CN115825436A - 布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂及布鲁氏菌抗体凝胶检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了医疗检测技术领域的一种布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂及布鲁氏菌抗体凝胶检测方法，该布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂包括微球凝胶、凝胶缓冲液、抗人球蛋白试剂及布鲁氏菌抗原试剂，凝胶缓冲液以PBS缓冲液为基底，PBS缓冲液中含有EDTA二钠、牛血清蛋白、PVP。该布鲁氏菌抗体凝胶检测方法包括在微球凝胶中加入凝胶缓冲液与抗人球蛋白试剂的混合物，进行离心后滴加待测血样和布鲁氏菌抗原试剂，进行离心后根据微球凝胶上部是否形成凝集物来判断检测结果。本发明的布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂具有高特异性、高灵敏度、抗干扰性强，检测方法操作便捷、快速准确。
Description
技术领域
本发明涉及布鲁氏菌检测技术领域，尤其涉及一种布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂及布鲁氏菌抗体凝胶检测方法。
背景技术
布鲁氏菌病(Brucellosis，简称布病)是由布鲁氏菌侵入机体，引起发热和流产为特征的人畜共患的传染性疾病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。布鲁氏菌主要侵害动物的生殖系统，引起流产和不孕不育，带来严重的经济损失。人们通过接触患病动物的血液、胎盘、胚胎或者子宫分泌物，或者人们食用带有布鲁氏菌病菌动物的制品而感染布鲁氏菌病后，往往难以治愈，严重者甚至丧失劳动和生育能力，从而造成严重的公共卫生问题。
目前诊断布鲁氏菌病的检测方法主要包括：虎红平板(RB)凝集法、标准凝集试管(SAT)法、间接抗人球法(Indirect Coombs)以及免疫捕捉凝集(Immunocapture-agglutination)法。这些诊断布鲁氏菌病的检测方法均为血清免疫学方法，需从待测血样中分离出红细胞。其中，虎红平板(RB)法和标准凝集试管(SAT)法只能检出完全抗体，检不出不完全抗体，假阴性机率高(敏感性低)；间接抗人球法可以检出不完全抗体，但是需要多次离心洗涤，检测时间长；免疫捕捉法所用试剂价格较贵，另外检测时间需要18到24小时，难以达到快速确诊的需求。
因此，针对上述布鲁氏菌病检测方法的不足，亟需开发一种高敏感性和特异性好、操作便捷快速的布鲁氏菌检测技术。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供的布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂具有特异性好、高灵敏度，提供的布鲁氏菌抗体凝胶检测方法操作便捷、快速准确，待测血样可以是血清、全血。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
本发明提供的布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂，包括：微球凝胶、凝胶缓冲液、抗人球蛋白试剂、布鲁氏菌抗原试剂，其特征在于：所述凝胶缓冲液以PBS缓冲液为基底，所述PBS缓冲液中加有EDTA二钠、牛血清蛋白、PVP。
优选的，所述微球凝胶为交联葡聚糖微球凝胶，所述交联葡聚糖微球凝胶的粒径范围为30～80微米。
优选的，所述PBS缓冲液含有磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠和氯化钾，其中，磷酸氢二钠的浓度范围是9～10.5mM，磷酸二氢钾的浓度范围是1.5～2.5mM，氯化钾的浓度范围是2～3mM，氯化钠的浓度范围是130～140mM，所述PBS缓冲液的PH值范围为：7.2～7.4。
优选的，所述PVP的分子量为8000～40000。
优选的，所述凝胶缓冲液是每100ml所述PBS缓冲液中加有0.5～1.5克牛血清蛋白、1.5～3克EDTA二钠，0.2～0.5g PVP，所述凝胶缓冲液的PH值为6.8～7.2。
