TWI698643B - 用於檢測米田堡血型抗原的抗體及其片段、試劑盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明揭露一種分離的抗體或其片段，其選擇性地與米田堡（Miltenberger）血型抗原的一表位專一性地結合，其中表位係選自於SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所組成的群組中之胺基酸序列的一部分，且至少包含胺基酸序列Arg-Asp-Thr-Tyr。本發明另揭露用於檢測米田堡血型抗原的試劑盒及方法。

Description

用於檢測米田堡血型抗原的抗體及其片段、試劑盒及方法
本發明是關於一種用於檢測米田堡抗原的抗體及其片段、試劑盒及方法。
僅次於Rh血型系統，MNS血型系統中有一類特殊的米田堡（Miltenberger）亞血型系統，其血型抗原是以人類血清免疫抗體所鑑定的一系列低頻率抗原組合的紅血球表型。米田堡血型抗原（Miltenberger blood group antigen）極可能是在演化過程中，由序列結構相似（homologous）的血型糖蛋白A（glycophorin A，GYPA）、血型糖蛋白B（glycophorin B，GYPB），和血型糖蛋白E（glycophorin E，GYPE）基因重組產生的蛋白混合體（hybrid protein）。米田堡血型抗原現今已發現11種亞型（subtypes），包括米田堡血型抗原第一型（Mi.I）至米田堡血型抗原第十一型（Mi.XI）。米田堡血型抗原第三型（Mi.III）推測是由一段血型糖蛋白A基因，藉由同源重組（homologous recombination）插入血型糖蛋白B。所以米田堡血型抗原第三型的基因序列呈血型糖蛋白B-A-B混合基因的型態，此B-A-B混合基因轉錄出一段具強烈抗原性的Mur胜肽，故米田堡血型抗原第三型又稱Gp. Mur（參見例如Journal of Molecular Evolution (1995) 41:4,478-486）。
在台灣，米田堡血型抗原第三型是所有特殊血型裡發生頻率最高的；尤其在特定原住民族群，其發生頻率高達20至90%。整體而言，台灣人約有6.27%米田堡血型抗原第三型陽性之人口。米田堡血型抗原第三型在特定東南亞國家，其發生頻率與台灣相當，例如泰國為9至10%、菲律賓為8.3%、香港為6.3%、印尼為2.47%及中國為1.9%。而米田堡血型第三型在高加索白種人（歐、美、澳等）、北方漢人和日本人中的發生頻率都小於0.01%。
臨床報告證實米田堡血型抗原第三型會導致同種異體免疫性疾病，如輸血不良反應、新生兒溶血症等。因此，在輸血前必須判斷捐贈者的血液中是否具有米田堡抗原，以避免前述不良反應發生。然而，目前尚無商售可得的抗米田堡血型抗原的單株抗體、試劑，也沒有合適且快速的檢測方法。
因此，現仍亟需一種用來檢測捐贈者樣品中，是否具有米田堡血型抗原的抗體、試劑盒及方法，能夠在輸血前確認捐贈者及受贈者的米田堡血型是否匹配，以避免不良反應的發生。
有鑒於上述課題，本發明的目的為提供一種用於檢測米田堡血型抗原的抗體及其片段、試劑盒及方法。在輸血前加以應用，用來確認捐贈者的樣品中是否具有米田堡血型抗原，以篩選適合受贈者的捐贈者樣品，進而避免將樣品輸入受贈者後，產生同種異體免疫性疾病的不良反應。
為達上述目的，本發明提供一種分離的抗體或其片段，抗體或其片段選擇性地與米田堡（Miltenberger）血型抗原的一表位專一性結合，其中表位係選自於SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所組成的群組中之胺基酸序列的一部分，且至少包含胺基酸序列Arg-Asp-Thr-Tyr。
在一實施例中，抗體或其片段包括：一重鏈可變區，包括具有SEQ ID NO.7胺基酸序列的CDR-H1、具有SEQ ID NO.8胺基酸序列的CDR-H2以及具有SEQ ID NO.9胺基酸序列的CDR-H3；以及一輕鏈可變區，包括具有SEQ ID NO.10胺基酸序列的CDR-L1、具有SEQ ID NO.11胺基酸序列的CDR-L2以及具有SEQ ID NO.12胺基酸序列的CDR-L3。
為達上述目的，本發明更提供一種分離的抗體或其片段，具有一結合結構域包括：一重鏈可變區，包括具有SEQ ID NO.7胺基酸序列的CDR-H1、具有SEQ ID NO.8胺基酸序列的CDR-H2以及具有SEQ ID NO.9胺基酸序列的CDR-H3；以及一輕鏈可變區，包括具有SEQ ID NO.10胺基酸序列的CDR-L1、具有SEQ ID NO.11胺基酸序列的CDR-L2以及具有SEQ ID NO.12胺基酸序列的CDR-L3。
在一實施例中，重鏈可變區具有SEQ ID NO.13的胺基酸序列。
在一實施例中，輕鏈可變區具有SEQ ID NO.14的胺基酸序列。
在一實施例中，重鏈可變區係由SEQ ID NO.15核苷酸序列所編碼的。
在一實施例中，輕鏈可變區係由SEQ ID NO.16核苷酸序列所編碼的。
在一實施例中，抗體或其片段係選自於單株抗體、人源化抗體、重組抗體、人類抗體、抗體的生物活性片段、抗體模擬物及其任何組合所組成的群組。
在一實施例中，抗體或其片段係選自於Fab、Fab'、F(ab') 2、Fv片段、scFv抗體片段、線性抗體、單結構域抗體及其任何組合所組成的群組。
為達上述目的，本發明更提供一種試劑盒，係用於在一生物體的一樣品中檢測一米田堡（Miltenberger）血型抗原，試劑盒包括一如前所述的抗體或其片段。
在一實施例中，樣品係全血或分離的紅血球。
在一實施例中，生物體係人類。
