CN109725144A - 一种jmh血型抗原芯片及其在红细胞意外抗体检测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种血型抗原芯片及其在红细胞意外抗体检测中的应用，所述的检测包括(1)将纯化血型抗原包被至载体；(2)使检测样品与包被至载体的抗原接触；(3)加入标记有标记物的二抗；(4)针对标记物进行信号检测。本发明所述血型抗原芯片和红细胞意外抗体检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好、不依赖于红细胞，且能对众多稀有血型抗原的结合抗体进行高通量检测，并且可同时实现不同种稀有抗体的精准检测，无需借助细胞谱核对，避免因人员资质差异导致结果判读错误。

Description

一种JMH血型抗原芯片及其在红细胞意外抗体检测中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及血型抗体的血清学检测技术，特别是涉及一种血型抗原芯片、其制备方法及在红细胞意外抗体检测中的应用。

背景技术

输血安全已成为医疗卫生工作中的一个重要问题，并引起全社会的高度关注。世界卫生组织(WHO)一贯重视输血安全工作，近年来进一步加强了血液安全工作的力度，血液安全已被WHO列为了全球卫生工作七项重点工作之一。输血安全问题包括传染性输血不良反应的问题和非传染性输血不良反应的问题。英国、美国、法国均启动了输血严重危害报告系统，用来收集和报告各所医院自愿报告的与血液成分输注相关的主要不良事件。从欧美国家统计的数据可以看出，非传染性输血不良反应的发生率很高，并且一旦发生，后果极其严重。

红细胞同种意外抗体在中国汉族患者中检出率为0.38％-2.38％，是引起非传染性输血不良反应、新生儿溶血病、血型鉴定困难以及疑难配型、不明原因的贫血、红细胞输注无效等的主要原因。输血前进行红细胞同种不规则血型抗体精准检定，对于输血安全和输血疗效至关重要。为确保输血安全和输血疗效，红细胞同种意外抗体检测已成为输血前常规检测项目。若患者体内存在红细胞意外抗体，一旦输入的献血员红细胞上存在相应抗原，即会发生溶血性输血不良反应，严重者甚至死亡。

由于用来免疫生成单克隆抗体的抗原的精确结构是未知的，来源于多种异体材料包括卵巢囊液及唾液糖蛋白的可溶性抗原和人类细胞，因此为了减少由于抗原变异导致漏检的风险，这些用于常规血清学检测的克隆株反应较广泛，这同样增加了结构相似的抗原之间的交叉反应风险。有文章报道，ABO单克隆抗体与非ABO抗原的交叉反应尽管在血清学反应中很少出现，但经常出现于非血清学反应如酶免疫分析法和抑制试验中，因此抗体应用于此类试验时必须考虑交叉反应的情况。常规血清学试验检测灵敏度较低，容易导致献血员弱抗原的漏检，输注至患者体内引起溶血性输血不良反应，威胁患者生命，应用灵敏度较高的非血清学试验检测献血员血型抗原已成为发展趋势，若使用特异性不强的稀有血型抗体试剂进行献血员血型抗原分型可能导致错误的分型结果，进而无法确保安全有效的输血。因此用于献血员血型抗原检测的稀有血型抗体试剂的质量评价尤为重要。目前用于稀有血型抗体试剂质量评价的方法是基于凝集反应原理利用已知抗原的试剂红细胞表征抗体的特异性，但由于红细胞试剂浓度低、抗原性弱，且不同厂家不同批号之前细胞有差异；同时凝集反应灵敏度低，特异性低，无法实现多重检测，因此评价稀有血型抗体试剂的质量存在一定弊端。

红细胞意外抗体检定一直是输血安全关注的焦点，为此研发了很多种检测红细胞意外抗体的方法，如：经典抗人球蛋白法、柱凝集法、Capture捕获法等。专利CN00105438.4中通过微柱凝胶法对血小板血型抗原抗体进行检测，为血小板配型。专利CN200710049305.1提供一种利用微流技术检测血型的试剂盒、制备方法及检测方法。然而上述专利中临床血液中红细胞意外抗体的检测普遍存在灵敏度差、动力学线性范围窄、通量化筛选能力低、假阴性问题严重、检测试剂不便于储存等技术问题。

专利CN200880019301.1通过将红细胞或红细胞膜片段固定到珠子上实现体外鉴定个体的抗红细胞抗体，然而该专利中所描述的条件参数不可重复，并且该方法应用于红细胞意外抗体的检测时，抗原的包被方式、二抗的加入浓度以及样品的稀释浓度的变化都会影响检测的准确性，因此需要对该方法进行重新设计和评估。

