CN103869073A - HIV抗体及HIV-1p24抗原双标记时间分辨荧光免疫分析方法及试剂盒 - Google Patents

HIV抗体及HIV-1p24抗原双标记时间分辨荧光免疫分析方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种HIV抗体及HIV-1p24抗原双标记时间分辨荧光免疫分析方法及试剂盒。该分析方法主要包括：制备同时包被有HIV重组抗原和HIV-1p24单克隆抗体的固相载体；制备生物素标记的HIV-1p24单克隆抗体；制备镧系元素1标记的HIV重组抗原；制备镧系元素2标记的链霉亲和素；在抗原和抗体固相载体中，加入含有HIV标准抗体和HIV p24标准抗原的校准品或待测样品，加入生物素标记的HIV-1p24抗体，孵育、洗涤后，加入镧系元素1标记的HIV抗原和镧系元素2标记的链霉亲和素，再次孵育、洗涤后，加入增强液进行荧光检测。本发明的分析方法解决了现有HIV抗原抗体联合检测中抗体与抗原不能区分的难点，实现了同时定量检测HIV抗体和HIV-1p24抗原，缩短了HIV检测窗口期。

Description

HIV抗体及HIV-1p24抗原双标记时间分辨荧光免疫分析方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的分析检测技术，尤其涉及一种HIV抗体及HIV-1p24抗原双标记时间分辨荧光免疫分析方法及试剂盒。
背景技术
人类免疫缺陷病毒（HIV）于1981年在美国首次发现，是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒（lentivirus），属反转录病毒的一种。该病毒破坏人体的免疫能力，导致免疫系统的失去抵抗力，从而导致各种疾病及癌症在人体中的发生，发展到最后，导致艾滋病（获得性免疫缺陷综合症，acquired immuno deficiency syndrome，AIDS）。
HIV病毒基因组是两条相同的正链RNA，每条RNA长约9.2-9.8kb，编码了至少9个蛋白，可分为3类：结构蛋白、调控蛋白、辅助蛋白。根据基因组序列和结构，将HIV分为HIV-1与HIV-2，核酸杂交法检查HIV-1与HIV-2的核苷酸序列仅40%相同。目前已发现HIV-1的主要抗原为gag基因编码水解形成的P24核蛋白以及env基因编码的gp160、gp120；HIV-1O的主要抗原为env基因编码的gp41，HIV-2的主要抗原为env基因编码的gp36。
目前用于HIV检测方法有检测HIV感染者体液中病毒抗原和/或抗体的方法，操作方便，易于普及应用，其中抗体检测尤普遍。但HIV-1p24抗原在HIV感染检测中的地位和重要性也日益受到重视。HIV-1侵入机体后，核心抗原P24的水平随着病毒RNA水平的发展而发展，并在急性感染期即可出现,通常被认为是病毒复制的间接标志，与病情发展密切相关。因此，血液及其它体液标本中P24抗原的检测可以缩短窗口期，有助于HIV-1的早期诊断、预后判断及评价抗病毒治疗的效果,具有良好的实际应用价值。随着P24抗原检测技术的不断进步，低成本的P24抗原检测有望在一定程度上替代现有的昂贵的RNA 测定法。目前，最新一代（第四代）HIV检测试剂采用的是HIV-1/HIV-2抗体与HIV-1O亚群抗体及HIV-1 p24抗原的联合检测方法，但该试剂只能用于定性检测，难以实现精确定量，且不能区分HIV 抗体和抗原。
目前，HIV常用的检测方法有放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA）、酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、化学发光免疫分析法(chemiluminescent immunoassay，CLIA)、电化学发光免疫分析法（electro-chemiluminescence immunoassay，ECLI）等。RIA由于放射性污染，对环境和操作者影响较大，批内批间变异较大，难于自动化；ELISA采用大分子酶标记，且酶容易失活，这种依靠比色法或偏振光法的检测技术所受的干扰因素太多(即使是优秀的“管式ELISA”，其试管形状的变化也会影响试验的结果)，其灵敏度、线性和稳定性未能高于RIA；CLIA的化学发光通常是瞬间完成，发光峰值很快衰减，温度和pH值对发光有很大影响，该类因素影响了该类方法的应用；ECLI仍为非开放系统，试剂依赖进口，试剂昂贵，维修及检测成本高，这也限制了其推广应用。
