CN113295864A - 一种用于hiv抗原、抗体定量联合检测的试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及HIV病毒检测的技术领域,具体公开了一种用于HIV抗原、抗体定量联合检测的试剂盒及检测方法。该试剂盒包括:由HIV‑1型抗原、HIV‑2型抗原和HIV‑1 p24抗体分别包被的磁性荧光编码微球的混匀液A;利用荧光素标记的、与包被磁性荧光编码微球的HIV‑1型抗原、HIV‑2型抗原、HIV‑1 p24抗体分别配对的HIV‑1型抗原、HIV‑2型抗原、HIV‑1 p24抗体的混匀液B;该检测方法为:利用上述试剂盒与待测样本反应,并用流式细胞仪进行检测,从而能够同时获得待测样本中HIV‑1/2型抗原以及HIV‑1 p24抗体的相对浓度。
Description
技术领域
本申请涉及HIV病毒检测的技术领域,更具体地说,它涉及一种用于HIV抗原、抗体定量联合检测的试剂盒及检测方法。
背景技术
获得性免疫缺陷综合症是由人类免疫缺陷病毒(HIV病毒,即艾滋病病毒)感染所引起的一种免疫缺陷性疾病。HIV病毒感染的诊断是艾滋病预防控制工作的重要组成部分。
HIV病毒感染的过程如下:首先,HIV病毒侵入人体后,其表面的糖蛋白gp120与人体内的细胞表面受体CD4以高亲和力结合,形成HIV-CD4结合体;然后,在细胞表面受体CD4的作用下,HIV-CD4结合体会吸附到宿主细胞上,同时,糖蛋白gp120与宿主细胞表面的辅助受体相互作用,使得HIV病毒与宿主细胞的细胞膜更接近;接着,HIV病毒表面的糖蛋白gp41发生一系列构象变化,且其N端的融合片段插入宿主细胞的细胞膜,导致HIV病毒的包膜与宿主细胞的细胞膜最终融合,HIV病毒的RNA进入宿主细胞,从而完成HIV病毒的感染。
HIV病毒感染人体后,经过诊断,首先,能够检测到的是HIV病毒的RNA:在HIV病毒感染人体后的10-14天内,RNA含量的变化趋势是先呈指数上升、随后下降并保持在持续稳定的水平上,即进入HIV无症状期。然后,能够检测到的是p24抗原:p24抗原的含量随RNA含量的变化而变化,在HIV病毒感染期便会出现,称为p24抗原早期。p24抗原被认为是HIV病毒复制的间接标志,但由于检测方法的灵敏度不够高,使得p24抗原的检出时间要比RNA晚。最后,能够检测到的是HIV抗体。从HIV病毒感染到能够检测出HIV抗体的这一时期,被称作“窗口期”。
在窗口期,通过检测RNA、p24抗原和CD4淋巴细胞的含量,能够确定HIV病毒的感染情况。CD4淋巴细胞的含量随着HIV病毒的感染而逐渐降低,当血液中CD4淋巴细胞的含量下降到200个/ml时,就会发生严重的免疫缺陷,患者被确诊为艾滋病。故HIV病毒的RNA、p24抗原、HIV抗体和CD4淋巴细胞的含量可用来确定HIV病毒的感染,并检测HIV病毒感染的病情发展。
在病毒分类中,HIV病毒属逆转录病毒科慢病毒属中的人类免疫缺陷病毒组。根据血清学反应和病毒核酸序列测定,全球流行的HIV病毒可分为2种类型:HIV-1型和HIV-2型。
检测HIV病毒感染的方法有100多种,总体来说可以分为病毒检测和抗体检测两大类。其中,HIV抗体通常在HIV病毒感染后3-8周能够被检测出来。抗体检测大多数应用双抗原夹心法,该方法具有很好的灵敏性和特异性。然而,在窗口期,HIV抗体不能被检出,但可以检测到的是HIV相关抗原或分离HIV病毒。因此,通过检测p24抗原来诊断HIV病毒感染有着很大的优势,可以作为辅助诊断HIV病毒感染的一种方法。
免疫学检测技术目前已发展到第四代,主要是HIV-1/2型抗体和p24抗原的混合筛查方法,提出同时检测HIV-1/2型抗体和p24抗原,降低血源筛查的残余危险度。申请公布号为CN105527426A的中国专利文献中,检测HIV抗体采用的是间接法原理,利用荧光编码微球作为载体包被抗原与待测样本反应,再与相对应的生物素化抗人二抗反应,最后与报告分子结合;而检测HIV抗原则采用的是双抗体夹心法原理,利用包被有p24单克隆抗体的荧光编码微球与待测样本反应,再与荧光素标记的p24单克隆抗体反应。可见,虽然提出了HIV-1/2型抗体和p24抗原的同时检测,但实质上还是将HIV-1/2型抗体和p24抗原分开检测的,并没有实现两者的同时检测。
发明内容
本申请提供一种用于HIV抗原、抗体定量联合检测的试剂盒及检测方法,利用该试剂盒可同时检测出HIV-1/2型抗体以及HIV-1 p24抗原的相对浓度。
第一方面,本申请提供一种用于HIV抗原、抗体定量联合检测的试剂盒,采用如下的技术方案:
一种用于HIV抗原、抗体定量联合检测的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒具体包括:
由HIV-1型抗原、HIV-2型抗原和HIV-1 p24抗体分别包被的磁性荧光编码微球的混匀液A;
利用荧光素标记的、与包被磁性荧光编码微球的HIV-1型抗原、HIV-2型抗原、HIV-1 p24抗体分别配对的HIV-1型抗原、HIV-2型抗原、HIV-1 p24抗体的混匀液B。
本申请的试剂盒主要包括混匀液A和混匀液B。混匀液A中包含利用HIV-1型抗原、HIV-2型抗原和HIV-1 p24抗体分别包围的磁性荧光编码微球;在进行HIV抗原、抗体定量联合检测的过程中,先将待测样本与混匀液A反应,通过混匀液A中的HIV-1型抗原、HIV-2型抗原和HIV-1 p24抗体分别与待测样本中的待测HIV-1/2型抗体和HIV-1 p24抗原的识别和结合,从而使得待测样本中的待测HIV-1/2型抗体和HIV-1 p24抗原间接与磁性荧光编码微球结合。
混匀液B中包含荧光素标记的与HIV-1型抗原、HIV-2型抗原和HIV-1 p24抗体分别配对的HIV-1型抗原、HIV-2型抗原和HIV-1 p24抗体。在待测样本中的待测HIV-1/2型抗体和HIV-1 p24抗原间接与磁性荧光编码微球结合后,再利用荧光素标记的HIV-1型抗原、HIV-2型抗原和HIV-1 p24抗体与待测样本中的待测HIV-1/2型抗体和HIV-1 p24抗原识别和结合,从而完成对待测样本中的待测HIV-1/2型抗体和HIV-1 p24抗原的荧光标记。再利用流式细胞仪对待测样本中的待测HIV-1/2型抗体和HIV-1 p24抗原进行检测,获得待测样本中的待测HIV-1/2型抗体和HIV-1 p24抗原各自对应的荧光信号强度,再根据利用校准品制备的标准曲线中抗原抗体相对浓度与荧光信号强度的关系,以检测获得的待测样本中的待测HIV-1/2型抗体和HIV-1 p24抗原各自对应的荧光信号强度为基础,找到与之对应的抗原抗体相对浓度,从而获得待测样本中的待测HIV-1/2型抗体和HIV-1 p24抗原各自对应的浓度,完成对待测样本中HIV-1/2型抗体和HIV-1 p24抗原的相对浓度检测。