发明内容

为解决上述问题，本发明发明人通过对红细胞意外抗体的检测方法和检测条件的优化，提供一种灵敏度、准确性好的血型抗原芯片及其在检测红细胞意外抗体或输血配型中的用途。

本发明提供一种血型抗原芯片，所述的芯片包括纯化血型抗原和载体，所述的纯化血型抗原包被至所述的载体上，所述的纯化血型抗原能够结合红细胞意外抗体。

本发明所述的纯化血型抗原为JMH。

本发明所述的载体为微球，所述的微球选自二氧化硅微球、聚苯乙烯微球、磁性微球和生物大分子聚合物微球中的一种或两种以上的组合，优选的，本发明所述的载体为聚苯乙烯微球，特别优选的，本发明所述的载体为结合有荧光染料的聚苯烯微球。

优选的，所述的纯化血型抗原包被至载体的量为1-200μg/1.25×10⁷个微球。更优选的，所述纯化血型抗原包被至载体的量为50-200μg/1.25×10⁷个微球，更优选的，所述纯化血型抗原包被至载体的量为50-150μg/1.25×10⁷个微球，特别优选的，所述纯化血型抗原包被至载体的量为50-100μg/1.25×10⁷个微球。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的血型抗原芯片为液体芯片，所述的血型抗原芯片中包被有纯化血型抗原的微球悬浮于保存液中。

本发明提供了一种血型抗原芯片在如下用途中的应用：(1)红细胞意外抗体的筛查及鉴定；(2)红细胞意外抗体的定量检测；(3)输血配型。

本发明提供了一种血型抗原芯片的制备方法，所述的方法包括：

(1)微球的预处理：将微球超声重悬；

(2)微球的活化：将微球依次加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)、碳二亚胺(EDC)活化；

(3)向微球溶液中加入纯化血型抗原进行偶联，所述的纯化血型抗原能够结合红细胞意外抗体。

优选的，所述的纯化血型抗原包被至载体的量为1-200μg/1.25×10⁷个微球。更优选的，所述纯化血型抗原包被至载体的量为50-200μg/1.25×10⁷个微球，更优选的，所述纯化血型抗原包被至载体的量为50-150μg/1.25×10⁷个微球，特别优选的，所述纯化血型抗原包被至载体的量为50-100μg/1.25×10⁷个微球。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述的血型抗原芯片的制备方法包括：微球超声重悬后，去上清液；用去离子水震荡重悬微球，去上清液；用磷酸氢二钠缓冲液震荡重悬微球，加入Sulfo-NHS溶液，震荡混匀，加入EDC溶液中，震荡混匀，室温孵育5-30分钟，优选孵育20分钟；去上清液，用MES溶液，重悬微球，去上清液，重复两次后再加入MES溶液重悬微球；加入纯化血型抗原到悬浮的微球溶液中进行偶联反应，孵育0.5-4小时，优选为2小时；去上清液，用PBS-TBN(1％BSA，0.05％tween-20)溶液重悬偶联后的微球，室温混合孵育30min后去上清；用PBST清洗微球两次后，再用PBST重悬，并在2-8℃的黑暗环境中保存。

本发明提供一种血型抗体的鉴定或检测方法，包括：

(1)将纯化血型抗原包被至载体，所述的纯化血型抗原能够结合红细胞意外抗体；

(2)使检测样品与包被至载体的抗原孵育；

(3)加入标记有标记物的二抗；

(4)针对标记物进行信号检测。

本发明所述的纯化血型抗原为JMH。

本发明所述的载体为微球，所述的微球选自二氧化硅微球、聚苯乙烯微球、磁性微球和生物大分子聚合物微球中的一种或两种以上的组合，优选的，本发明所述的载体为聚苯乙烯微球，特别优选的，本发明所述的载体为结合有荧光染料的聚苯烯微球。

优选的，所述的纯化血型抗原包被至载体的量为1-200μg/1.25×10⁷个微球。更优选的，所述纯化血型抗原包被至载体的量为50-200μg/1.25×10⁷个微球，更优选的，所述纯化血型抗原包被至载体的量为50-150μg/1.25×10⁷个微球，特别优选的，所述纯化血型抗原包被至载体的量为50-100μg/1.25×10⁷个微球。

本发明所述的检测样品可以是全血、血清、血浆或抗体，优选的，所述的检测样品为血浆。优选的，本发明所述检测样品稀释后再与包被至载体的抗原接触，所述检测样品的稀释倍数为25-200倍，更优选的，所述的检测样品的稀释倍数为50-100倍，特别优选的，所述的检测样品的稀释倍数为100倍。

