JPH06507475A

JPH06507475A - 希釈緩衝液およびその使用法

Info

Publication number: JPH06507475A
Application number: JP4500964A
Authority: JP
Inventors: マケラ、ロナルド・エム
Original assignee: アボット・ラボラトリーズ
Priority date: 1990-11-09
Filing date: 1991-11-08
Publication date: 1994-08-25
Also published as: EP0556294A1; EP0556294A4; WO1992008971A1; US5185264A; KR930702678A; AU9023991A; CA2095824A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】希釈緩衝液およびその使用法発明の背景この発明は、一般に、通常「緩衝液」として知られる生物科学における希釈液として有用な溶液に関する。そのような溶液は酸および塩基の両方を中和することができ、それにより該溶液の元々の酸性度または塩基性度を維持する。さらに詳しくは、本発明は、抗体や抗原などの免疫血液学的、免疫学的および免疫化学的アッセイ成分の希釈に有用な改良された緩衝液に関する。

血液の免疫血液学的分析は、血液ドナーの候補者の赤血球が受領者の赤血球と適合するかどうかを決定するために、ドナーおよび受領者の赤血球で日常的に行われている。これら研究所で行われている標準的な分析法はＡＢＯ−Ｒｈ血液型判定であり、赤血球の分析またはいわゆる「適合（■ａｔｃｈ）Ｊを完成させるためにしばしば必要とされるケルやダッフィーなどの他の血液型の決定も行われる。ＡＢＯ血液型は抗原ＡおよびＢからなり、試験試料と抗Ａ１抗Ｂおよび抗Ａ、Ｂ抗血清との凝集反応に基づいて血液型Ａ、ＢＸＡＢおよびＯが決定される。Ｒｈ。

またはリーサス（Ｒｈｅｓｕｓ）血液型は、抗原Ｃ，Ｄ、Ｅ、ｃおよびｅを含む幾つかの抗原からなる。抗Ｄ（抗Ｒｈ、）と反応しない試験試料は、予備的にｒＲｈ陰性」として分類される。これらＲｈ陰性と推定される試験試料は手動の抗グロブリン試験で再試験され、該試験において「陰性」結果を確認するために高めたインキュベーション温度、洗浄、および第二の抗体の使用が必要とされる。

手動または自動を問わず、Ｄ抗原の検出に関して上記手動の抗グロブリン試験と同じかまたは一層高い感度を示す直接凝集法は示されていない。確認試験を行う必要を除くため、抗り試薬の感度を改良するための幾つかの試みがなされている。血液型判定試薬製造業者は、管中で行われる試験の凝集の質を高めるため、その試薬に種々の成分を加えることを行ってきた。それゆえ、たとえば、試験試料と抗り抗血清との凝集の決定の感度を改良する目的で、モノクローナルＩｇＭ抗り抗体を含有させることによりヒト血漿ＩｇＧ源を補給している。たとえば、プロダクト・インサート、オーツ・ダイアグノスティックス・システムズ、ブラッド・グルーピング・シーラム・アンタイ−Ｄ（Ａｎｔｉ−Ｒｈ、）（Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｉ　ｎ５ｅｒｔ。

０ｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｌｏｏｄ　Ｇｒｏｕｐｉｎｇ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｎｔｉ−ＤＸポリクローナルおよびモノクローナルの混合）を参照。しかしながら、凝集を改良するためにこの試薬を使用しても、抗り抗血清除性決定に必要な確認試験法の使用を排除できないし、また該決定に使用する抗体の希釈を排除することもできない。

マイクロタイター法を利用する免疫血液学的分析のための従来法では、手動および自動ともに、特異的で高感度の免疫血液学的血液型分析を行うためには希釈していないまたは低希釈の抗体成分を用いる必要がある。血液型判定試薬のための市販された希釈緩衝液は知られていない。マイクロプレートに直接加えて感度を高める製品を利用することができるが、これら製品は洗浄工程および第二の抗体と関連して加えられるのみである。たとえば、プロダクト・インサート、ガンマ・バイオロジカルズ、マイクロ−Ｕ・エンハンスメント・リージェント（ロウ・アイオニツク）・フォア・アンタイボディー・ディテクション・テスラ・イン・マイクロプレート（Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｉｎ５ｅｒｔ、Ｇａｍｍａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、　Ｍｉｃｒｏ−ＵＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　Ｒｅａｇｅｎｔ　（Ｌｏｗ　Ｉ　ｏｎｉｃ）　ｆｏｒ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｔｅ５ｔｓ　ｉ■ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ）、２月（１９８６）を参照。それゆえ、使用者は試験を行うのに必要な試薬を希釈することができないので、これら方法は使用者の費用をそれほど節約するものではない。

他の血液型試薬製造業者は、凝集反応を高めるために試薬中に高分子量の添加剤、高タンパク質および界面活性剤を導入した。しかしながら、これら試薬をマイクロプレート法に適用するにも、等張ＮａＣ］またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中の希釈していないまたは非常に低希釈の抗体試薬が必要である。たとえば、プロダクト・インサート、オー゛ハダイアグノスティックス・システムズ、ブラッド・グルーピング・リージェント・アンタイ−Ｄ・フォア・スライド・アンド・モディファイド・チューブ・テスラ（Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｉｎ５ｅｒｔ、　０ｒｔｈ。

Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　５ｙｓｔｅ＋＋＋ｓ、Ｂｌｏｏｄ　Ｇｒｏｕｐｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｎｔｉ−Ｄ　ｆｏｒＳｌｉｄｅ　ａｎｄ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｔｕｂｅ　Ｔｅ５ｔｓ）およびウィツトマン（Ｆ、に、Ｗｉｄｍａｎ）、アメリカン・アソシエーション・オブ・ブラッド・バンク・テクニークス（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｌｏｏｄ　Ｂａｎｋ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）の［シーｏｏシック・テクニークス・アンド・アロアンタイボディーズ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄＡ　１ｌｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）Ｊ、４３５〜４５１頁の４４０（１９８５）参照。さらに、静電気防止ガン（ａｎｔｉ−ｓｔａｔｉｃ　ｇｕｎ）処理や前以て湿潤させるなどのようなマイクロプレートの前処理が、ある種の系では以前に必要とされてきた。ウィツトマン、アメリカン・アソシエーション・オブ・ブラッド・バンク・テクニークスの「シーロロジック・テクニークス・アンド・アロアンタイボディーズＪ、４３５〜４５１頁の４３９（１９８５）参照。

発明の要約本発明は希釈液として有用な改良された緩衝液を提供することによって上記従来技術の問題を解決するものであり、市販の抗り抗血清またはヒト由来抗体を用いた場合の陰性または非反応性結果の際に必要な確認抗り試験手順を行う必要をなくすものである。本発明はまた、アッセイの感度または特異性を損なうことなく抗体などのアッセイ成分を希釈するのに有用な緩衝液をも提供する。本発明の緩衝液はまた、試験試料などの他のアッセイ成分またはアッセイに使用する抗原調製物を希釈するのに用いることもできる。本発明により提供される緩衝液は、たとえば、従来のマイクロタイター法では達成できながったレベルに抗体を希釈することを使用者に可能にする。このような抗体の希釈の結果、使用者にとって費用の節約になるとともに、モノクローナル抗血清が利用できない大部分の血液型抗原試験に使用しなければならないヒト由来抗体を保存するのにも役立つ。また、この緩衝液はマイクロタイタープレートを前処理することなく用いることができる。それゆえ、本発明の緩衝液を用いる場合には静電気防止ガンまたは前以て湿潤させて処理する必要がない。

従って、本発明は、リン酸緩衝液などの通常の生物学的緩衝液、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの高分子量ポリマー、トリトンＸ　１００覧どの生物学的界面活性剤、ウシ血清アルブミンおよび塩化ナトリウムをすべて有効濃度で含有し、ｐＨが約ｐＨ５〜約ｐＨ９の範囲である改良された緩衝溶液を提供する。

また、コール酸も、アッセイの競合後４時間までの視覚的な読み取りのために有効な濃度で溶液中に存在していてもよい。この緩衝液はまた、保存剤としてアジ化ナトリウムも有効な濃度で含んでいてもよい。使用可能な好ましいリン酸緩衝液は、−塩基性リン酸ナトリウム、さらに二塩基性リン酸ナトリウムを含有している。

本発明の緩衝液のｐＨは、約５．０のｐＨから約９．０のｐＨの範囲、好ましくは約５６〜約７．２であってよく、さらに好ましくはｐＨは約ｐＨ６，０〜約ｐＨ６，８、最も望ましくは緩衝液のｐＨは約ｐＨ６，４である。

本発明により提供される緩衝液の使用方法は、選択したアッセイ成分を該緩衝液中で希釈することからなる。該緩衝液を構成成員として含むキットもまた提供される。

発明の詳細な記載上述したように、この発明は、アッセイの感度または特異性のいずれをも損なうことなくアッセイ成分を希釈するのに有用な改良された緩衝液を提供する。

この緩衝液は２つの組成にて提供される。この緩衝液の一つの組成は、アッセイの競合後４時間までに視覚的な読み取りを行うのが望ましい場合に好ましい。この緩衝液の第二の組成は、自動化アッセイを行うべきで視覚的な読み取りが望ましくない場合、または視覚的な読み取りを直ちに行う場合に用いることができ好ましい。後者の緩衝組成物は、生物学的緩衝液、高分子量ポリマー、生物学的界面活性剤、およびウシ血清アルブミンをすべて有効な濃度で含有する。アッセイ競合後４時間までに視覚的な読み取りを行うのが望ましい場合には、上記緩衝液にアニオン性界面活性剤を有効量にて加える。本発明の緩衝組成物は、約５〜約９の範囲のｐＨを有する。保存剤として使用するためアジ化ナトリウムを上記好ましい組成物のいずれに対しても有効な濃度にて加えることができる。必要なら、水酸化ナトリウムを含むものなどのアルカリ性緩衝液を添加することにより本発明の緩衝液の全体のｐＨを調節することができる。