试剂盒中除了包括混匀液A和混匀液B外,还包括校准品和缓冲液。校准品为含有待测HIV-1型抗体和HIV-1 p24抗原的标准浓度溶液,利用缓冲液将校准品稀释为不同浓度的标准溶液,通过利用上述试剂盒检测不同浓度的标准溶液的荧光信号强度,从而获得HIV-1/2型抗体和HIV-1 p24抗原与荧光信号强度的标准曲线。因此,利用本申请的试剂盒,可同时检测获得待测样本中HIV-1/2型抗体以及HIV-1 p24抗原的相对浓度。
另外,目前的ELISA方法、化学发光法、时间分辨荧光免疫分析法,都是按照Cutoff值计算病人的阳性,上述方法均为一次样本反应,检测结果为抗原和抗体的总发光值,故不能区分阳性病人的抗原浓度和抗体浓度,也不能区分阳性病人是否为p24抗原早期。而利用本申请的试剂盒对待测样本进行检测,能够检测出阳性病人的抗原抗体相对浓度。进一步地,通过对p24抗原的检测,再结合HIV病毒感染后,HIV病毒的RNA、p24抗原以及HIV抗体的检测时间,可区分出阳性病人是否为p24抗原早期。因此,本申请的试剂盒不仅能够检测出阳性病人的抗原抗体相对浓度,而且还能够区分阳性病人是否为p24抗原早期。
本申请的试剂盒中所用的荧光编码微球为磁性荧光编码微球。利用本申请的试剂盒进行待测样本的检测时,在清洗微球的过程中,将荧光编码微球与液体分离的方式可以是磁力架,即利用磁力架对磁性荧光微球的吸附作用将磁性荧光编码微球吸附、固定在容器底部,从而方便上清液的去除。而相关技术中所用的荧光编码微球为聚丙乙烯微球,在清洗微球的过程中,将荧光编码微球与液体分离的方式为离心。通过离心将荧光编码微球沉淀在容器底部,由于荧光编码微球没有被固定,通过移液枪吸走上清液的过程中,容易同时将荧光编码微球吸走,从而造成微球离子的丢失,进而影响最终对待测样本的检测结果。另外,磁性荧光编码微球的表面积较大,能够包被捕获较多的抗原抗体,保证了载体微球能够最大程度地与待测样本中的抗原抗体结合,从而提高了检测灵敏度。因此,本申请所用的荧光编码微球为磁性荧光编码微球,不仅可以方便上清液的去除,而且能够提高待测样本检测结果的准确性。
优选的,所述混匀液A中,HIV-1型抗原、HIV-2型抗原和HIV-1 p24抗体分别与磁性荧光编码微球的包被比例为:10-30μg的抗体或抗原包被1×107个磁性荧光编码微球。
通过采用上述技术方案,经过试验分析,制备混匀液A的过程中,将HIV-1型抗原、HIV-2型抗原和HIV-1 p24抗体分别与磁性荧光编码微球的包被比例控制在上述范围内时,相同抗原抗体相对浓度下检测获得的荧光信号强度基本一致;当HIV-1型抗原、HIV-2型抗原和HIV-1 p24抗体分别与磁性荧光编码微球的包被比例小于或大于上述范围时,相同抗原抗体相对浓度下检测获得的荧光信号强度均小于两者包被比例在上述范围内时的荧光信号强度。由此可知,将HIV-1型抗原、HIV-2型抗原和HIV-1 p24抗体分别与磁性荧光编码微球的包被比例控制在上述范围内时,能够获得较为稳定的荧光信号强度,故最终获得的待测样本中HIV-1/2型抗体以及HIV-1 p24抗原的相对浓度较准确,因此,将HIV-1型抗原、HIV-2型抗原和HIV-1 p24抗体与磁性荧光编码微球的包被比例控制在:10-30μg的抗体或抗原包被1×107个磁性荧光编码微球。
优选的,所述混匀液B中,HIV-1型抗原、HIV-2型抗原、HIV-1 p24抗体的浓度均为10-50μg/mL。
通过采用上述技术方案,经过试验分析,制备混匀液B的过程中,将荧光素标记的HIV-1型抗原、HIV-2型抗原和HIV-1 p24抗体的浓度均控制在上述范围内,相同抗原抗体相对浓度下检测获得的荧光信号强度的变化梯度基本一致;当荧光素标记的HIV-1型抗原、HIV-2型抗原和HIV-1 p24抗体的浓度均为5μg/mL时,抗原抗体相对浓度在高点值时检测获得的荧光信号强度较低,而当荧光素标记的HIV-1型抗原、HIV-2型抗原和HIV-1 p24抗体的浓度均为60μg/mL时,抗原抗体相对浓度在0点值时检测获得的荧光信号强度过高。由此可知,将混匀液B中荧光素标记的HIV-1型抗原、HIV-2型抗原和HIV-1 p24抗体的浓度均控制在上述范围内时,能够获得较为稳定的荧光信号强度,故最终获得的待测样本中HIV-1/2型抗体以及HIV-1 p24抗原的相对浓度较准确。因此,将混匀液B中荧光素标记的HIV-1型抗原、HIV-2型抗原以及HIV-1 p24抗体的浓度均控制在10-50μg/mL的范围内。
优选的,所述荧光素包括藻红蛋白(PE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白复合物(PerCP)、别藻青蛋白(APC)。
藻红蛋白是从红藻中分离纯化的一种荧光蛋白,是一种新型荧光标记染料,因为其具有强烈的荧光,很好的吸光性能和很高的量子产量,在可见光谱区有很宽的激发及发射范围,故在免疫荧光、免疫组化、流式细胞仪检测等抗体的荧光标记和活体成像中有着广泛的应用。
异硫氰酸荧光素是生化试剂,也是医学诊断药品,主要用于荧光抗体技术中的荧光染料,能和各种抗体蛋白结合,结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性,并在碱性溶液中具有强烈的绿色荧光,用于医学、农学和畜牧等多方面,可对由细菌病毒和寄生虫等所致疾病进行快速诊断。
多甲藻黄素-叶绿素-蛋白复合物是从横烈甲纲门中分离出来的,它具有非常高的淬灭系数、高量子能效和很大的斯托克位移。PerCP属于活体荧光成像蛋白标记染料,能产生更高、耐光性更好的荧光,相对短波长的青蓝素染料而言,活体荧光成像蛋白标记染料是青蓝素染料卓越的替代品。PerCP通常用于荧光免疫标记,另外,PerCP还用于多色彩细胞的流式细胞分析,故PerCP可以和FITC、PE和其他荧光物质一同用于多色彩分析中。