时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)利用具有独特荧光特性的镧系元素，如铕(Eu)、铽(Te)、钐(Sm)、镝(Dy) 等及其螯合物为示踪剂，代替酶、同位素、荧光物质、化学发光物质等标记抗体、抗原、源素、多肽、蛋白质、核酸探针及生物细胞，待反应体系完成后，用时间分辨荧光免疫分析检测仪测定反应物中的荧光强度，定量分析待测物质的含量。由于镧系元素荧光时间极长，为传统荧光的103～106 倍。激发光与发射光之间的stokes 位移大，可达290nm，而普通荧光素的stokes 位移仅28nm，采用波长分辨和时间延迟的方法，可大大提高检测灵敏度和特异性，目前已应用于临床微量物质，如乙型肝炎病毒标志物以及前列腺抗原、癌胚抗原、甲胎蛋白等肿瘤标志物的定量测定。TRFIA克服了RIA放射性污染的不足、酶标记物的不稳定性和定量范围窄的缺陷、化学发光仅能一次发光、一般荧光标记受环境干扰的难点和ECLI的非直接标记等缺点，Eu标记TRFIA的灵敏度可达10-19 mol/L，目前已实现了分析技术的自动化。然而由于TRFIA法是刚刚开发出来的方法，可检测项目不多，许多项目亟待研究开发；而且在研发过程中需解决本方法稳定性、可重复性的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题即是克服上述现有技术的缺陷，提供一种HIV抗体及HIV-1p24抗原双标记时间分辨荧光免疫分析方法。通过本发明的方法，能解决现有技术中关于HIV检测存在的灵敏度低、稳定性差、操作繁琐等技术问题，尤其可以定量区分出HIV抗体和抗原，缩短HIV检测窗口期，还可用于短期抗病毒治疗效果价值的评估。
为实现上述发明目的，本发明的HIV抗体及HIV-1p24抗原双标记时间分辨荧光免疫分析方法，包括以下步骤：
①制备抗原和抗体固相载体：将HIV抗原和HIV-1p24单克隆抗体用包被缓冲液稀释后作为包被液，包被固相载体，用封闭液封闭，形成抗原和抗体固相载体；
②制备生物素标记抗体：用常规方法对HIV-1p24单克隆抗体进行生物素标记，形成生物素标记抗体；
③制备镧系元素1标记的HIV抗原：参照镧系元素离子标记试剂盒说明书，用镧系元素1对HIV抗原进行标记，制备镧系元素1标记的HIV抗原；
④制备镧系元素2标记的链霉亲和素：参照镧系元素离子标记试剂盒说明书，用镧系元素2对链霉亲和素进行标记，制备镧系元素2标记的链霉亲和素；其中，镧系元素1和镧系元素2是不同的镧系元素；
⑤测定方法：在步骤①制得的抗原和抗体固相载体中，加入含有HIV标准抗体和HIV-1p24标准抗原的校准品或待测样品，加入步骤②制备的生物素标记抗体，经孵育、洗涤所述固相载体后，加入步骤③制备的镧系元素1标记的HIV抗原和步骤④制备镧系元素2标记的链霉亲和素，再次孵育、洗涤所述固相载体后，加入增强液进行荧光检测；其中，HIV标准抗体中不含HIV-1p24抗体。
作为本发明的一种优选实施方式，步骤①中，具体制备步骤如下：将HIV抗原和HIV-1p24单克隆抗体用包被缓冲液分别稀释至0.1～10μg/ml后作为包被液，包被固相载体，孵育、洗涤固相载体后，用封闭液进行封闭，晾干；其中，固相载体为微孔反应条或微孔反应板；包被缓冲液为pH9.6的50mmol/L碳酸盐缓冲液、pH4.5的20mmol/L磷酸盐缓冲液、pH7.8的50mmol/L Tris-HCl缓冲液或pH4.5的50mmol/L柠檬酸盐缓冲液；封闭液为含0.5％BSA、pH7.8的50mmol/L Tris-HCl缓冲液。
作为本发明的一种优选实施方式，步骤③中，具体制备步骤如下：将HIV抗原加入到截留分子量为10000超滤离心管中，8000r／min离心5～6min，用pH为8.0～9.8的50mmol/L碳酸盐标记缓冲液重复洗涤后，将处理得到的HIV抗原加入到预先用标记缓冲液溶解的镧系元素1标记试剂中，混匀，2～8℃振荡孵育72±2h，反应液经用pH7.8、50mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡的层析柱层析，在A280监测收集第一洗脱峰；其中，HIV抗原和镧系元素1标记试剂的质量比为1:1～10:1。