优选的，所述凝胶缓冲液是每100ml所述PBS缓冲液中含有1～1.5克牛血清蛋白、2～3克EDTA二钠、0.2～0.4克PVP，所述凝胶缓冲液的PH值为7.0。
优选的，所述凝胶缓冲液与所述抗人球蛋白试剂的体积比为1：1～7：1。
优选的，所述布鲁氏菌抗原试剂是PBS缓冲液中加有虎红染色的布鲁氏菌抗原，所述虎红染色的布鲁氏菌抗原的浓度为1％～4％。
本发明提供的使用所述的布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂的布鲁氏菌抗体凝胶检测方法，包括：
S11：所述凝胶缓冲液中加入所述抗人球蛋白试剂制得混合物，所述凝胶缓冲液与所述抗人球蛋白试剂的体积比为1：1～7：1；
S21：所述微球凝胶中加入所述混合物制得凝胶基质，所述微球凝胶与所述混合物的体积比为8：3；
S31：在微柱凝胶卡的孔柱中加入30微升S21步骤的所述凝胶基质，将所述微柱凝胶卡进行离心；
S41：在S31步骤离心后的所述微柱凝胶卡的所述孔柱中滴加全血和所述布鲁氏菌抗原试剂；
S51：将S41步骤的所述微柱凝胶卡进行离心；
S61：判断结果：
当所述全血中的红细胞沉积在所述孔柱的底部，所述孔柱中的微球凝胶的上部形成凝集物时，判为阳性；
当所述全血中的红细胞沉积在所述孔柱的底部，所述孔柱中的微球凝胶的上部未形成凝集物时，判为阴性。
本发明提供的使用所述的布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂的布鲁氏菌抗体凝胶检测方法，包括：
S12：所述凝胶缓冲液中加入所述抗人球蛋白试剂制得混合物，所述凝胶缓冲液与所述抗人球蛋白试剂的体积比为1：1～7：1；
S22：所述微球凝胶中加入所述混合物制得凝胶基质，所述微球凝胶与所述混合物的体积比为8：3；
S32：在微柱凝胶卡的孔柱中加入30微升S22步骤的所述凝胶基质，将所述微柱凝胶卡进行离心；
S42：在S32步骤离心后的所述微柱凝胶卡的所述孔柱中滴加待测血样和所述布鲁氏菌抗原试剂；
S52：将S42步骤的所述微柱凝胶卡进行离心；
S62：判断结果：
当所述孔柱中的微球凝胶的上部形成凝集物时，判为阳性；
当所述孔柱中的微球凝胶的上部未形成凝集物时，判为阴性。
本发明的有益效果是：
本发明的布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂具有特异性好、高灵敏度，抗干扰性强，使用该检测试剂的布鲁氏菌抗体凝胶检测方法操作便捷、快速准确，不仅可使用血清作为待测样本，还可使用全血作为待测样本。使用全血作为待测样本时，完全避免红细胞和纤维蛋白原的影响，检测结果容易判断，抑制“双向”，保证布鲁氏菌的抗原与抗体有足够的凝集强度。本发明对操作人员的技能要求不高，检测程序简单，成本低廉。
附图说明
图1是本发明使用全血进行布鲁氏菌抗体检测的流程示意图。
图2是本发明使用全血进行布鲁氏菌抗体检测的原理图。
图3是本发明使用全血进行布鲁氏菌抗体检测的判断结果图。
图4是本发明使用血清进行布鲁氏菌抗体检测的流程示意图。
图5是本发明使用血清进行布鲁氏菌抗体检测的原理图。
图6是本发明使用血清进行布鲁氏菌抗体检测的判断结果图。
具体实施方式
为了本领域的技术人员能更好地理解本发明所提供的技术方案，下面结合具体实施例进一步对本发明进行详细描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明的布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂包括微球凝胶、凝胶缓冲液、抗人球蛋白试剂及布鲁氏菌抗原试剂。
微球凝胶在布鲁氏菌检测中起着分子筛作用，微球凝胶之间的空隙既可以让红细胞与未凝集的布鲁氏菌抗原通过，又可以阻挡布鲁氏菌抗原与抗体的凝集物通过。如果微球凝胶的直径范围和平均直径过小，则红细胞和未凝集的布鲁氏菌抗原就很难通过凝胶间隙而堆积在凝胶上部，造成假阳性的结果；如果直径范围和平均直径过大，就会导致布鲁氏菌抗体与布鲁氏菌抗原的凝集物的凝集强度下降而很难在凝胶上部形成凝集物而造成假阴性的结果。交联葡聚糖微球凝胶的粒径范围为30～80微米，平均粒径为(50+5)微米，所以微球凝胶选取合适粒径范围的交联葡聚糖微球凝胶进行检测，从而可有效避免误判。