别藻青蛋白是从蓝绿藻中分离纯化的藻胆蛋白,是用于生物学检测的超敏荧光染料。其作为荧光探针标记抗体,生物素和链霉亲和素或其他蛋白,用于免疫荧光、免疫组化、流式细胞检测及活体成像实验。
利用上述荧光素均可以对HIV-1型抗原、HIV-2型抗原以及HIV-1 p24抗体进行荧光标记。
第二方面,本申请提供一种用于HIV抗原、抗体定量联合检测的试剂盒的检测方法,采用如下的技术方案:
一种用于HIV抗原、抗体定量联合检测的试剂盒的检测方法,具体包括以下步骤:
(1)将待测样本与混匀液A反应10-15min,固液分离并弃去液体,获得抗原-抗体复合物;
(2)向步骤(1)获得的抗原-抗体复合物中加入混匀液B,孵育10-15min,固液分离并弃去液体,获得双抗原-双抗体-夹心复合物;
(3)利用PBS将步骤(2)获得的双抗原-双抗体-夹心复合物定容、混匀,获得检测液;利用流式细胞仪对检测液进行检测,获得待测样本中HIV-1/2型抗体以及HIV-1 p24抗原的相对浓度。
利用上述试剂盒及其检测方法,对待测样本进行检测,具体包括待测样本与混匀液A的反应,将待测样本中的待测HIV-1/2型抗体、HIV-1 p24抗原与磁性荧光编码微球上的HIV-1型抗原、HIV-2型抗原、HIV-1 p24抗体结合,获得抗原-抗体复合物,从而实现待测样本中的待测HIV-1/2型抗体、HIV-1 p24抗原的定位;然后将抗原-抗体复合物与混匀液B反应,利用混合液B中荧光素标记的HIV-1型抗原、HIV-2型抗原以及HIV-1 p24抗体与定位在磁性荧光编码微球上的待测HIV-1/2型抗体、HIV-1 p24抗原反应,进行抗原抗体结合反应,从而完成待测样本中待测HIV-1/2型抗体、HIV-1 p24抗原的荧光标记,获得双抗原-双抗体-夹心复合物;最后,双抗原-双抗体-夹心复合物进行定容,获得检测液,并利用流式细胞仪对检测液进行检测,获得待测样本中的待测HIV-1/2型抗体和HIV-1 p24抗原各自对应的荧光信号强度,再根据利用检测校准品获得的抗原抗体相对浓度与荧光信号强度关系的标准曲线,以检测获得的待测样本中的待测HIV-1/2型抗体和HIV-1 p24抗原各自对应的荧光信号强度为基础,找到与之对应的抗原抗体相对浓度,从而获得待测样本中的待测HIV-1/2型抗体和HIV-1 p24抗原各自对应的浓度,完成对待测样本中HIV-1/2型抗体和HIV-1 p24抗原的相对浓度检测。
待测样本与混匀液A的反应时间可以是10-15min。经过试验分析,待测样本与混匀液A的反应时间控制在上述范围内时,检测获得的HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的荧光信号强度呈现持续增长的趋势;当待测样本与混匀液A反应时间小于上述范围时,检测获得的HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的荧光信号强度小于反应时间处于上述范围内时检测获得的HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的荧光信号强度;当待测样本与混匀液A反应时间大于上述范围时,检测获得的HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的荧光信号强度增长趋势已减缓,且基本不变。因此,为了能够获得更加准确的待测样本中HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的信息,待测样本与混匀液A的反应时间选择控制在10-15min的范围内。
抗原-抗体复合物与混匀液B的反应时间可以是10-15min。经过试验分析,抗原-抗体复合物与混匀液B的反应时间控制在上述范围内时,检测获得的HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的荧光信号强度呈现持续增长的趋势;当抗原-抗体复合物与混匀液B的反应时间小于上述范围时,检测获得的HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的荧光信号强度小于反应时间处于上述范围内时检测获得的HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的荧光信号强度;当抗原-抗体复合物与混匀液B的反应时间大于上述范围时,检测获得的HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的荧光信号强度增长趋势已减缓,且基本不变。因此,为了能够获得更加准确的待测样本中HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的信息,抗原-抗体复合物与混匀液B的反应时间选择控制在10-15min的范围内。
在一个优选的实施方案中,孵育温度为37±1℃。经过试验分析,孵育温度为37℃时,检测获得的HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的荧光信号强度均大于孵育温度为室温(18-25℃)时检测获得的HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的荧光信号强度。因为,为了能够获得更加准确的待测样本中HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的信息,孵育温度选择控制在37±1℃的范围内。
优选的,所述待测样本为全血样本。
优选的,利用溶血剂将全血样本溶解后,再与混匀液A反应。
优选的,利用溶血剂处理步骤(1)获得的抗原-抗体复合物后,再与混匀液B反应。
优选的,所述待测样本为血清或血浆样本。
在一个具体的实施方案中,溶血剂中的表面活性剂可以是tween20、tween80和Triton X-100。优选地,溶血剂中的表面活性剂为Triton X-100。
