CN111398578A - 一种布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂盒 - Google Patents

一种布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂盒，包括盒体，所述盒体内设有内置有检测试剂卡的检测试剂卡盒、布鲁氏菌抗原试剂瓶、阳性质控试剂瓶、阴性质控试剂瓶、稀释液试剂瓶、倍比稀释板，所述检测试剂卡内装有微球凝胶和抗人球蛋白抗体AHG。与现有技术相比，本发明的布鲁氏菌抗体凝胶试剂监测盒中的抗人球蛋白微球凝胶法解决了SAT和RB法不能检出不完全抗体的不足，同时又避免了Coombs法多次洗涤和离心的繁琐，判读结果客观可标准化，不受操作者技能的影响，本发明布鲁氏菌抗体凝胶试剂监测盒可以在1个小时内检测出待检血清中是否存在布鲁氏菌抗体，进而判断是否有布鲁氏菌感染，这又是免疫捕捉凝集法所达不到的。

Description

一种布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂盒
技术领域
本发明涉及布鲁氏菌病快速检测技术领域，特别是一种布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂盒。
背景技术
布鲁氏菌病是一种人畜共患的传染性疾病，在1860年由David Bruce最先确认其发病原因，并以此命名。人们通过直接接触牛、羊、猪和骆驼等患病动物的血液、胎盘、胚胎或者子宫分泌物，或者人们食用带有布鲁氏菌病菌动物的制品（特别是末经高温消毒的牛奶或者奶制品）而被感染布鲁氏菌病。布鲁氏菌病的发病区域主要集中在地中海、中东、阿拉伯半岛、墨西哥、美国的中部和南部和南亚次大陆，布鲁氏菌病会给发病区域造成巨大的经济损失，同时对公众的健康也有严重的威胁。伤寒、单核白血球增多症、利什曼原虫症和结核病这些病和布鲁氏菌病的病症相似，并且布鲁氏菌病缺乏一些典型的症状，使得布鲁氏菌病诊断困难。
在布鲁氏菌病发病的进程中，血清中有三类抗体，分别是IgM、IgA和IgG。在1967年Coghlan等人通过蔗糖密度梯度分离的方法，检测一系列周期内病人的血清，发现在布鲁氏菌病急性期，血清里面有IgM和IgG完全抗体，在慢性期中，血清中主要是IgG不完全抗体。在1967年Kerrt等人确认在布鲁氏菌病慢性期内，血清中还含有不完全抗体IgA。IgM抗体是完全抗体，IgM抗体很容易和抗原结合形成可见凝集物。IgA、IgG是不完全抗体，IgA和IgG不完全抗体与抗原结合不能形成可见的凝集物，但是加入抗人球蛋白抗体（AHG）后，就可以形成可见凝集块。
诊断布鲁氏菌病主要是检测血清中的抗体，方法主要包括：虎红平板（RB）凝集法、标准凝集试管（SAT）法、间接抗人球法（Indirect Coombs）以及免疫捕捉凝集（Immunocapture-agglutination）法。
虎红平板凝集法的原理是：在PH=3.65的缓冲条件下，血清与被虎红染色的布氏菌悬浮液混合在一起时，当血清中有抗体时，便发生凝集反应。这种方法简单并且快速，对于急性病的病人可以在5到10分钟内给出相当好的结果。但是由于它只能检出完全抗体，所以当病人是布鲁氏菌病的慢性期，虎红平板凝集法会得出很高比例假阴性的结果，造成漏检。
标准凝集试管（SAT）法是在试管中进行的，在试管中按比例加入布氏菌悬浮液和倍比稀释的血清，血清的稀释比例为1：20到1：1280，然后在37℃水浴中孵育24小时，通过肉眼观察试管底部的凝集。
但是对于患有慢性期布鲁氏菌病、再次感染或者复发的病人来说，RB和SAT方法就很难检测出这些病人。在这些条件下，免疫反应是由IgG不完全抗体占主导，不完全抗体限制了RB和SAT方法的敏感性，所以在血清检测中使用这二种方法往往得到阴性结果。
Coombs法是在SAT法的基础上产生的，Coombs法可以用来检测IgG不完全抗体，但是此方法需要多次手工离心和洗涤，并且结果判读受检测者主观的影响，容易出现漏检与误检。
