CN105954509A - 肾素化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肾素化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，肾素化学发光免疫检测试剂盒包括：肾素单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒和抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物。这种肾素化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成肾素的检测这种肾素化学发光免疫检测试剂盒，经过实验，其检测灵敏度达到1pg/mL，相对于传统的肾素的检测方法灵敏度至少提高了10倍，这种肾素化学发光免疫检测试剂盒的检测精度较高。

Description

肾素化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及体外检测领域，尤其涉及一种肾素化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
肾素主要由肾小球旁细胞分泌，释放入肺循环中的血管紧张素转换酶的作用转化为血管紧张素Ⅱ。血管紧张素Ⅱ可直接使小动脉平滑肌收缩，外周阻力增加，从而使肾小管远端集合管钠再增强，导致体内水与钠潴留。血管紧张素Ⅱ和转换酶等经常存在于血浆中，因此肾素的释放是决定血浆中血管紧张素浓度的关键性条件。
高血压是最常见的心血管疾病，其发病率逐年上升，并可引起严重的心、脑、肾并发症，是脑卒中和冠心病的主要危险因素。血浆肾素含量的检测，可用于诊断高血压，诊断原发性醛固酮增多症，以及为原发性高血压病人心血管系统的并发症的发生提供有效的信息等。另外还可用于高血压患者的预后评估。
目前临床检测肾素的常见方法有酶联免疫吸附法、放射免疫分析法、酶促化学发光法，但这些方法都存在着一些不足之处。
一、酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附法(ELISA) 被广泛应用，但该方法也存在着下述的不足之处：
(1) 使用12×8型、6×8型、8×12型或整板型96 孔专用微孔板作为抗原包被用具和反应容器，在使用时只能分成12 批次、6 批次、8 批次或整板一次使用，无法进行独立的、单人份的检测；
(2) 定量测定所用的试剂种类较多，每一种检测试剂都要用试剂瓶来盛装，并且每使用一种试剂时都需要更换吸液嘴来分别加注到微孔板的微孔中，不但试剂瓶种类多，加注试剂的操作也极为繁琐；
(3) 缺少对检测信息的相应标注，只能通过查看试剂盒外包装盒的标识才能了解或知悉检测试剂的生产批号及有效期信息，而且所知悉的信息在检测过程中不受控，具有很大的随意性；
(4) 检测试剂在检测过程中处于开放的空间，容易引起各种试剂之间的交叉污染而影响检测结果的准确性；
(5) 检测过程多采用手工操作，试剂或样本的加量不很精确，操作过程极为繁琐和复杂，容易发生操作差错，检测结果的准确度和精密度较差；
(6) 在检测项目成套试剂的数量配置及使用上均为项目数×48/96人份，如果需要检测10 个项目，则试剂的配置及使用数须为10×48/96人份，如果只有一份样本需要检测10 个不同的项目，也需要配置10×48/96人份的试剂，存在着不够经济合理的缺点。
二、放射免疫分析法
放射免疫分析方法放射性污染大、加样步骤繁琐、操作复杂、操作时间长、测定结果不稳定、试剂保存时间短、试剂盒操作自动化程度低、配套仪器价格昂贵等不足之处。
二、化学发光法
化学发光法按发光原理可分为直接化学发光和酶促化学发光。
酶促化学发光主要有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶两种，但都有一定的局限性，辣根过氧化物酶主要缺点为：鲁米诺在没有辣根过氧化物酶存在情况下，也会被H2O2氧化自身发光，本底相对较高，影响信噪比，反应动力学复杂，影响因素多，结果不够稳定，要得到灵敏度高且平台期长的底物不容易。碱性磷酸酶主要缺点为：底物达到平台期的时间长，底物成本高，导致检测成本高，患者负担重。
吖啶酯作为标记物的直接化学发光相比酶促化学发光具有明细优势，主要表现在：反应不需要催化剂，只要碱性环境即可进行，反应迅速，背景发光低，信噪比高，干扰因素少，试剂稳定性好，可以两点定标，体系简单，激发液成本低，吖啶酯易与蛋白质联结，且联结后光子产率不减少。
发明内容
基于此，有必要提供一种检测灵敏度较高的肾素化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
一种肾素化学发光免疫检测试剂盒，包括：肾素单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒和抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物。
在一个实施例中，所述肾素单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒中，所述肾素单克隆抗体与所述羧基化的磁微粒的比例为1：25~35。
在一个实施例中，所述抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物中，所述肾素单克隆抗体与所述化学发光标记物的比例为50：1~10。