相关技术中对于HIV抗原、抗体的检测,一般采用的待测样本为人血清样本或血浆样本。以人血清或血浆样本为检测对象时,人血清或血浆样本均需要制备才能获得,通过制备去除全血中的各类细胞,如白血病、红细胞、血小板,以及血浆纤维蛋白等。若利用相关技术中的检测方法,以人全血样本为检测对象进行检测,则无法消除红细胞及其碎片带来的本底干扰,出现明显的假阳性,从而影响对待测样本的检测结果。
本申请的试剂盒及其检测方法不仅可以血清或血浆样本作为待测样本,而且还可以全血样本作为待测样本。一方面,以全血样本作为待测样本,无需进行血清样本或血浆样本的制备,能够有效节省时间,从而能够达到快速检测分析的临床需求。另一方面,由于无需进行血清样本或血浆样本的制备,故消除了在制备血清样本或血浆样本的过程中潜在的污染途径和传染途径,尤其是针对具有高危型的HIV感染样本,还能够有效降低相关工作人员受感染的风险性。
优选的,所述步骤(1)中,待测样本与混匀液A的添加比例为:每1μL待测样本对应加入30-50个抗原或抗体包围的磁性荧光编码微球。
优选的,待测样本的添加量为10-100μL。优选为50μL。
通过采用上述技术方案,经过试验分析,将待测样本与混匀液A的添加比例控制在上述范围内,能够保证最终检测获得较为准确的荧光信号强度,从而获得较为准确的抗原抗体相对浓度。当待测样本与混匀液A的添加比例小于或大于在上述范围内,最终检测获得的荧光信号强度均小于当待测样本与混匀液A的混合比例在上述范围内时的荧光信号强度,从而会导致最终获得的抗原抗体相对浓度不准确,影响最终的检测结果。因此,将测样本与混匀液A的混合比例控制在上述范围内。
同理,将待测样本的添加量控制在上述范围内时,能够保证最终检测获得较为准确的荧光信号强度,从而获得较为准确的抗原抗体相对浓度。当待测样本的添加量小于或大于在上述范围内,最终检测获得的荧光信号强度均小于当待测样本的添加量在上述范围内时的荧光信号强度,从而会导致最终获得的抗原抗体相对浓度不准确,影响最终的检测结果。因此,将待测样本的添加量控制在上述范围内。
综上所述,本申请具有以下有益效果:
1.本申请提供了一种用于HIV抗原、抗体定量联合检测的试剂盒及检测方法,通过一次测试能够分别获得HIV-1/2型抗体和HIV-1p24抗原的相对浓度,能更加有效地区分“窗口期”、“无症状期”、“艾滋病发病期”等阶段,能够为临床诊断、治疗提供更具体、更准确可靠的诊断信息及依据,方便医务工作者针对不同的感染情况开展有效的控制治疗方案。
2.本申请利用磁性荧光编码微球作为载体,其表面积大,能够包被捕获较多的抗原抗体,保证了载体微球能够最大程度地与待测样本中的抗原抗体结合,从而提高了检测灵敏度。且本申请所用载体微球为磁性荧光编码微球,其具有磁性,在清洗的过程中利用磁力吸附大大减小了微球丢失的可能性,易于实现自动化处理。相对于离心清洗微球,磁性荧光编码微球的清洗过程更加简单易操作。
3.本申请的试剂盒及其检测方法的检测对象不仅可以是血清样本或血浆样本,还可以是全血样本,尤其是能够以全血样本作为检测对象。通过对全血样本中血细胞的溶解,利用流式细胞仪检测,并用圈门的方式消除红细胞及其碎片的干扰,减少了血清样本或血浆样本的制备过程,能够达到快速检测分析的临床需求,同时消除了制备过程中潜在的污染途径和传播途径。
4.本申请的试剂盒及其检测方法高效快速,可以在30-60min内出结果,操作简便。
附图说明
图1为实施例1的FSC-SSC(前向角-侧向角度)散点图(待测样本为血清样本)。
图2为图1中HIV-1/2型抗体、HIV-1 p24抗原对应的磁性荧光编码微球与荧光信号强度的散点图。
图3为实施例2的FSC-SSC(前向角-侧向角度)散点图(待测样本为全血样本)。
图4为图3中HIV-1/2型抗体、HIV-1 p24抗原对应的磁性荧光编码微球与荧光信号强度的散点图。
图5为实施例3的FSC-SSC(前向角-侧向角度)散点图(待测样本为全血样本)。
图6为图5中HIV-1/2型抗体、HIV-1 p24抗原对应的磁性荧光编码微球与荧光信号强度的散点图。
具体实施方式
为使本发明的目的、方法及优点更加清楚明确,下面结合具体实施例对本发明做出详细说明,所述的实施例只用于说明本发明,而不是用于对本发明进行限定,任何在本发明基础上所做的修改、等同替换等均在本发明的保护范围内。
以下结合附图1-6、制备例1-13以及实施例1-13对本申请作进一步详细说明。
制备例1-3—溶血剂中表面活性剂的筛选
制备例1-3分别提供了含有不同种类表面活性剂的溶血剂,各实施例所含有的表面活性剂如表1所示。
溶血剂的制备方法如下:向浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.4)中加入体积百分比为0.1%的表面活性剂,混匀,即获得溶血剂。
表1制备例1-3的溶血剂中表面活性剂的种类。
制备例 | 表面活性剂 |
1 | tween20 |
2 | tween80 |
3 | Triton X-100 |
检测试验(一)
以制备例1-3制备的溶血剂为检测对象,进行溶血时间的检测。
检测方法如下:分别向制备例1-3制备的溶血剂中加入全血样本,使得全血样本占总溶液的体积百分比分别为10%、30%、60%和90%;全血样本发生溶血,检测并记录完全溶血的时间。制备例1-3的溶血剂完全溶血时间的检测结果如表2所示。
表2制备例1-3的溶血剂的溶血时间
如表2所示,当加入溶血剂中的全血样本占总溶液的体积百分比分别为10%、30%、60%和90%时,制备例3的溶血剂的完全溶血时间分别为3s、15s、40s和100s,且制备例3的溶血剂的完全溶血时间均小于制备例1的溶血剂以及制备例2的溶血剂的完全溶血时间。制备例3的溶血剂含有的表面活性剂为Triton X-100,由上述结果可知,含有Triton X-100的溶血剂在处理不同量全血样本时,完全溶血时间在100s以内,最长的完全溶血时间为100s。可知,制备例3的溶血剂能快速且充分溶血,故选择制备例3的溶血剂进行后续试验。
另外,通过表2的检测结果可知,全血样本占总溶液的体积百分比越大,完全溶血时间越长;即溶血剂占总溶液的体积百分比越大,完全溶血时间越短。如有更高的溶血时间要求,可以通过提高溶血剂中表面活性剂的体积百分比来加快溶血速度,缩短溶血时间。
本申请还提供了一种用于HIV抗原、抗体定量联合检测的试剂盒,该试剂盒的制备方法具体包括以下两部分:
(1)磁性荧光编码微球的包被
1-1预处理:
