CN103389384A - Miltenberger抗体检测试纸条及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种Miltenberger血型抗体检测免疫荧光层析试纸条及其检测方法，该试纸条由依次在衬板上相互搭接的样品垫、反应膜和吸收垫组成，所述样品垫两端分别设置有第一加样点和第二加样点，所述反应膜固定有一条内部质控带和至少一条抗体检测带。其检测方法包括如下步骤：将生物素标记的多肽血型抗原与血清样本混合后加入至样品垫中；加入荧光标记二抗；用荧光检测仪器检测。本发明能够解决我国乃至世界上目前缺乏简便实用的临床常规Miltenberger血型抗体检测技术和试剂的难题，辅助临床因Miltenberger血型抗体引起的新生儿溶血病、输血不良反应等疾病的诊断，保障临床安全、有效、科学输血。

Description

Miltenberger抗体检测试纸条及其检测方法

技术领域

本发明涉及医学检测领域，特别是涉及一种Miltenberger抗体检测免疫荧光层析试纸条及其检测方法。

背景技术

MNS血型系统是继ABO之后发现的第二个血型系统，其抗原的多态性数目仅次于Rh血型系统。MNS血型系统中有一类特殊的Miltenberger亚血型系统，其血型抗原是以人血清免疫抗体所鉴定的一系列低频率抗原组合的红细胞表型。该亚系统中Mur、Mil等几个抗原的发生频率在欧洲白人中低于千分之一，而在中国人和其他亚洲人群中为3%~10%。一项针对844名广西侗族人群的调查显示，Mur稀有血型抗原阳性率为15.4%。而林玛利等人在1990年针对台湾各种族的调查显示，高山原居民的阿美族的Mur血型阳性率则高达88.4%。

抗-Mur发生率在东南亚地区很高，特别是在我国台湾、香港人群中抗-Mur的发生频率甚至仅次于抗-A/抗-B。临床报告证实抗-Mur抗体会导致同种异型免疫性疾病，如输血不良反应、新生儿溶血病等。伴随全球化进程，各种族和各国人口在全世界的流动加快，使得Mur抗原在世界各国的临床意义日益重要。血液免疫学理论和临床实际都明确提出，在亚洲各国应用的血型抗体筛查红细胞组和血型抗体鉴定的谱细胞中应该有Mur抗原阳性红细胞。由于缺少相关试剂，多数医疗机构使用的抗体筛查细胞中并没有包含Miltenberger血型抗原，常规检测无法鉴定抗体的特异性，导致对存在该抗体的患者漏检。由于新鲜红细胞保存时间很短（最多3个月），Miltenberger抗原阳性红细胞来源非常有限，Miltenberger血型筛查及其抗体的检测受到极大地限制。目前Miltenberger血型抗体检测中面临的几个主要问题是：1）由于临床检测谱细胞中未使用相应筛选红细胞，不规则抗体经常漏检；2）含有稀有抗原的筛选红细胞的稳定供应得不到长期保证；3）新鲜红细胞保存时间极短。

由于至今也无商品化供应的抗Miltenberger血型抗原的单克隆抗体，人源血型试剂（人红细胞试剂和人血清抗体试剂）的固有缺点以及没有合适的试验方法，世界各国目前临床上不能够常规开展Miltenbergerr血型相容性试验，只在少数的大型血液中心和血型参比试验室对一些疑难的血型不相容疾病病人进行相关的检验工作。至今，临床上不能常规开展Miltenberger血型相容性实验的具体障碍和问题是：Miltenberger抗原试剂和抗体试剂都短缺，红细胞血球试剂和人血清抗体试剂的固有缺点，以及目前应用的免疫血清学试验技术方法的缺点等。我国临床对于Miltenberger血型抗原抗体的重要性及检测方法的相关研究也很少，目前仅限个案报道。  

