多熟知方法产生(例如J.Clin.Pathol.(2004) 57,912-917；及J Clin Pathol(2000),53,111-117)。举例而言，单克隆抗体可由不朽B细胞产 生，例如经由与骨髓瘤细胞融合以产生融合瘤细胞株或通过用例如EBV的病毒感染B细 胞而产生，也可使用重组技术在试管内通过用带有编码抗体的人造核苷酸序列的质体使宿 主细胞转型而自宿主细胞产生抗体。
人源化抗体可以使用熟知的方法，在任何适宜且能够产生抗体的哺乳动物来源中生 成，其包括但不限于小鼠、大鼠、骆驼、骆马、兔子或其他脊椎动物。
术语「重组抗体」是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。该术语还应该解释为，通过合成方式，编码有抗体的DNA分子所产生的 抗体，并且该DNA分子会表达抗体蛋白质或指定抗体的氨基酸序列，可以使用本领域所 熟知的合成DNA或氨基酸序列技术来获得DNA或氨基酸序列。
人类抗体的DNA序列，特别是互补性决定区(CDR)，可根据本领域公知的程序来加以分离。优选地，如国际专利申请公开号WO 1987/02671中所述，从不朽B细胞中分离出 人类CDR的DNA序列。适合产生本发明抗体的CDR，可以类似方式，自编码有能够结 合目标分子单克隆抗体的DNA中来取得。术语「互补决定区(complementarity-determining region)」及「CDR」可互换地使用，且是指每一可变区中一起形成抗体的抗原结合结构域 的多个部分之一。每一可变区含有三个CDR，称为CDR1、CDR2及CDR3。三个CDR沿 线性氨基酸序列为不相连的，但在经折迭多肽中为接近的。CDR位于连接可变区的β片的 平行股的环中。如本文所述，本领域技术人员可基于Kabat或Chothia编号鉴别CDR(参 见例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版， U.S.Departmentof Health and Human Services,NIH出版号91-3242，及Chothia,C.等人 (1987)J.Mol.Biol.196：901-917)。
术语「米田堡血型抗原」是指MNS血型系统中的亚血型系统，现今已发现11种亚型(subtypes)，包括「米田堡血型抗原」第一型(Mi.I)至米田堡血型抗原第十一型(Mi.XI)。 「米田堡血型抗原」是由Mia、Vw、Mur、Hut、Hil、Hop、Nob、DANE、TSEN、MINY、 MUT抗原的至少其中之一组成。其中「米田堡血型抗原第三型」包括Mia、Mur、Hil、 MINY及MUT抗原(参照例如ISBT Science Series(2011)6,296–301)。
术语「抗原」是指会引起免疫反应的分子。这种免疫反应可能涉及抗体产生、特定的 免疫活性细胞的活化，或前述两者。本领域技术人员会理解，任何大分子，包括几乎所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重组或基因体DNA。本领域技术 人员会理解，任何DNA，包含编码有引发免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序 列，是编码有本文的术语「抗原」。此外，本领域技术人员理解，抗原不需要由整段基因 的核苷酸序列来编码。显而易见的是，本发明包括，但不限于，使用多于一个基因的部分 核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以引起所需的免疫反应。再者，本领域 技术人员理解抗原不需要由「基因」编码。显而易见的是，抗原可以是合成的，或可以从 生物样品中获得。前述生物样品可以包括但不限于组织样品，肿瘤样品，细胞或生物流体。
术语「表位」是指抗原上的小化学分子，其可引发免疫反应，诱导B和/或T细胞反应。抗原可具有一个或多个表位。大多数抗原具有多个表位；即，这些抗原是多价的。通 常，表位大小约为10个氨基酸和/或糖。优选地，表位为约4至18个氨基酸，更优选地 约5至16个氨基酸，甚至更优选地为6至14个氨基酸，更优选地约7至12个氨基酸， 最优选地约8至10个氨基酸。本领域技术人员理解，抗原特异性的主要标准通常是整个 三维结构而非分子的特定线性序列。
如本文关于抗体所使用的术语「特异性结合」是指辨识特定抗原但基本上不辨识或结 合样品中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可以与来自 一个或多个物种的抗原结合。
术语「结合结构域」是指以特异性方式与一特定标的结构/抗原/表位结合或产生交 互作用的多肽的结构域。「结合或产生交互作用」也可理解为定义一种「特异性辨识作用」。 如本发明的「特异性辨识作用」一词是指抗体分子能以特异性方式与抗原如在此所界定的 米田堡血型抗原的至少一个、较佳至少二个、更佳至少三个表位交互作用和/或结合。
术语「免疫反应」定义为当淋巴细胞将抗原分子鉴定为外源的并诱导抗体形成和/或 活化淋巴细胞，以除去抗原时发生的对抗原的细胞反应。
术语「生物体」、「捐赠者」或「受赠者」可以是人类或非人类哺乳动物。非人哺乳动物包括例如家畜和宠物，例如绵羊，牛，猪，犬科动物，猫科动物和鼠类哺乳动物。优选 地，生物体是人类。
术语「样品」是指从生物体或生物体的组成(例如细胞)获得的样品。样品可以是任何生物组织或液体。样品包括但不限于骨髓、痰液、全血、血清、血浆、淋巴液、血球细 胞(例如红血球)、尿、腹膜液及胸水或来自于这些样品的细胞。生物样品还可以包括部 分组织，例如为了组织学目的而取得的冷冻切片。优选地，样品是全血或分离的红血球。