获取微球:分别取100μL磁性荧光编码微球悬浮液(约1×107个微球)于3个离心管中,并将3个离心管置于磁力架,进行磁性吸附,分离弃去上清液;
微球洗涤与重悬:分别向3个离心管中加入200μL微球洗涤液,涡旋10s,并将离心管置于磁力架,进行磁性吸附,分离弃去上清液;继续重复洗涤两次;分别向3个离心管中加入100μL微球洗涤液重悬微球,涡旋10s以混匀微球,获得3个微球重悬液A。
1-2活化:
活化微球:分别向3个微球重悬液A中加入10μL活化剂溶液,涡旋10s后,室温下避光反应20-30min,并将3个离心管置于磁力架,进行磁性吸附,分离弃去上清液;
活化后微球的洗涤与重悬:分别向3个离心管中加入200μL微球洗涤液,涡旋10s,并将3个离心管置于磁力架,进行磁性吸附,分离弃去上清液;继续重复洗涤两次;分别向3个离心管中加入100μL微球洗涤液重悬微球,涡旋10s以混匀微球,获得3个微球重悬液B。
1-3包被:
微球包被:分别向3个微球重悬液B中加入HIV-1型抗原、HIV-2型抗原以及HIV-1p24抗体,加入量为10-30μg;涡旋混匀后,室温下避光反应24h;将反应后的3个离心管置于磁力架,进行磁性吸附,分离弃去上清液;
包被后封闭:分别向3个离心管中加入等体积的封闭液,进行封闭反应,室温下避光封闭4h,将反应后的3个离心管置于磁力架,进行磁性吸附,分离弃去上清液;
包被后微球的洗涤与重悬:分别向3个离心管中加入200μL微球保存缓冲液,涡旋10s,将3个离心管置于磁力架,进行磁性吸附,分离弃去上清液;继续重复洗涤两次;分别向3个离心管中加入1ml微球保存缓冲液重悬微球,涡旋10s以混匀微球,获得3种磁性荧光编码微球重悬液。
1-4保存:分别将3种磁性荧光编码微球重悬液置于2-8℃避光保存;将3种磁性荧光编码微球重悬液按1:1:1的比例混合,即为混匀液A。
(2)HIV-1型抗原、HIV-2型抗原、HIV-1 p24抗体的荧光标记
2-1抗原/抗体的活化:将HIV-1型抗原、HIV-2型抗原、HIV-1 p24抗体分别用PBS进行透析(2-8℃);然后用2-IT(2-碘酪氨酸)进行活化,获得活化后的HIV-1型抗原、HIV-2型抗原、HIV-1 p24抗体;
2-2荧光素的活化:利用SMCC(琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐)对PE进行活化,获得活化后的PE;
2-3标记:将活化后的HIV-1型抗原、HIV-2型抗原、HIV-1 p24抗体分别与活化后的PE混合,于2-8℃下避光反应至少20h以上,获得3种混合液;
分别向3种混合液中加入等体积的终止液,进行终止反应,室温条件下避光终止20min,获得PE标记的HIV-1型抗原、HIV-2型抗原、HIV-1 p24抗体;
2-4保存:分别将PE标记的HIV-1型抗原、HIV-2型抗原、HIV-1 p24抗体置于2-8℃避光保存;将PE标记的HIV-1型抗原、HIV-2型抗原、HIV-1 p24抗体混合,即为混匀液B。
制备例4-8—抗原/抗体与磁性荧光编码微球的包被比例
制备例4-8分别提供了用于HIV抗原、抗体定量联合检测的试剂盒的制备方法,制备例4-8的不同之处在于:磁性荧光编码微球的包被步骤中HIV-1型抗原、HIV-2型抗原以及HIV-1 p24抗体的加入量,具体如表3所示。
表3制备例4-8的微球包被步骤中抗原/抗体的加入量
检测试验(二)
以制备例4-8制备的试剂盒为检测对象,进行检测。
检测方法如下:根据本申请试剂盒的检测方法,分别利用制备例4-8制备的试剂盒对抗原/抗体相对浓度为0、15.6、125、500、2000的校准品进行检测。利用流式细胞仪(室温)检测并记录各自对应的荧光信号强度,检测结果如表4所示。
表4制备例4-8的试剂盒对不同抗原/抗体相对浓度校准品的检测结果
如表4所示,除抗原抗体相对浓度为0的校准品外,当磁性荧光编码微球的包被步骤中HIV-1型抗原、HIV-2型抗原以及HIV-1 p24抗体的加入量分别均为10μg、20μg和30μg时,校准品各点的荧光强度基本一致;当磁性荧光编码微球的包被步骤中HIV-1型抗原、HIV-2型抗原以及HIV-1 p24抗体的加入量分别均为5μg时,校准品各点的荧光强度均小于HIV-1型抗原、HIV-2型抗原以及HIV-1 p24抗体的加入量分别均为10μg、20μg和30μg时的荧光强度;当磁性荧光编码微球的包被步骤中HIV-1型抗原、HIV-2型抗原以及HIV-1 p24抗体的加入量分别均为35μg时,校准品各点的荧光强度也均小于HIV-1型抗原、HIV-2型抗原以及HIV-1 p24抗体的加入量分别均为10μg、20μg和30μg时的荧光强度。
由此可知,磁性荧光编码微球的包被步骤中HIV-1型抗原、HIV-2型抗原以及HIV-1p24抗体与磁性荧光编码微球的最适合的包被比例为:10-30μg的抗体或抗原包被1×107个磁性荧光编码微球。
制备例9-13—荧光素标记的抗原/抗体浓度
制备例9-13分别提供了用于HIV抗原、抗体定量联合检测的试剂盒的制备方法,制备例9-13与制备例6的不同之处在于:混合液B中荧光标记的HIV-1型抗原、HIV-2型抗原以及HIV-1 p24抗体的浓度,具体如表5所示。
表5制备例9-13的混合液B中荧光素标记的抗原/抗体浓度
检测试验(三)
以制备例9-13制备的试剂盒为检测对象,进行检测。
检测方法如下:根据本申请试剂盒的检测方法,分别利用制备例9-13制备的试剂盒对抗原/抗体相对浓度为0、15.6、125、500、2000的校准品进行检测。利用流式细胞仪(室温)检测并记录各自对应的荧光信号强度,检测结果如表6所示。
表6制备例9-13的试剂盒对不同抗原/抗体相对浓度校准品的检测结果
如表6所示,可知,校准品各点的荧光强度随荧光素标记的抗原/抗体浓度的提高而提高。当混匀液B中荧光素标记的HIV-1型抗原、HIV-2型抗原以及HIV-1 p24抗体的浓度分别均为10μg、25μg和50μg时,校准品各点的荧光信号强度梯度基本一致;当混匀液B中荧光素标记的HIV-1型抗原、HIV-2型抗原以及HIV-1 p24抗体的浓度分别均为5μg时,校准品在高点值的荧光强度较低;当混匀液B中荧光素标记的HIV-1型抗原、HIV-2型抗原以及HIV-1 p24抗体的浓度分别均为60μg时,校准品在0点值的荧光强度过高。