為達上述目的，本發明更提供一種用於在一生物體中檢測一米田堡（Miltenberger）血型抗原的方法包括：製備生物體的一樣品；以及將一如前所述的抗體或其片段加到樣品中，以檢測樣品中是否具有米田堡（Miltenberger）血型抗原。
在一實施例中，樣品係全血或分離的紅血球。
在一實施例中，生物體係人類。
承上所述，本發明的功效在於：藉由提供一種用於檢測米田堡血型抗原的抗體及其片段、試劑盒及方法，可以確認生物體的樣品中是否具有米田堡血型抗原，以篩選適合用於例如但不限於輸血的樣品，進而避免將樣品輸入另一生物體後，產生同種異體免疫性疾病的不良反應。
以下將參照相關圖式，說明依據本發明用於檢測米田堡血型抗原的抗體及其片段、試劑盒及方法的較佳實施例，其中相同的元件將以相同的參照符號加以說明。
本發明的抗體及其片段、試劑盒及方法能夠用來檢測生物體的樣品中，是否具有米田堡血型抗原，進而篩選適合另一生物體的樣品，以避免同種異體免疫反應性疾病的發生。以下將以實施例來說明本發明用於檢測米田堡血型抗原的抗體及其片段、試劑盒及方法。
除非另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬技術領域的通常知識者理解的相同的含義。儘管在本發明的測試實驗中可以使用與本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料，但是本文描述了優選的材料和方法。在描述和要求保護本發明時，將使用以下術語。應該理解的是，這裡使用的術語的目的僅用於描述特定實施例，而非對本發明的限制。
術語「抗體」是指源自免疫球蛋白分子的蛋白質或多肽序列，其專一性結合抗原上的特定表位。抗體可以是源自天然來源或來自重組來源的完整免疫球蛋白，並且可以是完整免疫球蛋白中的可產生免疫反應部分。可用於本發明的抗體可以以多種形式存在，包括例如單株抗體、人源化抗體、重組抗體、人類抗體、抗體的生物活性片段及抗體模擬物。抗體可以來自天然來源或來自重組來源。抗體通常是免疫球蛋白分子的四聚體。本文所提供之「抗體」包括任何免疫球蛋白類型（例如IgG、IgM、IgD、IgE、IgA及IgY）、任何種類（例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2）或亞型（例如IgG2a及IgG2b）之成員。
術語「抗體片段」是指完整抗體或其重組變異體的至少一部分，並且是指抗原結合結構域，例如完整抗體的抗原決定可變區、其足以賦予該抗體片段辨別和與目標專一性（例如抗原）結合的能力。抗體片段的實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab') 2和Fv片段、scFv抗體片段、線性抗體、單結構域抗體如sdAb（VL或VH），VHH結構域，和由抗體片段形成的多專一性抗體。Fab片段（fragment, antigen binding）為用木瓜蛋白酶消化全長免疫球蛋白所產生之抗體片段，或具有合成產生（例如藉由重組方法）之相同結構的片段。Fab片段含有輕鏈可變區（含有VL及CL）及含有重鏈可變區（VH）及重鏈之一個恆定區（CH1）。F(ab') 2片段為在pH值4.0至4.5下用胃蛋白酶消化免疫球蛋白所產生之抗體片段，或具有合成產生（例如藉由重組方法）之相同結構的片段。F(ab') 2片段基本上含有兩個Fab片段，其中每一重鏈部分含有另外少數胺基酸，包括形成連接兩個片段之雙硫鍵鍵結的半胱胺酸殘基。Fab'片段為含有一半（一個重鏈及一個輕鏈）F(ab') 2片段之片段。Fv片段為僅含有抗體分子之輕鏈可變區（VL）及重鏈可變區（VH）的片段。scFv片段指含有以任何順序由多肽連接子共價連接之輕鏈可變區（VL）及重鏈可變區（VH）的抗體片段。該連接子使得兩個可變區連接而不干擾其長度。示例性連接子為(Gly-Ser)n殘基，一些Glu或Lys殘基分散於整個殘基中以增加溶解性。
術語「重鏈可變區（VH）」是指包含至少一部分互補決定區（CDR）的功能區及非功能區，其中重鏈可變區之功能區單獨或與另一抗體結構域（例如輕鏈可變區（VL））組合可與抗原結合。本發明中重鏈可變區之示例性功能區為含有CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的重鏈可變區。
術語「輕鏈可變區（VL）」是指包含至少一部分互補決定區（CDR）的功能區及非功能區（FR），其中輕鏈可變區之功能區單獨或與另一抗體結構域（例如重鏈可變區（VH））組合可與抗原結合。本發明中輕鏈可變區之示例性功能區為含有CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3的輕鏈可變區。
術語「單株抗體」是指相同單株群體，意謂單株抗體群體中之各個別抗體分子均與其他抗體分子相同。單株抗體可藉由許多習知方法產生（例如J.Clin.Pathol. (2004) 57,912-917；及J Clin Pathol (2000),53,111-117）。舉例而言，單株抗體可由不朽B細胞產生，例如經由與骨髓瘤細胞融合以產生融合瘤細胞株或藉由用例如EBV之病毒感染B細胞而產生，亦可使用重組技術在試管內藉由用帶有編碼抗體之人造核苷酸序列的質體使宿主細胞轉型而自宿主細胞產生抗體。
人源化抗體可以使用習知的方法，在任何適宜且能夠產生抗體的哺乳動物來源中生成，其包括但不限於小鼠、大鼠、駱駝、駱馬、兔子或其他脊椎動物。
術語「重組抗體」是指使用重組DNA技術產生的抗體，例如由噬菌體或酵母表現系統表現的抗體。該術語還應該解釋為，透過合成方式，編碼有抗體的DNA分子所產生的抗體，並且該DNA分子會表現抗體蛋白質或指定抗體的胺基酸序列，可以使用本領域所習知的合成DNA或胺基酸序列技術來獲得DNA或胺基酸序列。
