CN106501528A - 基于滤纸干血斑检测ToRCH10项抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供的一种基于滤纸干血斑检测ToRCH10项抗体的方法，其中，所述方法包括以下步骤：从滤纸片干血斑取得直径为2‑4mm的血片；将血片采用样本稀释液复溶，制得复溶样品；复溶样品采用流式荧光发光法测定。上述基于滤纸干血斑检测ToRCH10项抗体的方法，采用干全血滤纸法结合流式荧光发光法测定IgG抗体或IgM抗体，解决了现有检测方法中需样本量较多的问题，减少了需要的样本量，对人体损伤小，样本便于保存和运输，特别是针对采用对象是新生儿时，无需静脉采血，采样更加方便。

Description

基于滤纸干血斑检测ToRCH10项抗体的方法
技术领域
本发明涉及抗体检测方法领域，特别是涉及一种基于滤纸干血斑检测ToRCH10项抗体的方法。
背景技术
ToRCH一词是美国学者Nahmias于1971年提出的，由多种引起宫内感染的微生物和病毒的英文名称首字母组成。其中To代表刚地弓形虫(ToxopLasmagondii，Tox)，R代表风疹病毒(RubeLLaVirus,Rub)，C代表巨细胞病毒(CytomegaLoVirus,CMV)，H代表单纯疱疹病毒1型和2型(Herpes SimpLexVirus 1and 2,HSV1/2)。ToRCH感染是宫内感染的重要危险因素，孕妇被感染其中一种或多种病原体后，可通过胎盘传播给胎儿或通过产道引起围产期感染，导致流产、死胎、早产、先天畸形和智力障碍等不良结局，在围产医学中称为ToRCH综合症。
在免疫分析方法中，由于全血中的过氧化物酶、凝血因子等成分对于检测结果有影响，传统的均采用血清进行免疫分析检测。
目前，国际上公认的较为准确的ToRCH检测方法是测定人体血清中的特异性IgG、IgM抗体，以判断受感染的情况。检测方法有酶联免疫法、化学发光法等分析检测技术。
然而上述方法需要最终测定血清样本，因此需要采集较多的全血样本用于制备血清样本，当检测人群为新生儿时会较难采集血清或全血样本。另外还存在样本不易保存或运输的问题。
发明内容
基于此，有必要针对检测ToRCH10项抗体时样本用量多以及样本不易保存或运输的问题，提供一种基于滤纸干血斑检测ToRCH10项抗体的方法。
本发明提供的一种基于滤纸干血斑检测ToRCH10项抗体的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
从滤纸片干血斑取得直径为2-4mm的血片；
将血片采用样本稀释液复溶，制得复溶样品；
复溶样品采用流式荧光发光法测定。
在其中的一个实施例中，所述样本稀释液为包括羊抗人IgG抗体或牛血清白蛋白的磷酸缓冲溶液。
在其中的一个实施例中，所述血片采用样本稀释液复溶是将血片置于离心管中，向离心管中加入所述样本稀释液，室温震荡0.5-2h复溶，制得复溶样品。
在其中的一个实施例中，所述血片为4-8片，所述加入的样本稀释液为100-200μL。
在其中的一个实施例中，所述血片为4片，所述加入的样本稀释液为100μL。
在其中的一个实施例中，所述流式荧光发光法包括以下步骤：
步骤1：将所述复溶样品与磁性微球悬液混合，使复溶样品中的特异性IgG抗体或IgM抗体分别结合到交联有与所述IgG抗体或IgM抗体对应抗原的磁性微球上，洗涤去除反应后的剩余液体，制得磁性微球-抗原-抗体复合物；
步骤2：将藻红蛋白标记的抗人IgG抗体或IgM抗体加入步骤1制备的磁性微球-抗原-抗体复合物中，洗涤去除反应后的剩余液体，制得磁性微球-抗原-抗体-藻红蛋白标记的抗人IgG抗体或IgM抗体复合物；
步骤3：将磁性微球重悬液加入步骤2制备的磁性微球-抗原-抗体-藻红蛋白标记的抗人IgG抗体或IgM抗体复合物中，采用多功能流式分析仪检测。
在其中的一个实施例中，所述步骤1为：
在96孔反应板上各孔加入50μL/孔的磁性微球悬液；
在96孔反应板上各孔中分别加入10μL/孔的对照品、阴性质控品、阳性质控品以及复溶样品；
加盖封板纸，微孔板振荡器上充分混匀，置37℃恒温箱避光反应30min；