由此可知,混匀液B中荧光素标记的HIV-1型抗原、HIV-2型抗原以及HIV-1 p24抗体的最适合的浓度范围为10-50μg/mL。
基于上述,本申请还提供了一种用于HIV抗原、抗体定量联合检测的试剂盒的检测方法,具体包括以下步骤:
(1)将混匀液A加入待测样本中,并在37±1℃条件下反应10-15min,固液分离并弃去液体,获得抗原-抗体复合物;待测样本的体积可以是10-100μL,优选为50μL;优选地,每1μL待测样本对应加入30-50个抗原或抗体包围的磁性荧光编码微球;
(2)向步骤(1)获得的抗原-抗体复合物中加入混匀液B,在37±1℃条件下孵育10-15min,固液分离并弃去液体,获得双抗原-双抗体-夹心复合物;混匀液B中应含能够与步骤(1)的混匀液A中包被磁性荧光编码微球的HIV-1型抗原、HIV-2型抗原、HIV-1 p24抗体分别配对的HIV-1型抗原、HIV-2型抗原、HIV-1 p24抗体;
(3)利用PBS将步骤(2)获得的双抗原-双抗体-夹心复合物定容、混匀,获得检测液;利用流式细胞仪对检测液进行检测,获得待测样本中HIV-1/2型抗体和HIV-1 p24抗原的相对浓度。
其中,待测样本可以是血清或血浆样本,也可以是全血样本。当检测样本为全血样本时,需要利用溶血剂对全血样本进行溶解。利用溶血剂将全血样本溶解的时机可以是:
A.利用溶血剂将全血样本溶解后,再与混匀液A反应。
B.利用溶血剂处理步骤(1)获得的抗原-抗体复合物后,再与混匀液B反应。
实施例
利用制备例6中HIV-1型抗原、HIV-2型抗原以及HIV-1 p24抗体与磁性荧光编码微球的包被比例以及制备例11混匀液B中荧光素标记的HIV-1型抗原、HIV-2型抗原以及HIV-1p24抗体的浓度范围制得的试剂盒,进行待测样本中HIV-1/2型抗体以及HIV-1 p24抗原的检测。
实施例1
本实施例提供了一种用于HIV抗原、抗体定量联合检测的试剂盒的检测方法,检测对象为HIV血清样本,具体包括以下步骤:
(1)将20μL HIV血清样本加入15μL的混匀液A中,反应15min,并置于磁力架进行磁性吸附,分离弃去上清液,获得抗原-抗体复合物;
(2)向步骤(1)获得的抗原-抗体复合物中加入15μL混匀液B,37℃下孵育15min,并置于磁力架进行磁性吸附,分离弃去上清液,获得双抗原-双抗体-夹心复合物;
(3)利用PBS将步骤(2)获得的双抗原-双抗体-夹心复合物定容、混匀,获得检测液;
(4)利用流式细胞仪对检测液进行检测,
检测结果如下:
图1为实施例1的FSC-SSC(前向角-侧向角度)散点图(待测样本为血清样本)。
图2为图1中HIV-1/2型抗体、HIV-1 p24抗原对应的磁性荧光编码微球与荧光信号强度的散点图。
检测结果分析如下:
在图1所示的FSC-SSC散点图上圈出HIV-1/2型抗体、HIV-1 p24抗原对应的磁性荧光编码微球,并对图1中圈出的HIV-1/2型抗体、HIV-1 p24抗原对应的磁性荧光编码微球的荧光信号强度进行分析,获得图2所示的HIV-1/2型抗体、HIV-1 p24抗原对应的磁性荧光编码微球与荧光信号强度的散点图,从图2中可获得HIV-1/2型抗体以及HIV-1 p24抗原的荧光信号强度。
利用缓冲液将校准品稀释为不同的抗原抗体相对浓度,利用上述检测方法,分别检测上述各抗原抗体相对浓度下的荧光信号强度,作为标准曲线,结果如表7所示。
表7以HIV血清样本为待测样本的标准曲线
将图2获得的HIV-1/2型抗体、HIV-1 p24抗原的荧光信号强度带入标准曲线,从而获得血清样本中HIV-1/2型抗体、HIV-1 p24抗原的相对浓度。
利用上述检测方法,本实施例分别检测了5个HIV血清样本(编号:血清样本-1~血清样本-5)。根据图1、图2的检测结果以及表7,可知5个血清样本中HIV-1/2型抗体、HIV-1p24抗原的相对浓度,结果如表8所示。
表8实施例1中5个HIV血清样本的检测结果
由表8可明显得知,血清样本-1~血清样本-5中HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的相对浓度。其中,血清样本-3中HIV-1p24抗原的相对浓度为107.26,HIV-1/2型抗体的相对浓度仅为8.02,可见HIV-1/2型抗体刚出现不久,故血清样本-3的阳性病人属于“窗口期”。
血浆是离开血管的全血经抗凝处理后,通过离心沉淀,所获得的不含细胞成分的液体,其中含有纤维蛋白原,若向血浆中加入钙离子,血浆会发生再凝固,因此血浆中不含游离的钙离子。血清是离体的血液凝固之后,经血凝块聚缩释出的液体,其中已无纤维蛋白原,但含有游离的钙离子,若向其中再加入钙离子,血清也不会再凝固。因此,血浆与血清的区别是不含纤维蛋白原。此外,血浆与血清的另一个区别是:血清中少了很多的凝血因子以及血小板释放因子。因此,血清样本和血浆样本的区别并不会影响HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的相对浓度,故本申请仅以血清样本作为待测样本,进行HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原相对浓度的检测。
实施例2
本实施例提供了一种用于HIV抗原、抗体定量联合检测的试剂盒的检测方法,检测对象为HIV全血样本,具体包括以下步骤:
(1)将20μL HIV全血样本加入15μL混匀液A中,反应15min,继续加入100μL含有制备例3制得的溶血剂,进行溶血,并置于磁力架进行磁性吸附,分离弃去上清液,获得抗原-抗体复合物;
(2)向步骤(1)获得的抗原-抗体复合物中加入15μL混匀液B,37℃下孵育15min,并置于磁力架进行磁性吸附,分离弃去上清液,获得双抗原-双抗体-夹心复合物;
(3)利用PBS将步骤(2)获得的双抗原-双抗体-夹心复合物定容、混匀,获得检测液;
(4)利用流式细胞仪对检测液进行检测,
检测结果如下:
图3为实施例2的FSC-SSC(前向角-侧向角度)散点图(待测样本为全血样本)。
图4为图3中HIV-1/2型抗体、HIV-1 p24抗原对应的磁性荧光编码微球与荧光信号强度的散点图。
检测结果分析如下:
在图3所示的FSC-SSC散点图上圈出HIV-1/2型抗体、HIV-1 p24抗原对应的磁性荧光编码微球,并对图3中圈出的HIV-1/2型抗体、HIV-1 p24抗原对应的磁性荧光编码微球的荧光信号强度进行分析,获得图4所示的HIV-1/2型抗体、HIV-1 p24抗原对应的磁性荧光编码微球与荧光信号强度的散点图,从图4中可获得HIV-1/2型抗体以及HIV-1 p24抗原的荧光信号强度。
利用缓冲液将校准品稀释为不同的抗原抗体相对浓度,利用上述检测方法,分别检测上述各抗原抗体相对浓度下的荧光信号强度,作为标准曲线,结果如表9所示。
表9以HIV全血样本为待测样本的标准曲线(一)
将图4获得的HIV-1/2型抗体、HIV-1 p24抗原的荧光信号强度带入标准曲线,从而获得全血样本中HIV-1/2型抗体、HIV-1 p24抗原的相对浓度。
利用上述检测方法,本实施例分别检测了5个HIV全血样本(编号:全血样本-1~全血样本-5)。根据图3、图4的检测结果以及表9,可知5个全血样本中HIV-1/2型抗体、HIV-1p24抗原的相对浓度,结果如表11所示。
实施例3
本实施例提供了一种用于HIV抗原、抗体定量联合检测的试剂盒的检测方法,检测对象为HIV全血样本,具体包括以下步骤:
(1)向20μL全血样本中加入100μL制备例3制备的溶血剂,全血样本被稀释,大量红细胞破碎,作为样本;
(2)将步骤(1)获得的样本中加入15μL混匀液A中,反应15min,并置于磁力架进行磁性吸附,分离弃去上清液,获得抗原-抗体复合物;
(3)向步骤(2)获得的抗原-抗体复合物中加入15μL混匀液B,37℃下孵育15min,并置于磁力架进行磁性吸附,分离弃去上清液,获得双抗原-双抗体-夹心复合物;
(3)利用PBS将步骤(2)获得的双抗原-双抗体-夹心复合物定容、混匀,获得检测液;
(4)利用流式细胞仪对检测液进行检测,
检测结果如下:
图5为实施例3的FSC-SSC(前向角-侧向角度)散点图(待测样本为全血样本)。
图6为图5中HIV-1/2型抗体、HIV-1 p24抗原对应的磁性荧光编码微球与荧光信号强度的散点图。
检测结果分析如下:
在图5所示的FSC-SSC散点图上圈出HIV-1/2型抗体、HIV-1 p24抗原对应的磁性荧光编码微球,并对图5中圈出的HIV-1/2型抗体、HIV-1 p24抗原对应的磁性荧光编码微球的荧光信号强度进行分析,获得图6所示的HIV-1/2型抗体、HIV-1 p24抗原对应的磁性荧光编码微球与荧光信号强度的散点图,从图6中可获得HIV-1/2型抗体以及HIV-1 p24抗原的荧光信号强度。
利用缓冲液将校准品稀释为不同的抗原抗体相对浓度,利用上述检测方法,分别检测上述各抗原抗体相对浓度下的荧光信号强度,作为标准曲线,结果如表10所示。
表10以HIV全血样本为待测样本的标准曲线(二)
将图6获得的HIV-1/2型抗体、HIV-1 p24抗原的荧光信号强度带入标准曲线,从而获得全血样本中HIV-1/2型抗体、HIV-1 p24抗原的相对浓度。
利用上述检测方法,本实施例分别检测了5个HIV全血样本(编号:全血样本-1~全血样本-5,与实施例2的待测样本相同)。根据图5、图6的检测结果以及表10,可知5个全血样本中HIV-1/2型抗体、HIV-1p24抗原的相对浓度,结果如表11所示。
表11实施例2和实施例3中5个HIV全血样本的检测结果
由表11可明显得知,全血样本-1~全血样本-5中HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的相对浓度。已知,实施例2和实施例3的5个全血样本均相同,且各自对应的检测方法的区别仅在于溶血剂的使用时机不同,通过对比表11中实施例2和实施例3对5个全血样本的检测结果,可明显看出实施例2中全血样本-1~全血样本-5的检测结果分别与实施例3中全血样本-1~全血样本-5的检测结果相似,说明实施例2和实施例3中溶血剂的使用时机对全血样本-1~全血样本-5的检测结果没有影响。其中,实施例2和实施例3中,全血样本-4中HIV-1p24抗原的相对浓度分别为253.02、250.39,HIV-1/2型抗体的相对浓度分别仅为5.24、5.77,可见HIV-1/2型抗体刚出现不久,故全血样本-4的阳性病人属于“窗口期”。
通过上述实施例1-3,说明利用本申请的试剂盒进行检测时,检测对象不仅可以是血清或血浆样本,而且可以是全血样本。相对于血清或血浆样本来说,全血样本不需要进行样本处理,制备样本的过程更加简单方便,能够有效节省时间,加快检测进程。
实施例4
本实施例与实施例1的不同之处在于检测对象,本实施例的待测样本为不同浓度的校准品。利用缓冲液将校准品分别稀释至抗原抗体相对浓度为0、15.6、2000,利用实施例1的检测方法,分别检测上述各抗原抗体相对浓度下的荧光信号强度,结果如表12所示。
实施例5
本实施例与实施例4的不同之处在于步骤(2)的孵育温度,本实施例的孵育温度为室温(18~25℃)。利用缓冲液将校准品分别稀释至抗原抗体相对浓度为0、15.6、2000,利用实施例1的检测方法,分别检测上述各抗原抗体相对浓度下的荧光信号强度,结果如表12所示。
表12相同抗原抗体相对浓度不同孵育温度下的荧光信号强度
如表12所示,除抗原抗体相对浓度为0的校准品外,实施例5(孵育温度为37℃)检测获得的HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的荧光信号强度均大于实施例4(孵育温度为室温18-25℃)检测获得的HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的荧光信号强度。因为,为了能够获得更加准确的待测样本中HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的信息,孵育温度选择控制在37±1℃的范围内。
实施例6-9
实施例6-9与实施例1的不同之处在于:(1)待测样本:不同浓度的校准品;(2)待测样本与混匀液A的反应时间(具体如表13所示)。利用缓冲液将校准品分别稀释至抗原抗体相对浓度为0、15.6、2000,利用实施例1的检测方法,分别检测上述各抗原抗体相对浓度下的荧光信号强度,结果如表13所示。