制备PBS缓冲液时，将磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠和氯化钾混合配置，可以将这些化合物的粉末进行混合后溶解，也可以将这些化合物的溶液进行混合，均需满足PBS缓冲液中应含有磷酸氢二钠的浓度范围是9～10.5mM，磷酸二氢钾的浓度范围是1.5～2.5mM，氯化钾的浓度范围是2～3mM，氯化钠的浓度范围是130～140mM，配置的PBS缓冲液的PH值范围为：7.2～7.4。
制备凝胶缓冲液时，以PBS缓冲液为基底，向PBS缓冲液内加入EDTA二钠、牛血清蛋白、PVP等。配置凝胶缓冲液时，需满足每100ml的PBS缓冲液中含有0.5～1.5克牛血清蛋白、1.5～3克EDTA二钠，0.2～0.5g PVP，配置的凝胶缓冲液的PH值为6.8～7.2。为了尽量满足凝胶缓冲液的PH值为7.0，需每100ml PBS缓冲液中含有1～1.5克牛血清蛋白、2～3克EDTA二钠、0.2～0.4克PVP。EDTA二钠作为抗凝剂可以有效阻止纤维蛋白原转化成纤维蛋白，进而可有效阻止血样中红细胞的凝固。另外，牛血清蛋白可提高微球凝胶的润滑性，使未凝集的红细胞和布鲁氏抗原可穿过微球凝胶之间的间隙，可顺利沉积到微球凝胶的下部，从而避免假阳性。为了进一步提高微球凝胶的润滑性，可向PBS缓冲液内加入牛血清蛋白，还可适量加入PVP。PVP分子量的选择范围为8000～40000，实验中可选择PVP分子量的范围为8000～24000。在离心力作用下，PVP更易使没有凝集的红细胞和布鲁氏菌抗原顺利通过微球凝胶之间的间隙从而沉淀在微球凝胶的下部，避免假阳性和双向；PVP还可适当提高凝胶缓冲液的粘度，从而加强布鲁氏菌抗原与抗体的凝集强度。
准备抗人球蛋白试剂时，选取mill ipore公司生产的抗人球蛋白试剂溶液，按照凝胶缓冲液与抗人球蛋白试剂的溶液体积比范围为1：1～7：1来配置即可。检测时，将定量的抗人球蛋白试剂的溶液加入凝胶缓冲液中混合，也可事先配置好备用。
制备布鲁氏菌抗原试剂时，使用虎红染料将布鲁氏菌抗原染色，向PBS缓冲液中加入有虎红染色的布鲁氏菌抗原，虎红染色的布鲁氏菌抗原的浓度为1％～4％。为了显色明显，虎红染色的布鲁氏菌抗原的浓度可为2％～4％。可以用虎红染料对布鲁氏菌抗原进行染色，也可以使用其他染色剂进行染色。
制备的微球凝胶、凝胶缓冲液、抗人球蛋白试剂及布鲁氏菌抗原试剂，可以单独封装在试剂瓶中，也可以将微球凝胶与凝胶缓冲液配置好封装在试管或灌入微柱凝胶卡的若干个孔柱中，将孔柱开口用铝箔密封。
本发明使用上述布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂进行布鲁氏菌的检测方法，待测血样为全血或血清，可在试管、微柱凝胶卡及其他实验容器中进行检测。使用微柱凝胶卡进行检测时，可将微球凝胶、凝胶缓冲液与抗人球蛋白试剂一起混合，混合充分后加入微柱凝胶卡的孔柱中；也可以先将微球凝胶装入微柱凝胶卡的孔柱中，再按照要求注入一定量的凝胶缓冲液使混合充分，然后按照体积比加入抗人球蛋白试剂，通过离心使混合充分；向离心后的孔柱中加入待测血样和布鲁氏菌抗原试剂，再将微柱凝胶卡进行离心，通过观察微柱凝胶卡孔柱中的微球凝胶上部是否形成凝集物进行检测结果判断。
本发明的具体实施例是使用上述布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂，在微柱凝胶卡的孔柱中进行布鲁氏菌病的检测。具体检测方法如下：
实施例1：
如图1所示，是使用全血进行布鲁氏菌抗体检测的流程示意图。在使用微柱凝胶卡进行检测时，将微球凝胶、凝胶缓冲液与抗人球蛋白试剂加入凝胶卡的孔柱进行混合后，再加入全血与布鲁氏菌抗原试剂进行检测，具体步骤包括：
S11：凝胶缓冲液中加入抗人球蛋白试剂制得混合物，凝胶缓冲液与抗人球蛋白试剂的体积比为1：1～7：1；
S21：微球凝胶中加入S11步骤的混合物制得凝胶基质，微球凝胶与混合物的体积比为8：3；
S31：在微柱凝胶卡的孔柱中加入30微升S21步骤的凝胶基质，将微柱凝胶卡放入离心机进行离心；
S41：在S31步骤离心后的微柱凝胶卡的对应的上述孔柱中加入1～3滴全血和1～3滴布鲁氏菌抗原试剂；为避免过多的红细胞影响检测结果，可在上述孔柱中加入1滴全血；为节省材料，可加入1滴布鲁氏菌抗原试剂；
S51：将S41步骤的微柱凝胶卡放入卡式离心机进行离心，离心条件为800g*20min；