如本文针对核酸(例如DNA或RNA)所使用的术语「分离」(isolated)，是指从存在于大分子的天然来源中的其他DNA或RNA对应分离出来的DNA或RNA分子。本文使 用的术语「分离」还指当通过重组DNA技术产生时，基本上不含细胞物质、病毒物质或 培养基、或化学合成时的化学前驱物或其他化学物质的核酸或肽。此外，「分离的核酸」 意指包括非天然产生的核酸片段，并且不会在天然状态被发现。术语「分离」在本文中也 用于意指从其他细胞蛋白中分离出来的多肽，并且意在包括纯化及重组的多肽。「分离的 抗体」或「分离的抗体片段」是从宿主细胞分泌的物质分离出来的抗体或抗体片段，且不 含细胞物质、病毒物质或培养基。
术语「肽」、「多肽」和「蛋白质」可交替使用，并且指由通过肽键共价连接的氨基酸残基所组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，且不限制蛋白质或肽序列可包含的氨基酸的最大数量。多肽包括任何肽或蛋白质，其包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸。如本文所使用的，该术语是指短链，其在本领域中通常也称为肽、寡肽及 寡聚物；例如较长的链，其在本领域通常称为蛋白质，其中有很多种类。「多肽」包括， 例如，生物活性片段、基本上同源的多肽(substantially homologous polypeptides)、寡肽、 同二聚体(homodimers)、异二聚体(heterodimers)、多肽变异体(variants)、修饰的多肽、 衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
术语「编码」是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因、cDNA或mRNA，具有确定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA及mRNA)或确定的氨基酸序列，在生物过程 中用作合成其他聚合物和大分子的模板以及由此过程产生的生物学特性。因此，在细胞或 其他生物系统中，如果对应于该基因的mRNA转录和翻译产生蛋白质，则该基因编码蛋白 质。编码链，其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中被提供，且非编码链， 用作基因或cDNA转录的模板，可以被称为可编码蛋白质或该编码基因或cDNA的其他产 物。
术语「同种异体」是指源自相同物种的不同动物的任何物质。
术语「载体」是指物质组合物，其包含分离的核酸并可用于将分离的核酸递送至细胞 内部。本领域已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物相关的 多核苷酸、质体及病毒。因此，术语「载体」包括自主复制的质体或病毒。该术语还应解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质体和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、微脂体等。病毒载体的实例包括但不限于仙台病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、反转录 病毒载体、慢病毒载体等。
「宿主细胞」为用于接受、维持、再生及扩增载体的细胞。宿主细胞也可用于表达由载体编码的多肽。当宿主细胞分裂时，载体中所含的核酸复制，从而扩增核酸。举例而言，宿主细胞被载体转染、转化或转导，以包含该载体，用于表达由载体编码的多肽(例如抗 体或其片段)。「宿主细胞」可以是细菌、酵母菌、嗜菌体、哺乳动物的细胞(例如但不限 于CHO、COS、239F、SF9和/或其他细胞株)等可用来产生载体编码的多肽的细胞。
术语「转染的(transfected)」或「转化的」或「转导的」是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。转染的(transfected)」或「转化的」或「转导的」细胞是已经用外源核 酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括初代受试者细胞及其后代。
在本发明的上下文中，使用以下缩写表示通常存在的核酸碱基。「A」是指腺苷(adenosine)、「C」是指胞嘧啶(cytosine)、「G」是指鸟苷(guanosine)、「T」是指胸苷(thymidine)、「U」是指尿苷(uridine)。
在本发明的上下文中，使用以下缩写表示通常存在的氨基酸。「Ala(A)」是指丙氨酸 (Alanine)、「Phe(F)」是指苯丙氨酸(Phenylalanine)、「Cys(C)」是指半胱氨酸(Cysteine)、 「Sec(U)」是指硒代半胱氨酸(Selenocysteine)、「Asp(D)」是指天冬氨酸(Aspartate)、 「Asn(N)」是指天冬酰胺(Asparagine)、「Glu(E)」是指谷氨酸(Glutamate)、「Gln(Q)」 是指谷氨酰胺(Glutamine)、「Gly(G)」是指甘氨酸(Glycine)、「His(H)」是指组氨酸 (Histidine)、「Leu(L)」是指亮氨酸(Leucine)、「Ile(I)」是指异亮氨酸(Isoleucine)、「Lys(K)」是指赖氨酸(Lysine)、「Pyl(O)」是指吡咯赖氨酸(Pyrrolysine)、「Met(M)」 是指甲硫氨酸(Methionine)、「Pro(P)」是指脯氨酸(Proline)、「Arg(R)」是指精氨酸(Arginine)、「Ser(S)」是指丝氨酸(Serine)、「Thr(T)」是指苏氨酸(Threonine)、「Val (V)」是指缬氨酸(Valine)、「Trp(W)」是指色氨酸(Tryptophan)、「Tyr(Y)」是指酪 氨酸(Tyrosine)。
本发明的示例性实施例描述如下：
分离的抗体或其片段