作为本发明的一种优选实施方式，步骤④中，具体制备步骤如下：将链霉亲和素加入到截留分子量为10000超滤离心管中，8000r／min离心5～6min，用pH为8.0～9.8的50mmol/L碳酸盐标记缓冲液重复洗涤后，将处理得到的链霉亲和素加入到预先用标记缓冲液溶解的镧系元素2标记试剂中，混匀，2～8℃振荡孵育72±2h，反应液经用pH7.8、50mmol/LTris-HCl缓冲液平衡的层析柱层析，在A280监测收集第一洗脱峰；其中，链霉亲和素和镧系元素2标记试剂的质量比为1:1～10:1。
作为本发明的一种优选实施方式，步骤⑤中含有HIV标准抗体和HIV-1p24标准抗原的校准品采用以下方式制备：用含有10g/L BSA的pH7.8、50mmol/L的Tris-HCl缓冲液将HIV标准抗体原料和HIV-1p24标准抗原原料稀释成含有0、0.5、1、2、4、8NCU/ml的HIV标准抗体和对应的0、10、40、160、640、1280U/ml的HIV-1p24标准抗原的混合校准品；或者，用50%～55%的血细胞比容的全血将HIV标准抗体原料和HIV-1p24标准抗原原料制备成含有0、0.5、1、2、4、8NCU/ml的HIV标准抗体和对应的0、10、40、160、640、1280U/ml的HIV-1p24标准抗原的混合校准品，用采血滤纸作为载体，将制备好的含有HIV标准抗体和HIV-1p24标准抗原的混合校准品滴加到所述采血滤纸的6个不同位置上，室温自然干燥后得到的干滤纸片校准品。
本发明的另一目的在于提供一种HIV抗体及HIV-1p24抗原双标记时间分辨荧光免疫试剂盒。
为实现上述发明目的，本发明的HIV抗体及HIV-1p24抗原双标记时间分辨荧光免疫试剂盒包括：同时包被有HIV抗原和HIV-1p24单克隆抗体的固相载体、校准品、生物素标记的HIV-1p24单克隆抗体、镧系元素1标记的HIV抗原、镧系元素2标记的链霉亲和素、实验缓冲液、浓缩洗液以及增强液；其中，校准品为同时含有呈浓度梯度的HIV标准抗体和呈浓度梯度的HIV-1p24标准抗原的混合校准品，HIV标准抗体中不含HIV-1p24抗体；镧系元素1和镧系元素2是不同的镧系元素。
作为本发明的一种优选实施方式，所述HIV抗原包括HIV gp120、gp41和/或gp36抗原。
作为本发明的一种优选实施方式，校准品为同时含有HIV标准抗体原液配制而成的0、0.5、1、2、4、8NCU/ml的HIV标准抗体和对应的HIV-1p24标准抗原原液配制而成的0、10、40、160、640、1280U/ml的HIV-1p24HIV标准抗原的混合校准品，所述HIV标准抗体中不含HIV-1p24抗体。
作为本发明的一种优选实施方式，镧系元素1为Eu3+，镧系元素2为Sm3+。
作为本发明的一种优选实施方式，实验缓冲液为含100ml/L BSA、0.05g/L染料1、6ml/L Tween20、0.01mg/L EDTA、30ppm Procline300的pH7.8、50mmol/L Tris-HCl缓冲液；所述浓缩洗液为含有4ml/L Tween20、30ppm染料2、30ppm Procline300的pH7.8、50mmol/L Tris-HCl缓冲液，其中所述染料1的颜色和所述染料2的颜色不一样；所述增强液为含0.5ml/L曲拉通-100、0.8ml/L冰乙酸、0.5g/L乙酸钠、24mg/L三正辛基氧化磷、3mg/Lβ-萘甲酰三氟丙酮的pH3.4、6mmol/L醋酸盐缓冲液。
本发明的HIV抗体及HIV-1p24抗原时间分辨荧光免疫分析方法和试剂盒，联合采用了双抗原夹心、双抗体夹心和生物素-亲和素时间分辨荧光免疫原理，解决了现有HIV抗体和抗原联合检测中抗体（HIV-1/HIV-2型/HIV-1O群）与抗原（HIV-1p24）不能区分的难点；实现了一个微孔能分别检测出HIV抗体和抗原，也实现了一个微孔能同时定量检测HIV抗体（HIV-1/HIV-2型/HIV-1O群）和抗原（HIV-1p24）；该分析方法溯源至国家标准血清物质，实现了HIV抗体（HIV-1/HIV-2型/HIV-1O群）和抗原（HIV-1p24）检测结果的溯源性；使HIV检测窗口期缩短，HIV-1p24抗原的定量检测不仅可以将窗口期缩短4～5天，还有利于短期抗病毒治疗效果价值的评估。还具有检测结果准确性、灵敏度高、特异性强、稳定性好、检测方法简便、高效等特点。
附图说明
图1为本发明试剂盒一个实施例中HIV抗体的血清检测剂量-反应曲线。
图2为本发明试剂盒一个实施例中HIV-1p24抗原的血清检测剂量-反应曲线。
图3为本发明试剂盒一个实施例中HIV抗体的滤纸片检测剂量-反应曲线。