优选的，所述步骤(2)中检测样品与包被至载体的抗原孵育的时间为15-60min。更优选的，所述孵育时间为30-45min。最优选的，所述孵育时间为45min。

本发明所述的标记有标记物的二抗选自标记有荧光素或酶的蛋白或抗体及其偶联物；所述蛋白或抗体及其偶联物选自亲和素、链霉亲和素、地高辛抗体、组氨酸抗体、含Ni亲和分子、荧光分子抗体；所述的荧光素选自花青素Cy系列荧光素、Alexa Fluor系列荧光素或异硫氰酸荧光素；所述的酶为碱性磷酸酶或过氧化物酶。优选的，所述的标记有标记物的二抗为Cy3标记的抗人IgG抗体。优选的，本发明所述的二抗的加入浓度为1-8ug/ml，更优选的，本发明所述的二抗的加入浓度为2-6ug/ml，特别优选的，本发明所述的二抗的加入浓度为4ug/ml。

本发明所述的信号检测包括荧光法检测、显色法检测、电化学检测、力学检测等。优选的，本发明所述的信号检测为荧光法检测，更优选的，本发明所述的信号检测的在波长为532nm和635nm进行荧光检测。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的血型抗体的检测方法包括：取96孔微孔板，每孔加入PBS-TBN溶液或1％BSA溶液37℃孵育0.5-3h，封闭；加入检测样品和纯化血型抗原包被的载体，孵育，去上清液；用PBS-TBN溶液洗涤96孔板；加入荧光标记的二抗和PBS-TBN孵育；用PBS-TBN溶液洗涤96孔板；用PBS-TBN重悬微球，用流式细胞仪进行检测。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：

(1)灵敏度高、线性范围广。本发明所述微球、芯片、血型抗体检测方法的灵敏度远高于现有技术常用的非典型凝集素筛选法(AAS)、微柱凝胶法，检测限远远低于微柱凝胶法，灵敏度提高1000倍以上；另外本发明线性范围广，动力学范围提高2-3个数量级，尤其适用于低浓度稀有血型抗体、红细胞意外抗体的检测。

(2)特异性强，重复性好。本发明所制备的血型抗原芯片具有很好的特异性，不同的抗原芯片均能检测出相应的抗体，不同的抗原芯片之间没有发生交叉反应，且本发明所述的血型抗体检测方法具有很好的重复性。

(3)不依赖红细胞、储存方便。本发明所述血型抗体检测方法无需使用红细胞，偶联有抗原的微球可长期稳定储存，解决了携带稀有抗原红细胞来源不足、难储存、易溶血的技术问题。

(4)集成度高、可实现高通量全面筛查。本发明所述微球、芯片、血型抗体检测方法可根据需要和成本进行适当集成。既可以将多种稀有血型抗原集成，实现一次检测全面分析所有血型抗原的目的；也可以将同种稀有血型抗原分类标记集成，实现对某种稀有血型抗原的大规模筛查。

(5)可实现抗体的精准鉴定。由于抗原为纯化抗原，与抗体进行特异性结合，因此可直接判断抗体的具体种类，无需根据细胞谱进行核对排除，可确保结果的单一性，避免由于人员资质问题导致的结果误判，实现抗体的精准鉴定。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。

图1血型抗原芯片检测血型抗体的流程图。在96孔板中加入抗原包被的微球，加入血清形成微球-抗原-抗体复合物，然后再加入荧光标记的二抗读取信号，通过流式细胞仪检测，532nm的荧光检测值与635nm的微球检测共同读取信号结果。

图2临床114例血清样本红细胞意外抗体检测结果，横轴为样本标号，纵轴为包被到微球上的不同抗原名称，0.8721到0.8721058代表血清抗体结合信号由低到高。

图3临床100例血清样本红细胞意外抗体检测结果，横轴为样本标号，纵轴为包被到微球上的不同抗原名称，0.6166731到0.61671代表血清抗体结合信号由低到高。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