本发明的一实施例提供一种分离的抗体或其片段(以下简称「抗Mia抗体」)，抗Mia抗体选择性地与米田堡(Miltenberger)血型抗原(以下简称「Mia抗原」)的一表位特异 性结合，其中该表位是选自SEQ ID NO.1(DXHKRDTY)、SEQ ID NO.2(XHKRDTYA)、 SEQ ID NO.3(HKRDTYAA)、SEQ ID NO.4(DKRDTYPA)、SEQ ID NO.5(KRDTYPAH) 及SEQ ID NO.6(RDTYPAHT)所组成的群组中的氨基酸序列的一部分，且至少包含氨基 酸序列Arg-Asp-Thr-Tyr(RDTY)。在本实施例中，SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2氨基酸序 列中的X可以是T、M或K。
在本实施例中，抗Mia抗体包括一重链可变区，包括具有SEQ ID NO.7(GYTFTNYAIH) 氨基酸序列的CDR-H1、具有SEQ ID NO.8(WINAGNGNTKYSQKFQG)氨基酸序列的 CDR-H2以及具有SEQ ID NO.9(ARDFRIPSLAVAEVGLDY)氨基酸序列的CDR-H3；以 及一轻链可变区，包括具有SEQ ID NO.10(KSSQSVLYSSNNKNYLA)氨基酸序列的 CDR-L1、具有SEQID NO.11(WASTRES)氨基酸序列的CDR-L2以及具有SEQ ID NO.12 (QQLYSTPLT)氨基酸序列的CDR-L3。
在本实施例中，重链可变区可具有SEQ ID NO.13 (QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYTFTNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNG NTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAIYYCARDFRIPSLAVAEVGLDYWG QGTLVTVSS)的氨基酸序列。在本实施例中，重链可变区是由SEQ IDNO.15 (CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGA AGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCAACTATGCTATACATTGGGTGCGC CAGGCCCCCGGACAAAGGCTTGAGTGGATGGGTTGGATCAACGCTGGCAATGGTAAC ACAAAATATTCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATTACCAGGGACACATCCGCG AGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAAGACACGGCTATATATTACT GTGCGAGAGATTTTCGGATACCTTCTCTAGCAGTGGCTGAGGTCGGTCTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA)核苷酸序列所编码的。
在本实施例中，轻链可变区可具有SEQ ID NO.14 (DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWAS TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQLYSTPLTFGGGTKVEIKR)的氨基 酸序列。在本实施例中，轻链可变区是由SEQ ID NO.16 (GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGC CACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATACAGCTCCAACAATAAGAACTAC TTAGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCAT CTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATT TCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCA ATTGTATAGTACTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAAGTGGAGATCAAACGA)核 苷酸序列所编码的。
在本发明的另一实施例中，提供一种分离的抗体或其片段(以下简称「抗Mia抗体」) 具有一结合结构域包括：一重链可变区，包括具有SEQ ID NO.7(GYTFTNYAIH)氨基酸序列的CDR-H1、具有SEQ ID NO.8(WINAGNGNTKYSQKFQG)氨基酸序列的CDR-H2 以及具有SEQID NO.9(ARDFRIPSLAVAEVGLDY)氨基酸序列的CDR-H3；以及一轻链 可变区，包括具有SEQID NO.10(KSSQSVLYSSNNKNYLA)氨基酸序列的CDR-L1、具 有SEQ ID NO.11(WASTRES)氨基酸序列的CDR-L2以及具有SEQ ID NO.12 (QQLYSTPLT)氨基酸序列的CDR-L3。