图4为本发明试剂盒一个实施例中HIV-1p24抗原的滤纸片检测剂量-反应曲线。
具体实施方式
本发明分析方法的基本原理是：以HIV抗原和HIV-1p24单克隆抗体共同包被固相载体，在固相载体中加入校准品或待测样本，再加入生物素标记HIV-1p24抗体，孵育后，校准品或待测样本中的HIV抗体或p24抗原分别与固相载体上的HIV抗原和HIV-1p24单克隆抗体结合，形成固相HIV抗原-HIV抗体或固相HIV p24抗体-HIV p24抗原-生物素标记的HIVp24抗体；洗涤去除校准品或对待测样本中未结合的抗体、抗原和杂质，然后同时加入镧系元素1-HIV抗原和镧系元素2-链霉亲和素，孵育后，形成固相HIV抗原-HIV抗体-镧系元素1-HIV抗原和固相HIV p24抗体-HIVp24抗原-生物素标记的HIV p24抗体-镧系元素2-链霉亲和素；洗涤去除未结合的标记物和杂质，利用时间分辨荧光免疫法的原理检测荧光值，镧系元素1标记荧光检测采用镧系元素1标记窗口检测程序，镧系元素2标记荧光检测采用镧系元素2标记窗口检测程序，荧光值强度与校准品或待测样本中的抗体或抗原的含量成正比，根据荧光值比值，从而可以定量测定且区分出所测样本中HIV抗体和p24抗原的值。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例中的HIV重组抗原、HIV p24单克隆抗体、生物素标记HIV p24抗体、链霉亲和素购于Sigma公司；固相载体96孔微孔空白板（8×12孔）购于深圳市金灿华实业有限公司；铕(Eu3+)与钐(Sm3+)标记试剂盒购于芬兰Wallac公司；琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B购于瑞典Pharmacia公司；S&S903滤纸购于芬兰Thermo Labsystems公司；GBW(E)090052HIV-1抗体血清(液体)标准物质和GBW(E)090122HIV-1p24抗原血清(液体)标准物质为中国卫生部临床检验中心提供；HIV抗体参考品、HIV-1p24抗原的参考品为中国食品药品检定研究院提供；增强液、浓缩洗液、实验缓冲液、FWZ-Ⅰ型微量振荡仪、DEM-Ⅲ型全自动酶标洗板均由广州市丰华生物工程有限公司提供。VictorTM 2D1420型TRFIA仪购于美国Perkin Elmer公司。其他试剂为国产分析纯。
实施例1：试剂盒的制备
本实施例1的试剂盒包括：同时包被有HIV抗原和HIV-1p24单克隆抗体的固相载体、校准品、生物素标记的HIV-1p24单克隆抗体、镧系元素1标记的HIV抗原、镧系元素2标记的链霉亲和素、实验缓冲液、浓缩洗液以及增强液。其具体制备方法如下：
①制备抗原和抗体固相载体：将HIV重组抗原（含HIV gp120、gp41、gp36表位，可检测HIV-1型、HIV-2型、HIV-1O亚群）和HIV-1p24单克隆抗体用包被缓冲液（可以使用pH9.6、50mmol/L的碳酸缓冲液；pH4.5的20mmol/L的磷酸盐缓冲液；pH7.8、50mmol/L的Tris-HCl缓冲液或pH4.5、50mmol/L的柠檬酸盐缓冲液等）分别稀释至0.1、0.5、1、2、5、10μg/mL的浓度作为包被液，在96孔微孔空白板加入HIV抗原包被液和HIV-1p24抗体包被液各100μ1/孔，孵育过夜，将96孔板洗涤1次，然后再按250μ1/孔加入0.5％BSA、pH7.8、50mmol/L的Tris-HCl缓冲封闭液，37±2℃条件下孵育2～3h；将96孔板甩干，晾干，真空包装，2～8℃保存备用。
②制备校准品：在本发明中校准品可以是液态的也可以是滤纸干血片。（1）液态校准品：分别以GBW(E)090052HIV-1型抗体血清(液体)标准物质和GBW(E)090122HIV-1型p24抗原血清(液体)标准物质为参比，将HIV单克隆抗体（不含HIV-1p24抗体）原料和HIV-1p24重组抗原原料用含有10g/L BSA的pH7.8、50mmol/L的Tris-HCl缓冲液稀释成含有0、0.5、1、2、4、8NCU/ml HIV标准抗体和对应的0、10、40、160、640、1280U/mlHIV-1p24标准抗原的混合校准品，分装成0.5ml/瓶。（2）滤纸干血片校准品：以HIV-1抗体血清标准物质和HIV-1p24抗原血清标准物质为参比，将HIV抗体（不含HIV-1p24抗体）原料和HIV-1p24抗原原料加入到50%-55%的血细胞比容的全血中充分混匀，制备成含有0、0.5、1、2、4、8NCU/mlHIV标准抗体和对应的0、10、40、160、640、1280U/ml HIV-1p24标准抗原的混合校准品，用S&S903采血滤纸作为载体，将以50μL体积将各个不同浓度的校准品点加至滤纸上，每套标准品共有6个血斑，并有低、中、高浓度的质量控制品3个血斑，经自然阴干后过塑。