S61：判断结果：
当全血中的红细胞沉积在孔柱的底部，孔柱中的微球凝胶的上部形成红色凝集物时，判为阳性；
当全血中的红细胞沉积在孔柱的底部，孔柱中的微球凝胶的上部未形成红色凝集物时，判为阴性。
当全血中的红细胞穿过微球凝胶的间隙而沉积在孔柱中的微球凝胶的下部，也就是说红细胞沉积在孔柱的底部时，说明加入的血样为全血或抗凝全血。
步骤S61的判断结果，具体如图2所示的的检测原理。主要是通过观察微柱凝胶卡中的红细胞沉积在孔柱的底部，孔柱中的微球凝胶的上部是否形成凝集物来判断检测结果。向有凝胶基质的微柱凝胶卡的孔柱中加入全血或抗凝全血，当待检血样中有布鲁氏菌完全抗体时，加入的布鲁氏菌抗原和布鲁氏菌完全抗体结合后在孔柱中的微球凝胶的上部形成凝集物。因凝集物会被微球凝胶阻挡在其上部，在离心力的作用下，红细胞和/或多余的未凝集的布鲁氏菌抗原则通过微球凝胶之间的空隙而沉积在微球凝胶的下部或沉积在孔柱的底部，则将检测结果判为阳性，如图2的(a)所示。当待检血样中含有布鲁氏菌不完全抗体时，加入的布鲁氏菌抗原与布鲁氏菌不完全抗体结合后形成较小的凝集物，进一步通过抗人球蛋白试剂的桥联作用在孔柱中的微球凝胶的上部形成大的凝集物。因凝集物会被微球凝胶阻挡在其上部，在离心力的作用下，红细胞和/或多余的未凝集的布鲁氏菌抗原则通过微球凝胶之间的空隙而沉积在微球凝胶的下部或沉积在孔柱的底部，则检测结果判为阳性，如图2的(b)所示。当待检血样中无布鲁氏菌抗体时，加入的布鲁氏菌抗原无法独自凝集，在离心力作用下，红细胞和/或布鲁氏菌抗原则会通过微球凝胶之间的空隙而沉积在微球凝胶的下部或沉积在孔柱的底部，孔柱中的微球凝胶的上部则不会形成凝集物，则检测结果判为阴性，如图2的(c)所示。
当向有微球凝胶的孔柱中加入全血或抗凝全血时，由于布鲁氏菌抗原已被虎红染色，通过肉眼观测布鲁氏菌抗原与抗体在孔柱中的微球凝胶的上部形成有红色凝集物，红细胞和/或未凝集的布鲁氏菌抗原经离心会沉积在孔柱中的微球凝胶的下部或沉积在孔柱的底部从而孔柱底部出现红色，则孔柱的底部出现红色以及在孔柱中的微球凝胶的上部形成红色凝集物时，判为阳性；当红细胞和/或未凝集的布鲁氏菌抗原沉积在孔柱中的微球凝胶的下部或沉积在孔柱的底部，则孔柱底部出现红色以及在孔柱中的微球凝胶的上部未形成红色凝集物时，判为阴性。
如图3所示，是针对使用全血进行布鲁氏菌抗体检测的结果判读的进一步验证。为了进一步验证上述判断结果的准确性，从而避免假阳性和假阴性。具体是在步骤S51将微柱凝胶卡离心后，在步骤S61观察凝胶卡的孔柱1中的是否出现凝集物。离心后红细胞4全部沉积在孔柱1的底部，当布鲁氏菌抗原与布鲁氏菌抗体完全结合形成的红色凝集物2形成在微球凝胶3的顶部，则凝集强度判为“4+”；当凝集物2主要集中在微球凝胶3的顶部，但有少量的凝集物从微球凝胶3的顶部落下，则凝集强度判为“3+”。因此，在出现凝集强度为“4+”、“3+”时，检测结果便可以判阳性，如图3中的(a)所示。当小凝集物散落在孔柱1中并分散在整个微球凝胶3中，则凝集强度判断为“2+”；当小凝集物分散在孔柱1中并散落在微球凝胶3的下半部分，则凝集强度判为“1+”；当少量的小凝集物或未凝集的布鲁氏菌抗原5与红细胞4通过微球凝胶3的下部而沉积在孔柱的底部，则凝集强度判断为“-”。因此，在出现凝集强度为“2+”、“1+”、“-”，检测结果便可以判阴性。如果阴性或者弱凝集时，微球凝胶3的顶部有淡淡的一条凝集带6，则判为“双向”。个别“双向”时，也会有极少量的小凝集物或未凝集的布鲁氏菌抗原5与红细胞4通过微球凝胶3而沉积在孔柱的底部。在出现“双向”时，可通过加入适量的PVP后观察凝集带6消失，可进一步根据是否有凝集物进行判断。在出现阴性、双向时，如图3中的(b)所示。
实施例2：
图4所示，是使用血清进行布鲁氏菌抗体检测的流程示意图。在使用微柱凝胶卡进行检测时，将微球凝胶、凝胶缓冲液与抗人球蛋白试剂加入凝胶卡的孔柱进行混合后，再加入血清与布鲁氏菌抗原试剂进行检测，具体步骤包括：
S12：凝胶缓冲液中加入抗人球蛋白试剂制得混合物，凝胶缓冲液与抗人球蛋白试剂的体积比为1：1～7：1；
S22：微球凝胶中加入上述混合物制得凝胶基质，微球凝胶与混合物的体积比为8：3；
S32：在微柱凝胶卡的孔柱中加入30微升S22步骤的凝胶基质，将微柱凝胶卡进行离心；
S42：在S32步骤离心后的微柱凝胶卡的孔柱中滴加1～3滴血清和1～3滴布鲁氏菌抗原试剂；通常滴加1滴血清和1滴布鲁氏菌抗原试剂，便于观察即可；