实施例1JMH血型抗原芯片的制备

将未偶联的微球超声重悬，取200uL(浓度为1.25×10⁷个/mL)微球到EP管内，将EP管放置在磁力板上30s，将微球与溶液分开，去上清液，移走磁力分离器并用100μl去离子水震荡重悬微球，将EP管放置在磁力板上30s，将微球与溶液分开，去上清液。移走磁力分离器并用80uL 100mM，PH6.2磷酸氢二钠缓冲液，震荡重悬微球，加入10uL的50mg/ml的Sulfo-NHS溶液(溶于水中)，轻柔震荡混匀，加入10μl的50mg/ml的EDC溶液中(溶于水中)，轻柔震荡混匀，在室温孵育20分钟，每隔10分钟轻柔震荡混匀一次，将EP管放置在磁力板上30s，将微球与溶液分开，去上清液。移走磁力分离器并用250uL的50mM MES，PH5.0溶液，震荡重悬微球，将EP管放置在磁力板上30s，将微球与溶液分开，去上清液，重复两次。移走磁力分离器并用100μl的50mM MES，PH5.0溶液，震荡重悬活化并清洗后的微球。加入12.5μg(浓度0.5mg/ml 25μl)纯抗原JMH到悬浮的微球溶液中，用50mM MES，PH5.0的溶液将总体积增至500μl，震荡混匀进行偶联反应，在室温中边翻转混合边孵育2个小时。将EP管放置在磁力板上30s，将微球与溶液分开，去上清液。移走磁力分离器并用500μl的PBS-TBN溶液震荡重悬偶联后的微球，在室温中翻转混合孵育30min。将EP管放置在磁力板上30s，将微球与溶液分开，去上清液。用1mL PBST溶液清洗微球2次。移走磁力分离器并用1ml的PBST溶液重悬偶联并清洗后的微球，将其保存在4℃的黑暗环境中。

实施例2抗体的稀释倍数、孵育时间及二抗浓度对检测的影响

取96孔板，每孔加入200μl 1％BSA 37℃孵育1h封闭。加入50μl稀释后的检测样品JMH抗体和2500个实施例1制备的JMH血型抗原芯片，用PBS-TBN补足100μl，室温孵育一定时间。将96孔板放置在磁力板上5min，将微球与溶液分开，去上清液。用150μl PBS-TBN溶液洗涤96孔板3次(洗板时加入150μl PBS-TBN溶液，置于振荡器中震荡5min，取出后将96孔板放置在磁力板上5min，将微球与溶液分开，去上清液)。加入50μl的荧光标记的二抗抗人IgG，加入50μl PBS-TBN，室温震荡孵育0.5h，用150μl PBS-TBN溶液洗涤96孔板2次，用200μlPBS-TBN重悬磁珠，用流式细胞仪进行检测。

此实验在样品检测步骤设置三个影响因素，分别是：检测样品稀释倍数、孵育时间和二抗浓度，每种影响因素有4个水平，因此设计三因素、4水平正交试验，利用spss软件进行正交试验设计。

检测样品稀释倍数	25倍	50倍	100倍	200倍
					孵育时间	15min	30min	45min	60min
二抗浓度	2ug/ml	4ug/ml	6ug/ml	8ug/ml

实验结果如下：

1)检测样品稀释倍数：25倍、50倍、100倍、200倍均有差异，随稀释倍数增加，信号降低，因此根据实际情况选取稀释倍数100倍。

2)孵育时间：15min与30min、45min、60min均有差异P＜0.05；30min与15min、45min、60min均有差异P＜0.05；45min与15min、30min均有差异，与60min无差异P＞0.05；60min与15min、30min均有差异，与45min无差异P＞0.05；因此最终选取45min。

3)二抗浓度：2ug/ml与4ug/ml、6ug/ml、8ug/ml均有差异P＜0.05；4ug/ml与6ug/ml、8ug/ml无差异P＞0.05；6ug/ml与4ug/ml、8ug/ml无差异P＞0.05；8ug/ml与4ug/ml、6ug/ml无差异P＞0.05；因此最终选取4ug/ml。

综上所述，在血型抗体检测操作中，最佳的检测条件为抗体稀释100倍、抗体与血型抗原芯片孵育45min、二抗浓度为4ug/ml。

实施例3血型抗原芯片对血型抗体检测的灵敏度

按照图1所示检测流程，取96孔板，每孔加入200微升1％BSA溶液37℃孵育1h封闭。加入50uL稀释后的抗体，抗体分别稀释163840倍、40960倍、10240倍、2560倍、640倍、160倍、40倍、10倍、5倍和2500个实施例1制备的血型抗原芯片，用PBS-TBN将体系体积补足100uL进行室温孵育45min，；然后将96孔板放置在磁力板上5分钟，去上清液；用150微升PBS-TBN溶液洗涤96孔板3次；加入50微升Cy3标记的抗人IgG，加入50微升PBS-TBN，室温震荡孵育0.5小时；用100微升PBS-TBN溶液洗涤96孔板2次；用200微升PBS-TBN重悬微球，用流式细胞仪进行检测。检测结果证明，当检测抗体稀释163840倍时，本发明所制备的JMH血型抗原芯片依然能检测出抗体，说明血型抗原芯片具有较高的灵敏度，当所述检测抗体的稀释倍数为25-200倍时，抗体的检测效果最佳。