③制备生物素标记抗体：可以采用常规方法对HIV-1p24单克隆抗体进行生物素标记，形成生物素标记抗体，本实施例中直接采用商业化的生物素标记的HIV-1p24抗体。采用棋盘方阵滴定法，选出生物素标记HIV-1p24抗体的最适工作浓度，将生物素标记HIV p24抗体用含有10g/L BSA的pH7.8、50mmol/L的Tris-HCl缓冲液稀释成最适工作浓度的1/20倍，使其实际使用时用实验缓冲液再按1:20稀释检测效果最佳。
④制备镧系元素1标记的HIV抗原：按照Eu3+标记试剂盒说明书操作，将1.0mg的HIV重组抗原加入Millipore公司的截留分子量为10000的超滤离心管中，8000r／min离心5～6min，再用标记缓冲液(pH为8.0～9.8的50mmol/L碳酸盐缓冲液)重复洗涤6次，将处理得到的200μL HIV重组抗原加入到1.0mg的预先用标记缓冲液溶解的Eu3+标记试剂充分混匀，2～8℃振荡孵育（72±2）h。反应液用pH7.8、50mmol/L的Tris-HCl缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱（1cm×40cm）层析，在A280监测收集第一洗脱峰。采用棋盘滴定法确定Eu3+标记HIV抗原浓度的最佳工作浓度，使其实际使用时用实验缓冲液再按1:20稀释检测效果最佳。
⑤制备镧系元素2标记的链霉亲和素：按照Sm3+标记试剂盒说明书操作，将1.0mg的SA加入Millipore公司的截留分子量为10000的超滤离心管中，8000r／min离心5～6min，再用标记缓冲液(pH为8.0～9.8的50mmol/L碳酸盐缓冲液)重复洗涤6次，将处理得到的200μl SA加入到1.0mg的预先用标记缓冲液溶解的Sm3+标记试剂充分混匀，2～8℃振荡孵育（72±2）h。反应液经分别用H7.8、50mmol/L的Tris-HCl缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱（1cm×40cm）层析，在A280监测收集第一洗脱峰。采用棋盘滴定法确定Sm3+标记链霉亲和素的最佳工作浓度，使其实际使用时用实验缓冲液再按1:20稀释检测效果最佳。
⑥制备实验缓冲液、浓缩洗液和增强液：
实验缓冲液：含100ml/L小牛血清、0.05g/L染料1、6ml/L Tween20、0.01mg/L EDTA、30ppm Procline300的pH7.8、50mmol/L Tris-HCl缓冲液；
浓缩洗液：含有4ml/L Tween20、30ppm染料2、30ppm Procline300的pH7.8、50mmol/L Tris-HCl缓冲液，其中染料1和染料2的颜色不同，染料的选择没有限制，只要是有颜色的水溶性好、低吸附性的色素染料均可。
增强液：0.5ml/L曲拉通-100、0.8ml/L冰乙酸、0.5g/L乙酸钠、24mg/L三正辛基氧化磷、3mg/Lβ-萘甲酰三氟丙酮的pH3.4、6mmol/L醋酸盐缓冲液。
⑦分装上述水剂校准品、生物素标记抗体、制备镧系元素1标记的HIV抗原、制备镧系元素2标记的链霉亲和素、实验缓冲液（30ml/瓶）、浓缩洗液（40ml/瓶）和增强液（40ml/瓶）。
⑧贴标签，组装为成品。
实施例2：检测分析HIV抗体和HIV-1p24抗原
①试剂准备
抗原和抗体固相载体：将实施例1制备的所需数量的抗原和抗体固相载体平衡至室温（20～25℃）。余下的抗原和抗体固相载体及时置入自封袋密闭并于2～8℃保存。
洗涤液：将实施例1中40ml浓缩洗液和960ml纯化水在干净的容器中混合，作为工作洗涤液备用。
标记物工作液：将实施例1中制备的Eu3+标记HIV重组抗原和Sm3+标记链霉亲和素分别与实验缓冲液按体积比1:1:20加进洁净的同一个一次性容器中并混匀，使用前30min内配制，当次实验用完。
生物素标记抗体工作液：将生物素标记HIV-1p24抗体与实验缓冲液按体积比1:20加进洁净的一次性容器中并混匀，使用前30min内配制，当次试验用完。
②试验操作
