CN104360087A

CN104360087A - 一种检测Miltenberger血型抗体的方法

Info

Publication number: CN104360087A
Application number: CN201410750915.4A
Authority: CN
Inventors: 田晶晶; 李勇; 丁少华; 段生宝; 王红梅; 陈晔洲; 蒙青林; 魏双施
Original assignee: Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology of CAS
Current assignee: Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology of CAS
Priority date: 2014-12-10
Filing date: 2014-12-10
Publication date: 2015-02-18

Abstract

本发明公开了一种检测Miltenberger血型抗体的方法，包括步骤为：将纳米磁珠与亲和素偶联形成亲和素磁珠；将所述亲和素磁珠与末端修饰生物素的多肽抗原偶联，封闭未偶联位点，得到免疫磁珠；将所述免疫磁珠与检测样本混匀后孵育并洗涤，再加入荧光标记二抗或酶标记二抗孵育并洗涤后测定得到结果。通过上述方式，本发明基于纳米磁珠免疫分析检测Miltenberger血型抗体的方法，操作难度低且简便，能实现完全抗体和不完全抗体的同时检测，检测过程耗时短，结果易于判定，易于自动化，检测结果准确，结合检测仪器可实现半定量或定量检测，能保障临床安全、有效、科学的输血。

Description

一种检测Miltenberger血型抗体的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种Miltenberger血型抗体检测新方法即基于纳米磁珠免疫分析检测Miltenberger血型抗体的方法。

背景技术

目前临床上常规的血型鉴定包括ABO和Rh血型系统。红细胞还存在MNS血型，在这一系统中有一类特殊的亚血型系统-MI亚血型系统（Milternberger subsystem），Miltenberger血型抗原是以人血清免疫抗体所鉴定的一系列低频率抗原组合的红细胞表型。该类特异性血型不规则抗体多以IgM的形式存在，少数为IgG型，两者可单独或同时存在。该亚系统中Mur、Mia等几个抗原的发生频率在欧洲白人中低于千分之一，但在中国人和其他亚洲人群中分布较高，约为3％～10％。有文献报道，抗-Mur发生率在东南亚地区，特别是在我国台湾、香港人群中很高，抗-Mur发生率甚至仅次于抗-A/抗-B，临床报告已证实抗-Mur抗体会导致同种异型免疫性疾病，如输血不良反应、新生儿溶血病、器官移植排异反应等。

世界各国目前临床上均未能常规开展Miltenberger血型相容性试验，只在少数的大型血液中心和血型参比试验室对一些疑难的血型不相容疾病病人进行相关的检验工作。

临床输血理论及案例证明，在亚洲各国应用的血型抗体筛查红细胞组和血型抗体鉴定的谱细胞中应该有Miltenberger血型抗原阳性红细胞。由于缺少相关试剂，多数医疗机构使用的抗体筛查细胞中并没有包含Miltenberger血型抗原，导致对存在该抗体的患者漏检。同时，新鲜红细胞保存时间短，Miltenberger抗原阳性红细胞来源非常有限，Miltenberger血型筛查及其抗体的检测受到极大地限制。目前Miltenberger血型抗体检测中面临的几个主要问题是：1）临床检测谱细胞中缺乏Miltenberger血型抗原阳性红细胞；2）含有Miltenberger血型抗原阳性红细胞来源有限；3）红细胞保存时间短。

免疫磁珠由磁性微球载体和免疫配体结合组成，由于磁珠的比表面积大，磁珠对配体的载量相对其它介质高，同时它还具备可以进行磁分离的特性，这些优势赋予它无可比拟的优势。在免疫检测、细胞分选、生物大分子分离纯化及靶向给药等生物医学领域得到广泛的应用。免疫磁珠介导的免疫检测有效率高，分离快速，重复性好及可自动化操作等优点。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种检测Miltenberger血型抗体的方法，该方法是基于纳米磁珠免疫分析的，能保障临床安全、有效、科学的输血。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种检测Miltenberger血型抗体的方法，包括步骤为：（1）将纳米磁珠与亲和素偶联形成亲和素磁珠；（2）将所述亲和素磁珠与末端修饰生物素的Miltenberger血型多肽抗原偶联，封闭未偶联位点，得到免疫磁珠；（3）将所述免疫磁珠与检测样本混匀后孵育并洗涤，再加入荧光标记二抗或酶标记二抗孵育并洗涤后测定得到结果。