人類抗體的DNA序列，特別是互補性決定區（CDR），可根據本領域公知的程序來加以分離。優選地，如國際專利申請公開號WO 1987/02671中所述，從不朽B細胞中分離出人類CDR的DNA序列。適合產生本發明抗體的CDR，可以類似方式，自編碼有能夠結合目標分子單株抗體的DNA中來取得。術語「互補決定區(complementarity-determining region)」及「CDR」可互換地使用，且是指每一可變區中一起形成抗體之抗原結合結構域的複數個部分之一。每一可變區含有三個CDR，稱為CDR1、CDR2及CDR3。三個CDR沿線性胺基酸序列為不相連的，但在經摺疊多肽中為接近的。CDR位於連接可變區之β片之平行股的環中。如本文所述，本領域通常知識者可基於Kabat或Chothia編號鑑別CDR（參見例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版號91-3242，及Chothia,C.等人(1987)J.Mol.Biol.196：901-917）。
術語「米田堡血型抗原」是指MNS血型系統中的亞血型系統，現今已發現11種亞型（subtypes），包括「米田堡血型抗原」第一型（Mi.I）至米田堡血型抗原第十一型（Mi.XI）。「米田堡血型抗原」是由Mia、Vw、Mur、Hut、Hil、Hop、Nob、DANE、TSEN、MINY、MUT抗原的至少其中之一組成。其中「米田堡血型抗原第三型」包括Mia、Mur、Hil、MINY及MUT抗原（參照例如ISBT Science Series (2011) 6, 296–301）。
術語「抗原」是指會引起免疫反應的分子。這種免疫反應可能涉及抗體產生、特定的免疫活性細胞的活化，或前述兩者。本領域技術人員會理解，任何大分子，包括幾乎所有的蛋白質或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重組或基因體DNA。本領域技術人員會理解，任何DNA，包含編碼有引發免疫反應的蛋白質的核苷酸序列或部分核苷酸序列，係編碼有本文的術語「抗原」。此外，本領域技術人員理解，抗原不需要由整段基因的核苷酸序列來編碼。顯而易見的是，本發明包括，但不限於，使用多於一個基因的部分核苷酸序列，並且這些核苷酸序列以各種組合排列以引起所需的免疫反應。再者，本領域技術人員理解抗原不需要由「基因」編碼。顯而易見的是，抗原可以是合成的，或可以從生物樣品中獲得。前述生物樣品可以包括但不限於組織樣品，腫瘤樣品，細胞或生物流體。
術語「表位」是指抗原上的小化學分子，其可引發免疫反應，誘導B及／或T細胞反應。抗原可具有一個或多個表位。大多數抗原具有多個表位；即，該些抗原是多價的。通常，表位大小約為10個胺基酸及／或糖。優選地，表位為約4至18個胺基酸，更優選地約5至16個胺基酸，甚至更優選地為6至14個胺基酸，更優選地約7至12個胺基酸，最優選地約8至10個胺基酸。本領域技術人員理解，抗原專一性的主要標準通常是整個三維結構而非分子的特定線性序列。
如本文關於抗體所使用的術語「專一性結合」是指辨識特定抗原但基本上不辨識或結合樣品中的其他分子的抗體。例如，專一性結合來自一個物種的抗原的抗體也可以與來自一個或多個物種的抗原結合。
術語「結合結構域」是指以特異性方式與一特定標的結構／抗原／表位結合或產生交互作用之多肽的結構域。「結合或產生交互作用」亦可理解為定義一種「專一性辨識作用」。如本發明之「專一性辨識作用」一詞是指抗體分子能以專一性方式與抗原如在此所界定的米田堡血型抗原之至少一個、較佳至少二個、更佳至少三個表位交互作用及／或結合。
術語「免疫反應」定義為當淋巴細胞將抗原分子鑑定為外源的並誘導抗體形成及／或活化淋巴細胞，以除去抗原時發生的對抗原的細胞反應。
術語「生物體」、「捐贈者」或「受贈者」可以是人類或非人類哺乳動物。非人哺乳動物包括例如家畜和寵物，例如綿羊、牛、豬、犬科動物、貓科動物和鼠類哺乳動物。優選地，生物體是人類。
術語「樣品」是指從生物體或生物體的組成（例如細胞）獲得的樣品。樣品可以是任何生物組織或液體。樣品包括但不限於骨髓、痰液、全血、血清、血漿、淋巴液、血球細胞（例如紅血球）、尿、腹膜液及胸水或來自於這些樣品的細胞。生物樣品還可以包括部分組織，例如為了組織學目的而取得的冷凍切片。優選地，樣品是全血或分離的紅血球。
如本文針對核酸（例如DNA或RNA）所使用的術語「分離」（isolated），是指從存在於大分子的天然來源中的其他DNA或RNA對應分離出來的DNA或RNA分子。本文使用的術語「分離」還指當透過重組DNA技術產生時，基本上不含細胞物質、病毒物質或培養基、或化學合成時的化學前驅物或其他化學物質的核酸或肽。此外，「分離的核酸」意指包括非天然產生的核酸片段，並且不會在天然狀態被發現。術語「分離」在本文中也用於意指從其他細胞蛋白中分離出來的多肽，並且意在包括純化及重組的多肽。「分離的抗體」或「分離的抗體片段」是從宿主細胞分泌的物質分離出來的抗體或抗體片段，且不含細胞物質、病毒物質或培養基。
術語「肽」、「多肽」和「蛋白質」可交替使用，並且指由透過肽鍵共價連接的胺基酸殘基所組成的化合物。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸，且不限制蛋白質或肽序列可包含的胺基酸的最大數量。多肽包括任何肽或蛋白質，其包含透過肽鍵彼此連接的兩個或更多個胺基酸。如本文所使用的，該術語是指短鏈，其在本領域中通常也稱為肽、寡肽及寡聚物；例如較長的鏈，其在本領域通常稱為蛋白質，其中有很多種類。「多肽」包括，例如，生物活性片段、基本上同源的多肽（substantially homologous polypeptides）、寡肽、同二聚體（homodimers）、異二聚體（heterodimers）、多肽變異體（variants）、修飾的多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重組肽、合成肽或其組合。