取出96孔反应板，振荡30s混匀后置于磁板上静置60s，甩掉反应液后各孔分别加入200μL/孔的洗液，重悬30s后置于磁板上静置60s，甩掉洗液，以除去反应残留物。
在其中的一个实施例中，所述步骤2为：
在所述步骤1处理后的96孔反应板的各孔分别加入50μL/孔的藻红蛋白标记的抗人IgG抗体或IgM抗体溶液，加盖封板纸，微孔板振荡器上充分混匀，置37℃恒温箱避光反应30min；
取出96孔反应板，振荡30s混匀后置于磁板上静置60s，甩掉反应液后各孔分别加入200μL/孔洗液，重悬30s后置于磁板上静置60s，甩掉洗液，以去除反应残留物。
在其中的一个实施例中，所述步骤3为：
在所述步骤2处理后的96孔反应板的各孔分别加入150μL/孔的磁性微球重悬液，充分振荡，使磁性微球悬浮；将96孔反应板在多功能流式分析仪上测试。
上述基于滤纸干血斑检测ToRCH10项抗体的方法，克服了免疫分析法中认为全血中的凝血因子会对检测结果产生影响、而采用血清作为检测样品进行分析的普遍认识，通过采用滤纸干血斑(全血)结合流式荧光发光法(化学发光免疫分析法中的一种)测定IgG抗体或IgM抗体，解决了现有检测方法中需样本量较多的问题，减少了需要的样本量，对人体损伤小，样本便于保存和运输，特别是针对采用对象是新生儿时，无需静脉采血，采样更加方便。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明方法与基于静脉血清检测ToRCH IgG抗体相关性示意图；
图2为本发明方法与基于静脉血清检测ToRCH IgM抗体相关性示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例，并结合附图，对本发明的基于滤纸干血斑检测ToRCH10项抗体的方法进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明基于滤纸干血斑检测ToRCH10项抗体，采样量少，采样方便，结合流式荧光发光法能达到基于静脉血清检测ToRCH10项抗体的准确性。具体的，本发明方法包括以下步骤：
从滤纸片干血斑打下直径为2-4mm的血片；
血片采用样本稀释液复溶，制得复溶样品；
复溶样品采用流式荧光发光法测定。
样本稀释液优选为包括羊抗人IgG抗体或牛血清白蛋白的磷酸缓冲溶液。
血片采用样本稀释液复溶是将4-8片血片置于离心管中，向离心管中加入100-200μL样本稀释液，室温震荡0.5-2h复溶，制得复溶样品。
流式荧光发光法包括以下步骤：
步骤1：将所述复溶样品与磁性微球悬液混合，使复溶样品中的特异性IgG抗体或IgM抗体分别结合到交联有与所述IgG抗体或IgM抗体对应抗原的磁性微球上，洗涤去除反应后的剩余液体，制得磁性微球-抗原-抗体复合物；
其中，步骤1具体为：
在96孔反应板上各孔加入50μL/孔的磁性微球悬液；
在96孔反应板上各孔中分别加入10μL/孔的对照品，阴性质控品、阳性质控品以及复溶样品；其中对照品优选加入复数个孔位；
加盖封板纸，微孔板振荡器上充分混匀，置37℃恒温箱避光反应30分钟；
取出96孔反应板，振荡30s混匀后置于磁板上静置60s，甩掉反应液后各孔分别加入200μL/孔的洗液，重悬30s后置于磁板上静置60s，甩掉洗液，以除去反应残留物。
步骤2：将藻红蛋白标记的抗人IgG抗体或IgM抗体加入步骤1制备的磁性微球-抗原-抗体复合物中，洗涤去除反应后的剩余液体，制得磁性微球-抗原-抗体-藻红蛋白标记的抗人IgG抗体或IgM抗体复合物；
其中，步骤2具体为：
在所述步骤1处理后的96孔反应板的各孔分别加入50μL/孔的藻红蛋白标记的抗人IgG抗体或IgM抗体溶液，加盖封板纸，微孔板振荡器上充分混匀，置37℃恒温箱避光反应30min；
取出96孔反应板，振荡30s混匀后置于磁板上静置60s，甩掉反应液后各孔分别加入200μL/孔洗液，重悬30s后置于磁板上静置60s，甩掉洗液，以去除反应残留物。
步骤3：将磁性微球重悬液加入步骤2制备的磁性微球-抗原-抗体-藻红蛋白标记的抗人IgG抗体或IgM抗体复合物中，采用多功能流式分析仪检测。
其中，步骤3具体为：
在所述步骤2处理后的96孔反应板的各孔分别加入150μL/孔的磁性微球重悬液，充分振荡，使磁性微球悬浮；将96孔反应板在多功能流式分析仪上测试。