在本实施例中，重链可变区可具有SEQ ID NO.13 (QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYTFTNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNG NTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAIYYCARDFRIPSLAVAEVGLDYWG QGTLVTVSS)的氨基酸序列。在本实施例中，重链可变区是由SEQ IDNO.15 (CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGA AGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCAACTATGCTATACATTGGGTGCGC CAGGCCCCCGGACAAAGGCTTGAGTGGATGGGTTGGATCAACGCTGGCAATGGTAAC ACAAAATATTCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATTACCAGGGACACATCCGCG AGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAAGACACGGCTATATATTACT GTGCGAGAGATTTTCGGATACCTTCTCTAGCAGTGGCTGAGGTCGGTCTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA)核苷酸序列所编码的。
在本实施例中，轻链可变区可具有SEQ ID NO.14 (DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWAS TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQLYSTPLTFGGGTKVEIKR)的氨基 酸序列。在本实施例中，轻链可变区是由SEQ ID NO.16 (GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGC CACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATACAGCTCCAACAATAAGAACTAC TTAGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCAT CTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATT TCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCA ATTGTATAGTACTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAAGTGGAGATCAAACGA)核 苷酸序列所编码的。
在前述实施例中，抗Mia抗体的来源可以是人类、猩猩、鼠类、兔子、山羊、鸡的抗体，优选地，抗Mia抗体是来自人类的抗体。抗Mia抗体包括但不限于单克隆抗体、人源 化抗体、重组抗体、人类抗体、抗体的生物活性片段、抗体仿真物其任何组合所组成的群 组。如上所述，抗Mia抗体还可以是抗原片段，包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片 段、scFv抗体片段、线性抗体、单结构域抗体及其任何组合所组成的群组。优选地，抗 Mia抗体是单克隆抗体。在前述实施例中，抗Mia抗体可以是任何免疫球蛋白类型(例如 IgG、IgM、IgD、IgE、IgA及IgY)、任何种类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及 IgA2)或亚型(例如IgG2a及IgG2b)的成员。优选地，抗Mia抗体是IgM抗体。相较于 其他种型，IgM抗体为五聚体形式，具有较大的分子量以及较高的亲和力，因此在进行血 球凝集测试时，可以很容易地观察到凝集的情况，因此利于使用自动化机器进行判读。血 球凝集测试的详细描述如后，在此不先重复赘述。
用于检测Mia抗原的试剂盒
本发明的一实施例中，提供一种试剂盒，其用于在一生物体的一样品中检测Mia抗原， 试剂盒中包括一如前所述的抗体或其片段(抗Mia抗体)。其中，抗Mia抗体的详细描述如前，在此不再重复赘述。
在本实施例中，生物体可以是人类或非人类哺乳动物。非人哺乳动物包括例如家畜和 宠物，例如绵羊、牛、猪、犬科动物、猫科动物和鼠类哺乳动物。优选地，生物体是人类。
在本实施例中，样品包括但不限于骨髓、痰液、全血、血清、血浆、淋巴液、血球细胞(例如红血球)、尿、腹膜液及胸水或来自于这些样品的细胞。优选地，样品是全血或 分离的红血球。
用于检测Mia抗原的方法
本发明的一实施例中，提供一种用于在一生物体中检测Mia抗原的方法包括：制备生 物体的一样品；以及将一如前所述的抗体或其片段(抗Mia抗体)加到样品中，以检测样品中是否具有Mia抗原。其中，抗Mia抗体的详细描述如前，在此不再重复赘述。
在本实施例中，生物体可以是人类或非人类哺乳动物。非人哺乳动物包括例如家畜和 宠物，例如绵羊、牛、猪、犬科动物、猫科动物和鼠类哺乳动物。优选地，生物体是人类。
在本实施例中，样品包括但不限于骨髓、痰液、全血、血清、血浆、淋巴液、血球细胞(例如红血球)、尿、腹膜液及胸水或来自于这些样品的细胞。优选地，样品是全血或 分离的红血球。
在本实施例中，制备生物体的样品的步骤包括但不限于采集所需的样品、对样品进行 对应的处理。举例而言，若样品是全血，则制备生物体的样品的步骤仅为采集生物体的血 液；或者，若样品是分离的红血球，则制备生物体的样品的步骤包括采集生物体的血液以 及从该血液中分离出红血球。在此，分离红血球的方法是本领域技术人员熟知的，包括但 不限于离心、梯度离心或其他任何可从血液中分离红血球的方法。
在本实施例中，将抗Mia抗体加到样品中，以检测样品中是否具有Mia抗原的步骤，可以用来判断样品中是否具有Mia抗原，判断的方法包括但不限于血球凝集测试、免疫印迹法、ELISA、免疫沉淀法、血清学检测或任何其他本领域技术人员熟知可用来判断抗体 与抗原是否有进行结合的方法。
建立编码抗Mia抗体的核酸、含编码抗Mia抗体核酸的载体以及可分泌抗Mia抗体的宿主细胞
