TWI437229B - Detection of rice field blood type of the third type of method - Google Patents

Description

檢測米田堡血型第三型之方法

本發明係為一種米田堡血型之檢測方法，特別是一種利用聚合酵素鏈鎖反應檢測米田堡血型第三型的方法。

在台灣，米田堡血型抗原第三型(Miltenberger blood group antigen type III,Mi.III)是所有特殊血型裡發生頻率最高的；尤其在特定原住民族群，其發生頻率高達20-90%。整體而言，台灣人有2-7%米田堡血型第三型陽性之人口(Lin and Broadberry,1998)。米田堡血型第三型在特定東南亞國家，其發生頻率與台灣相當，例如泰國為9-10%、菲律賓為8.3%、香港為6.3%、印尼為2.47%及中國為1.9%。而米田堡血型第三型在高加索白種人(歐，美，澳等)、北方漢人和日本人中的發生頻率都小於0.01%，對他們而言是稀有血型(Tippett et al.,1992)。因為米田堡血型第三型會引起新生兒溶血症(hemolytic diseases of the newborn)及相當強烈之抗原抗體反應(antigen-antibody interaction)，於病人輸血前，醫院血庫必須為將輸血之病人做交叉試驗(cross match)，若有反應再檢驗病人血清裡是否帶有米田堡血型第三型抗體，避免輸到米田堡血型第三型的陽性紅血球而引起輸血反應。特別是米田堡血型第三型導致的溶血反應(hemolysis)，其嚴重程度與輸錯ABO血型(ABO mismatch)之反應相當，臨床上不容輕忽(Broadberry and Lin,1994)。

米田堡血型抗原極可能是在演化過程中，由序列結構相似(homologous)的血型糖蛋白A(GYPA)、血型糖蛋白B(GYPB)，和血型糖蛋白E(GYPE)基因重組產生的蛋白混合體(hybrid protein)。米田堡血型第三型推測是由一段血型糖蛋白A基因，藉由同源重組(homologous recombination)插入血型糖蛋白B。所以米田堡血型第三型的基因序列呈血型糖蛋白B-A-B混合基因的型態，此B-A-B混合基因轉錄出一段具強烈抗原性(strongly antigenic)的Mur胜肽，故米田堡血型第三型抗原又稱Gp.Mur(Huang and Blumenfeld,1991)。有些人帶有抗Mur或抗“Mi^a ”抗體，血庫檢測之交叉試驗就是要防止這些人輸到米田堡血型第三型陽性之血球。

米田堡系列抗原(Miltenberger series,Mi)屬於複雜的MNS血型系統，現今已發現11種次型(subtypes)，相關的MNS抗原也已發現40多種(Lin,2005;Poole,2000)。馬偕醫院血庫和輸血研究室是第一個注意到米田堡血型第三型在台灣的重要性(Lin,2005)。事實上，馬偕醫院血庫也碰過血液檢體帶有其他米田堡次型，如米田堡血型第一型(Gp.Vw)、米田堡血型第五型(Gp.Hil)及米田堡血型第六型(Gp.Bun)。有時也碰到無法判讀又類似米田堡血型之檢體，即血清學(serology)結果不吻合任何已知抗原抗體反應之組合。因為米田堡血型定義之抗血清(antisera)大多來自英美等國人民，可能有些本土新穎的次型因此無法被定義出。

在西元2001年抗米田堡單株抗體發展出來之前，西方國家多是用米田堡女士(Mrs. Miltenberger)在1972年捐出的抗血清(anti-“Mi^a ”)來檢定米田堡型(Tippett et al.,1992)。現今全世界檢定米田堡血型用之各種抗血清已剩不多，而且是買不到的，需要時必須寫信向相關實驗室索取。此血型在東南亞之比例也高(如泰國也有約10%之發生頻率)。因此發展一米田堡血型第三型血型檢驗試劑，適用於台灣及東南亞各醫院血庫、醫檢單位、捐血中心及血液中心，是有其必要性。

泰國Palacajornsuk等人於2007年在Transfusion Medicine期刊發表過一聚合酵素鏈鎖反應(PCR)方法，可以基因鑑定(genotyping)米田堡特殊血型。其方法主要先從全血萃取出DNA檢體然後把前述純化過的DNA檢體以2組引子對進行聚合酵素鏈鎖反應，來檢驗多種米田堡血型次型(subtypes)，其中也包括米田堡第三型(Transfusion Medicine 17,169-174(2007))。但當我們嘗試Palacajornsuk等人發展出的聚合酵素鏈鎖反應方法後發現，他們設計的聚合酵素鏈鎖反應引子對(primer pair)的專一性差，當配合不同廠牌的DNA聚合酶(DNA polymerase or Taq)使用時，常常有偽陽性(false-positive)的結果產生。除此之外，Palacajornsuk等人設計的引子對不能直接用在全血的聚合酵素鏈鎖反應(one-step direct blood PCR)，只能用在已純化過的DNA檢體上。除了Palacajornsuk等人發展的方法需使用純化過的DNA檢體，手續較為繁瑣外；此外，他們的方法常常有偽陽性的結果，使人對其準確度存疑，故其方法在一般檢驗單位執行上並不適合。