本发明实施例与参照例采用的仪器与试剂如下：
仪器：医用低速离心机(北京白洋医疗机械有限公司)，多功能流式分析仪Luminex200(美国Luminex公司)，Harris Micro-punch打孔器(美国Harris公司)。
试剂：弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型/2型IgG抗体检测试剂盒(上海透景公司)，弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型/2型IgM抗体检测试剂盒(上海透景公司)。
其中，弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型/2型IgG抗体检测试剂盒中各溶液成分如表1所示；弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型/2型IgM抗体检测试剂盒中各溶液成分如表2所示。
表1弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型/2型IgG抗体检测试剂盒中各溶液成分表
其中，浓缩洗液使用前用去离子水10倍稀释后备用。
表2弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型/2型IgM抗体检测试剂盒中各溶液成分表
其中，浓缩洗液使用前用去离子水10倍稀释后备用。
本发明的滤纸片干血斑优选的采样点位脚后跟、脚大拇指、手指尖，优选的针刺后用滤纸蘸取血滴或将血滴滴在滤纸片上，采样后的滤纸室温放置1-2h进行干燥，制备滤纸片干血斑备用。
本发明静脉血清作为参照样品，验证本发明方法的准确性。静脉血清采用如下方法制备：用促凝管采集静脉血，室温放置半小时后8000rpm离心4分钟，取上层血清备用。
本发明具体实施例的复溶样品与参照例的参照样品来自6位受试者，实施例的滤纸片干血斑测试样本采样点为手指尖，分别记为S1、S2、S3、S4、S5以及S6，由该滤纸片干血斑制备的复溶样品分别记为复溶样品S1-S6；参照样品的静脉血清采自静脉，分别记为C1、C2、C3、C4、C5以及C6。
实施例1
取弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型/2型IgG抗体检测试剂盒中的对照品、阴性质控品、阳性质控品1-2以及静脉血清C1-C6各10μL，分别用200μL弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型/2型IgG抗体检测试剂盒中IgG样本稀释液进行稀释，制得对照品稀释液、阴性质控品稀释液、阳性质控品1-2稀释液、静脉血清C1-C6稀释液；
用打孔器分别在滤纸片干血斑S1-S6上打4个直径为3毫米的圆片放入离心管中，打孔位置需覆盖满全血，分别加入100μL弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型/2型IgG抗体检测试剂盒中IgG样本稀释液室温震荡1小时进行复溶，制得复溶样品S1-S6。
步骤1
在96孔反应板上各孔加入50μL/孔的弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型/2型IgG抗体检测试剂盒中的磁性微球悬液；
再在96孔反应板上各孔中分别加入对照品稀释液、阴性质控品稀释液、阳性质控品1-2稀释液、静脉血清C1-C6稀释液以及复溶样品S1-S6，10μL/孔；
加盖封板纸，微孔板振荡器上充分混匀，置37℃恒温箱避光反应30分钟；
取出96孔反应板，振荡30s混匀后置于磁板上静置60s，甩掉反应液后各孔分别加入200μL/孔的洗液，重悬30s后置于磁板上静置60s，甩掉洗液，重复洗涤3次，以除去反应残留物。
步骤2
在步骤1处理后的96孔反应板的各孔分别加入50μL/孔的弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型/2型IgG抗体检测试剂盒中的藻红蛋白标记的抗人IgG抗体溶液，加盖封板纸，微孔板振荡器上充分混匀，置37℃恒温箱避光反应30min；