本発明の改良された生物学的緩衝組成物は、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（モルホリノ −エタンスルホン酸）緩衝液、ビス−トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス− ＨＣｌ緩衝液およびホウ酸緩衝液などの通常の緩衝液を、約１０〜１００ｍｍの範囲、好ましくは約１０〜３０ｍｍ、最も好ましくは約２０ｍｍの有効濃度にて含む。好ましい緩衝液は、−塩基性リン酸ナトリウム、および二塩基性リン酸ナトリウムを該緩衝液の有効濃度を達成できる濃度で好ましくは含有するリン酸緩衝液である。

本発明の緩衝液中のＰＶＰの有効濃度は、約０．０５〜約０．２５％、好ましくは約０．０５〜約０．１５％の範囲であり、最も好ましくは該濃度は約０．０８５％である。生物学的界面活性剤の有効濃度は、約０．００５〜約０．０６％、好ましくは約０．０１〜約０．０２５％の範囲であり、最も好ましくは該濃度は約０゜０１７％である。好ましい界面活性剤はトリトンＸ−１００’である。コール酸の有効濃度は、約００１〜約０．３％、好ましくは約０．１３〜約０．２％の範囲であり、最も好ましくはコール酸の濃度は約０．１５％である。ウシ血清アルブミンは、約１．５〜約３．５％、好ましくは約１．７５〜約２．７５％の範囲の有効濃度にて提供され、最も好ましくはＢＳＡの濃度は約２．２５％である。塩化ナトリウムの有効濃度は、約０〜約３００ｍｍ、好ましくは約１００〜約２００ｍｍの範囲であり、最も好ましくは塩化ナトリウムの濃度は約１５４ｍｍである。

本発明に使用するために選択される高分子量ポリマーとしては、分子量が約１０ｋｄ〜約１５００ｋｄのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、分子量が約１０ｋｄ〜約２０００ｋｄの範囲のデキストラン、分子量が約２００ｄ〜約１０，０００ｄの範囲のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分子量が約１０．０００ｄ〜約１００．０００６のポリビニルアルコール、ポリブレン（ヘキサジメトリンプロミド）、メチルセルロース、アラビアゴム、硫酸プロタミン、メルクアット（■ ｅｒｑｕａｔ）、セルフアット（ｃｅｌｑｕａｔ）およびマグナフロック（■ａｇｎａｆｌｏｃ）が有効濃度で供される。

好ましい高分子量ポリマーはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）：最も好ましくはＰＶＰ−３６０が有効濃度で供される。これら高分子量ポリマーは、凝集「促進剤」として働く９本発明に利用できるこれら高分子量ポリマーの大部分は正の電荷を有しているが、正の電荷が必ずしも必要であるわけではない。

本発明に使用する生物学的界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、双性イオン界面活性剤およびカチオン性界面活性剤が挙げられる。本発明に使用する非イオン性界面活性剤には、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ツイーン”２０）、ポリオキノエチレンソルビタンモノオレエート（ツイーン’８０）、ポリオキシエチレンエーテル（トリトン３、ブリシュ（ＢｒｉＤ’）およびオシルフェノールーエチレンオキシド（ノニデート′）が含まれる。

アニオン性界面活性剤には、カプリル酸、コール酸、デオキシコール酸、グリココール酸およびドデシル硫酸ナトリウムが含まれる。双性イオン界面活性剤には、ＣＨＡＰＳ”（３−［３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ〕−１− プロパンスルホネート）が含まれる。有用なカチオン性界面活性剤には、セチルピリジニウムクロリドが含まれる。好ましくは、非イオン性界面活性剤を使用する。最も好ましい非イオン性界面活性剤はトリトンＲＸ−１００である。手動もしくは自動のいずれかの手順において視覚的な読み取りが望まれる場合には、本発明の緩衝液にアニオン性界面活性剤を添加するのが好ましい。最も好ましいアニオン性界面活性剤はコール酸である。

本発明の緩衝液は、アッセイ成分の希釈液として特に有用である。本明細書において使用する「アッセイ成分」なる語は、全血、または血清、血漿、赤血球、白血球、および血小板を含む全血成分を意味する。それゆえ、ヒトおよび動物試験試料またはこれら成分の市販調製物を本発明の緩衝液で希釈することができる。

さらに、アッセイ成分には、ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体、とりわＩｇＧまたは１ｇＭクラス、およびその断片；抗原およびその断片；抗原性溶解液、組換えタンパク質、合成ペプチドなどの市販アッセイ試薬が含まれる。また、ラテックス粒子、マグネチックビーズ、微細粒子などの不活性なアッセイ物質が懸濁液中で提供される場合には本発明の緩衝液中に懸濁してもよく、あるいは懸濁液中のこれら物質の希釈が望まれる場合には本発明の緩衝液を用いて希釈を行うことも考えられる。本発明の緩衝液はまた、アッセイ手順がこれら構成のアッセイ成分の希釈を要求する場合にはいつでも、「Ｕ字」、「７字」または平底マイクロプレートシステムに使用するＢＳＡまたは等張ＮａＣ１の代わりとして用いることができる。

アッセイ成分、とりわけ細胞は、本発明の緩衝液で希釈する前にブロメリン、パパイン、トリプシン、キモトリプシン、フィシン、ノイラミニダーゼ、−ウロキナーゼなどの酵素で処理してもよいし、またはアッセイ成分を処理しなくてもよい（酵素処理なし）。好ましくは、とりわけ凝集アッセイを行う場合には、本発明の緩衝液を最大の能力まで最適に使用するためにアッセイ成分を酵素処理する。