為解決上述問題，本發明係提供一種檢測米田堡血型第三型之方法，包含提供一個體之血液樣本，其中該血液樣本可為全血、冷凍過之全血或是由全血經純化後的DNA樣本，再使用一引子對SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4與該血液樣本進行一聚合酵素鏈鎖反應的增幅；及檢測該聚合酵素鏈鎖反應的結果，以判斷該血液樣本是否存在米田堡血型第三型抗原，其中當米田堡血型第三型抗原存在時，該個體即為米田堡血型第三型者。

在本發明一實施例中，其中該聚合酵素鏈鎖反應之步驟包含：94℃之模板變性反應4分鐘，32次循環之94℃之變性反應50秒、49℃緩冷黏著反應50秒、及68℃延長反應2分鐘，最後再以68℃延長反應2分鐘。

在本發明另一實施例中，其中該聚合酵素鏈鎖反應進一步包含一SEQ ID NO：5作為正控制組DNA之質體(plasmid)及一SEQ ID NO：6作為負控制組DNA之質體。

本發明另提供一種檢測米田堡血型第三型之試劑組，係包含SEQ ID NO：3以及SEQ ID NO：4所示核酸序列之引子對。

本發明亦提供一種鑑定米田堡血型第三型的引子對，其中該引子對係為包含SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4之所示核酸序列。

本發明方法對米田堡第三型基因序列具高度專一性，即使直接用冷凍後之全血來進行聚合酵素鏈鎖反應，其鑑定結果也非常準確，故對台灣及東南亞國家等米田堡血型第三型發生率高區域之血液檢驗單位有極大的幫助。

以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

發明人分析前述泰國Palacajornsuk等人之聚合酵素鏈鎖反應(PCR)方法常出現有偽陽性(false-positive)，其原因在於米田堡血型第三型之基因序列與血型糖蛋白A(glycophorin A,GYPA)、血型糖蛋白B(glycophorin B,GYPB)及血型糖蛋白E(glycophorin E,GYPE)之全長基因的相似度在99%以上。如第一圖，圖中本發明之引子對-GB-F1,Mi3F及Mi3R，被框起來；而泰國Palacajornsuk等人發展之F2及Rccgg引子，以粗線劃線註明。把此四條基因序列排列一起後，發明人發現泰國Palacajornsuk等人所設計的引子-F2(SEQ ID NO：1)以及Rccgg(SEQ ID NO：2)，容易在PCR實驗裡與GYPA、GYPB及GYPE結合，故其偽陽性結果來自於每個檢體自身都帶有的GYPA/GYPB/GYPE基因。本發明設計的引子除了正向引子-Mi3F(SEQ ID NO:3)選在Mi.III特有的基因序列上，其反向引子-Mi3R(SEQ ID NO:4)位在GYPA、GYPE和GYPB基因之相異處，故能區別此三個序列極相似的基因。

因此，本發明設計之引子-Mi3F(SEQ ID NO：3)與Mi3R(SEQ ID NO：4)，比先前Palacajornsuk研發的更具專一性，其序列如下表一所示：

若比較序列之間的相似程度(% match)，泰國Palacajornsuk等人之引子對與GYPA序列有96.8%的相似度，對GYPB序列有90.3%相似度，對GYPE序列亦有90.3%相似度。而本發明設計的引子對，對GYPA序列降為89.5%相似度，對GYPB序列降為76.5%相似度，對GYPE序列降為82.4~89.5%相似度。本發明除了降低引子與個體GYPA及GYPE基因序列之吻合程度，亦計算引子對與目標基因(targeted gene，即米田堡血型第三型之基因)可能結合的溫度：Mi3F之變性溫度(melting temperature)為49.5℃；Mi3R之變性溫度為38.1℃，根據這物理性質設計並反覆試驗聚合酵素鏈鎖反應步驟。我們同時也設計正控制組DNA質體(SEQ ID NO：5)與負控制組DNA質體(SEQ ID NO：6)，此二控制組質體可與實驗組(即欲檢驗血型之檢體)同時進行聚合酵素鏈鎖反應，其步驟為：先升溫至94℃維持4分鐘做DNA模板變性反應，再經32次循環之變性94℃ 50秒、黏著49℃ 50秒、延伸68℃ 2分鐘，最後再一延伸反應68℃ 2分鐘。