血清样本检测法：（1）吸取75μl的HIV抗体和HIV-1p24校准品或对照品、待测样本加入抗原和抗体固相载体各个反应孔中；（2）每个孔中加入25μl生物素标记抗体工作液；（3）抗原和抗体固相载体在室温下，用振荡孵育40min；（4）第一步孵育结束后，用洗涤液洗涤4次；（5）向每个反应位中加入100μl已配好的标记物工作液；（6）在室温下，振荡孵育40min；（7）第二步孵育结束后，洗涤液洗涤6次；（8）向每个反应位中加入增强液100μl；（9）抗原和抗体固相载体于室温下缓慢振荡5min后检测，在30min内完成检测并进行分析，检测在TRFIA仪上自动完成，软件中的参数根据实施例中的条件进行相应设置，Eu3+标记荧光检测采用铕标记窗口检测程序，Sm3+标记荧光检测采用钐标记窗口检测程序。其检测结果如图1和图2所示，图1中在0、0.5、1、2、4、8NCU/ml范围内，曲线的线性线性回归方程为Y=6904.26X+2798，相关系数r为0.998，表明曲线线性趋势良好，采用双对数LOG-LOG_B，SPLINE数学拟合模型的剂量-反应曲线拟合程度高；图2中在0、10、40、160、640、1280U/ml范围内，曲线的线性回归方程为Y=3268.34X+2397,相关系数r为0.999，表明曲线线性趋势良好，采用双对数LOG-LOG_B，SPLINE数学拟合模型的剂量-反应曲线拟合程度高。
滤纸干血片样本检测法：(1)将校准品、质控品或待测样本用打孔器打下直径约3.0mm样品盘,将各样品盘放入抗原和抗体固相载体中；（2）向反应板每孔中加入200μl已配好的生物素标记抗体工作液；（3）抗原和抗体固相载体在室温下，用振荡孵育60min；（4）第一步孵育结束后，甩板，洗涤4次；（5）向每个反应位中加入200μl已配好的标记物工作液；（6）在室温下，振荡孵育60min；（7）第二步孵育结束后，洗涤6次；（8）向每个反应位中加入增强液200μl；（9）抗原和抗体固相载体于室温下缓慢振荡5min后检测，在30min内完成检测并进行分析，检测在TRFIA仪上自动完成，软件中的参数根据实施例中的条件进行相应设置，Eu3+标记荧光检测采用铕标记窗口检测程序，Sm3+标记荧光检测采用钐标记窗口检测程序。其检测结果如图3和图4所示，图3中在0、0.5、1、2、4、8NCU/ml范围内，曲线的线性线性回归方程为Y=69.3X+213，相关系数r为1，表明曲线线性趋势良好，采用双对数LOG-LOG_B，SPLINE数学拟合模型的剂量-反应曲线拟合程度高；图2中在0、10、40、160、640、1280U/ml范围内，曲线的线性回归方程为Y=29.71X+329，相关系数r为0.999，表明曲线线性趋势良好，采用双对数LOG-LOG_B，SPLINE数学拟合模型的剂量-反应曲线拟合程度高。
实施例3：检测结果分析
（1）HIV抗体的检测性能
①阴性参考品符合率：检测HIV抗体国家阴性参考品20支，阳性反应不多于2份（≥18/20）。
②阳性参考品符合率：检测国家HIV1型抗体阳性参考品18支，均为阳性反应（18/18），且P11、P12号样品的检测荧光值P12≥P11；2支HIV2型抗体阳性参考品，均为阳性反应（2/2）。
③最低检出限：检测国家最低检出限参考品6份，阳性反应不少于3份且基质血清S1为阴性反应。
④线性：检测企业参考品，L1～L5共5个样品测定值统计分析后，实测值与理论值的线性相关系数r大于0.98。
⑤准确度：检测企业参考品，L1～L5共5个样品的实测值与理论值相对偏倚均在±20.0%内。
⑥稳定性：试剂盒自成品生产之日起于37℃放置6天（有效期为12个月）成品剩余效期内，则按37℃放置6天有效期为12个月推算37℃放置的时间进行检测，结果符合各项目规定的要求。
（2）HIV1型p24抗原的检测性能
①阴性参考品符合率：检测HIV1型p24抗原国家阴性参考品20支，均为阴性反应（20/20）。
②阳性参考品符合率：检测HIV1型p24抗原国家阳性参考品10支，均为阳性反应（10/10）。
③重复性：平行测定HIV1型p24抗原及抗体联合检测试剂用国家精密度参考品10孔，荧光值的精密度（CV值）≤15%。
④最低检出限：检测国家灵敏度参考品10支：L1(20U/ml)、L2(10U/ml)、L3(5U/ml)、L4(2.5U/ml)、L5(1.25U/ml)……L10(稀释用基质血浆)；最低检出量不得高于10U/ml，L10不得出现阳性反应。
⑤线性：检测国家参考品，L1～L5共5个样品测定值统计分析后，实测值与理论值的线性相关系数r大于0.98。