取出96孔反应板，振荡30s混匀后置于磁板上静置60s，甩掉反应液后各孔分别加入200μL/孔洗液，重悬30s后置于磁板上静置60s，甩掉洗液，重复洗涤3次，以去除反应残留物。
步骤3
在步骤2处理后的96孔反应板的各孔分别加入150μL/孔的弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型/2型IgG抗体检测试剂盒中的磁性微球重悬液，充分振荡，使磁性微球悬浮；将96孔反应板在多功能流式分析仪上测试。
测试结果如表3所示。
表3实施例1测试结果
实施例2
取弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型/2型IgM抗体检测试剂盒中的对照品、阴性质控品、阳性质控品以及静脉血清C1-C6各10μL，分别用200μL弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型/2型IgG抗体检测试剂盒中IgM样本稀释液进行稀释，制得对照品稀释液、阴性质控品稀释液、阳性质控品稀释液、静脉血清C1-C6稀释液；
用打孔器分别在滤纸片干血斑S1-S6上打4个直径为3毫米的圆片放入离心管中，打孔位置需覆盖满全血，分别加入100μL弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型/2型IgM抗体检测试剂盒中ToRCH IgM样本稀释液室温震荡1小时进行复溶，制得复溶样品S1-S6。
步骤1
在96孔反应板上各孔加入50μL/孔的弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型/2型IgM抗体检测试剂盒中的磁性微球悬液；
再在96孔反应板上各孔中分别加入对照品稀释液、阴性质控品稀释液、阳性质控品稀释液、静脉血清C1-C6稀释液以及复溶样品S1-S6，10μL/孔；
加盖封板纸，微孔板振荡器上充分混匀，置37℃恒温箱避光反应30min；
取出96孔反应板，振荡30s混匀后置于磁板上静置60s，甩掉反应液后各孔分别加入200μL/孔的洗液，重悬30s后置于磁板上静置60s，甩掉洗液，重复洗涤3次，以除去反应残留物。
步骤2
在步骤1处理后的96孔反应板的各孔分别加入50μL/孔的弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型/2型IgM抗体检测试剂盒中的藻红蛋白标记的抗人IgM抗体溶液，加盖封板纸，微孔板振荡器上充分混匀，置37℃恒温箱避光反应30min；
取出96孔反应板，振荡30s混匀后置于磁板上静置60s，甩掉反应液后各孔分别加入200μL/孔洗液，重悬30s后置于磁板上静置60s，甩掉洗液，重复洗涤3次，以去除反应残留物。
步骤3
在步骤2处理后的96孔反应板的各孔分别加入150μL/孔的弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型/2型IgM抗体检测试剂盒中的磁性微球重悬液，充分振荡，使磁性微球悬浮；将96孔反应板在多功能流式分析仪上测试。
测试结果如表4所示。
表4实施例2测定结果
用透景公司软件对实施例1以及实施例2的测定结果进行定性分析，其中，结果≥1为阳性，＜1为阴性。
ToRCHIgG 5项检测6位受检者，参照品测试结果分别为Tox-IgG 0/6、Rub-IgG 3/6、CMV-IgG 0/6、HSV1-IgG 6/6、HSV2-IgG 1/6，测定样本测定结果分别为Tox-IgG 0/6、Rub-IgG 3/6、CMV-IgG 0/6、HSV1-IgG 6/6、HSV2-IgG 1/6，血清与DBS指尖全血结果阳性符合率为100％。
ToRCH IgM5项检测6位受检者，参照品测定结果分别为Tox-IgM 0/6、Rub-IgM 0/6、CMV-IgM 0/6、HSV1-IgM 0/6、HSV2-IgM 0/6，测定样本测定结果分别为Tox-IgM 0/6、Rub-IgM 0/6、CMV-IgM 0/6、HSV1-IgM 0/6、HSV2-IgM 0/6，血清与DBS指尖全血结果阳性符合率为100％。