本發明使用所發展出的引子對，利用聚合酵素鏈鎖反應進行米田堡第三型血型的鑑定。我們主要使用台灣翰新國際有限公司製作的血液直接PCR反應組(Direct Blood PCR set)來進行實驗組(即血液檢體欲鑑定是否有Mi.III血型)和正控制組PCR，此方法亦適用於使用其他國內外廠牌生產的PCR kits。每個實驗組PCR反應總體積為25 μL，除了19 μL Taq酵素液(翰新牌)，另含3.6 μL冷凍或新鮮之離心過的血球、0.7 μL的Mi3F(10 μM)及0.7 μL的Mi3R(10 μM)。Mi.III PCR反應步驟為：94℃之模板變性反應4分鐘，32次循環之94℃之變性反應50秒、49℃緩冷黏著反應50秒、68℃延長反應2分鐘，最後以68℃再延長反應2分鐘。我們同時也進行PCR控制試驗，來驗證PCR反應本身是否成功。此PCR可以放出每個血液檢體裡的GYPB和Mi.III基因，為PCR的正控制組。此PCR反應總體積亦為25 μL，其中包含19 μL Taq酵素液(翰新牌)，3.6 μL冷凍或新鮮之離心過的血球、0.7 μL的GB-F1(10 μM)及0.7 μL的Mi3R(10 μM)。此正控制組PCR的反應步驟為：94℃之模板變性反應4分鐘，35次循環之94℃之變性反應50秒、55℃緩冷黏著反應50秒、68℃延長反應2分鐘，最後以68℃再延長反應2分鐘。

反應的結果若在640-bp有DNA條帶(band)，即表示有Mi.III序列被部份增幅，即該血液樣本帶有Mi.III基因。在控制實驗中，正控制組PCR可以增幅所有檢體裡的GYPB和Mi.III基因，若有檢體在正控制組PCR實驗中未有738-bp之DNA條帶(band)被增幅，即表示此檢體本身有問題；若全部檢體都做不出738-bp之DNA條帶，則表示該次的PCR反應過程有問題。此正控制組PCR之產物可以用來做後續的DNA定序，加以確認此DNA產物有無含Mi.III基因。

PCR反應結果均以電泳圖表示，使用379個新鮮及冰凍的血液檢體作為樣本，利用本發明方法進行米田堡第三型之血液檢測，結果如第二A、B圖所示，分別為實驗組以及正控制組實驗，該二圖係其中11個血液檢體(編號1-11)之檢測結果，第二A圖為Mi.III實驗組PCR之結果，其中檢體序號1-5能呈現出640-bp條帶之檢體，為陽性反應，表示帶有Mi.III之基因序列。無法呈現640-bp條帶之檢體(序號6-11)則判定沒有此特殊血型基因。我們所設計的正、負控制組質體(+/-;positive/negative control DNA plasmids)需包括在每次的PCR檢驗中：正控制組質體之DNA帶有Mi.III基因，故會被放出738-bp條帶；負控制組質體僅有GYPB序列，故不會被放出738-bp條帶。第二B圖為同批檢體之PCR控制實驗之結果，如圖所示，所有的檢體均可以被放出738-bp條帶，其放大的DNA可能為GYPB、Mi.III、或兩者都有。PCR控制實驗之產物可以用來做DNA定序，一來確認Mi.III實驗組PCR的結果是否正確，二來可以進階決定檢體為heterozygous Mi.III(Mi.III+/-)或homozygous Mi.III(Mi.III+/+)。檢體1-2號定序後確認為Mi.III+/+；檢體3-5號為Mi.III+/-;6-11號之定序結果顯示僅含GYPB序列。

GYPB和Mi.III基因序列極為相似，本發明於製作正控制組DNA質體(SEQ ID NO：5)及負控制組DNA質體(SEQ ID NO：6)時，係分別擷取GYPB和Mi.III之部份基因片段插入在TOPO質體的位置295-5424。故在pMiIIIe2e6及pGBe2e6質體位置295-5424分別為插入之Mi.III和GB基因片段。TOPO質體之其他部分沒有變動。這兩個質體之間，在1160-1220區段有7個相異點，以及在4588處也相異。

請參考第三A圖，該圖為正控制組(+)DNA質體(pMiIIIe2e6)，含Mi.III基因片段cloned於TOPO clone(Invitrogen,USA)裡，可以被PCR增幅出含有Mi.III之738-bp DNA片段；而第三B圖為負控制組(-)DNA質體(pGBe2e6)，含GYPB基因片段cloned於TOPO clone(Invitrogen,USA)裡，無法被增幅出640-bp之DNA片段。