好ましくは、使用する酵素はブロメリンである。

本発明により提供される緩衝液は、アッセイ自体を行う前にアッセイ成分を希釈するのに使用してもよいし、または特定のアッセイ法に従って試験試料や他のアッセイ成分の系列希釈を行う場合などのようにアッセイを行っているときにアッセイ成分を希釈するのに使用することもできる。提供される緩衝液は、赤血球上の特定の抗原の存在または不存在を決定するために使用する抗体を希釈するのに特に有用である。本発明の緩衝液を用いて抗体を希釈する場合には、赤血球が特定の抗原を保持し試験試料中に存在して抗体と凝集することが可能となる。赤血球の凝集（クランピング）は陽性の反応を示し、一方、均一な細胞懸濁液によって示される非凝集は陰性の反応を示す。本発明の緩衝液を希釈液として使用する場合には非特異的な反応は認められなかった。過去においては、上記のようなおよびヒト由来ポリクローナル血漿に対して行われる抗体試験には別のコントロール試験を行うことが必要であり、このコントロール試験において、試験試料が市販の抗体成分自体と反応するのか補助成分と反応するのがを決定するために市販抗体試薬中に存在する補助成分に対して試験試料を試験する。しかしながら、補助成分と反応する２つの希な既知試料から得られた予備試験結果は、本発明の緩衝液を使用した場合には上記別の試験は行う必要がないことを示している。というのは、本発明の緩衝液で希釈した試験試料は補助成分と反応しないからである。

本発明により提供される他の利点が明らかになった。たとえば、本発明の緩衝液は赤血球上のＤ抗原の存在を試験するために用いることができる。これら結果の感度は、結果を確認するために別の試験を必要としないほどに増大することが決定されており、それゆえ、マイクロプレート試験法を採用した場合に用いられる通常の手順である確認試験の標準手順が省かれる。本発明の緩衝液はまた、肝炎表面抗原や梅毒試験などのための他の抗原−抗体相互反応において使用して反応を高めることができる。

本発明の緩衝液を含有する試薬は、アッセイにおける該緩衝液の性能を損なうことなく有意に種々の濃度にて用いることができる。表１に本発明の緩衝液の試薬成分およびその有効濃度範囲を示す。

表１計　濃度範囲　好ましい濃度範囲（約　〜約　）　（約　〜約　）ポリビニルピロリドン０．００５〜０．２５％　０．０５〜０．１５％（冒／ｖ％）、Ｋ値９０、分子量１００〜１５００Ｋ。

最も好ましい濃度：　０．０８５％トリトンＸ−１００”　０．００５〜００６％　０．０１〜０．０２５％最も好ましい濃度：　０．０１７％コール酸　０．０１〜０３％　０．１３〜０．２％最も好ましい濃度：　０．１５％ＢＳＡ　１．５〜３．５％　１．７５〜２．７５％最も好ましい濃度：　２．２５％リン酸緩衝液（−塩基性リン酸ナトリウム、および二塩基性リン酸ナトリウム）１０〜１００園１　１０〜３０＋ｕ最も好ましい濃度：　２（ｍｐＨ５，０〜９．０　５．６〜７．２　：　６．０〜６．８：最も好ましいｐＨ：　６．４これら濃度は、試験当たり６０μｍの希釈抗体、および３０μｌの赤血球懸濁液（３〜５％）に基づく。コール酸成分は、４時間までの視覚的読み取りを望まない場合には本発明の緩衝液を希釈液として使用する際に必要ないことが理解される。それゆえ、この場合にはコール酸は本発明の緩衝液組成から除いてよい。、塩化ナトリウムはｐＨを調節するために用いることができる。それゆえ、塩化ナトリウムが下記のように提供される。

成分　濃度範囲　好ましい濃度範囲（約　〜約　）　（約　〜約　）Ｎ　ａ　Ｃ１０〜３０（ｍ　１００〜２０（ｍ最も好ましい濃度：１５軸■ 視覚的読み取りのために最も好ましい組成において、本発明の緩衝液は下記濃度で提供される。

視覚的読み取りのための緩衝液の調合：希釈緩衝液、１０リツトル（Ｌ）調製物サイズ：物質ニー塩化性リン酸ナトリウム　２２．１ｇ（０，２２１％ｗ　／　ｖ　）二塩化性リン酸ナトリウム　５．６２　ｇ（０，０５６％ｗ　／　ｖ　）塩化ナトリウム　９０゜Ｏｇ（０，９％ｗ　／　ｖ　）ＰＶＰ−３６０８，５ｇ（０，０８５％ｗ／ｖ）コール酸　１５．０ｇ（０，１５％ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　２２５．０ｇ（２，２５％ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００’（１０％＞　１７．０ミリリツトル（ｍｌ）（０，０１７％ｗ／ｖ）手順：約８リツトルのＤｉ水に一塩化性リン酸ナトリウムおよび二塩化性リン酸ナトリウムを加え、溶解するまで混合する。ついで、この混合物に塩化ナトリウムを加え、再び溶解するまで混合する。ついでＰＶＰ−３６０を加え、激しく混合する。添加後、コール酸を加え、溶解するまで混合する。ついでＢＳＡを加え、溶解するまで混合する。最後にトリトンＸ−１００１＋を加え、溶解するまで混合する（この混合は約１５分で完了する）。水酸化ナトリウムを用いて混合物をｐＨ６゜４に調節する。全量１０Ｌにする。視覚的読み取りを必要としない場合にはコール酸を処方から外し、トリトンの濃度を示された範囲内で増加させてもよい。アジ化ナトリウムの存在が望まれる場合には、塩化ナトリウムを添加するときに１０、０　ｇ（０，１％Ｗ／Ｖ）のアジ化ナトリウムを緩衝液に加える。緩衝液のｐＨは水酸化ナトリウムを用いて調節してよい。