在一个实施例中，所述羧基化的磁微粒的粒径为0.05μm~1μm。
在一个实施例中，所述化学发光标记物为鲁米诺、异鲁米诺、三联吡啶钌或吖啶酯。
在一个实施例中，还包括化学发光底物液，所述化学发光底物液包括A液和B液。
在一个实施例中，所述A液为H2O2溶液，所述B液为NaOH溶液。
在一个实施例中，还包括肾素定标品。
在一个实施例中，所述肾素定标品为浓度分别为0pg/mL、50pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL和1600pg/mL的肾素的溶液。
一种上述的肾素化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
取羧基化的磁微粒的悬浮液，磁分离去上清后用MES缓冲液重悬，接着加入EDC水溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接着加入肾素单克隆抗体，室温下混悬2h~10h，磁分离去除上清后用Tris缓冲液重悬，得到肾素单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒；以及
取肾素单克隆抗体，加入碳酸盐缓冲液后混匀，然后加入化学发光标记物后混匀，室温下避光反应1h~2h后除杂，得到抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物。
这种肾素化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成肾素的检测这种肾素化学发光免疫检测试剂盒，经过实验，其检测灵敏度达到1pg/mL，相对于传统的肾素的检测方法灵敏度至少提高了10倍，这种肾素化学发光免疫检测试剂盒的检测精度较高。
附图说明
图1为一实施方式的肾素化学发光免疫检测试剂盒的制备方法的流程图；
图2为实施例3得到的肾素标准曲线图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
一实施方式的肾素化学发光免疫检测试剂盒，包括：肾素单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒和抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物。
优选的，肾素单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒中，肾素单克隆抗体与羧基化的磁微粒的比例为1：25~35。
优选的，抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物中，肾素单克隆抗体与化学发光标记物的比例为50：1~10。
优选的，羧基化的磁微粒的粒径为0.05μm~1μm。
化学发光标记物可以为鲁米诺、异鲁米诺、三联吡啶钌或吖啶酯。其中，化学发光标记物优选为吖啶酯。
在其他的实施例中，上述肾素化学发光免疫检测试剂盒还包括化学发光底物液。
化学发光底物液包括A液和B液。A液可以为H2O2溶液，B液可以为NaOH溶液。
本实施例中，A液为浓度为0.1mol/L的H2O2溶液，B液为浓度为0.25mol/L的NaOH溶液。
在其他的实施例中，上述肾素化学发光免疫检测试剂盒还包括肾素定标品。
肾素定标品为浓度分别为0pg/mL、50pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL和1600pg/mL的肾素的溶液。
具体的，肾素定标品可以采用标准品缓冲液将肾素配制成浓度分别为0pg/mL、50pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL和1600pg/mL的肾素的溶液。
这种肾素化学发光免疫检测试剂盒用于肾素检测时，利用全自动化学发光免疫分析仪对肾素定标品进行检测，绘制标准曲线，内置于电脑软件；接着测试实际样本，根据样本发光值计算样本浓度；最后对肾素全自动化学发光免疫分析系统进行性能（灵敏度、线性、精密度、干扰性）的评价。
这种肾素化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成肾素的检测这种肾素化学发光免疫检测试剂盒，经过实验，其检测灵敏度达到1pg/mL，相对于传统的肾素的检测方法灵敏度至少提高了10倍，这种肾素化学发光免疫检测试剂盒的检测精度较高。
此外，这种肾素化学发光免疫检测试剂盒还具有以下优点：
1、选择吖啶酯作为标记材料，并应用于化学发光免疫分析系统，该发光体系为直接化学发光，与传统的酶促化学发光相比，该反应不需要酶的参与，更加节约成本；
2、选用吖啶酯的化学发光免疫分析系统线性范围宽，能达到1pg/mL~ 1000pg/mL，而传统的肾素的检测方法的检线性范围为10pg/mL~ 800pg/mL；
3、吖啶酯化学发光免疫分析系统重复性高，批内及批间差均在5%以内，这是其它化学发光免疫分析系统难以达到的；
4、化学发光免疫分析系统已实现样本的定量，通过内置标准曲线到测试软件，只需测试样本就可直接得到样本的浓度值；
5、化学发光免疫分析系统可以实现全自动化，试剂及样本的添加全有仪器完成，操作更加简便，减少了人为的误差。
如图1所示的上述肾素化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