為了確認我們的方法專一性高，所有的聚合酵素鏈鎖反應之產物都再進一步DNA定序分析(sequencing)，如第四圖所示，Mi.III+/+指此檢體之兩條對偶基因(alleles)皆為Mi.III型，即homozygosity。Mi.III+/-指此檢體之一條基因為Mi.III型，另一條為GYPB基因。GYPB則指此檢體有兩條GYPB對偶基因，沒有帶有Mi.III特殊血型的檢體僅會有GYPB序列被放出。測試至今，我們尚未有任何的偽陽性(false-positive)或偽陰性(false-negative)的結果。

因此本發明可作為檢驗米田堡特殊血型之檢驗試劑，適用於台灣各醫院血庫、醫檢單位、捐血中心及血液中心。且本發明方法對米田堡第三型基因序列具高度專一性，即使直接用冷凍後之全血來進行聚合酵素鏈鎖反應，其鑑定結果也非常準確，準確率達100%。

<110>　財團法人台灣基督長老教會馬偕紀念社會事業基金會馬偕紀念醫院

<120>　檢測米田堡血型第三型之方法

<160>　7

<210>　1

<211>　30

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　F2引子

<400>　1

<210>　2

<211>　30

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　Rccgg引子

<400>　2

<210>　3

<211>　17

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　Mi3F引子

<400>　3

<210>　4

<211>　19

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　Mi3R引子

<400>　4

<210>　5

<211>　9086

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　米田堡血型抗原第三型正控制組質體(positive control plasmid)

<400>　5

<210>　6

<211>　9086

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　米田堡血型抗原第三型負控制組質體(negative control plasmid)

<400>　6

<210>　7

<211>　25

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　GB-F1引子

<400>　7

第一圖係為先前技術與本發明之引子對與個體GYPA/GYPB/GYPE基因相似度比較。本發明之引子-GB-F1,Mi3F及Mi3R，被框起來；而泰國Palacajornsuk等人發展之F2及Rccgg引子，以粗線劃線註明。

第二圖係為本發明方法之部分實驗結果。A圖為Mi.III實驗組PCR之結果，能放出640-bp條帶之檢體(檢體序號1-5)呈陽性反應，表示帶有Mi.III之基因序列。無法放出640-bp條帶之檢體(序號6-11)則沒有此特殊血型基因。B圖為同批檢體之PCR控制實驗之結果，如圖所示，所有的檢體均可以被放出738-bp條帶，其放大的DNA可能為GYPB、Mi.III、或兩者都有。

第三圖係為正、負控制組DNA質體。左為正控制組DNA質體(pMiIIIe2e6)，含Mi.III基因片段cloned於TOPO clone(Invitrogen,USA)裡。右為負控制組DNA質體(pGBe2e6)，含GYPB基因片段cloned於TOPO clone(Invitrogen,USA)裡。

第四圖係為DNA定序確認的三種例子。Mi.III+/+指此檢體之兩條對偶基因(alleles)皆為Mi.III型，即homozygosity。Mi.III+/-指此檢體之一條基因為Mi.III型，另一條為GYPB基因。GYPB則指此檢體的兩條對偶基因均為GYPB，沒有Mi.III特殊血型之序列。

Claims (11)

1. 一種檢測米田堡血型第三型之方法，包含：提供一個體之血液樣本，使用一引子對SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4與該血液樣本進行一聚合酵素鏈鎖反應的增幅；及檢測該聚合酵素鏈鎖反應的結果，以判斷該血液樣本是否存在米田堡血型第三型抗原，其中當米田堡血型第三型抗原存在時，該個體即為米田堡血型第三型者。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該血液樣本為全血、或冷凍過之全血。
3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該血液樣本係為自全血純化之DNA樣本。
4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中經SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4所示核酸序列之引子對所增幅之序列大小為640bp。
5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該聚合酵素鏈鎖反應之步驟包含：94℃之模板變性反應4分鐘，32次循環之94℃之變性反應50秒、49℃緩冷黏著反應50秒、68℃延長反應2分鐘，最後以68℃再延長反應2分鐘。
6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該聚合酵素鏈鎖反應進一步包含一SEQ ID NO：5作為正控制組DNA之質體及一SEQ ID NO：6作為負控制組DNA之質體。
7. 一種檢測米田堡血型第三型之試劑組，係包含SEQ ID NO： 3以及SEQ ID NO：4所示核酸序列之引子。
8. 如申請專利範圍第7項所述之試劑組，其中該試劑組進一步包含一SEQ ID NO：5作為正控制組DNA之質體及一SEQ ID NO：6作為負控制組DNA之質體。
9. 如申請專利範圍第7項所述之試劑組，其中該SEQ ID NO：3以及SEQ ID NO：4所示核酸序列之引子，係以該聚合酵素鏈鎖反應進行增幅。
10. 如申請專利範圍第7項所述之試劑組，其中該試劑組進一步包含SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：7所示之核酸序列。
11. 一種鑑定米田堡血型第三型的引子對，其中該引子對係為包含SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4所示之核酸序列。