たとえば、有効な抗体希釈の範囲は、１：２〜約１：１００，０００であることがわかった。有効な希釈範囲は、希釈しようとするアッセイ成分に応じて変わるであろう。しかしながら、本発明の緩衝液で１　＋　１００．０００以上、１：５ｏｏ、ｏｏｏまでの希釈が種々のアッセイ成分を用いて達成できることが考えられる。この希釈は、アッセイ自体を行う前に行うことができる。また、アッセイ法に従って試験試料や他の可能なアッセイ成分の系列希釈を行う場合などのように、アッセイ自体を行うときに抗体、試験試料、または抗原などの成分を希釈するのに本発明の緩衝液を用いることができることも考えられる。

つぎに本発明を実施例により記載するが、これは本発明の好ましい態様を説明するためであって本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

実施例実施例１市販の抗血清を用いた緩衝液の感度：自動アッセイ基本型（ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ）自動化ブラッドバンクアナライザー（アボット・ラボラトリーズ、アボットパーク、イリノイ州、６００６４、の基本型）を用い、本発明の緩衝液（好ましい態様で提供、コール酸およびアジ化ナトリウム含有）中に希釈した市販の抗血清の評価を行った。５つの市販の抗血清（抗Ｄ１抗Ｃ１抗Ｅ、抗Ｃおよび抗ｅ）を系列希釈した。各希釈液を４つの同型接合（ｈｏ■ｏｚｙｇｏｕｓ）試料、４つの異型接合（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）試料、および１つの抗原陰性ドナー試料に対して試験した。この実験に使用した物質は以下の通りであった：本明細書に記載したようにして提供される本発明の緩衝液；抗Ｄ（オーツ・ダイアグノスティックス・バイオクローン（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｂｉｏｃｌｏｎｅ）’、　ｏブトＮｏ、ＤＢ１１３Ａ）、抗Ｃ（オーツ・ダイアグノスティックス、ロットＮｏ、Ｃ３１６３Ｂ）、抗Ｅ（オーツ・ダイアグノスティックス、ロットＮｏ、ＥＳ１２４Ｂ）、抗Ｃ（オーツ・ダイアグノスティックス、ロットＮｏ、５Ｃ８２６Ａ）、抗ｅ（オーツ・ダイアグノスティックス、ロットＮｏ、５Ｅ１３３Ａ）。アッセイはマイクロタイタートレイ中で行った。被験細胞の表現型は、実験を行う時点ではわかっていなかった。

提供した被験細胞は、アボット・ラボラトリーズで試験する前に完全なＲｈ−ｈｒ表現型についてサウスイースタンウィスコンシンの血液センター（ミルウォーキー、ライスコンシン州）にて分析した；しかしながら、力価を決定するに際しての主観性を排除するため、アボット・ラボラトリーズで試験する前に被験細胞を暗号化した。血液センターから送られた教示シートを用い、下記暗号化被験細胞に対して各希釈抗血清を試験した。

抗Ｄプレート＋Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＨＳ　ＩＳＪ、Ｍのラベルを付した細胞抗Ｃプレート：Ａ、ｃＳＤ、Ｅ、ＨＳＩＳＪ、Ｌ、Ｏのラベルを付した細胞抗Ｅプレート：　ＣＳＤ、Ｆ、Ｊ、ＭＳＮ、０．ＱＳＲのラベルを付した細胞抗Ｃプレート＋Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、ＫＳＯ，Ｐのラベルを付した細胞抗ｅプレート：Ｃ，ｐ、Ｆ、Ｈ，Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｏ，Ｐのラベルを付した細胞被験細胞希釈液は下記のものを含むニア、５ｍｌの２％ブロメリン（シグマ・ケミカル、セントルイス、ミズーリ州から入手、ロットＮｏ、３７０３３−１５）１．０ｍｌの１％ツイーンｌ１２０（シグマ・ケミカル、セントルイス、ミズーリ州から入手、ロットＮｏ、２１１９７−１２）、および９１．５ｍｌの０９％ＮａＣ１，０，１％アジ化ナトリウム。

本明細書に記載した各抗血清を用い、ＡＡＢＢテクニカルマニュアル、第９版、２３９頁に概略が示されている手順に従い、系列２倍希釈液を個々に調製した。

調製した希釈液は、１２から１　：１３１０７２の範囲にわたっていた。これら希釈液は、基本型自動化ブラッドバンクアナライザー（アボット・ラボラトリーズ、アボットバーク、イリノイ州、６００６４）を用いた赤血球表現型決定に利用した。