取羧基化的磁微粒的悬浮液，磁分离去上清后用MES缓冲液重悬，接着加入EDC水溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接着加入肾素单克隆抗体，室温下混悬2h~10h，磁分离去除上清后用Tris缓冲液重悬，得到肾素单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒。
MES（2-(N-吗啡啉)乙磺酸）缓冲液的浓度为0.02M，pH为5.5。
Tris缓冲液的浓度为0.1M并且含有2%BSA，pH为8.0。
EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺）水溶液的浓度为10mg/mL~20mg/mL，EDC与羧基化的磁微粒的比例为0.05：0.1~1。
优选的，肾素单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒中，肾素单克隆抗体与羧基化的磁微粒的比例为1：25~35。
优选的，羧基化的磁微粒的粒径为0.05μm~1μm。
取肾素单克隆抗体，加入碳酸盐缓冲液后混匀，然后加入化学发光标记物后混匀，室温下避光反应1h~2h后除杂，得到抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物。
碳酸盐缓冲液浓度为0.1M，pH为9.0~9.5，
除杂的操作为离心脱盐柱脱盐，具体操作为：先分别用纯净水及TBS缓冲液（40 mM Tris-HCl，0.5% BSA，1% NaCl，pH 8.0）处理离心脱盐柱，最后加入得到的肾素单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒的溶液，最后收集离心管中的液体。
优选的，抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物中，肾素单克隆抗体与化学发光标记物的比例为50：1~10。
化学发光标记物可以为鲁米诺、异鲁米诺、三联吡啶钌或吖啶酯。其中，化学发光标记物优选为吖啶酯。
得到的肾素单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒和抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物组合即可得到上述肾素化学发光免疫检测试剂盒。
这种肾素化学发光免疫检测试剂盒在使用时，还需要化学发光底物液和肾素定标品。
化学发光底物液和肾素定标品可以自行配制得到。
化学发光底物液包括A液和B液。A液可以为H2O2溶液，B液可以为NaOH溶液。
本实施例中，A液为浓度为0.1mol/L的H2O2溶液，B液为浓度为0.25mol/L的NaOH溶液。
具体的，肾素定标品可以采用标准品缓冲液将肾素配制成浓度分别为0pg/mL、50pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL和1600pg/mL的肾素的溶液。
这种肾素化学发光免疫检测试剂盒的制备方法简单方便，制得的肾素化学发光免疫检测试剂盒的检测灵敏度较高，具有良好的应用前景。
以下为具体实施例。
实施例1：肾素化学发光免疫检测试剂盒的制备
（1）肾素单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒的制备：
取含有50mg粒径为0.05μm~1μm的羧基化的磁微粒（MagnaBind21353）悬浮液，磁分离去上清，用0.02 M，pH为5.5 MES缓冲液重悬，加入1mL新配置的10mg/mL的EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入4mg肾素单克隆抗体（biorbyt，货号orb48780），室温下混悬6h，磁分离，去除上清，用含2%BSA的0.1M，pH为8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到肾素单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒，每瓶5mL分装保存于4℃备用。
（2）抑制素单克隆抗体标记的吖啶酯的制备：
取50μL浓度为25mg/mL的肾素单克隆抗体，加入150μL浓度为0.1M、pH为9.0~9.5的碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入1.5μL浓度为5mg/mL的吖啶酯溶液混匀，室温下避光反应，1.5h后取出，用2mL的zeba离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，最后加入得到的抑制素单克隆抗体标记的吖啶酯溶液，收集离心管中的液体至保存管得到抑制素单克隆抗体标记的吖啶酯，每瓶5mL分装保存于4℃备用。
（3）肾素定标品的制备：
用标准品缓冲液（40 mM Tris-HCl，0.5% BSA，1% NaCl，pH 8.0）将肾素配置成浓度为0pg/mL、50 pg /mL、200pg /mL、500 pg /mL、1000 pg /mL和1600 pg /mL，每瓶0.5 mL分装冻干，4 ℃保存备用。
实施例2：肾素化学发光免疫检测方法
以全自动化学发光免疫分析仪（YHLO，货号iFlash3000）为检测工具，方法学模式为双抗体夹心法，即仪器依次加入50 μL的样品、50 μL的肾素单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒以及50 μL的肾素处理液，反应20 min后，再加50 μL的肾素包被的吖啶酯，反应20 min后，进行磁分离，仪器将反应混合物送入暗室，依次加入发光底物A液（H2O2）及B液（NaOH）进行发光反应，最后记录发光值。