術語「編碼」是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因、cDNA或mRNA，具有確定的核苷酸序列（即，rRNA、tRNA及mRNA）或確定的胺基酸序列，在生物過程中用作合成其他聚合物和大分子的模板以及由此過程產生的生物學特性。因此，在細胞或其他生物系統中，如果對應於該基因的mRNA轉錄和轉譯產生蛋白質，則該基因編碼蛋白質。編碼股，其核苷酸序列與mRNA序列相同並且通常在序列表中被提供，且非編碼股，用作基因或cDNA轉錄的模板，可以被稱為可編碼蛋白質或該編碼基因或cDNA的其他產物。
術語「同種異體」是指源自相同物種的不同動物的任何物質。
術語「載體」是指物質組合物，其包含分離的核酸並可用於將分離的核酸遞送至細胞內部。本領域已知許多載體，包括但不限於線性多核苷酸、與離子或兩親性化合物相關的多核苷酸、質體及病毒。因此，術語「載體」包括自主複製的質體或病毒。該術語還應解釋為包括促進核酸轉移到細胞中的非質體和非病毒化合物，例如聚離胺酸化合物、微脂體等。病毒載體的實例包括但不限於仙台病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體等。
「宿主細胞」為用於接受、維持、再生及擴增載體之細胞。宿主細胞亦可用於表現由載體編碼之多肽。當宿主細胞分裂時，載體中所含之核酸複製，從而擴增核酸。舉例而言，宿主細胞被載體轉染、轉化或轉導，以包含該載體，用於表現由載體編碼之多肽（例如抗體或其片段）。「宿主細胞」可以是細菌、酵母菌、嗜菌體、哺乳動物的細胞（例如但不限於CHO、COS、239F、SF9及／或其他細胞株）等可用來產生載體編碼之多肽的細胞。
術語「轉染的（transfected）」或「轉化的」或「轉導的」是指將外源核酸轉移或引入宿主細胞的過程。轉染的（transfected）」或「轉化的」或「轉導的」細胞是已經用外源核酸轉染、轉化或轉導的細胞。細胞包括初代受試者細胞及其後代。
在本發明的上下文中，使用以下縮寫表示通常存在的核酸鹼基。「A」是指腺苷（adenosine）、「C」是指胞嘧啶（cytosine）、「G」是指鳥苷（guanosine）、「T」是指胸苷（thymidine）、「U」是指尿苷（uridine）。
在本發明的上下文中，使用以下縮寫表示通常存在的胺基酸。「Ala（A）」是指丙胺酸（Alanine）、「Phe（F）」是指苯丙胺酸（Phenylalanine）、「Cys（C）」是指半胱胺酸（Cysteine）、「Sec（U）」是指硒半胱胺酸（Selenocysteine）、「Asp（D）」是指天門冬胺酸（Aspartate）、「Asn（N）」是指天冬醯胺（Asparagine）、「Glu（E）」是指麩胺酸（Glutamate）、「Gln（Q）」是指麩醯胺酸（Glutamine）、「Gly（G）」是指甘胺酸（Glycine）、「His（H）」是指組胺酸（Histidine）、「Leu（L）」是指白胺酸（Leucine）、「Ile（I）」是指異白胺酸（Isoleucine）、「Lys（K）」是指離胺酸（Lysine）、「Pyl（O）」是指吡咯離胺酸（Pyrrolysine）、「Met（M）」是指甲硫胺酸（Methionine）、「Pro（P）」是指脯胺酸（Proline）、「Arg（R）」是指精胺酸（Arginine）、「Ser（S）」是指絲胺酸（Serine）、「Thr（T）」是指蘇胺酸（Threonine）、「Val（V）」是指纈胺酸（Valine）、「Trp（W）」是指色胺酸（Tryptophan）、「Tyr（Y）」是指酪胺酸（Tyrosine）。
本發明的示例性實施例描述如下：
分離的抗體或其片段
本發明的一實施例提供一種分離的抗體或其片段（以下簡稱「抗Mia抗體」），抗Mia抗體選擇性地與米田堡（Miltenberger）血型抗原（以下簡稱「Mia抗原」）的一表位專一性結合，其中該表位係選自於SEQ ID NO.1（DXHKRDTY）、SEQ ID NO.2（XHKRDTYA）、SEQ ID NO.3（HKRDTYAA）、SEQ ID NO.4（DKRDTYPA）、SEQ ID NO.5（KRDTYPAH）及SEQ ID NO.6（RDTYPAHT）所組成的群組中之胺基酸序列的一部分，且至少包含胺基酸序列Arg-Asp-Thr-Tyr（RDTY）。在本實施例中，SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2胺基酸序列中的X可以是T、M或K。
在本實施例中，抗Mia抗體包括一重鏈可變區，包括具有SEQ ID NO.7（GYTFTNYAIH）胺基酸序列的CDR-H1、具有SEQ ID NO.8（WINAGNGNTKYSQKFQG）胺基酸序列的CDR-H2以及具有SEQ ID NO.9（ARDFRIPSLAVAEVGLDY）胺基酸序列的CDR-H3；以及一輕鏈可變區，包括具有SEQ ID NO.10（KSSQSVLYSSNNKNYLA）胺基酸序列的CDR-L1、具有SEQ ID NO.11（WASTRES）胺基酸序列的CDR-L2以及具有SEQ ID NO.12（QQLYSTPLT）胺基酸序列的CDR-L3。