在本发明一个较佳实施例中，所述纳米磁珠是具有磁性的四氧化三铁磁珠、具有磁性的三氧化二铁磁珠或聚合物包裹的磁性聚合物，所述纳米磁珠的表面上包含有活性基团。

在本发明一个较佳实施例中，所述磁性聚合物为二氧化硅磁性微球或聚苯乙烯磁性微球，或丙烯酸树脂磁性微球或壳聚糖磁性微球，所述活性基团为氨基、羧基、巯基、羟基或环氧基。

在本发明一个较佳实施例中，所述纳米磁珠的大小在50纳米-2微米之间。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中所述偶联过程为：将纳米磁珠稀释至体积分数为5-50%，与1-5 mg/mL亲和素混合均匀，加入偶联剂，反应4-8h得到亲和素磁珠。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（2）中所述免疫磁珠制备过程为：将亲和素磁珠稀释至体积分数为5-50%，与1-5 mg/mL多肽抗原混合均匀，反应30min-2h，磁力吸附洗涤去上清，再用0.1-1% g/ml的牛血清白蛋白或脱脂乳封闭12h-24h，得到免疫磁珠。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（3）中所述检测样本包括待检样本、阴性样本、阳性样本和空白样本，所述免疫磁珠与所述检测样本的体积比为1:1-5。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（3）中所述荧光标记二抗中用于标记的荧光素为花青素Cy系列荧光素、Alexa Fluor系列荧光素或异硫氰酸荧光素。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（3）中所述酶标记二抗中用于标记的酶为碱性磷酸酶或过氧化物酶。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（3）中所述加入荧光标记或酶标记二抗孵育后的洗涤次数为2-4次。

本发明的有益效果是：本发明的检测Miltenberger血型抗体的方法，是基于纳米磁珠免疫分析检测的，该方法用免疫磁珠代替传统红细胞，使操作难度降低，因磁珠的加入，用磁力分离代替离心洗涤，操作更简便，同时能实现完全抗体和不完全抗体的同时检测，检测过程耗时短，结果易于判定，易于自动化，检测结果准确，结合检测仪器可实现半定量或定量检测，该检测方法能保障临床安全、有效、科学的输血。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1是本发明的检测Miltenberger血型抗体的方法的原理示意图；

图2是本发明的检测Miltenberger血型抗体的方法中荧光二抗检测免疫磁珠的流式细胞图，其中a为空白对照、b为阴性对照、c为阳性样本。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种检测Miltenberger血型抗体的方法，该方法基于基于纳米磁珠免疫分析，包括如下步骤：

（1）免疫磁珠制备

1、纳米磁珠的制备

准确称取2.35g FeCl₃·6H₂O、1.0g尿素和1.5g PAA 2000，加入到40mL二乙二醇溶液中，搅拌10min，使之完全溶解得到混合液；将混合液加入到50mL水热合成反应釜的聚四氟乙烯内衬中，通氮气排除空气，然后将反应釜封闭拧紧后置于预先加热到250℃的电热鼓风干燥箱中，并持续保持250℃，反应8 h；自然冷却后取出反应物，加入50 mL的无水乙醇清洗磁粒，清洗后将磁粒置于超声波清洗器中超声分散10 min，磁性分离，弃上清；用无水乙醇重复清洗2次，再用去离子水清洗3次，最后用去离子水将所得的产物重新分散，得到表面含羧基修饰基团的纳米磁珠。

2、亲和素磁珠制备

1）用0.15M磷酸盐缓冲液（pH=7.2）将纳米磁珠稀释至体积分数为5%的溶液，再加入等体积的浓度为5mg/ml的亲和素溶液，轻轻混匀后，立即加入20mg碳酰二亚胺盐，置于混匀仪室温反应6h。

2）反应完成后，磁性分离去上清，用磷酸盐缓冲液磁性洗涤3次，稀释到体积分数为10%，得到亲和素磁珠待用。

3、亲和素磁珠偶联多肽抗原

1）取5ml体积分数为10%的亲和素磁珠，加入等体积的浓度为2mg/ml的生物素标记的多肽抗原溶液，轻轻混匀后，37℃反应30min。

2）反应完成后，磁性分离去上清，用磷酸盐缓冲液磁性洗涤3次，加入5ml 0.1%牛血清白蛋白溶液封闭未反应末端，4℃反应12h，反应完成后用磷酸盐缓冲液磁性洗涤3次，稀释到体积分数为10%，得到免疫磁珠待用。