在本实施例中，编码有抗Mia抗体的分离的核酸可以通过本领域已知的任何方法获得。 例如，如果抗Mia抗体的核苷酸序列是已知的，则编码抗Mia抗体的核苷酸序列可以由化 学合成的寡核苷酸组装而成。前述合成例如但不限于将各个分别编码有抗Mia抗体的部分 核苷酸序列的寡核苷酸，退火并连接，然后通过PCR扩增。本发明所述的多核苷酸还可以 从任何其他合适的核酸来源产生，例如抗体cDNA文库，或从表达抗体的任何组织或细胞分离的cDNA文库(例如，选自表达抗体的融合瘤细胞)。编码由融合瘤制备的抗Mia抗 体的轻链和重链的cDNA可以通过标准PCR扩增或cDNA转殖技术获得。关于使用噬菌 体展示技术获得的抗体，可以从文库中的各种噬菌体选殖中获得本发明实施例中编码有抗 Mia抗体的分离的核酸。
在本发明的一实施例中，编码抗Mia抗体的分离的核酸可以包含编码有下列氨基酸序 列的至少其中之一或其组合的核苷酸序列：SEQ ID NO.7(GYTFTNYAIH)、SEQ ID NO.8(WINAGNGNTKYSQKFQG)、SEQ ID NO.9(ARDFRIPSLAVAEVGLDY)、SEQ ID NO.10(KSSQSVLYSSNNKNYLA)、SEQ ID NO.11(WASTRES)以及SEQ ID NO.12 (QQLYSTPLT)。在本发明的另一实施例中，编码抗Mia抗体的分离的核酸可以包含SEQ ID NO.15所述的核苷酸序列，其为编码重链可变区的核苷酸序列。在本发明的另一实施例 中，编码抗Mia抗体的分离的核酸可以包含SEQ ID NO.16所述的核苷酸序列，其为编码 轻链可变区的核苷酸序列。在本发明的另一实施例中，编码抗Mia抗体的分离的核酸可以 包含SEQ ID NO.15及SEQ IDNO.16所述的核苷酸序列。
在本发明的另一实施例中，可以将前述获得编码重链可变区和轻链可变区的核苷酸序 列，进一步通过标准重组DNA技术进行重组，例如将可变区核苷酸序列转化为全长抗体 核苷酸序列、Fab核苷酸序列或scFv核苷酸序列。在前述重组中，可以将编码重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列可操作地连接到另一核苷酸序列上，或编码另一种蛋白质的核苷酸片段上，例如抗体恒定区或连接体。在本文中使用的术语「可操作地连接」意指两个 核苷酸序列以功能性方式连接，例如，使得两个核苷酸序列片段编码的氨基酸序列保持符 合阅读框，或者使蛋白质在所需启动子的控制下表达。
通过将编码重链可变区的核苷酸序列与编码重链恒定区(CH1，CH2和CH3)的另一核苷酸序列可操作地连接，可以将编码重链恒定区的分离的核酸转化为具有全长重链的核酸。小鼠和人类(或其他哺乳动物)重链恒定区的核苷酸序列及核苷酸序列的片段是本领域已知的(参见例如，Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No.91-3242)。 重链恒定区可以是IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，IgE，IgM或IgD恒定区。在一些实 施例中，重链恒定区是选自IgM种型。关于Fab重链核苷酸序列，可以将编码重链可变区 的核苷酸序列仅与编码重链CH1恒定区的另一核苷酸序列可操作地连接。
通过将编码轻链可变区的核苷酸序列与编码轻链恒定区CL的另一核苷酸序列可操作 地连接，可以将编码轻链可变区的分离的核酸转化为全长轻链的核酸。小鼠和人类(或其 他哺乳动物)轻链恒定区的核苷酸序列及核苷酸序列的片段是本领域已知的(参见例如， Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S. Department of Health and Human Services,NIH PublicationNo.91-3242)。轻链恒定区可以是 κ或λ恒定区。
为了产生scFv核苷酸序列，编码重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列片段与编码连 接体的另一片段可操作地连接，例如，编码(Gly-Ser)n残基的连接体片段，将重链可变区和 轻链可变区的核苷酸序列连接使得该核苷酸序列表达出连续的单链蛋白(包括重链可变 区、轻链可变区及连接体)(参见例如，Bird等人，1988Science 242：423-426、Huston等 人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883、McCafferty等人，(1990)Nature 348： 552-554)。
在一些实施例中，本文所述的任何核酸都可以整合到表达载体中以构建可编码抗Mia 抗体的载体，并将该载体转殖到宿主细胞中。一般而言，整合到载体的核苷酸序列不包括 内含子(intron)。在本实施例中，可通过例如但不限于电穿孔、转染或转导等本领域技术 人员熟知用来将载体转殖到宿主细胞的方法来进行，以使宿主细胞表达抗Mia抗体。在本 实施例中，宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，包括但不限于细菌、酵母菌、嗜菌体、哺乳动物的细胞(例如但不限于CHO、COS、239F、SF9和/或其他细胞株)。上述方法 描述于C.Toyoda等人(2014)British Blood Transfusion Society中，其内容通过引用并入本文。在一些实施例中，当在培养基中培养时，宿主细胞瞬时或稳定地在载体上表达核酸， 因此提供了产生本发明前述的抗体或片段的方法。
建立融合瘤细胞株以表达抗Mia抗体
在本发明的一实施例中，采集含有Mia抗原的捐赠者(编号377T)的血液(以下简称「377T」)，以建立融合瘤细胞株用以表达抗Mia抗体。
通过血球凝集测试进行抗体活性测试
将使用前述方法(包括载体或融合瘤技术)产生的抗Mia抗体进行血球凝集测试。在 本实施例中，标准品(具有多特异性抗Mia抗体的捐赠者血浆)与1022个捐赠者血液样品取自中国台湾血液基金会，标准品通过先前方法鉴定为可能具有多特异性抗Mia抗体的捐赠者血浆。在本实施例中，使用标准品与抗Mia抗体(377T)分别检测1022个捐赠者 血液样品，并以自动血液分组系统(PK7300，Beckman Coulter，东京，日本)，进行判读， 自动区分有血球凝集(判读为Mia抗原阳性，也即带有Mia抗原)的样品与无血球凝集(判 读为Mia抗原阴性，也即没有Mia抗原)的样品，标准品与本发明的抗Mia抗体的检测结 果如下表1所示。