请参阅图1和图2所示，以参照品测定结果为x坐标，测定样本测定结果为纵坐标进行拟合，ToRCH IgG得拟合曲线y＝1.0278x+0.0111，R2＝0.987，ToRCH IgM得拟合曲线y＝0.8649x-0.0139，R2＝0.9203，相关性非常好。说明本发明方法与参照品的测定结果与静脉血清测定结果相同，本发明方法可以完全替代静脉血清样品进行ToRCH10项抗体检测，减少了样品需要量。另外，滤纸干血斑样品更易保存和运输，降低了ToRCH10项抗体检测成本。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种基于滤纸干血斑检测ToRCH10项抗体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
从滤纸片干血斑取得直径为2-4mm的血片；
将血片采用样本稀释液复溶，制得复溶样品；
复溶样品采用流式荧光发光法测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本稀释液为包括羊抗人IgG抗体或牛血清白蛋白的磷酸缓冲溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血片采用样本稀释液复溶是将血片置于离心管中，向离心管中加入所述样本稀释液，室温震荡0.5-2h复溶，制得复溶样品。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述血片为4-8片，所述加入的样本稀释液为100-200μL。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述血片为4片，所述加入的样本稀释液为100μL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流式荧光发光法包括以下步骤：
步骤1：将所述复溶样品与磁性微球悬液混合，使复溶样品中的特异性IgG抗体或IgM抗体分别结合到交联有与所述IgG抗体或IgM抗体对应抗原的磁性微球上，洗涤去除反应后的剩余液体，制得磁性微球-抗原-抗体复合物；
步骤2：将藻红蛋白标记的抗人IgG抗体或IgM抗体加入步骤1制备的磁性微球-抗原-抗体复合物中，洗涤去除反应后的剩余液体，制得磁性微球-抗原-抗体-藻红蛋白标记的抗人IgG抗体或IgM抗体复合物；
步骤3：将磁性微球重悬液加入步骤2制备的磁性微球-抗原-抗体-藻红蛋白标记的抗人IgG抗体或IgM抗体复合物中，采用多功能流式分析仪检测。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤1为：
在96孔反应板上各孔加入50μL/孔的磁性微球悬液；
在96孔反应板上各孔中分别加入10μL/孔的对照品、阴性质控品、阳性质控品以及复溶样品；
加盖封板纸，微孔板振荡器上充分混匀，置37℃恒温箱避光反应30min；
取出96孔反应板，振荡30s混匀后置于磁板上静置60s，甩掉反应液后各孔分别加入200μL/孔的洗液，重悬30s后置于磁板上静置60s，甩掉洗液，以除去反应残留物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤2为：
在所述步骤1处理后的96孔反应板的各孔分别加入50μL/孔的藻红蛋白标记的抗人IgG抗体或IgM抗体溶液，加盖封板纸，微孔板振荡器上充分混匀，置37℃恒温箱避光反应30min；
取出96孔反应板，振荡30s混匀后置于磁板上静置60s，甩掉反应液后各孔分别加入200μL/孔洗液，重悬30s后置于磁板上静置60s，甩掉洗液，以去除反应残留物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤3为：
在所述步骤2处理后的96孔反应板的各孔分别加入150μL/孔的磁性微球重悬液，充分振荡，使磁性微球悬浮；将96孔反应板在多功能流式分析仪上测试。
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