在本實施例中，重鏈可變區可具有SEQ ID NO.13（QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYTFTNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAIYYCARDFRIPSLAVAEVGLDYWGQGTLVTVSS）的胺基酸序列。在本實施例中，重鏈可變區係由SEQ ID NO.15（CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCAACTATGCTATACATTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGACAAAGGCTTGAGTGGATGGGTTGGATCAACGCTGGCAATGGTAACACAAAATATTCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATTACCAGGGACACATCCGCGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAAGACACGGCTATATATTACTGTGCGAGAGATTTTCGGATACCTTCTCTAGCAGTGGCTGAGGTCGGTCTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA）核苷酸序列所編碼的。
在本實施例中，輕鏈可變區可具有SEQ ID NO.14（DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQLYSTPLTFGGGTKVEIKR）的胺基酸序列。在本實施例中，輕鏈可變區係由SEQ ID NO.16（GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATACAGCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATTGTATAGTACTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAAGTGGAGATCAAACGA）核苷酸序列所編碼的。
在本發明的另一實施例中，提供一種分離的抗體或其片段（以下簡稱「抗Mia抗體」）具有一結合結構域包括：一重鏈可變區，包括具有SEQ ID NO.7（GYTFTNYAIH）胺基酸序列的CDR-H1、具有SEQ ID NO.8（WINAGNGNTKYSQKFQG）胺基酸序列的CDR-H2以及具有SEQ ID NO.9（ARDFRIPSLAVAEVGLDY）胺基酸序列的CDR-H3；以及一輕鏈可變區，包括具有SEQ ID NO.10（KSSQSVLYSSNNKNYLA）胺基酸序列的CDR-L1、具有SEQ ID NO.11（WASTRES）胺基酸序列的CDR-L2以及具有SEQ ID NO.12（QQLYSTPLT）胺基酸序列的CDR-L3。
在本實施例中，重鏈可變區可具有SEQ ID NO.13（QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYTFTNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAIYYCARDFRIPSLAVAEVGLDYWGQGTLVTVSS）的胺基酸序列。在本實施例中，重鏈可變區係由SEQ ID NO.15（CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCAACTATGCTATACATTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGACAAAGGCTTGAGTGGATGGGTTGGATCAACGCTGGCAATGGTAACACAAAATATTCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATTACCAGGGACACATCCGCGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAAGACACGGCTATATATTACTGTGCGAGAGATTTTCGGATACCTTCTCTAGCAGTGGCTGAGGTCGGTCTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA）核苷酸序列所編碼的。
在本實施例中，輕鏈可變區可具有SEQ ID NO.14（DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQLYSTPLTFGGGTKVEIKR）的胺基酸序列。在本實施例中，輕鏈可變區係由SEQ ID NO.16（GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATACAGCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATTGTATAGTACTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAAGTGGAGATCAAACGA）核苷酸序列所編碼的。
在前述實施例中，抗Mia抗體的來源可以是人類、猩猩、鼠類、兔子、山羊、雞的抗體，優選地，抗Mia抗體是來自人類的抗體。抗Mia抗體包括但不限於單株抗體、人源化抗體、重組抗體、人類抗體、抗體的生物活性片段、抗體模擬物其任何組合所組成的群組。如上所述，抗Mia抗體還可以是抗原片段，包括但不限於Fab、Fab'、F(ab') 2、Fv片段、scFv抗體片段、線性抗體、單結構域抗體及其任何組合所組成的群組。優選地，抗Mia抗體係單株抗體。在前述實施例中，抗Mia抗體可以是任何免疫球蛋白類型（例如IgG、IgM、IgD、IgE、IgA及IgY）、任何種類（例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2）或亞型（例如IgG2a及IgG2b）之成員。優選地，抗Mia抗體是IgM抗體。相較於其他種型，IgM抗體為五聚體形式，具有較大的分子量以及較高的親和力，因此在進行血球凝集測試時，可以很容易地觀察到凝集的情況，故而利於使用自動化機器進行判讀。血球凝集測試的詳細描述如後，於此不先重複贅述。