（2）患者样本采集与处理

1）抽取正常人静脉血分离血清。

2）抽取待检患者静脉血分离血清。

3）对照血清

阴性对照血清：经国家规定的转氨酶、乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病五项指标检测合格且与上述检测试剂不发生反应的健康成年人血清，表明其血清中不含有Miltenberger血型抗体。

阳性对照血清：经国家规定的转氨酶、乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病五项指标检测合格的健康成年人，且与上述检测试剂发生反应的人血清，表明其血清中含有Miltenberger血型抗体。

4）样品检测

分别取200 μL所述免疫磁珠悬液置于1.5ml离心管中，分别加入200 μL待检样本、200 μL阴性对照血清和200 μL磷酸盐缓冲液，混和均匀，将离心管置于37℃水浴下孵育30 min，再分别用500ul磷酸盐缓冲液磁性分离洗涤3次。加入用生理盐水稀释5000倍的50 Μl FITC标记二抗，在37℃下孵育30 min得到混合液。分别用500ul磷酸盐缓冲液磁性分离洗涤3次，最后将磁珠混悬于200 μL磷酸盐缓冲液。可以进行荧光读值，结果如图2所示。血清中Miltenberger血型抗体浓度较低，通过免疫磁珠富集及信号放大作用，阳性血清与阴性血清荧光值有10倍差异。利用此免疫磁珠检测系统可有效筛检人血清Miltenberger血型抗体，为临床提供一种检测手段。

本发明的有益效果是：本发明的基于纳米磁珠免疫分析检测Miltenberger血型抗体的方法，该方法形成具有Miltenberger血型抗原的免疫磁珠，代替传统血型抗体检测试剂中的Miltenberger抗原阳性红细胞，建立了血型抗体的免疫荧光检测技术及酶联免疫检测技术，解决了目前稀有血型筛查红细胞来源紧缺以及保存时间短的难题。该检测方法中利用纳米磁珠磁性作用，使磁性分离代替离心洗涤，操作简便，检测过程耗时短，结果易于判定，可同时对大量样本进行检测，易于自动化，结合检测仪器可实现半定量或定量检测。该检测方法可解决我国乃至世界上目前缺乏简便实用的Miltenberger血型抗体检测试剂的难题，有助于临床因Miltenberger血型抗体引起的输血不良反应、新生儿溶血病、器官移植排异反应等疾病的诊断，保障临床安全、有效、科学输血。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种检测Miltenberger血型抗体的方法，其特征在于，包括步骤为：（1）将纳米磁珠与亲和素偶联形成亲和素磁珠；（2）将所述亲和素磁珠与末端修饰生物素的Miltenberger血型多肽抗原偶联，封闭未偶联位点，得到免疫磁珠；（3）将所述免疫磁珠与检测样本混匀后孵育并洗涤，再加入荧光标记二抗或酶标记二抗孵育并洗涤后测定得到结果。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述纳米磁珠是具有磁性的四氧化三铁磁珠、具有磁性的三氧化二铁磁珠或聚合物包裹的磁性聚合物，所述纳米磁珠的表面上包含有活性基团。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述磁性聚合物为二氧化硅磁性微球或聚苯乙烯磁性微球，或丙烯酸树脂磁性微球或壳聚糖磁性微球，所述活性基团为氨基、羧基、巯基、羟基或环氧基。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述纳米磁珠的大小在50纳米-2微米之间。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中所述偶联过程为：将纳米磁珠稀释至体积分数为5-50%，与1-5 mg/mL亲和素混合均匀，加入偶联剂，反应4-8h得到亲和素磁珠。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述免疫磁珠制备过程为：将亲和素磁珠稀释至体积分数为5-50%，与1-5 mg/mL多肽抗原混合均匀，反应30min-2h，磁力吸附洗涤去上清，再用0.1-1% g/ml的牛血清白蛋白或脱脂乳封闭12h-24h，得到免疫磁珠。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（3）中所述检测样本包括待检样本、阴性样本、阳性样本和空白样本，所述免疫磁珠与所述检测样本的体积比为1:1-5。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（3）中所述荧光标记二抗中用于标记的荧光素为花青素Cy系列荧光素、Alexa Fluor系列荧光素或异硫氰酸荧光素。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（3）中所述酶标记二抗中用于标记的酶为碱性磷酸酶或过氧化物酶。

10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（3）中所述加入荧光标记或酶标记二抗孵育后的洗涤次数为2-4次。