澳大利亚CSL公司利用Kode^TM技术，将合成的多肽抗原连接到红细胞上，制备得到筛检抗-Mur抗体及抗-MUT抗体的红细胞。这种技术是将红细胞与含有功能（表位）基团-连接链-脂肪基团（function-epitope-spacer lipid, FSL）的液体混合一段时间，携带有特殊抗原表位的FSL可以模拟糖脂结构结合于红细胞表面，从而改变红细胞的血型。但这种技术只能增加抗原，而不能封闭原有的红细胞抗原。这一筛查红细胞已经被用来进行大规模的抗体筛检。但CSL公司利用Kode^TM技术所制备的仍然是基于存活红细胞的血型抗原试剂，上述提到的几个根本问题并没有得到解决，存在于存活的红细胞膜上的血型抗原，由于红细胞容易溶血，抗原性也随之消亡。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种Miltenberger抗体检测免疫荧光层析试纸条及其检测方法，免疫荧光层析技术操作快速简便，结合检测仪器能够实现半定量或定量检测；该技术能够解决我国乃至世界上目前缺乏简便实用的临床常规Miltenberger血型抗体检测技术和试剂的难题，辅助临床因Miltenberger血型抗体引起的新生儿溶血病、输血不良反应等疾病的诊断，以及进行输血前相容性实验检测，保障临床安全、有效、科学输血。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种Miltenberger抗体检测免疫荧光层析试纸条，包括反应膜、样品垫、吸收垫和衬板，所述反应膜位于所述底板上，所述反应膜上固定有检测带和质控带，所述样品垫和所述吸收垫分别与所述反应膜的两侧部分重叠，并位于所述反应膜和所述底板上，所述样品垫上包括第一加样点和第二加样点，所述第一加样点设置在远离所述样品垫与所述反应膜重叠的一侧，所述第二加样点设置在接近所述样品垫与所述反应膜重叠的一侧。

在本发明一个较佳实施例中，所述反应膜的材料为硝酸纤维素膜、醋酸纤维膜、尼龙膜和聚四氟乙烯膜中的一种，所述样品垫或所述吸收垫与所述反应膜的两侧重叠部分的长度为0.5 mm。

在本发明一个较佳实施例中，所述质控带上固定有人IgG和人IgM，所述检测带为至少一条，所述检测带上固定有链霉亲和素。

在本发明一个较佳实施例中，所述试纸条用于Miltenberger抗体检测的检测方法，包括步骤为：

（1）将待检血清与多肽抗原的混合液加入到第二加样点处中，将洗涤液加入到第一加样点处洗涤，重复3次；

（2）再将荧光标记二抗加入到所述第二加样点处中，重复3次；

（3）将所述试纸条置于荧光检测仪中检测。

在本发明一个较佳实施例中，所述荧光标记二抗的荧光素为花青素Cy系列荧光素或Alexa Fluor系列荧光素。

在本发明一个较佳实施例中，所述荧光标记二抗的二抗为羊抗人IgG和/或羊抗人IgM、兔抗人IgG和/或兔抗人IgM、鸡抗人IgG和/或鸡抗人IgM中的一种。

在本发明一个较佳实施例中，所述洗涤液是含有体积分数为0.5%的Tween-20且pH值为7.2的0.15 M磷酸盐缓冲液。

在本发明一个较佳实施例中，所述待检血清与多肽抗原的混合液为将体积比为1:1的待检血清和多肽抗原混匀后在室温下孵育1 h得到。

本发明的有益效果是：免疫荧光层析技术操作快速简便，结合检测仪器能够实现半定量或定量检测；该技术能够解决我国乃至世界上目前缺乏简便实用的临床常规Miltenberger血型抗体检测技术和试剂的难题，辅助临床因Miltenberger血型抗体引起的新生儿溶血病、输血不良反应等疾病的诊断，以及进行输血前相容性实验检测，保障临床安全、有效、科学输血。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1是本发明Miltenberger抗体检测免疫荧光层析试纸条一较佳实施例的结构示意图；

附图中各部件的标记如下：1、第一加样点，2、样品垫，3、第二加样点，4、检测带，5、反应膜，6、质控带，7、吸收垫，8、衬板。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：

请参阅图1，一种Miltenberger抗体检测免疫荧光层析试纸条，包括反应膜5、样品垫2、吸收垫7和衬板8，所述反应膜5位于所述衬板8上，所述反应膜5上固定有检测带4和质控带6，所述样品垫2和所述吸收垫7分别与所述反应膜5的两侧部分重叠，并位于所述反应膜5和所述衬板8上，所述样品垫2上包括第一加样点1和第二加样点3，所述第一加样点1设置在远离所述样品垫2与所述反应膜5重叠的一侧，所述第二加样点3设置在接近所述样品垫2与所述反应膜5重叠的一侧。