用於檢測 Mia 抗原的試劑盒
本發明的一實施例中，提供一種試劑盒，係用於在一生物體的一樣品中檢測Mia抗原，試劑盒中包括一如前所述的抗體或其片段（抗Mia抗體）。其中，抗Mia抗體的詳細描述如前，於此不再重複贅述。
在本實施例中，生物體可以是人類或非人類哺乳動物。非人哺乳動物包括例如家畜和寵物，例如綿羊、牛、豬、犬科動物、貓科動物和鼠類哺乳動物。優選地，生物體是人類。
在本實施例中，樣品包括但不限於骨髓、痰液、全血、血清、血漿、淋巴液、血球細胞（例如紅血球）、尿、腹膜液及胸水或來自於這些樣品的細胞。優選地，樣品是全血或分離的紅血球。
用於檢測 Mia 抗原的方法
本發明的一實施例中，提供一種用於在一生物體中檢測Mia抗原的方法包括：製備生物體的一樣品；以及將一如前所述的抗體或其片段（抗Mia抗體）加到樣品中，以檢測樣品中是否具有Mia抗原。其中，抗Mia抗體的詳細描述如前，於此不再重複贅述。
在本實施例中，生物體可以是人類或非人類哺乳動物。非人哺乳動物包括例如家畜和寵物，例如綿羊、牛、豬、犬科動物、貓科動物和鼠類哺乳動物。優選地，生物體是人類。
在本實施例中，樣品包括但不限於骨髓、痰液、全血、血清、血漿、淋巴液、血球細胞（例如紅血球）、尿、腹膜液及胸水或來自於這些樣品的細胞。優選地，樣品是全血或分離的紅血球。
在本實施例中，製備生物體的樣品的步驟包括但不限於採集所需的樣品、對樣品進行對應的處理。舉例而言，若樣品是全血，則製備生物體的樣品的步驟僅為採集生物體的血液；或者，若樣品是分離的紅血球，則製備生物體的樣品的步驟包括採集生物體的血液以及從該血液中分離出紅血球。於此，分離紅血球的方法是本領域技術人員習知的，包括但不限於離心、梯度離心或其他任何可從血液中分離紅血球的方法。
在本實施例中，將抗Mia抗體加到樣品中，以檢測樣品中是否具有Mia抗原的步驟，可以用來判斷樣品中是否具有Mia抗原，判斷的方法包括但不限於血球凝集測試、免疫墨點法、ELISA、免疫沉澱法、血清學檢測或任何其他本領域技術人員習知可用來判斷抗體與抗原是否有進行結合的方法。
建立編碼抗 Mia 抗體的核酸、含編碼抗 Mia 抗體核酸的載體以及 可分泌 抗 Mia 抗體 的宿主細胞
在本實施例中，編碼有抗Mia抗體的分離的核酸可以透過本領域已知的任何方法獲得。例如，如果抗Mia抗體的核苷酸序列是已知的，則編碼抗Mia抗體的核苷酸序列可以由化學合成的寡核苷酸組裝而成。前述合成例如但不限於將各個分別編碼有抗Mia抗體的部分核苷酸序列的寡核苷酸，退火並連接，然後透過PCR擴增。本發明所述的多核苷酸還可以從任何其他合適的核酸來源產生，例如抗體cDNA文庫，或從表現抗體的任何組織或細胞分離的cDNA文庫（例如，選自表現抗體的融合瘤細胞）。編碼由融合瘤製備的抗Mia抗體的輕鏈和重鏈的cDNA可以透過標準PCR擴增或cDNA轉殖技術獲得。關於使用噬菌體展示技術獲得的抗體，可以從文庫中的各種噬菌體選殖中獲得本發明實施例中編碼有抗Mia抗體的分離的核酸。
在本發明的一實施例中，編碼抗Mia抗體的分離的核酸可以包含編碼有下列胺基酸序列的至少其中之一或其組合的核苷酸序列：SEQ ID NO.7（GYTFTNYAIH）、SEQ ID NO.8（WINAGNGNTKYSQKFQG）、SEQ ID NO.9（ARDFRIPSLAVAEVGLDY）、SEQ ID NO.10（KSSQSVLYSSNNKNYLA）、SEQ ID NO.11（WASTRES）以及SEQ ID NO.12（QQLYSTPLT）。在本發明的另一實施例中，編碼抗Mia抗體的分離的核酸可以包含SEQ ID NO.15所述的核苷酸序列，其為編碼重鏈可變區的核苷酸序列。在本發明的另一實施例中，編碼抗Mia抗體的分離的核酸可以包含SEQ ID NO.16所述的核苷酸序列，其為編碼輕鏈可變區的核苷酸序列。在本發明的另一實施例中，編碼抗Mia抗體的分離的核酸可以包含SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16所述的核苷酸序列。
在本發明的另一實施例中，可以將前述獲得編碼重鏈可變區和輕鏈可變區的核苷酸序列，進一步透過標準重組DNA技術進行重組，例如將可變區核苷酸序列轉化為全長抗體核苷酸序列、Fab核苷酸序列或scFv核苷酸序列。在前述重組中，可以將編碼重鏈可變區和輕鏈可變區的核苷酸序列可操作地連接到另一核苷酸序列上，或編碼另一種蛋白質的核苷酸片段上，例如抗體恆定區或連接子。在本文中使用的術語「可操作地連接」意指兩個核苷酸序列以功能性方式連接，例如，使得兩個核苷酸序列片段編碼的胺基酸序列保持符合閱讀框，或者使蛋白質在所需啟動子的控制下表現。
透過將編碼重鏈可變區的核苷酸序列與編碼重鏈恆定區（CH1，CH2和CH3）的另一核苷酸序列可操作地連接，可以將編碼重鏈恆定區的分離的核酸轉化為具有全長重鏈的核酸。小鼠和人類（或其他哺乳動物）重鏈恆定區的核苷酸序列及核苷酸序列的片段是本領域已知的（參見例如，Kabat, E. A.等人（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）。重鏈恆定區可以是IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，IgE，IgM或IgD恆定區。在一些實施例中，重鏈恆定區係選自IgM種型。關於Fab重鏈核苷酸序列，可以將編碼重鏈可變區的核苷酸序列僅與編碼重鏈CH1恆定區的另一核苷酸序列可操作地連接。