上記自動化ブラッドバンクアナライザーの構成には「コンベイヤ−タイプ」の機構として働くトラックが含まれており、マイクロタイタートレイはトラックの上に置かれ、４．８分間隔でステーションからステーションへと運ばれるようになっていた。

ステーション１は試薬ステーションであった。６０μｍの抗血清試薬が希釈された形態にてマイクロタイタートレイ上の所定の位置へ分配された。加えて、２３０μｌのブロメリン試薬が３つの細胞希釈ウェルに分配された。一つのウェルは第一希釈ウェルと称され、ここには全血を入れて遠心分離にかけることにより赤血球をペレット化した「パイロット」チューブからの充填赤血球が置かれた。

ステーション２は試料取り扱いステーションであった。７０μｍの充填赤血球をパイロットチューブから第一細胞希釈ウェル（２３０μｍのブロメリン溶液を入れである）中にピペットにて入れた。この細胞懸濁液を吸引しピペット自体の中へ分配することにより混合した。

ステーション３は細胞希釈器７分配器であった。７０μｍの第一細胞希釈液（約１５．４％の細胞濃度）を各試験試料について２つの第二希釈ウェルに移した。

これら第二希釈ウェルを混合し、これら懸濁液（約４〜５％の細胞濃度）の３０ μｌを所定の試験ウェルに分配した。

ついで、トレイを下記トラックに沿って移動させた。

ステーション４　−　水平ステーション５　−Ａの方向へ５０°傾斜ステーシヨン５　−Ｈの方向へ５０６傾斜ステーシヨン７　−Ａの方向へ６５°傾斜ステーシヨン８　−　水平ステーション９　−Ｂの方向へ６５°傾斜ステーシコン１〇　−水平ステーション１１−　Ａの方向へ５０°傾斜ステーシヨン１２−　水平ステーション１３−　光路中で細胞の存在または不存在についてトレイを読み取る。

陽性結果は高光カウントであることが決定され、三日月状の凝集物が形成されへ陰性結果は低光カウントであることが決定され、均一な細胞懸濁液が存在した。

トレイ当たり８つの細胞を試験した。試験した数の抗血清希釈液のためには２つの別々のトレイが必要であった。トレイ＃１には１．２から１：４０９６の希釈液が含まれていた。トレイ＃２には１：８１９２から１　＋１３１，０７２の希釈液が含まれていた。

表２〜６に示すデータは、本発明の緩衝液を利用した場合には市販の抗血清を高度に希釈することができることを示している。

表２抗り暗号化した試料　見釈　期待される結果Ａ　１６，３９４　＋Ｂ　ＯＯＤ　３２，７６８　＋Ｈ３２，７６８＋Ｆ　３２，７６８　＋８　３２．７６８　＋１１６．３８４　十Ｊ　１６．３８４　十Ｍ　３２，７６８　＋表３抗ＣＡ　２．０４８　＋０２．０４８　＋Ｄ　２，０４８　＋Ｅ　２．０４８　＋Ｈ２，０４８＋１　２．０４８　＋０４．０９６　十表４抗Ｅ表５抗Ｃ暗号化した試料　希釈　期待される結果Ａ　４，０９６　十Ｂ　８，１９２　＋Ｄ　８，１９２　＋Ｅ　ＯＯＧ　８，１９２　＋１８．１９２　十Ｋ　８，１９２　＋０　８．１９２　＋Ｐ　１６，３９４　十抗ｅＭ　１２８　＋ドナー抗血清を用いた緩衝液の感度二手動性ＡＡＢＢテクニカルマニュアル、第９版、２３９頁に概略が示されている手順に従い、ライスコンシンのサウスイースタン血液センターにてアッセイを手動で行った。アッセイを行う前に被験細胞を０５％のフィシンで処理した。これらアンセイをＵ−底マイクロタイタープレート中にてドナー血漿について行った。

結果の視覚的解釈を行った。試験した抗体は実施例１のものと同じであった。各希釈抗血清を実施例１の記載と同じパネルに対して試験した。本発明の緩衝液を用いた試験に加えて３％ＢＳＡ緩衝液についても試験した。これらの結果を下記表７〜１１に詳記する。