表1：针对1022个样品检测Mia抗原的检测结果，表格中的数字代表样品数。
a代表标准品检测为Mia阳性，抗Mia抗体(377T)检测为Mia阴性；
b代表标准品检测为Mia阴性，抗Mia抗体(377T)检测为Mia阳性。
由表1可知，与标准品检测的结果相比，在1022个样品中，仅有2个样品的判读结果不同。进一步针对这两个样品进行测序，由测序结果发现标准品检测为Mia阳性，抗 Mia抗体(377T)检测为Mia阴性的样品(简称样品a)，其基因型为GYPB/GYPB(也即 不带有Mia抗原的正常血型糖蛋白B，因此，样品a的检测结果应该为阴性，抗Mia抗体 (377T)检测为阴性为正确的结果。另外，标准品检测为Mia阴性，抗Mia抗体(377T) 检测为Mia阳性的样品(简称样品b)，其基因型为GYP.Mur/GYPB(也即带有Mia抗原 的Mia血型抗原第三型，因此，样品b的检测结果应该为阳性，抗Mia抗体(377T)检测 为阳性为正确的结果。由上述结果可知，抗Mia抗体(377T)具有比标准品更佳的灵敏度 及特异性。
抗Mia抗体(377T)的氨基酸序列分析
在本实验例中，对抗Mia抗体进行序列分析，发现抗Mia抗体包括一重链可变区以及 一轻链可变区。重链可变区包括具有SEQ ID NO.7(GYTFTNYAIH)氨基酸序列的CDR-H1、具有SEQ ID NO.8(WINAGNGNTKYSQKFQG)氨基酸序列的CDR-H2以及具有SEQ ID NO.9(ARDFRIPSLAVAEVGLDY)氨基酸序列的CDR-H3。轻链可变区包括具有SEQ ID NO.10(KSSQSVLYSSNNKNYLA)氨基酸序列的CDR-L1、具有SEQ ID NO.11(WASTRES) 氨基酸序列的CDR-L2以及具有SEQ ID NO.12(QQLYSTPLT)氨基酸序列的CDR-L3。 在本实施例中，可以使用本领域熟知分析抗体氨基酸序列的任何方法，进行抗Mia抗体(377T)的氨基酸序列分析。
抗Mia抗体(377T)的抗原结合表位分析(epitope analysis)
接下来，进行抗原结合表位分析，以鉴定与抗Mia抗体(377T)结合的Mia抗原表位的氨基酸序列。请参考图1，在本实验例中，合成SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.17至SEQ ID NO.18以进行表位分析。图1横轴所示氨基酸序列由左而右分别为SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.18。将上述氨基酸序列合成的肽配置 于DMSO中，并用于ELISA分析。将96孔盘加入每孔50uL含有20ug/ml抗原(即上述 氨基酸序列的肽)的磷酸盐缓冲液(PBS)，于4℃下涂布(coating)至隔天。将磷酸盐缓 冲液移除后，每孔加入300uL的封闭缓冲液(含有3％脱脂牛奶)，于37℃下培养1小时。 移除封闭缓冲液后，每孔加入50uL加入抗Mia抗体(377T)，于37℃下培养1小时。随 后移除抗Mia抗体(377T)并以洗涤液清洗后，加入含有抗人类二级抗体(Leadgene human IgG-HRP，浓度1：5000+Leadgenehuman IgM-HRP，浓度1：5000)的磷酸盐缓冲溶液T (含有Tween 20，PBST)，于37℃下培养1小时。移除未结合的抗人类二级抗体并以洗涤 液清洗后，每孔加入50uL的基质(Leadgenecommercial TMB)，于37℃下培养10分钟。 接着每孔加入50uL的终止溶液(含有0.2M H2SO4)并以冷光仪检测450nm的吸光值。 如图所示，抗Mia抗体(377T)与由SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.6的氨基酸序列组成的 肽，具有高的450nm吸光值，表示抗Mia抗体(377T)与这些氨基酸序列组成的抗原表 位，具有高的结合力。
综上所述，本发明的抗Mia抗体可与Mia抗原的表位特异性结合，且具有相较于标准 品更高的灵敏度及特异性。利用本发明产生的抗Mia抗体、试剂盒及方法能够在生物体的 样品中检测是否含有Mia抗原，以确认样品是否适合用于例如输血的用途，为血库或医院 等需要大量使用血液样品的机构，提供方便、准确的检验方法、试剂盒及抗体。
以上所述仅为举例性，而非为限制性者。任何未脱离本发明的精神与范畴，而对其进 行的等效修改或变更，均应包含于后附的权利要求中。
【序列表】
<110> 医疗财团法人台湾血液基金会
<120> 用于检测米田堡血型抗原的抗体及其片段、试剂盒及方法
<160> 13
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 米田堡蛋白的表位
<220>
<221> misc 特征
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Thr、或Met、或Lys
<400> 1
Asp Xaa His Lys Arg Asp Thr Tyr
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 米田堡蛋白的表位
<220>
<221> misc 特征
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Thr、或Met、或Lys
<400> 2
Xaa His Lys Arg Asp Thr Tyr Ala
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 米田堡蛋白的表位