透過將編碼輕鏈可變區的核苷酸序列與編碼輕鏈恆定區CL的另一核苷酸序列可操作地連接，可以將編碼輕鏈可變區的分離的核酸轉化為全長輕鏈的核酸。小鼠和人類（或其他哺乳動物）輕鏈恆定區的核苷酸序列及核苷酸序列的片段是本領域已知的（參見例如，Kabat, E. A.等人（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）。輕鏈恆定區可以是κ或λ恆定區。
為了產生scFv核苷酸序列，編碼重鏈可變區和輕鏈可變區的核苷酸序列片段與編碼連接子的另一片段可操作地連接，例如，編碼(Gly-Ser) n殘基的連接子片段，將重鏈可變區和輕鏈可變區的核苷酸序列連接使得該核苷酸序列表現出連續的單鏈蛋白（包括重鏈可變區、輕鏈可變區及連接子）（參見例如，Bird等人，1988 Science 242：423-426、Huston等人，（1988）Proc. Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883、McCafferty等人，（1990）Nature 348：552-554）。
在一些實施例中，本文所述的任何核酸都可以整合到表現載體中以構築可編碼抗Mia抗體的載體，並將該載體轉殖到宿主細胞中。一般而言，整合到載體的核苷酸序列不包括內含子（intron）。在本實施例中，可透過例如但不限於電穿孔、轉染或轉導等本領域技術人員習知用來將載體轉殖到宿主細胞的方法來進行，以使宿主細胞表現抗Mia抗體。在本實施例中，宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞，包括但不限於細菌、酵母菌、嗜菌體、哺乳動物的細胞（例如但不限於CHO、COS、239F、SF9及／或其他細胞株）。上述方法描述於C.Toyoda等人（2014）British Blood Transfusion Society中，其內容通過引用併入本文。在一些實施例中，當在培養基中培養時，宿主細胞瞬時或穩定地在載體上表現核酸，因此提供了產生本發明前述的抗體或片段的方法。
建立融合瘤細胞株以表現抗 Mia 抗體
在本發明的一實施例中，採集含有Mia抗原的捐贈者（編號377T）的血液（以下簡稱「377T」），以建立融合瘤細胞株用以表現抗Mia抗體。
透過血球凝集測試進行抗體活性測試
將使用前述方法（包括載體或融合瘤技術）產生的抗Mia抗體進行血球凝集測試。在本實施例中，標準品（具有多專一性抗Mia抗體的捐贈者血漿）與1022個捐贈者血液樣品取自台灣血液基金會，標準品透過先前方法鑑定為可能具有多專一性抗Mia抗體的捐贈者血漿。在本實施例中，使用標準品與抗Mia抗體（377T）分別檢測1022個捐贈者血液樣品，並以自動血液分組系統（PK7300，Beckman Coulter，東京，日本），進行判讀，自動區分有血球凝集（判讀為Mia抗原陽性，亦即帶有Mia抗原）的樣品與無血球凝集（判讀為Mia抗原陰性，亦即沒有Mia抗原）的樣品，標準品與本發明的抗Mia抗體的檢測結果如下表1所示。
表1：針對1022個樣品檢測Mia抗原的檢測結果，表格中的數字代表樣品數。
抗 Mia 抗體（ 377T ） 標準品 Mia 陽性 Mia 陰性
Mia陽性 50 1 a
Mia陰性 1 b 971
a代表標準品檢測為Mia陽性，抗Mia抗體（377T）檢測為Mia陰性； b代表標準品檢測為Mia陰性，抗Mia抗體（377T）檢測為Mia陽性。
由表1可知，與標準品檢測的結果相比，在1022個樣品中，僅有2個樣品的判讀結果不同。進一步針對這兩個樣品進行定序，由定序結果發現標準品檢測為Mia陽性，抗Mia抗體（377T）檢測為Mia陰性的樣品（簡稱樣品a），其基因型為GYPB/GYPB（亦即不帶有Mia抗原的正常血型糖蛋白B，故而，樣品a的檢測結果應該為陰性，抗Mia抗體（377T）檢測為陰性為正確的結果。另外，標準品檢測為Mia陰性，抗Mia抗體（377T）檢測為Mia陽性的樣品（簡稱樣品b），其基因型為GYP.Mur/GYPB（亦即帶有Mia抗原的Mia血型抗原第三型，故而，樣品b的檢測結果應該為陽性，抗Mia抗體（377T）檢測為陽性為正確的結果。由上述結果可知，抗Mia抗體（377T）具有比標準品更佳的靈敏度及專一性。
抗 Mia 抗體（ 377T ）的胺基酸序列分析
在本實驗例中，對抗Mia抗體進行序列分析，發現抗Mia抗體包括一重鏈可變區以及一輕鏈可變區。重鏈可變區包括具有SEQ ID NO.7（GYTFTNYAIH）胺基酸序列的CDR-H1、具有SEQ ID NO.8（WINAGNGNTKYSQKFQG）胺基酸序列的CDR-H2以及具有SEQ ID NO.9（ARDFRIPSLAVAEVGLDY）胺基酸序列的CDR-H3。輕鏈可變區包括具有SEQ ID NO.10（KSSQSVLYSSNNKNYLA）胺基酸序列的CDR-L1、具有SEQ ID NO.11（WASTRES）胺基酸序列的CDR-L2以及具有SEQ ID NO.12（QQLYSTPLT）胺基酸序列的CDR-L3。在本實施例中，可以使用本領域習知分析抗體胺基酸序列的任何方法，進行抗Mia抗體（377T）的胺基酸序列分析。
抗 Mia 抗體（ 377T ）的抗原結合表位分析（ epitope analysis ）