⑥准确度：检测国家参考品，L1～L5共5个样品的实测值与理论值相对偏倚均在±20.0%内。
⑦稳定性：试剂盒自成品生产之日起于37℃放置6天（有效期为12个月）；成品剩余效期内，则按37℃放置6天有效期为12个月推算37℃放置的时间进行检测，结果符合各项目规定的要求。
实施例4：干扰试验评价
以上实施例1制备的试剂盒的分析特异性评价如下：血样本中胆红素818μmol/L、血红蛋白180g/L、甘油三酯21.54mmol/L对本试剂盒的检测结果无干扰作用。不受血样本中柠檬酸钠（1.088mol/L）、乙二胺四乙酸二钾（0.2744mol/L）、草酸钾（0.5428mol/L）、氟化钠（0.4878mol/L）、肝素钠（150U/L）等抗凝剂的干扰。检测甲型肝炎病毒抗体、乙型肝炎病毒表面抗体、乙型肝炎病毒e抗体、乙型肝炎病毒核心抗体、丙型肝炎病毒抗体、梅毒抗体、乙型肝炎病毒表面抗原、乙型肝炎病毒e抗原、重组乙型肝炎病毒核心抗原、重组丙型肝炎病毒核心抗原均无交叉反应。
实施例5：实施例1的试剂盒与参比试剂盒的等效性评价
用实施例1的试剂盒和参比试剂盒分别检测1020例正常人血清样本，其临床比对结果如表1所示。
表1
Figure BDA0000485351940000131
由上表1可以看出，本发明的试剂盒的特异性为100%。
用实施例1的试剂盒和参比试剂盒分别检测306例HIV抗体阳性血清样本，其临床比对结果如表2所示。
表2
Figure BDA0000485351940000132
由上表2可以看出，本发明的试剂盒检测HIV抗体的灵敏度为100%。
用实施例1的试剂盒和参比试剂盒分别检测261例HIV-1p24抗原阳性血清样本，其临床比对结果如表3所示。
表3
Figure BDA0000485351940000141
由上表3可以看出，本发明的本发明的试剂盒检测HIVp24抗原的灵敏度为100%。
本发明的试剂盒和检测分析方法联合采用了双抗原夹心、双抗体夹心和生物素-亲和素分辨荧光免疫法，操作简单快速，可实现自动化分析，非常值得在临床上应用推广。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种HIV抗体及HIV-1p24抗原双标记时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
①制备抗原和抗体固相载体：将HIV抗原和HIV-1p24单克隆抗体用包被缓冲液稀释后作为包被液，包被固相载体，用封闭液封闭，形成抗原和抗体固相载体；
②制备生物素标记抗体：用常规方法对HIV-1p24单克隆抗体进行生物素标记，形成生物素标记抗体；
③制备镧系元素1标记的HIV抗原：参照镧系元素离子标记试剂盒说明书，用镧系元素1对HIV抗原进行标记，制备镧系元素1标记的HIV抗原；
④制备镧系元素2标记的链霉亲和素：参照镧系元素离子标记试剂盒说明书，用镧系元素2对链霉亲和素进行标记，制备镧系元素2标记的链霉亲和素；其中，所述镧系元素1和镧系元素2是不同的镧系元素；
⑤测定方法：在步骤①制得的抗原和抗体固相载体中，加入含有HIV标准抗体和HIV-1p24标准抗原的校准品或待测样品，加入步骤②制备的生物素标记抗体，经孵育、洗涤所述固相载体后，加入步骤③制备的镧系元素1标记的HIV抗原和步骤④制备镧系元素2标记的链霉亲和素，再次孵育、洗涤所述固相载体后，加入增强液进行荧光检测；其中，所述HIV标准抗体中不含HIV-1p24抗体。
2.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述步骤①中，具体制备步骤如下：将HIV抗原和HIV-1p24单克隆抗体用包被缓冲液分别稀释至0.1～10μg/ml后作为包被液，包被固相载体，孵育、洗涤固相载体后，用封闭液进行封闭，晾干；其中，所述固相载体为微孔反应条或微孔反应板；所述包被缓冲液为pH9.6的50mmol/L碳酸盐缓冲液、pH4.5的20mmol/L磷酸盐缓冲液、pH7.8的50mmol/L Tris-HCl缓冲液或pH4.5的50mmol/L柠檬酸盐缓冲液；所述封闭液为含0.5％BSA、pH7.8的50mmol/L Tris-HCl缓冲液。