实施例3：肾素化学发光免疫检测试剂盒性能评价
采用实施例2中的方法对肾素定标品进行检测，得到绘制标准曲线如图2所示。
接着对接着测试实际样本，根据样本发光值计算样本浓度。
灵敏度的检测：
参照CLSI EP17-A 文件推荐实验方案，计算肾素化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度，求得的灵敏度为1pg/ mL。
线性的检测：
对浓度为1 pg /mL、50 pg /mL、200pg /mL、500 pg /mL、1000 pg /mL标准品做线性分析，计算线性相关系数，r=0.9996，另外，该试剂盒对肾素样品检测的线性范围为1pg/ml ~1000pg/mL。
精密度测定：
取浓度为100pg/mL及1000pg/mL两个肾素样品，每个样本每个浓度各做3个平行，用三批试剂盒进行检测，计算试剂盒批内及批间差，结果表明该试剂盒批内及批间差均小于5%。
干扰性实验：
取混合血清分别添加干扰物包括：结合胆红素、游离胆红素、血红蛋白、抗坏血酸、甘油酯，添加比例按照 1：20进行，分别测定混合血清及添加了各种干扰物后混合血清的测值，计算二者之间的偏差，以 ±10%为可接受范围。结果表明，干扰性均达到 NCCLS 的文件标准，可用于临床实验室肾素 状况的准确评估。
实施例4、肾素化学发光免疫检测试剂盒的对比实验
分别用化学发光检测方法和传统的酶联免疫吸附法对浓度为1 pg /mL、50 pg /mL、200pg /mL、500 pg /mL、1000 pg /mL、1600 pg /mL的肾素样品做检测，两种方法检测灵敏度相比，数据如下表所示：
由上表可以看出，化学发光检测方法的灵敏度较酶联免疫吸附法提高了约10倍。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种肾素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括：肾素单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒和抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物。
2.根据权利要求1所述的肾素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述肾素单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒中，所述肾素单克隆抗体与所述羧基化的磁微粒的比例为1：25~35。
3.根据权利要求1所述的肾素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物中，所述肾素单克隆抗体与所述化学发光标记物的比例为50：1~10。
4.根据权利要求1所述的肾素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述羧基化的磁微粒的粒径为0.05μm~1μm。
5.根据权利要求1所述的肾素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记物为鲁米诺、异鲁米诺、三联吡啶钌或吖啶酯。
6.根据权利要求1所述的肾素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，还包括化学发光底物液，所述化学发光底物液包括A液和B液。
7.根据权利要求6所述的肾素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述A液为H2O2溶液，所述B液为NaOH溶液。
8.根据权利要求1所述的肾素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，还包括肾素定标品。
9.根据权利要求8所述的肾素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述肾素定标品为浓度分别为0pg/mL、50pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL和1600pg/mL的肾素的溶液。
10.一种根据权利要求1~9中任一项所述的肾素化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
取羧基化的磁微粒的悬浮液，磁分离去上清后用MES缓冲液重悬，接着加入EDC水溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接着加入肾素单克隆抗体，室温下混悬2h~10h，磁分离去除上清后用Tris缓冲液重悬，得到肾素单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒；以及取肾素单克隆抗体，加入碳酸盐缓冲液后混匀，然后加入化学发光标记物后混匀，室温下避光反应1h~2h后除杂，得到抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物。
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