CN108508000A - 乙肝前s1抗原化学发光检测试剂盒 - Google Patents

乙肝前s1抗原化学发光检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种乙肝前S1抗原化学发光检测试剂盒，所述试剂盒包括试剂1和试剂2，所述试剂1包括缓冲液、磁微粒、生物素标记的抗乙肝前S1抗原单克隆抗体和多羟基醇；和所述试剂2包括缓冲液、吖啶酯标记的抗乙肝前S1抗原多克隆抗体和多羟基糖。本发明试剂盒在使用中信号背景低，信号强度显著增加；试剂盒的灵敏度、准确性和重复性显著增加。

Description

乙肝前S1抗原化学发光检测试剂盒
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂领域，具体涉及一种乙肝前S1抗原化学发光检测试剂盒。
背景技术
乙型肝炎是严重危害人类健康的传染性疾病，全球约有20亿人曾感染过乙型肝炎病毒(HBV)，其中3.5亿人为慢性HBV感染。
编码HBV蛋白的基因区共有4个：S基因区、C基因区、P基因区和X基因区。其中S基因区由S基因、前S2基因、前S1基因组成，分别编码HBsAg、前S2蛋白、前S1蛋白及多聚人血清白蛋白受体。HBV前S1抗原(PreS1-Ag)主要存在于完整的Dane颗粒和管型颗粒表面，是由前S1基因编码的表面抗原蛋白成分之一，在HBV感染者血清中一般与HBsAg共同表达。PreS1-Ag可以与肝细胞表面受体特异性结合，是病毒进入肝细胞的关键蛋白；同时，PreS1-Ag蛋白位于HBV表面，具有高度的免疫性，介导宿主的免疫应答，在病毒与肝细胞结合、调节乙型肝炎病毒DNA合成、转化病毒与细胞基因表达活性、调节机体免疫、导致疾患等方面起作用，并在病毒装配、表现出传染性等过程中起着至关重要的作用。
长期以来人们认为HBeAg阳性是HBV复制活跃的指标之一，但近年来国内外不少研究表明PreS1-Ag是病毒存在和复制的又一新指标，并且PreS1-Ag与HBV复制的检验金标准HBV-DNA的结果非常相近，同时印证了PreS1-Ag参与HBV的组装、复制和对肝细胞侵袭及与HBV颗粒体内存在有关。
检测前S1抗原为双抗体夹心法，常见的检测方法有酶联免疫吸附法，放射免疫分析法，化学免疫分析发光法，但这些方法都存在一些不足之处。酶联免疫吸附法多采用手工操作，自动化程度低；操作步骤复杂且时间长；检测结果准确度和精密度较差，灵敏度低。放射免疫分析法，放射性污染大，操作复杂、实验耗时长，试剂盒保存时间短，检测结果不稳定、灵敏度低。化学发光免疫分析法常见的有板式化学发光法和磁微粒化学发光法。板式化学发光法与酶联免疫法相似，自动化程度低，多采用手工操作，检测结果由于人为因素导致的误差较大，灵敏度也较低；磁微粒化学发光法采用全自动仪器进行检测，自动化程度高，结果更稳定，但目前临床上使用的试剂盒普遍存在灵敏度偏低，低端分辨率不足的问题，而且多采用多点校准品定标，增加试剂检测成本和患者负担。
在国内，前S1抗原检测在临床上主要以化学发光免疫分析法为主，但由于具有自主知识产权的国产前S1抗原检测试剂盒目前还比较少，而且灵敏度较低，试剂成本高，目前一般只在三甲医院有开展，在三甲以下医院开展较少，因此有待开发对前S1抗原检测灵敏度高、特异性好并且能降低检测成本的检测技术。
发明内容
本发明提供一种乙肝前S1抗原化学发光检测试剂盒，所述试剂盒包括试剂1和试剂2，所述试剂1包括缓冲液、磁微粒、生物素标记的抗乙肝前S1抗原单克隆抗体和多羟基醇；和所述试剂2包括缓冲液、吖啶酯标记的抗乙肝前S1抗原多克隆抗体和多羟基糖。
在一些实施方式中，缓冲液是pH6.0～8.0、5mM～100mM的PBS缓冲液。在一些实施方式中，缓冲液可以是pH7.0～7.5、20mM～80mM的PBS缓冲液、20mM～60mM、20mM～40mM的PBS缓冲液。
在一些实施方式中，所述试剂1包括缓冲液、0.2mg/mL～0.6mg/mL磁微粒、4μg/mL～12μg/mL生物素标记的抗乙肝前S1抗原单克隆抗体和5g/L～50g/L甘露醇或山梨糖醇；和所述试剂2包括缓冲液、2.0μg/mL～6.0μg/mL吖啶酯标记的抗乙肝前S1抗原多克隆抗体和5g/L～50g/L海藻糖或蔗糖。在一些实施方式中，可以是0.3mg/mL～0.5mg/mL磁微粒；可以是6μg/mL～10μg/mL生物素标记的抗乙肝前S1抗原多克隆抗体；和10g/L～40g/L甘露醇或山梨糖醇、20g/L～30g/L甘露醇或山梨糖醇。
在一些实施方式中，所述试剂1还包括1g/L～50g/L牛血清白蛋白、5mL/L～20mL/L丙三醇、0.05mL/L～0.2mL/L TritonX-100、10mg/L～50mg/L 4-氨基安替比林和0.5mL/L～5mL/L proclin-300。在一些实施方式中，可以是5g/L～40g/L牛血清白蛋白、10g/L～30g/L牛血清白蛋白、15g/L～25g/L牛血清白蛋白；10mL/L～15mL/L丙三醇；0.1mL/L～0.2mL/LTritonX-100、0.15mL/L～0.2mL/L TritonX-100；20mg/L～40mg/L 4-氨基安替比林、15mg/L～30mg/L 4-氨基安替比林；和1mL/L～5mL/L proclin-300、2mL/L～4mL/L proclin-300。试剂中各组份是组合起来发挥作用，有效降低了试剂背景信号，提高了试剂的灵敏度、稳定性。