<400> 3
His Lys Arg Asp Thr Tyr Ala Ala
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 米田堡蛋白的表位
<400> 4
Asp Lys Arg Asp Thr Tyr Pro Ala
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 米田堡蛋白的表位
<400> 5
Lys Arg Asp Thr Tyr Pro Ala His
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 米田堡蛋白的表位
<400> 6
Arg Asp Thr Tyr Pro Ala His Thr
1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成
<400> 7
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Ala Ile His
1 5 10
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成
<400> 8
Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys
1 5 10
Phe Gln Gly
15
<210> 9
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成
<400> 9
Ala Arg Asp Phe Arg Ile Pro Ser Leu Ala Val Ala Glu Val
1 5 10
Gly Leu Asp Tyr
15
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成
<400> 10
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn
1 5 10
Tyr Leu Ala
15
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成
<400> 11
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成
<400> 12
Gln Gln Leu Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 13
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro
1 5 10
Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
15 20 25
Phe Thr Asn Tyr Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
30 35 40
Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly
45 50 55
Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile
60 65 70
Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser
75 80
Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg
85 90 95
Asp Phe Arg Ile Pro Ser Leu Ala Val Ala Glu Val Gly Leu
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 14
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成
<400> 14
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser
1 5 10
Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser
15 20 25
Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr
30 35 40
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp
45 50 55
Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
60 65 70
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
75 80
Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr
85 90 95
Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 15
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成
<400> 15
caggtccagc ttgtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc 50
agtgaagatt tcctgcaagg cttctggata caccttcacc aactatgcta 100
tacattgggt gcgccaggcc cccggacaaa ggcttgagtg gatgggttgg 150
atcaacgctg gcaatggtaa cacaaaatat tcacagaagt tccagggcag 200