优选的，所述反应膜5的材料为硝酸纤维素膜、醋酸纤维膜、尼龙膜和聚四氟乙烯膜中的一种。所述质控带6上固定有人IgG和人IgM。所述检测带4为至少一条，所述检测带4上固定有链霉亲和素。

实施例二：

提供一种实施例一所述试纸条用于Miltenberger血型抗体筛检的检测方法：

（1）试纸条的制备：

1）选取Millipore HF 180带背衬膜作为反应膜，将其裁成30×1.8 cm 大小备用，将人IgG和人IgM使用0.01 M的pH值为7.2的PBS调节其浓度为0.5 mg/mL，加入体积分数为1%的 Tween-20，使用划膜仪将其喷于NC膜表面作为质控带，划膜量为0.5 μL/cm。将链霉亲和素应用0.15 M的pH值为7.2的PBS调节至浓度为0.1 mg/mL，使用划膜仪将其喷于NC膜表面作为检测带，每条线间隔为5 mm，划膜结束后立即放入37℃烘箱中干燥过夜，室温保存备用；

2）试纸条的组装

选取国产优质玻璃纤维膜BT100作为样品垫的材料，将其剪成30×1.8 cm大小备用，选取国产优质吸水纸CH37K作为吸收垫的材料，并将其剪裁成30×1.8 cm大小备用，在规格为30×6 cm的PVC衬板上首先黏贴反应膜，然后将样品垫与吸收垫采取搭接的方法黏贴于衬板上，搭接的长度为0.5 mm，以便于反应液的扩散，组装好后，将其切成4 mm宽的试纸条，并封装于塑料外壳中，放于铝箔袋中，4℃密封保存。

3）荧光反应液的制备

将抗人IgG或抗人IgM抗体溶液磷酸盐缓冲液调节至浓度为2 mg/mL，pH为7.5至8.0，取1 mL抗体溶液，缓慢加入100 μL浓度为1 mg/mL的Cy5荧光染料，在4℃缓慢搅拌3 h后在室温反应1 h，再用pH 为7.4的磷酸盐缓冲液进行透析，去除未反应的Cy5染料。透析液完成后回收偶联好的荧光抗体，测定偶联效率与抗体浓度后，在4℃下避光保存。

（2）检测样本的制备

1）待检病人血清

抽取待检患者静脉血分离血清；

2）待检血清与多肽抗原孵育

将对应Miltenberger亚血型系统中Mia （MNS7）、Mur （MNS10）、Hil（MNS20）以及MUT （MNS35）血型抗原氨基酸序列的多肽以0.15 M pH 7.2 PBS溶解至10 mg/mL，取50 μL多肽抗原与50 μL待检血清混匀后，室温孵育1 h备用。

（3）检测步骤

1）将试纸条和反应液平衡至室温（18-25℃）；

2）加入10 μL待检血清与多肽抗原的混合液至样品垫中；

3）加入10 μL 含有体积分数为0.5%的Tween-20的pH为7.2的0.15M PBS至样品垫中；

4）重复步骤3）3次；

5）加入5 μL Cy5-抗人IgG和/或抗人IgM至样品垫中；

6）重复步骤3）3次；

7）将试纸条置于荧光信号读取仪器中，读取荧光信号进行测定。

实施例三：

提供一种实施例一所述试纸条用于Miltenberger血型抗体特异性鉴定的检测方法：

（1）试纸条的制备：

1）选取Millipore HF 180带背衬膜作为反应膜，将其裁成30×1.8 cm 大小备用，将人IgG和人IgM使用0.01 M的pH值为7.2的PBS调节其浓度为0.5 mg/mL，加入体积分数为1%的 Tween-20，使用划膜仪将其喷于NC膜表面作为质控带6，划膜量为0.5 μL/cm。将链霉亲和素应用0.15 M的pH值为7.2的PBS调节至浓度为0.1 mg/mL，使用划膜仪将其喷于NC膜表面作为检测带，每条线间隔为5 mm，划膜结束后立即放入37℃烘箱中干燥过夜，室温保存备用；