表13待测样本与混匀液A在不同反应时间下的荧光信号强度
如表13所示,除抗原抗体相对浓度为0的校准品外,实施例6(待测样本与混匀液A反应时间5min)检测获得的HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的荧光信号强度小于实施例7-9检测获得的HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的荧光信号强度;实施例7-8检测获得的HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的荧光信号强度呈现持续增长的趋势;与实施例7-8相比,实施例9(待测样本与混匀液A反应时间20min)检测获得的HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的荧光信号强度增长趋势已减缓,且基本不变。因此,为了能够获得更加准确的待测样本中HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的信息,待测样本与混匀液A的反应时间选择控制在10-15min的范围内。
实施例10-13
实施例10-13与实施例1的不同之处在于:(1)待测样本:不同浓度的校准品;(2)抗原-抗体复合物与混匀液B的反应时间(具体如表14所示)。利用缓冲液将校准品分别稀释至抗原抗体相对浓度为0、15.6、2000,利用实施例1的检测方法,分别检测上述各抗原抗体相对浓度下的荧光信号强度,结果如表14所示。
表14抗原-抗体复合物与混匀液B在不同反应时间下的荧光信号强度
如表14所示,实施例10(抗原-抗体复合物与混匀液B的反应时间为5min)检测获得的HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的荧光信号强度小于实施例11-13检测获得的HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的荧光信号强度;实施例11-12检测获得的HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的荧光信号强度呈现持续增长的趋势;与实施例11-12相比,实施例13(抗原-抗体复合物与混匀液B的反应时间为20min)检测获得的HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的荧光信号强度增长趋势已减缓,且基本不变。因此,为了能够获得更加准确的待测样本中HIV-1/2型抗体以及HIV-1p24抗原的信息,抗原-抗体复合物与混匀液B的反应时间选择控制在10-15min的范围内。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释,其并不是对本申请的限制,本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改,但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
1.一种用于HIV抗原、抗体定量联合检测的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒具体包括:
由HIV-1型抗原、HIV-2型抗原和HIV-1 p24抗体分别包被的磁性荧光编码微球的混匀液A;
利用荧光素标记的、与包被磁性荧光编码微球的HIV-1型抗原、HIV-2型抗原、HIV-1p24抗体分别配对的HIV-1型抗原、HIV-2型抗原、HIV-1 p24抗体的混匀液B。
2.根据权利要求1所述的一种用于HIV抗原、抗体定量联合检测的试剂盒,其特征在于:所述混匀液A中,HIV-1型抗原、HIV-2型抗原和HIV-1 p24抗体分别与磁性荧光编码微球的包被比例为:10-30μg的抗体或抗原包被1×107个磁性荧光编码微球。
3.根据权利要求1所述的一种用于HIV抗原、抗体定量联合 检测的试剂盒,其特征在于:所述混匀液B中,HIV-1型抗原、HIV-2型抗原、HIV-1 p24抗体的浓度均为10-50μg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种用于HIV抗原、抗体定量联合检测的试剂盒,其特征在于:所述荧光素包括藻红蛋白(PE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白复合物(PerCP)、别藻青蛋白(APC)。
5.如权利要求1-4任一所述的一种用于HIV抗原、抗体定量联合检测的试剂盒的检测方法,其特征在于,具体包括以下步骤:
(1)将待测样本与混匀液A反应10-15min,固液分离并弃去液体,获得抗原-抗体复合物;
(2)向步骤(1)获得的抗原-抗体复合物中加入混匀液B,孵育10-15min,固液分离并弃去液体,获得双抗原-双抗体-夹心复合物;
(3)利用PBS将步骤(2)获得的双抗原-双抗体-夹心复合物定容、混匀,获得检测液;利用流式细胞仪对检测液进行检测,获得待测样本中HIV-1/2型抗体和HIV-1 p24抗原的相对浓度。
6.根据权利要求5所述的一种用于HIV抗原、抗体定量联合检测的试剂盒的检测方法,其特征在于:所述待测样本为全血样本。
7.根据权利要求6所述的一种用于HIV抗原、抗体定量联合检测的试剂盒的检测方法,其特征在于:利用溶血剂将全血样本溶解后,再与混匀液A反应。
8.根据权利要求6所述的一种用于HIV抗原、抗体定量联合检测的试剂盒的检测方法,其特征在于:利用溶血剂处理步骤(1)获得的抗原-抗体复合物后,再与混匀液B反应。
9.根据权利要求5所述的一种用于HIV抗原、抗体定量联合检测的试剂盒的检测方法,其特征在于:所述待测样本为血清或血浆样本。
10.根据权利要求5所述的一种用于HIV抗原、抗体定量联合检测的试剂盒的检测方法,其特征在于,所述步骤(1)中,待测样本与混匀液A的添加比例为:每1μL待测样本对应加入30-50个抗原或抗体包围的磁性荧光编码微球;待测样本的添加量为10-100μL。
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