免疫捕捉凝集（immunocapture-agglutination）法是在Coombs法基础上发展而来的，该方法可以用来IgG和IgA不完全抗体，并且与Coombs法有相似的敏感性和特异性。这方法的优点是容易操作，不需要洗涤和离心的步骤，缺点是该方法需要在24小时后得到结果。
发明内容
本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂盒，将Coombs法和微球凝胶层析法相结合，快速诊断待检血清中是否存在布鲁氏菌抗体，进而判断是否有布鲁氏菌感染。
为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
一种布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂盒，包括盒体，所述盒体内设有内置有检测试剂卡的检测试剂卡盒、装有经染色剂的布鲁氏菌抗原的布鲁氏菌抗原试剂瓶、装有阳性质控试剂的阳性质控试剂瓶、装有阴性质控试剂的阴性质控试剂瓶、装有稀释液试剂的稀释液试剂瓶、倍比稀释板，倍比稀释板抽屉式插接在盒体下部，所述检测试剂卡内装有微球凝胶和抗人球蛋白抗体AHG。
进一步，所述检测试剂卡包括设置于塑料卡片中的若干个反应孔柱，反应孔柱中加入有微球凝胶和抗人球蛋白抗体AHG，反应孔柱用铝箔密封。
进一步，所述微球凝胶和抗人球蛋白抗体AHG的体积比为2.5~5.0：1。
进一步，所述布鲁氏菌抗原悬浮液是在检测前用PH为6.0-7.4的等渗PBS缓冲液作为稀释液稀释布鲁氏菌抗原得到，所述布鲁氏菌抗原悬浮液中布鲁氏菌抗原的质量/体积为0.2-0.5%。
进一步，所述微球凝胶的粒径分布在20~120微米之间。
与现有技术相比，本发明的布鲁氏菌抗体凝胶试剂监测盒中的抗人球蛋白微球凝胶法解决了SAT和RB法不能检出不完全抗体的不足，同时又避免了Coombs法多次洗涤和离心的繁琐，判读结果客观可标准化，不受操作者技能的影响，本发明布鲁氏菌抗体凝胶试剂监测盒可以在1个小时内检测出待检血清中是否存在布鲁氏菌抗体，进而判断是否有布鲁氏菌感染，这又是免疫捕捉凝集法所达不到的。
附图说明
图1为本发明的结构俯视图。
图2为本发明的检测试剂卡的结构示意图。
图3为本发明的倍比稀释板的结构示意图。
图4为本发明的检测试剂卡的检测原理图。
图5为本发明的待检血清的阳性和阴性的判定标准，其中：a为阴性；b为阳性。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
如图1-3所示，本实施例的一种布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂盒，包括盒体1，从图1知，该盒体1可以是拼接的，所述盒体1内设有内置有检测试剂卡3的检测试剂卡盒2、装有经染色剂的布鲁氏菌抗原的布鲁氏菌抗原试剂瓶4、装有阳性质控试剂的阳性质控试剂瓶5、装有阴性质控试剂的阴性质控试剂瓶6、装有稀释液试剂的稀释液试剂瓶7、倍比稀释板8，倍比稀释板8抽屉式插接在盒体下部，所述检测试剂卡3内装有微球凝胶和抗人球蛋白抗体AHG；如图2所示，检测试剂卡3包括设置于塑料卡片31中的若干个反应孔柱32，反应孔柱32中加入有微球凝胶322和抗人球蛋白抗体AHG321，反应孔柱用铝箔33密封。需要说明的是，本实施例中的用虎红染料对布鲁氏菌抗原进行染色，当然，也可以使用其他染色剂。
使用本实施例的布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂盒的检测原理为：如图4所示，在反应孔柱中预加入粒径分布在20~120微米之间的微球凝胶和抗人球蛋白AHG试剂，微球凝胶和抗人球蛋白抗体AHG的体积比为2.5~5.0 ：1，检测时，将待检血清与布鲁氏菌抗原悬浮液的混合物加入到反应孔柱中，布鲁氏菌抗原悬浮液是在检测前用PH为6.0-7.4的等渗PBS缓冲液作为稀释液稀释布鲁氏菌抗原得到，所述布鲁氏菌抗原悬浮液中布鲁氏菌抗原的质量/体积为0.2-0.5%；然后离心；当待检血清中不含有布氏菌抗体时，加入的布鲁氏菌病抗原悬浮液不会与AHG形成凝块，从而在离心后，粉红色布鲁氏菌抗原就会沉淀在微柱的底部，判断为阴性；当待检血清中含有布氏菌完全抗体时，加入的布鲁氏菌病抗原可以和待检血清中的布氏菌完全抗体形成凝块，离心后，粉红色的抗原抗体凝集物被阻隔在微柱的上部，判断为阳性；当待血清中含有不完全抗体时，血清中的不完全抗体首先和布氏菌抗原结合，然后通过AHG的桥联作用形成大的凝块，离心后，粉红色的抗原抗体凝集物被阻隔在微柱的上部，也判断为阳性。