2）试纸条的组装

选取国产优质玻璃纤维膜BT100作为样品垫的材料，将其剪成30×1.8 cm大小备用，选取国产优质吸水纸CH37K作为吸收垫的材料，并将其剪裁成30×1.8 cm大小备用，在规格为30×6 cm的PVC衬板上首先黏贴反应膜，然后将样品垫与吸收垫采取搭接的方法黏贴于衬板上，搭接的长度为0.5 mm，以便于反应液的扩散，组装好后，将其切成4 mm宽的试纸条，并封装于塑料外壳中，放于铝箔袋中，4℃密封保存。

3）荧光反应液的制备

将抗人IgG或抗人IgM抗体溶液磷酸盐缓冲液调节至浓度为2 mg/mL，pH为7.5至8.0，取1 mL抗体溶液，缓慢加入100 μL浓度为1 mg/mL的Cy5荧光染料，在4℃缓慢搅拌3 h后在室温反应1 h，再用pH 为7.4的磷酸盐缓冲液进行透析，去除未反应的Cy5染料。透析液完成后回收偶联好的荧光抗体，测定偶联效率与抗体浓度后，在4℃下避光保存。

（2）检测样本的制备

1）待检病人血清

抽取待检患者静脉血分离血清；

2）待检血清与多肽抗原孵育

将对应Miltenberger亚血型系统中Mia （MNS7）、Mur （MNS10）、Hil（MNS20）以及MUT （MNS35）血型抗原氨基酸序列的多肽分别以0.15 M pH 7.2 PBS溶解至10 mg/mL，取50 μL多肽抗原与50 μL待检血清混匀后，室温孵育1 h备用。

（3）检测步骤

1）将试纸条和反应液平衡至室温（18-25℃）；

2）加入10 μL待检血清与多肽抗原的混合液至样品垫中；

3）加入10 μL 含有体积分数为0.5%的Tween-20的pH为7.2的0.15M PBS至样品垫中；

4）重复步骤3）3次；

5）加入5 μL Cy5-抗人IgG和/或抗人IgM至样品垫中；

6）重复步骤3）3次；

7）将试纸条置于荧光信号读取仪器中，读取荧光信号进行测定。

本发明Miltenberger血型抗体检测免疫荧光层析试纸条及其检测方法的有益效果是：免疫荧光层析技术操作快速简便，结合检测仪器能够实现半定量或定量检测；该技术能够解决我国乃至世界上目前缺乏简便实用的临床常规Miltenberger血型抗体检测技术和试剂的难题，辅助临床因Miltenberger血型抗体引起的新生儿溶血病、输血不良反应等疾病的诊断，以及进行输血前相容性实验检测，保障临床安全、有效、科学输血。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种Miltenberger抗体检测免疫荧光层析试纸条，其特征在于，包括反应膜、样品垫、吸收垫和衬板，所述反应膜位于所述底板上，所述反应膜上固定有检测带和质控带，所述样品垫和所述吸收垫分别与所述反应膜的两侧部分重叠，并位于所述反应膜和所述底板上，所述样品垫上包括第一加样点和第二加样点，所述第一加样点设置在远离所述样品垫与所述反应膜重叠的一侧，所述第二加样点设置在接近所述样品垫与所述反应膜重叠的一侧。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述反应膜的材料为硝酸纤维素膜、醋酸纤维膜、尼龙膜和聚四氟乙烯膜中的一种，所述样品垫或所述吸收垫与所述反应膜的两侧重叠部分的长度为0.5 mm。

3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述质控带上固定有人IgG和人IgM，所述检测带为至少一条，所述检测带上固定有链霉亲和素。

4.根据权利要求1所述的试纸条用于Miltenberger抗体检测的检测方法，其特征在于，包括步骤为：

（1）将待检血清与多肽抗原的混合液加入到第二加样点处中，将洗涤液加入到第一加样点处洗涤，重复3次；

（2）再将荧光标记二抗加入到所述第二加样点处中，重复3次；

（3）将所述试纸条置于荧光检测仪中检测。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述荧光标记二抗的荧光素为花青素Cy系列荧光素或Alexa Fluor系列荧光素。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述荧光标记二抗的二抗为羊抗人IgG和/或羊抗人IgM、兔抗人IgG和/或兔抗人IgM、鸡抗人IgG和/或鸡抗人IgM中的一种。

7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述洗涤液是含有体积分数为0.5%的Tween-20且pH值为7.2的0.15 M磷酸盐缓冲液。

8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述待检血清与多肽抗原的混合液为将体积比为1:1的待检血清和多肽抗原混匀后在室温下孵育1 h得到。

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