表７抗り試験（終点希釈結果）暗号化した試料　３％ＢＳＡ　緩衝液Ａ　２．０４８　１６，３９４Ｂ　ＯＯＤ　４，０９６　１６．３９４Ｅ　４，０９．６　１６，３９４Ｆ　４．０９６　１６．３９４Ｈ２，０４８１６，３９４１２、０４８１６，３９４Ｊ　４，０９６　８．１９２Ｍ　１，０２４　８，１９２表８抗Ｃ試験（終点希釈結果）暗号化した試料　３％ＢＳＡ　緩衝液Ａ　２．０４８　４．０９６Ｃ４，０９６８，１９２Ｄ　２，０４８　８，１９２Ｅ　４，０９６　８．１９２Ｈ４，０９６８，１９２Ｉ　２，０４８　８．１９２Ｊ　ＯＯＬ　４．０９６　１６．３９４０　１．０２４　８，１９２表９抗Ｅ試験（終点希釈結果）Ｄ　６４　１２８Ｆ　６４　１２８Ｊ、　１２８　２５６゜Ｍ　６４　１２８Ｎ　１２８　２５６Ｑ　１２８　１２８Ｒ１２８６４表１０抗Ｃ試験（終点希釈結果）暗号化した試料　３％ＢＳＡ　緩衝液Ａ　５１２　２．０４８Ｂ　５１２　８．１９２Ｄ　５１２　８．１９２Ｇ　５１２　１６，３９４Ｉ　５１２　４，０９６Ｋ　１．０２４　８，１９２０　５１２　８．１９２Ｐ　１，０２４　８．１９２表１１抗ｅ試験（終点希釈結果）暗号化した試料　３％ＢＳＡ　緩衝液Ｃ１，０２４２，０４８Ｄ　１．０２４　４．０９６Ｆ　１．０２４　４．０９６８　２．０４８．　８．１９２Ｉ　２，０４８　８，１９２Ｍ　１．０２４　４．０９６Ｎ　０　００　１．０２４　８，１９２Ｐ　１，０２４　８．１９２実施例３自動化システムにおけるＤｕ表現型決定ＢＳＡと比べた緩衝液の感度この実験は、実施例１に記載した自動化２方向傾斜システム上でＤｕｕ現型決定に利用した場合の３％ＢＳＡと緩衝希釈液との性能を比較対照するために行った。ここでいう一層高感度の緩衝液とは、凝集法によりＤｕｕ現型の存在を検出するためにより少ない量の抗体を利用することを可能にする緩衝液として定義される。当業者にとってＤｕはＤ抗原を保持する赤血球として分類され、Ｄ抗原の存在は最初の試験法を用いることによっては示すことができず、それゆえ、その存在を示すには間接抗グロブリン法などの一層詳細な試験が必要とされる。このＤｕの定義は使用した方法（手動か自動か）および使用した抗血清源の両方に依存する。この実験においてＤｕとは、ダイナテックマイクロバンクシステムズ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｍｉｃｒｏｂａｎｋ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）（バラジャー・リージョン・レッド・クロス（Ｂａｄｇｅｒ　Ｒｅｇｉｏｎ　Ｒｅｄ　Ｃｒｏｓｓ）、マジソン、ウイスコンノン州）上では最初にＤ陰性とスクリーニングされ、間接抗グロブリン試験によってＤ陽性と再試験された赤血球試料として定義される。

実験は下記の点を変更した他は実施例１の手順に従った。単一の抗血清のみを試験した、オーツ・ダイアグノスティックスのスライド・抗Ｄ１０ットＮｏ、Ｄ５６７０Ｄ０２倍系列希釈を調製する方法は、最初の希釈を１：６．２５とした他は実施例１と同様にして行った。この希釈法は、ＡＡＢＢテクニカルマニュアル、第９版、２３９頁（テクニック・フォア・マスター・ダイルージョン（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｆｏｒ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｄｉｌｕｔｉｏｎ［１９８５コ））に記載されている。

過去においては、手動または自動のいずれの場合も、マイクロプレート法で市販の抗血清を利用するに際して本来的な問題があった。抗血清試薬中に入れる添加物が偽陽性反応（特異的抗体の不存在下での凝集）を排除するのに充分なレベルまで希釈されるように抗血清を希釈する必要があった。それゆえ、低い希釈で特異的な凝集が起こることを確認するためにコントロールが必要であった。添加物がさらに希釈され存在する希釈液の量がそれら添加物の量を越えるにつれ、高希釈において非特異的な凝集は起こらなくなった。希釈緩衝液および３％ＢＳＡの両者で市販の抗血清を希釈した際に起こる非特異的凝集のレベルをまず決定した。

非特異的凝集の起こる希釈レベルは、３％ＢＳＡでは１：１２．５であり、希釈緩衝液では１．２５であった。これら希釈以上での陽性反応はすべて陽性結果と考えられ、これら希釈またはそれ以下での反応はすべて偽陽性結果と考えられる。