具体使用方法：
初筛：
1）、取100μl稀释液加到稀释板上的适当孔或微管中， 加5μL受检血清充分混合，取50μL混合液丢弃，血清浓度约为5/100；
2）、加入50μl布鲁氏菌虎红抗原溶液并充分混合，此时血清浓度约为5/200，即效价为1/40；
3）、在凝胶卡上标记相应的受检血清标本序号，在相关孔中取50μl混合物，加入到凝胶卡的相应孔中；
4）、将布鲁氏菌凝胶卡置于离心机中，在一定转速下经过一定时间的离心，通常推荐3000转离心20分钟；
5）取出目测结果，红线在上面即为阳性，红线落到孔底即为阴性。
进一步检测：
初筛发现阳性的样品应用倍比稀释法（定量法）测定。
倍比稀释法（定量法）如下：
1）、每个患者在稀释平板上至少分离4个孔。
2）、在第一个孔中加入100μl稀释液，并在其他孔中加入50μl生理盐水；
3）、在第一个孔中加入5μl受检血清并混合，从第一孔取50μl，加入第二孔，用这种方法进行系列稀释，从最后一个孔取50μl并将其丢弃；
4）、向所有孔中加入50μl布鲁氏虎红抗原溶液；
5）、在凝胶卡上使用的孔上标记相关受检血清稀释效价数；
6）、通过在相关孔中取50μl混合物，加入到凝胶卡中的相应孔中；
7）、将凝胶卡置于离心机中，在3000转速中离心20分钟，取出目测结果。
在这个应用中，第一孔的效价是1/40，第二孔效价是1/80，第三孔效价是1/160，第四孔效价是1/320。
结果的判定：如果效价在1/160或者以上仍呈现为阳性（红线在上面）将被认为是布鲁氏菌抗体的阳性结果，如图5b；否则即为阴性，如图5a。
8）质控：每个试剂盒均应至少做一次质控，即分别用试剂盒内的阳性血清和阴性血清，按上述方法检测，结果应分别符合阳性和阴性。
综述，本发明的布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂盒具有重复性高、稳定性好、结果准确、试 剂 制 备 国 产化、 工艺简单、 成本低等优点, 具有较好的推广应用和开发价值,并有助于实现实验自动 化检测的目标，为布鲁斯抗体血清免疫学研究提供先进的新型检测技术手段。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂盒，包括盒体，其特征在于：所述盒体内设有内置有检测试剂卡的检测试剂卡盒、装有经染色剂的布鲁氏菌抗原的布鲁氏菌抗原试剂瓶、装有阳性质控试剂的阳性质控试剂瓶、装有阴性质控试剂的阴性质控试剂瓶、装有稀释液试剂的稀释液试剂瓶、倍比稀释板，倍比稀释板抽屉式插接在盒体下部，所述检测试剂卡内装有微球凝胶和抗人球蛋白抗体AHG。
2.根据权利要求1所述的布鲁氏菌抗体凝胶试剂监测盒，其特征在于：所述检测试剂卡包括一塑料卡片，该塑料卡片注塑有若干个反应孔柱，反应孔柱中加入有微球凝胶和抗人球蛋白抗体AHG，反应孔柱用铝箔密封。
3.根据权利要求1所述的布鲁氏菌抗体凝胶试剂监测盒，其特征在于：所述微球凝胶和抗人球蛋白抗体AHG的体积比为2.5~5.0：1。
4.根据权利要求1所述的布鲁氏菌抗体凝胶试剂监测盒，其特征在于：所述布鲁氏菌抗原悬浮液是在检测前用PH为6.0-7.4的等渗PBS缓冲液作为稀释液稀释布鲁氏菌抗原得到，所述布鲁氏菌抗原悬浮液中布鲁氏菌抗原的质量/体积为0.2-0.5%。
5.根据权利要求1所述的布鲁氏菌抗体凝胶试剂监测盒，其特征在于：所述微球凝胶的粒径分布在20~120微米之间。
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