S52：将S42步骤的微柱凝胶卡放入卡式离心机进行离心，离心条件为800g*20min；
S62：判断结果：
当孔柱中的微球凝胶的上部形成红色凝集物时，判为阳性；
当孔柱中的微球凝胶的上部未形成红色凝集物时，判为阴性。
步骤S62的判断结果，具体如图5所示的检测原理。主要是观察微柱凝胶卡孔柱中的微球凝胶的上部是否形成凝集物来判断检测结果。当待检血清中含有布鲁氏菌完全抗体时，加入的布鲁氏菌抗原和布鲁氏菌完全抗体结合形成凝集物，如图5的(a)所示；当待检血清中含有布鲁氏菌不完全抗体时，加入的布鲁氏菌抗原先与布鲁氏菌不完全抗体结合形成较小的凝集物，然后通过抗人球蛋白试剂的桥联作用形成大的凝集物，如图5的(b)所示。由于布鲁氏菌抗原已被虎红染色，很容易通过肉眼观测到孔柱中微球凝胶上部是否形成红色凝集物进行结果判断。当孔柱中的微球凝胶上部形成红色凝集物时，判为阳性，如图5的(a)、(b)所示；当孔柱中的微球凝胶上部未形成红色凝集物时，判为阴性,如图5的(c)所示。
加入的待检血样为血清时，当血清中有抗体时，微球凝胶上部形成凝集物，则检测结果判为阳性；当加入的血清中无任何抗体时，微球凝胶上部不会形成凝集物，则检测结果判为阴性。
如图6所示，是针对使用血清进行布鲁氏菌抗体检测的结果判读的进一步验证。为了进一步验证上述判断结果的准确性，从而避免假阳性和假阴性。具体是在步骤S52将微柱凝胶卡离心后，在步骤S62观察凝胶卡的孔柱1中的凝集物。当布鲁氏菌抗原和布鲁氏菌抗体完全结合的凝集物2形成在微球凝胶3的顶部，凝集强度判为“4+”；当凝集物2主要集中在微球凝胶3的顶部，有一点点凝集物从微球凝胶3的顶部落下，凝集强度判为“3+”。因此，在出现凝集强度为“4+”、“3+”时，检测结果便可以判阳性，如图6的(a)所示。当凝集物分散在孔柱1中并散落在整个微球凝胶3中，凝集强度判断为“2+”；当凝集物散落并主要集中在微球凝胶3的下半部分，凝集强度判为“1+”；当有少量凝集物或未凝集的布鲁氏菌抗原5会下沉在微球凝胶3的底部，凝集强度判断为“-”。因此，在出现凝集强度为“2+”、“1+”、“-”，检测结果便可以判阴性。如果阴性或者弱凝集时，微球凝胶3的顶部有淡淡的一条凝集带6，便判为“双向”。个别“双向”时，也会有极少量的小凝集物或未凝集的布鲁氏菌抗原5通过微球凝胶3而沉积在孔柱的底部。另外，在出现双向时，可根据加入适量的PVP而消失凝集带6，可进一步根据是否有凝集物进行判断。在出现凝阴性、双向时，如图6的(b)所示。
因此，无论待测血样是血清、全血或抗凝全血，主要通过观察孔柱中的微球凝胶上部是否明显出现红色凝集物，则可快速判断检测结果是否为阳性。
为进一步验证上述检测方法的判断结果，进行如下几组对比实验：
对比实验(一)
凝胶缓冲液的配方：100ml PBS缓冲液中，加入0.5g牛血清蛋白、2克EDTA二钠，未加入PVP,缓冲液PH值为7.0。
布鲁氏菌抗原浓度为2％，具体检测方法如实施例1的步骤：
S11：凝胶缓冲液中加入抗人球蛋白试剂制得混合物，凝胶缓冲液与抗人球蛋白试剂的体积比为1：1
S21：微球凝胶中加入上述混合物制得凝胶基质，微球凝胶与混合物的体积比为8：3；
S31：在微柱凝胶卡的孔柱中加入30微升S21步骤的凝胶基质，将微柱凝胶卡进行离心；
S41：取2.5微升阴性质控抗凝全血加入到50微升PBS缓冲液中并混匀。
S51：在S31步骤离心后的微柱凝胶卡的孔柱中加入25微升S41稀释的阴性质控抗凝全血和25微升布鲁氏菌抗原悬浮液；
S61：将S51步骤的微柱凝胶卡放入卡式离心机进行离心，离心条件为800g*20min；
离心后发现有双向产生，很容易造成假阳性误判。
对比实施(二)
凝胶缓冲液的配方：100ml PBS缓冲液中，加入0.5g牛血清蛋白、0.2克PVP，分子量10000，2克EDTA二钠，缓冲液PH值为7.0。
布鲁氏菌抗原浓度为2％，其它步骤如对比实验(一)，离心后红细胞和布鲁氏菌抗原均沉淀在孔柱的底部，结果清晰可判。
对比实验(三)：
向100ml PBS缓冲液中加入1克牛血清蛋白，2克乙二胺四乙酸二钠，0.2克PVP，PVP分子量为10000来制备凝胶缓冲液，凝胶缓冲液的PH值为7.0。
配置虎红染色的布鲁氏菌抗原悬浮液，虎红染色的布鲁氏菌抗原的浓度为2％。