この比較結果を表１２に示す。

表１２希釈液と３％ＢＳＡとでのＤｕ試試験比較口希釈試料＃　３％ＢＳＡ　希釈液１　５０　１．６００２　４００　３．２００４　１００　１．６００６　１００　１．６００７　４００　３．２００８　１．６００　１２．８００１０　１’００　１，６００１１　２００　．１，６００１４　４００　３．２００１５　１００　１．６００１６　１００　１．６００２０　検出せず　２００２１　２００　３．２００２２　４００　３．２００２３　４００　６．４００２９　８００　３．２００３３　検出せず　４００３８、　５０　８００３９　４００　１．６００４０　検出せず　８００４４　検出せず　２００４８　検出せず　８００４９　２５　１．６００５０　１００　１．６００５１　２００　１．６００５２　４００　１．６００５６　検出せず　４００５７　１．６００　１２．８００５８　１００　１．６００５９　Ｚｏｏ　８００６０　２００　１．６００６１　２００　１．６００６３　８００　３．２００６５　２００　１、．６００本発明が関係する技術分野に属する当業者であれば、本発明の範囲（下記請求の範囲によってのみ定められる）がら逸脱することな（、本明細書に開示した特別に記載した本発明の態様に種々の変更および修飾を加え得ることは明らかであろう。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．有効濃度のリン酸緩衝液；有効濃度の高分子量ポリマー；有効濃度の生物学的界面活性剤；有効濃度のウシ血清アルブミン；および有効濃度の塩化ナトリウムからなり、ｐＨが約ｐＨ６〜約ｐＨ９の範囲である緩衝液組成物。
２．リン酸緩衝液の有効濃度が約１０〜約１００ｍＭの範囲であり；高分子量ポリマーが約０．００５〜約０．２５％（ｗ／ｖ）の範囲の有効濃度のポリビニルピロリドンであり；生物学的界面活性剤が約０．００５〜約０．０３％（ｗ／ｖ）の範囲の有効濃度の非イオン性界面活性剤であり；ウシ血清アルブミンの有効濃度が約１．５〜約３．５％（ｗ／ｖ）の範囲であり；塩化ナトリウムの有効濃度が約０〜約３００ｍＭの範囲であり、該緩衝液のｐＨが約ｐＨ５．６〜ｐＨ７．２の範囲である請求項１に記載の緩衝液。
３．リン酸緩衝液の有効濃度が約１０〜約３０ｍＭの範囲であり；ポリビニルピロリドンの有効濃度が約０．０５〜約０．１５％（ｗ／ｖ）の範囲であり；生物学的界面活性剤が約０．０１〜約０．０２５％（ｗ／ｖ）の範囲の有効濃度の非イオン性界面活性剤トリトンＸ−１００Ｒであり；ウシ血清アルブミンの有効濃度が約１．７５〜約２．７５％（ｗ／ｖ）の範囲であり；塩化ナトリウムの有効濃度が約１００〜約３００ｍＭの範囲であり、該緩衝液のｐＨが約６．４である請求項２に記載の緩衝液。
４．さらに有効濃度のアジ化ナトリウムを含有する請求項３に記載の緩衝液組成物。
５．約０．２２％（ｗ／ｖ）の一塩基性リン酸ナトリウム；約０．０５６％（ｗ／ｖ）の二塩基性リン酸ナトリウム；約０．９％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウム；約０．０８５％（ｗ／ｖ）の濃度のポリビニルピロリドン；約０．１５％（ｗ／ｖ）の濃度のコール酸；約２．２５％（ｗ／ｖ）の濃度のウシ血清アルブミン；および約０．０１７％（ｗ／ｖ）の濃度のトリトンＸ−１００Ｒ；からなり、ｐＨが約６．４である請求項３に記載の緩衝液。
６．さらにアニオン性界面活性剤を含有する請求項１に記載の緩衝液組成物。
７．該アニオン性界面活性剤が約０．０１〜約０．３％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度のコール酸である請求項６に記載の緩衝液組成物。
８．有効濃度のリン酸緩衝液；有効濃度の高分子量ポリマー；有効濃度の生物学的界面活性剤；有効濃度のウシ血清アルブミン；および有効濃度の塩化ナトリウムからなり、ｐＨが約ｐＨ５．０〜約ｐＨ９の範囲である緩衝液組成物の既知量とアッセイ成分の既知量とを混合することを特徴とするアッセイ成分の希釈性。
９．該アッセイ成分が、抗体またはその断片、抗原またはその断片、全血成分、抗原性溶解液、組換えタンパク質および合成ペプチドよりなる群から選ばれたものである、請求項８に記載の方法。
１０．約１０〜約１００ｍＭの範囲の濃度のリン酸緩衝液；約０．００５〜約０．２５％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度のポリビニルピロリドン；約０．００５〜約０．０３％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度の非イオン性界面活性剤；約１．５〜約３．５％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度のウシ血清アルブミン；および約０〜約３００ｍＭの範囲の濃度の塩化ナトリウムからなり、ｐＨが約ｐＨ５．６〜ｐＨ７．２の範囲である緩衝液組成物の既知量中に希釈したアッセイ成分からなることを特徴とする、アッセイを行うためのキット。
１１．該緩衝液組成物が、約１０〜約３０ｍＭの範囲の濃度のリン酸緩衝液；約０．０５〜約０．１５％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度のポリビニルピロリドン；約０．０１〜約０．０２５％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度の非イオン性界面活性剤トリトンＸ−１００Ｒ；約０．０１〜約０．３％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度のコール酸；約１．７５〜約２．７５％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度のウシ血清アルブミン；および約１００〜約３００ｍＭの範囲の濃度の塩化ナトリウムからなり、ｐＨが約ｐＨ６．４である請求項１０に記載のキット。
１２．緩衝液組成物中に希釈した抗Ｒｈ抗体を含む、Ｒｈ式血液型抗原の存在を検出するための血液試料の免疫血液学的分析を行うためのキットであって、該組成物が、約１０〜約３０ｍＭの範囲の濃度のリン酸緩衝液；約０．０５〜約０．１５％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度のポリビニルピロリドン；約０．０１〜約０．０２５％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度の非イオン性界面活性剤トリトンＸ−１００Ｒ；約０．０１〜約０．３％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度のコール酸；約１．７５〜約２．７５％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度のウシ血清アルブミン；および約１００〜約３００ｍＭの範囲の濃度の塩化ナトリウムからなり、ｐＨが約ｐＨ６．４であることを特徴とするキット。