实施例4血型抗原芯片对血型抗体检测的特异性

利用实施例1制备的JMH血型抗原芯片，按照实施例2所述的最佳检测方法进行抗体检测，分别加入JMH、K、k三种不同抗体，验证JMH血型抗原芯片和不同抗体之间是否存在交叉反应，实验结果显示，本发明所制备的JMH血型抗原芯片具有很好的特异性，抗原芯片能检测出相应的抗体，且JMH血型抗原芯片与不同抗体之间没有发生交叉反应。

实施例5血型抗原芯片对血型抗体检测的重复性

利用实施例1制备的JMH血型抗原芯片，按照实施例2所述的最佳检测方法检测JMH抗体，抗体分别稀40960倍、10240倍、2560倍、640倍、160倍、40倍、10倍，连续两天做相同的实验，每次做两块微孔板，检测本发明所制备的JMH血型抗原芯片对血型抗体检测时的重复性，其中同一天的两块微孔板数据代表实验内重复性，连续两天的两块微孔板数据代表实验间重复性。实验结果证明，本发明所制备的JMH血型抗原芯片在对相应的血型抗体进行检测时，实验间及实验内均存在很好的重复性。

实施例6血型抗原芯片对红细胞意外抗体检测的临床大规模应用

利用实施例1制备的JMH血型抗原芯片检测114例临床血清标本，检测方法如实施例2所述的最佳检测方法，检测结果如图2所示。需要说明，上述114例临床标本在常规检测方法检测时结果均为阴性，由图2可以看出，利用本申请所制备的血型抗原芯片及检测检测方法能检测到常规方法检测不到的抗体。为验证本发明所述的检测方法的可靠性，进行下一批临床样本的试验。

同样，将实施例1制备的JMH血型抗原芯片用于100例临床血清标本的检测，检测方法如实施例2所述的最佳检测方法，检测结果如图3所示。在常规检测方法检测结果均为阴性的情况下，本发明所制备的血型抗原芯片仍检测到一些抗体，说明所述血型抗原芯片灵敏度高，可检测到临床常规方法检测不到的抗体，从而避免该种抗体导致的溶血性输血不良反应。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种血型抗原芯片，包括纯化血型抗原和载体，所述的纯化血型抗原包被至所述的载体上；所述的载体为微球，所述的微球选自二氧化硅微球、聚苯乙烯微球、磁性微球和生物大分子聚合物微球中的一种或两种以上的组合。

2.根据权利要求1所述的血型抗原芯片，其特征在于，所述纯化血型抗原为JMH。

3.根据权利要求1所述的血型抗原芯片，其特征在于，所述的纯化血型抗原包被至载体的量为1-200μg/1.25×10⁷个微球。

4.一种权利要求1-3任一所述的血型抗原芯片的制备方法，包括如下步骤：

(1)微球的预处理：将微球超声重悬；

(2)微球的活化：将微球依次加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺、碳二亚胺活化；

(3)向微球溶液中加入纯化血型抗原进行偶联，所述的纯化血型抗原能够结合红细胞意外抗体。

5.一种权利要求1-3任一所述的血型抗原芯片在如下用途中的应用：(1)红细胞意外抗体的筛查及鉴定；(2)红细胞意外抗体的定量检测；(3)输血配型。

6.一种用权利要求1-3任一所述的血型抗原芯片进行血型抗体的鉴定或检测方法，包括：

(1)将纯化血型抗原包被至载体，所述的纯化血型抗原能够结合红细胞意外抗体；

(2)使检测样品与包被至载体的抗原孵育；

(3)加入标记有标记物的二抗；

(4)针对标记物进行信号检测。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的检测样品为全血、血清、血浆或抗体，所述检测样品稀释后再与包被至载体的抗原接触，稀释倍数为25-200倍。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中检测样品与包被至载体的抗原孵育的时间为15-60min。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的标记有标记物的二抗选自标记有荧光素或酶的蛋白或抗体及其偶联物；所述蛋白或抗体及其偶联物选自亲和素、链霉亲和素、地高辛抗体、组氨酸抗体、含Ni亲和分子、荧光分子抗体；所述的荧光素选自花青素Cy系列荧光素、Alexa Fluor系列荧光素或异硫氰酸荧光素；所述的酶为碱性磷酸酶或过氧化物酶；所述二抗的加入浓度为1-8ug/ml。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的信号检测包括荧光法检测、显色法检测、电化学检测、力学检测。