准备抗人球蛋白试剂时，按照凝胶缓冲液与抗人球蛋白试剂的体积比为1：1～7：1来配置。为了验证抗人球蛋白试剂和凝胶缓冲液的体积比对实验结果的影响，设计如下实验：
针对每一个体积比例，准备8支试管和对应的8孔微柱凝胶卡。第一支试管加入100微升PBS缓冲液，第二到第八支试管分别加入50微升PBS缓冲液。第一到第七支试管用于阳性抗凝全血的稀释，第八支用于阴性抗凝全血的稀释。第一支试管加入5微升阳性抗凝全血，并与PBS缓冲液混匀，然后移出50微升到第二支试管，并在第二支试管中混匀，以此类推。第八支试管加入2.5微升阴性抗凝全血，然后混匀。使用移液枪，每支试管中移出25微升混合液，加入到微柱凝胶卡中相应的孔柱内，加完后使用移液枪往每个孔柱加入25微升布鲁氏菌抗原悬浮液。最后把微柱凝胶卡放入卡式离心机中离心，离心条件为：800g*20min。第一孔的全血的效价为1/40，第二到第七孔为倍比稀释的全血效价。
结果判读：离心后，红细胞全部沉积在孔柱的底部。当凝集物完全在微球凝胶的顶部，凝集强度判为4+；当凝集物主要集中在微球凝胶的顶部，有一点凝集物从凝胶顶部落下，凝集强度判为3+；当凝集物分散在孔柱中的整个微球凝胶中，凝集强度判断为2+；当凝集物主要集中在微球凝胶的下半部分，凝集强度判为1+；当凝集物完全沉在微球凝胶柱的底部，凝集强度判断为阴性。如果阴性或者弱凝集时，凝胶顶部有淡淡的一条凝集带，便判为双向。凝集强度为4+和3+时，便可以判阳性。
准备抗人球蛋白试剂时，为了验证按照凝胶缓冲液与抗人球蛋白试剂的体积比为1：1～7：1来配置，进行一下几组实验：
(1)、当全是抗人球蛋白试剂，实验检测结果如下：
| 第一孔 | 第二孔 | 第三孔 | 第四孔 | 第五孔 | 第六孔 | 第七孔 | 第八孔 |
| 1/40 | 1/80 | 1/160 | 1/320 | 1/640 | 1/1280 | 1/2560 | - |
| 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 3+ | 2+ | +(双向) | (双向) |
如上表所示，当全是抗人球蛋白试剂，效价1/320为4+，然后凝集强度减弱，但是效价为1/2560和阴性时，会出现双向，这样容易造成假阳性误诊。
(2)、当抗人球蛋白试剂：凝胶缓冲液体积比为1：1时，实验检测结果如下：
| 第一孔 | 第二孔 | 第三孔 | 第四孔 | 第五孔 | 第六孔 | 第七孔 | 第八孔 |
| 1/40 | 1/80 | 1/160 | 1/320 | 1/640 | 1/1280 | 1/2560 | - |
| 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 3+ | 2+ | + | - |
如上表所示，当抗人球蛋白试剂：凝胶缓冲液体积比为1：1时，相比全是抗人球蛋白试剂，凝集强度没有本质上的减弱，但是在1/2560和阴性时，没有双向产生。主要是凝胶缓冲液中的EDTA二钠，可以有效的抑制抗凝全血中的纤维蛋白原转化成纤维蛋白，阻住红细胞产生微小的凝集物；同时牛血清蛋白和PVP，可以使微球凝胶表面更光滑，更有利于没有凝集的红细胞和虎红抗原沉积到底部，抑制双向的产生。
(3)、当抗人球蛋白试剂：凝胶缓冲液体积比为1：3时，实验检测结果如下：
| 第一孔 | 第二孔 | 第三孔 | 第四孔 | 第五孔 | 第六孔 | 第七孔 | 第八孔 |
| 1/40 | 1/80 | 1/160 | 1/320 | 1/640 | 1/1280 | 1/2560 | - |
| 4+ | 4+ | 4+ | 3+ | 3+ | 2+ | + | - |
如上表所示，当抗人球蛋白试剂：凝胶缓冲液体积比为1：3时，凝集强度有所下降，在1/320时凝集强度为3+。主要是因为当血浆中的不完全抗体和布鲁氏菌抗原结合成小的凝集产物，抗人球蛋白试剂通过桥联作用，使这些小的凝集产物形成大的凝集产物。如果没有足够的抗人球蛋白试剂，这些小的凝集产物就容易在离心的过程中掉下来，使凝集强度有所减弱。
(4)、当抗人球蛋白试剂：凝胶缓冲液体积比为1：7时，实验检测结果如下：
| 第一孔 | 第二孔 | 第三孔 | 第四孔 | 第五孔 | 第六孔 | 第七孔 | 第八孔 |
| 1/40 | 1/80 | 1/160 | 1/320 | 1/640 | 1/1280 | 1/2560 | - |
| 4+ | 4+ | 3+ | 3+ | 3+ | 2+ | + | - |