agtcaccatt accagggaca catccgcgag cacagcctac atggagctga 250
gcagcctgag atctgaagac acggctatat attactgtgc gagagatttt 300
cggatacctt ctctagcagt ggctgaggtc ggtcttgact actggggcca 350
gggaaccctg gtcaccgtct cctca
375
<210> 16
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成
<400> 16
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga 50
gagggccacc atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca 100
acaataagaa ctacttagct tggtatcagc agaaaccagg acagcctcct 150
aagctgctca tttactgggc atctacccgg gaatccgggg tccctgaccg 200
attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc atcagcagcc 250
tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaatt gtatagtact 300
ccgctcactt tcggcggagg gaccaaagtg gagatcaaac ga 342
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 米田堡蛋白的表位
<220>
<221> misc 特征
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Thr、或Met、或Lys
<400> 17
Asn Asp Xaa His Lys Arg Asp Thr
1 5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 米田堡蛋白的表位
<400> 18
Asp Thr Tyr Pro Ala His Thr Ala
1 5
Claims (14)
1.一种分离的抗体或其片段，所述抗体或其片段与米田堡(Miltenberger)血型抗原的一表位特异性结合，其中所述表位是选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所组成的群组中的氨基酸序列的一部分，且包含氨基酸序列Arg-Asp-Thr-Tyr，其中所述抗体或其片段包括：
一重链可变区，包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的CDR-H1、具有SEQ ID NO.8氨基酸序列的CDR-H2以及具有SEQ ID NO.9氨基酸序列的CDR-H3；以及
一轻链可变区，包括具有SEQ ID NO.10氨基酸序列的CDR-L1、具有SEQ ID NO.11氨基酸序列的CDR-L2以及具有SEQ ID NO.12氨基酸序列的CDR-L3。
2.一种分离的抗体或其片段，具有一结合结构域，所述结合结构域包括：
一重链可变区，包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的CDR-H1、具有SEQ ID NO.8氨基酸序列的CDR-H2以及具有SEQ ID NO.9氨基酸序列的CDR-H3；以及
一轻链可变区，包括具有SEQ ID NO.10氨基酸序列的CDR-L1、具有SEQ ID NO.11氨基酸序列的CDR-L2以及具有SEQ ID NO.12氨基酸序列的CDR-L3。
3.如权利要求1或2所述的抗体或其片段，其中所述重链可变区具有SEQ ID NO.13的氨基酸序列。
4.如权利要求1或2所述的抗体或其片段，其中所述轻链可变区具有SEQ ID NO.14的氨基酸序列。
5.如权利要求3所述的抗体或其片段，其中所述重链可变区是由SEQ ID NO.15核苷酸序列所编码的。
6.如权利要求4所述的抗体或其片段，其中所述轻链可变区是由SEQ ID NO.16核苷酸序列所编码的。
7.如权利要求1或2所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是选自单克隆抗体、人源化抗体、重组抗体、人类抗体、抗体的生物活性片段、抗体模拟物及其任何组合所组成的群组。
8.如权利要求1或2所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、单结构域抗体及其任何组合所组成的群组。
9.一种试剂盒，其用于在一生物体的一样品中检测一米田堡(Miltenberger)血型抗原，所述试剂盒包括一如权利要求1至8中任一项所述的抗体或其片段。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其中所述样品是全血或分离的红血球。
11.如权利要求9所述的试剂盒，其中所述生物体是人类。
12.一种用于在一生物体中检测一米田堡(Miltenberger)血型抗原的方法，所述方法包括：
制备所述生物体的一样品；以及
将一如权利要求1至8中任一项所述的抗体或其片段加到所述样品中，以检测所述样品中是否具有所述米田堡(Miltenberger)血型抗原。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述样品是全血或分离的红血球。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述生物体是人类。
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