接下來，進行抗原結合表位分析，以鑑定與抗Mia抗體（377T）結合的Mia抗原表位的胺基酸序列。請參考圖1，在本實驗例中，合成SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.17至SEQ ID NO.18以進行表位分析。圖1橫軸所示胺基酸序列由左而右分別為SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.18。將上述胺基酸序列合成的胜肽配置於DMSO中，並用於ELISA分析。將96孔盤加入每孔50 uL含有20 ug/ml抗原（即上述胺基酸序列的胜肽）的磷酸鹽緩衝液（PBS），於4℃下塗佈（coating）至隔天。將磷酸鹽緩衝液移除後，每孔加入300 uL的阻隔緩衝液（含有3%脫脂牛奶），於37℃下培養1小時。移除阻隔緩衝液後，每孔加入50 uL加入抗Mia抗體（377T），於37℃下培養1小時。隨後移除抗Mia抗體（377T）並以洗滌液清洗後，加入含有抗人類二級抗體（Leadgene human IgG-HRP，濃度1：5000 + Leadgene human IgM-HRP，濃度1：5000）的磷酸鹽緩衝溶液T（含有Tween 20，PBST），於37℃下培養1小時。移除未結合的抗人類二級抗體並以洗滌液清洗後，每孔加入50 uL的基質（Leadgene commercial TMB），於37℃下培養10分鐘。接著每孔加入50 uL的終止溶液（含有0.2 M H 2SO 4）並以冷光儀檢測450 nm的吸光值。如圖所示，抗Mia抗體（377T）與由SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6的胺基酸序列組成的胜肽，具有高的450 nm吸光值，表示抗Mia抗體（377T）與這些胺基酸序列組成的抗原表位，具有高的結合力。
綜上所述，本發明的抗Mia抗體可與Mia抗原的表位專一性結合，且具有相較於標準品更高的靈敏度及專一性。利用本發明產生的抗Mia抗體、試劑盒及方法能夠在生物體的樣品中檢測是否含有Mia抗原，以確認樣品是否適合用於例如輸血的用途，為血庫或醫院等需要大量使用血液樣品的機構，提供方便、準確的檢驗方法、試劑盒及抗體。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
圖1為本發明抗體或其片段與米田堡血型抗原的結合表位分析結果。
Figure pseq-0
Figure pseq-1
Figure pseq-2
Figure pseq-3
Figure pseq-4
Figure pseq-5
Figure pseq-6
Figure pseq-7
Figure pseq-8

Claims (14)

  1. 一種分離的抗體或其片段，該抗體或其片段與米田堡(Miltenberger)血型抗原的一表位專一性結合，其中該表位係選自於SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所組成的群組中之胺基酸序列的一部分，且包含胺基酸序列Arg-Asp-Thr-Tyr，其中該抗體或其片段包括：一重鏈可變區，包括具有SEQ ID NO.7胺基酸序列的CDR-H1、具有SEQ ID NO.8胺基酸序列的CDR-H2以及具有SEQ ID NO.9胺基酸序列的CDR-H3；以及一輕鏈可變區，包括具有SEQ ID NO.10胺基酸序列的CDR-L1、具有SEQ ID NO.11胺基酸序列的CDR-L2以及具有SEQ ID NO.12胺基酸序列的CDR-L3。
  2. 一種分離的抗體或其片段，具有一結合結構域，該結合結構域包括：一重鏈可變區，包括具有SEQ ID NO.7胺基酸序列的CDR-H1、具有SEQ ID NO.8胺基酸序列的CDR-H2以及具有SEQ ID NO.9胺基酸序列的CDR-H3；以及一輕鏈可變區，包括具有SEQ ID NO.10胺基酸序列的CDR-L1、具有SEQ ID NO.11胺基酸序列的CDR-L2以及具有SEQ ID NO.12胺基酸序列的CDR-L3。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述的抗體或其片段，其中該重鏈可變區具有SEQ ID NO.13的胺基酸序列。
  4. 如申請專利範圍第1或2項所述的抗體或其片段，其中該輕鏈可變區具有SEQ ID NO.14的胺基酸序列。
  5. 如申請專利範圍第3項所述的抗體或其片段，其中該重鏈可變區係由SEQ ID NO.15核苷酸序列所編碼的。
  6. 如申請專利範圍第4項所述的抗體或其片段，其中該輕鏈可變區係由SEQ ID NO.16核苷酸序列所編碼的。
  7. 如申請專利範圍第1或2項所述的抗體或其片段，其中該抗體或其片段係選自於單株抗體、人源化抗體、重組抗體、人類抗體、抗體的生物活性片段、抗體模擬物及其任何組合所組成的群組。
  8. 如申請專利範圍第1或2項所述的抗體或其片段，其中該抗體或其片段係選自於Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗體片段、線性抗體、單結構域抗體及其任何組合所組成的群組。
  9. 一種試劑盒，係用於在一生物體的一樣品中檢測一米田堡(Miltenberger)血型抗原，該試劑盒包括一如申請專利範圍第1項至第8項中任一項所述的抗體或其片段。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的試劑盒，其中該樣品係全血或分離的紅血球。
  11. 如申請專利範圍第9項所述的試劑盒，其中該生物體係人類。
  12. 一種用於在一生物體中檢測一米田堡(Miltenberger)血型抗原的方法，該方法包括：製備該生物體的一樣品；以及將一如申請專利範圍第1項至第8項中任一項所述的抗體或其片段加到該樣品中，以檢測該樣品中是否具有該米田堡(Miltenberger)血型抗原。
  13. 如申請專利範圍第12項所述的方法，其中該樣品係全血或分離的紅血球。
  14. 如申請專利範圍第12項所述的方法，其中該生物體係人類。
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