当抗人球蛋白试剂：凝胶缓冲液的体积比为1：7时，凝集强度进一步下降。在1/160时，效价为3+，主要是因为抗人球蛋白试剂过少，不完全抗体检测的能力进一步下降所致。
因此，通过上述实验正式选取凝胶缓冲液与抗人球蛋白试剂的体积比为1：1～7：1。
对比实验(四):
使用对比实验(三)中的抗人球蛋白试剂：凝胶缓冲液的体积比为1:7一样的实验条件，除了凝胶缓冲液配方不一样。100ml PBS缓冲液中加入1克牛血清蛋白，2克乙二胺四乙酸二钠和0.4克PVP，PVP分子量为10000来制备凝胶缓冲液，胶缓冲液的PH值为7.0。其实验检测结果如下：
| 第一孔 | 第二孔 | 第三孔 | 第四孔 | 第五孔 | 第六孔 | 第七孔 | 第八孔 |
| 1/40 | 1/80 | 1/160 | 1/320 | 1/640 | 1/1280 | 1/2560 | - |
| 4+ | 4+ | 4+ | 3+ | 3+ | 2+ | + | - |
如上表所示，凝胶缓冲液中增加PVP的量，第三孔凝集强度从原来的3+增加到4+。
综上所述，既要保持阳性的高效价，又要抑制双向的产生，抗人球蛋白试剂和凝胶缓冲液的体积比为1：1。这样会有足够的抗人球蛋白试剂用以桥联不完抗体和布鲁氏菌抗原的凝集产物，同时缓冲液中的EDTA二钠、牛血清蛋白及PVP可以有效的抑制双向的产生。
另外，由于文献Evaluation of a New and Rapid Serologic Test forDetecting Brucellosis:Brucella Coombs Gel Test，当血清效价为1/160以上且凝集强度为3+以上，便判为阳性。为了简化检验步骤，设计如下实验：
用EDTA管抽取待测病患的全血，然后颠倒EDTA管，使EDTA和全血混匀。一支试管中加入2毫升PBS缓冲液，然后使用滴管吸取抗凝全血，加一滴抗凝全血到试管中，并混匀。使用滴管往微柱凝胶卡中对应的孔中加一滴经PBS稀释的抗凝全血，然后再使用滴管加一滴布鲁氏菌抗原悬浮液到对应的孔中，最后离心。滴管一滴的体积为30微升左右，这样操作，全血的效价大约为1/140，接近文献的1/160。
使用抗人球蛋白试剂：凝胶缓冲液的体积比为1：1的配方来验证该微柱凝胶卡在实际操作中的效果，其中凝胶缓冲液为100ml PBS缓冲液中加入1克牛血清蛋白，2克乙二胺四乙酸二钠，0.2克PVP，PVP分子量为10000来制备凝胶缓冲液，凝胶缓冲液的PH值为7.0。配置虎红染色的布鲁氏菌抗原悬浮液，虎红染色的布鲁氏菌抗原的浓度为2％，待测病患为16人，在二张微柱凝胶卡的共16个孔柱中，使用滴管向每个孔柱中滴加PBS稀释抗凝全血。实验检测结果如下：
如上表所示，阳性的凝集强度均为4+，阴性均无双向产生，证明该方法简单有效。后面使用虎红平板凝集法进行复查验证，16个病患中，有7个是阳性，9个是阴性，通过医院的跟踪询问，其中与本方法检测结果不一致的阳性4号病患有过感染史。
相比有关血清学检测方法的文献记载，本发明的血样使用全血时，省去了抽血后离心这一步骤，以及在加入微球凝胶卡中之前，省去了布鲁氏菌抗原悬浮液和待测样本的混匀，同时可以完全避免红细胞和血浆中纤维蛋白原的影响。该方法有望在牧区中广泛推广，牧民只要使用EDTA管抽取待测病患的全血，所使用的耗材为滴管。相比移液枪要有专业人士操作，滴管是大众性耗材，并不需要花大量时间来教导牧民怎么使用该卡，节省了大量的人力和物力。
本发明的布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂具有高特异性、高灵敏度，抗干扰性强，使用该检测试剂的布鲁氏菌抗体凝胶检测方法操作便捷、快速准确。不仅可使用血清作为待测样本，还可使用全血作为待测样本。使用全血为待测样本时，完全避免红细胞和纤维蛋白原的影响，检测结果容易判断，检测方法抑制“双向”，保证布鲁氏菌的抗原与抗体有足够的凝集强度。本发明可使用滴管耗材取样和加样，对操作人员的技能要求不高，可以在医院以外的任何场地进行检测，检测程序简单，成本低廉。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂，包括微球凝胶、凝胶缓冲液、抗人球蛋白试剂、布鲁氏菌抗原试剂，其特征在于：所述凝胶缓冲液以PBS缓冲液为基底，所述PBS缓冲液中加有EDTA二钠、牛血清蛋白、PVP。