3.如权利要求1所述的分析法，其特征在于，所述步骤③中，具体制备步骤如下：将HIV抗原加入到截留分子量为10000的超滤离心管中，8000r／min离心5～6min，用pH8.0～9.8、50mmol/L碳酸盐标记缓冲液重复洗涤后，将处理得到的HIV抗原加入到预先用标记缓冲液溶解的镧系元素1标记试剂中，混匀，2～8℃振荡孵育72±2h，反应液经用pH7.8、50mmol/LTris-HCl缓冲液平衡的层析柱层析，在A280监测收集第一洗脱峰；其中，所述HIV抗原和所述镧系元素1标记试剂的质量比为1:1～10:1。
4.如权利要求1所述的分析法，其特征在于，所述步骤④中，具体制备步骤如下：将链霉亲和素加入到截留分子量为10000的超滤离心管中，8000r／min离心5～6min，用pH8.0～9.8、50mmol/L碳酸盐标记缓冲液重复洗涤后，将处理得到的链霉亲和素加入到预先用标记缓冲液溶解的镧系元素2标记试剂中，混匀，2～8℃振荡孵育72±2h，反应液经用pH7.8、50mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡的层析柱层析，在A280监测收集第一洗脱峰；其中，所述链霉亲和素和所述镧系元素2标记试剂的质量比为1:1～10:1。
5.如权利要求1所述的分析法，其特征在于，所述步骤⑤中含有HIV标准抗体和HIV-1p24标准抗原的校准品采用以下方式制备：
用含有10g/L BSA的pH7.8、50mmol/L的Tris-HCl缓冲液将HIV标准抗体原料和HIV-1p24标准抗原原料稀释成含有0、0.5、1、2、4、8NCU/ml的HIV标准抗体和对应的0、10、40、160、640、1280U/ml的HIV-1p24标准抗原的混合校准品；或者，
用50%～55%的血细胞比容的全血将HIV标准抗体原料和HIV-1p24标准抗原原料制备成含有0、0.5、1、2、4、8NCU/ml的HIV标准抗体和对应的0、10、40、160、640、1280U/ml的HIV-1p24标准抗原的混合校准品，用采血滤纸作为载体，将制备好的含有HIV标准抗体和HIV-1p24标准抗原的混合校准品滴加到所述采血滤纸的6个不同位置上，室温自然干燥后得到的干滤纸片校准品。
6.一种HIV抗体及HIV-1p24抗原双标记时间分辨荧光免疫试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：同时包被有HIV抗原和HIV-1p24单克隆抗体的固相载体、校准品、生物素标记的HIV-1p24单克隆抗体、镧系元素1标记的HIV抗原、镧系元素2标记的链霉亲和素、实验缓冲液、浓缩洗液以及增强液；
其中，所述校准品为同时含有呈浓度梯度的HIV标准抗体和呈浓度梯度的HIV-1p24标准抗原的混合校准品，所述HIV标准抗体中不含HIV-1p24抗体；
所述镧系元素1和镧系元素2是不同的镧系元素。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述HIV抗原包括HIVgp120、gp41和/或gp36抗原。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述校准品为同时含有HIV标准抗体原液配制而成的0、0.5、1、2、4、8NCU/ml的HIV标准抗体和对应的HIV-1p24标准抗原原液配制而成的0、10、40、160、640、1280U/ml的HIV-1p24HIV标准抗原的混合校准品，所述HIV标准抗体中不含HIV-1p24抗体。
9.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述镧系元素1为Eu3+，所述镧系元素2为Sm3+。
10.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述实验缓冲液为含100ml/L BSA、0.05g/L染料1、6ml/L Tween20、0.01mg/L EDTA、30ppmProcline300的pH7.8、50mmol/L Tris-HCl缓冲液；所述浓缩洗液为含有4ml/L Tween20、30ppm染料2、30ppm Procline300的pH7.8、50mmol/LTris-HCl缓冲液，其中所述染料1的颜色和所述染料2的颜色不一样；所述增强液为含0.5ml/L曲拉通-100、0.8ml/L冰乙酸、0.5g/L乙酸钠、24mg/L三正辛基氧化磷、3mg/Lβ-萘甲酰三氟丙酮的pH3.4、6mmol/L醋酸盐缓冲液。
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