2.根据权利要求1所述的布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂，其特征在于：所述微球凝胶为交联葡聚糖微球凝胶，所述交联葡聚糖微球凝胶的粒径范围为30～80微米。
3.根据权利要求1所述的布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂，其特征在于：所述PBS缓冲液含有磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠和氯化钾，其中，磷酸氢二钠的浓度范围是9～10.5mM，磷酸二氢钾的浓度范围是1.5～2.5mM，氯化钾的浓度范围是2～3mM，氯化钠的浓度范围是130～140mM，所述PBS缓冲液的PH值范围为：7.2～7.4。
4.根据权利要求1所述的布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂，其特征在于：所述PVP的分子量为8000～40000。
5.根据权利要求1所述的布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂，其特征在于：所述凝胶缓冲液是每100ml所述PBS缓冲液中加有0.5～1.5克牛血清蛋白、1.5～3克EDTA二钠，0.2～0.5gPVP，所述凝胶缓冲液的PH值为6.8～7.2。
6.根据权利要求5所述的布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂，其特征在于：所述凝胶缓冲液是每100ml所述PBS缓冲液中含有1～1.5克牛血清蛋白、2～3克EDTA二钠、0.2～0.4克PVP，所述凝胶缓冲液的PH值为7.0。
7.根据权利要求1所述的布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂，其特征在于：所述凝胶缓冲液与所述抗人球蛋白试剂的体积比为1：1～7：1。
8.根据权利要求1所述的布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂，其特征在于：所述布鲁氏菌抗原试剂是PBS缓冲液中加有虎红染色的布鲁氏菌抗原，所述虎红染色的布鲁氏菌抗原的浓度为1％～4％。
9.使用权利要求1-8任一项所述的布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂的布鲁氏菌抗体凝胶检测方法，包括：
S11：所述凝胶缓冲液中加入所述抗人球蛋白试剂制得混合物，所述凝胶缓冲液与所述抗人球蛋白试剂的体积比为1：1～7：1；
S21：所述微球凝胶中加入所述混合物制得凝胶基质，所述微球凝胶与所述混合物的体积比为8：3；
S31：在微柱凝胶卡的孔柱中加入30微升S21步骤的所述凝胶基质，将所述微柱凝胶卡进行离心；
S41：在S31步骤离心后的所述微柱凝胶卡的所述孔柱中滴加全血和所述布鲁氏菌抗原试剂；
S51：将S41步骤的所述微柱凝胶卡进行离心；
S61：判断结果：
当所述全血中的红细胞沉积在所述孔柱的底部，所述孔柱中的微球凝胶的上部形成凝集物时，判为阳性；
当所述全血中的红细胞沉积在所述孔柱的底部，所述孔柱中的微球凝胶的上部未形成凝集物时，判为阴性。
10.使用权利要求1-8任一项所述的布鲁氏菌抗体凝胶检测试剂的布鲁氏菌抗体凝胶检测方法，包括：
S12：所述凝胶缓冲液中加入所述抗人球蛋白试剂制得混合物，所述凝胶缓冲液与所述抗人球蛋白试剂的体积比为1：1～7：1；
S22：所述微球凝胶中加入所述混合物制得凝胶基质，所述微球凝胶与所述混合物的体积比为8：3；
S32：在微柱凝胶卡的孔柱中加入30微升S22步骤的所述凝胶基质，将所述微柱凝胶卡进行离心；
S42：在S32步骤离心后的所述微柱凝胶卡的所述孔柱中滴加待测血样和所述布鲁氏菌抗原试剂；
S52：将S42步骤的所述微柱凝胶卡进行离心；
S62：判断结果：
当所述孔柱中的微球凝胶的上部形成凝集物时，判为阳性；
当所述孔柱中的微球凝胶的上部未形成凝集物时，判为阴性。
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Cited By (2)
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