在一些实施方式中，所述试剂2还包括1g/L～50g/L酪蛋白、5mL/L～20mL/L丙三醇、0.05mL/L～0.2mL/L TritonX-100、0.5mL/L～5mL/L proclin-300和10mg/L～50mg/L4-氨基安替比林。在一些实施方式中，所述试剂2可以包括5g/L～10g/L酪蛋白、10g/L～15g/L酪蛋白、15g/L～20g/L酪蛋白；5mL/L～20mL/L丙三醇、5mL/L～100mL/L丙三醇、10mL/L～20mL/L丙三醇；0.05mL/L～0.2mL/L TritonX-100、0.05mL/L～0.1mL/L TritonX-100、0.1mL/L～0.2mL/L TritonX-100；0.5mL/L～5mL/L proclin-300、0.5mL/L～1mL/Lproclin-300、1mL/L～2mL/L proclin-300、2mL/L～4mL/L proclin-300；和10mg/L～20mg/L 4-氨基安替比林、20mg/L～30mg/L 4-氨基安替比林、30mg/L～40mg/L 4-氨基安替比林、40mg/L～50mg/L 4-氨基安替比林。试剂中各组份是组合起来发挥作用，有效降低了试剂背景信号，提高了试剂的灵敏度、稳定性。
在一些实施方式中，所述试剂2包括4.0μg/mL吖啶酯标记的抗乙肝前S1抗原多克隆抗体、20mM pH7.4PBS缓冲溶液、10g/L酪蛋白、10g/L海藻糖或蔗糖、10mL/L丙三醇、0.1mL/L TritonX-100、1mL/L proclin-300和20mg/L4-氨基安替比林。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括校准品，所述校准品包括PBS缓冲液、酪蛋白、海藻糖或蔗糖、丙三醇、吐温和proclin-300。
在一些实施方式中，所述校准品包括0μg/mL或10μg/mL乙型肝炎病毒前S1抗原、5mM～100mM、pH6.0～8.0PBS缓冲溶液、5g/L～20g/L酪蛋白、5g/L～50g/L海藻糖或蔗糖、5mL/L～20mL/L丙三醇、0.1mL/L～1.0mL/L吐温和0.5mL/L～5mL/L proclin-300。在一些实施方式中，可以是10g/L～20g/L酪蛋白、15g/L～20g/L酪蛋白；10g/L～40g/L海藻糖或蔗糖、20g/L～30g/L海藻糖或蔗糖；5mL/L～10mL/L丙三醇、10mL/L～20mL/L丙三醇、15mL/L～20mL/L丙三醇；0.1mL/L～0.2mL/L吐温、0.1mL/L～0.15mL/L吐温；1mL/L～4mL/L proclin-300、2mL/L～4mL/L proclin-300。
在一些实施方式中，所述校准品包括0μg/mL或10μg/mL乙型肝炎病毒前S1抗原、20mM pH7.4PBS缓冲溶液、10g/L酪蛋白、20g/L海藻糖或蔗糖、10mL/L丙三醇、0.5mL/L吐温和1mL/L proclin-300。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括化学发光底物液，所述化学发光底物液包括A液和B液；所述A液为H2O2溶液，所述B液为NaOH溶液。
本发明中通过试剂1和试剂2中各个组分的选择，不仅使本发明试剂盒在使用中信号背景大大降低，而且信号强度显著增加；试剂盒的灵敏度、准确性和重复性显著增加。特别是试剂1中甘露醇或山梨糖醇和试剂2中海藻糖或蔗糖的存在，显著增加了本发明试剂盒的灵敏度。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
实施例一:抗PreS1-Ag单克隆抗体包被的亲和素化的磁微粒(试剂1)的制备1.生物素化的抗PreS1-Ag单克隆抗体制备
取1.0mg抗PreS1-Ag单克隆抗体，用磷酸盐缓冲液稀释至1.0mg/mL，然后加入13.3μL浓度为10mM/L的生物素酯，室温下反应30min，再加入10μL浓度为1M的Tris溶液，室温下混匀10min终止反应，最后用20mM、pH为7.4的磷酸盐缓冲液透析16-24小时，取透析后的液体即得到生物素化的抗PreS1-Ag单克隆抗体。
2.生物素化抗体包被亲和素磁微粒
取50mg亲和素化的磁微粒悬浮液，磁分离去上清，用连接缓冲液(20mM PBS，10g/LBSA，20g/L甘露醇，10mL/L丙三醇，20mg/L 4-氨基安替比林，0.1mL/L TritonX-100，1mL/Lproclin-300)清洗三次，然后用25mL连接缓冲液重悬，加入0.05mg生物素化的抗PreS1-Ag单克隆抗体，室温下混悬30min，磁分离去上清，用连接缓冲液清洗一次后再重悬至25mL，然后加入25μL磁微粒封闭液(10mmol/L生物素酯)室温下混悬15min，磁分离去上清，用连接缓冲液清洗三次后重悬至125mL，即得到0.4mg/mL抗PreS1-Ag单克隆抗体包被的亲和素化的磁微粒及为试剂1。
依照此类似方法，制备0.2mg/mL和0.6mg/mL抗PreS1-Ag单克隆抗体包被的亲和素化的磁微粒。同时制备了4μg/mL、8μg/mL和12μg/mL生物素标记的抗乙肝前S1抗原单克隆抗体。
实施例二:吖啶酯标记的抗HBsAg多克隆抗体(试剂2)制备
取1.0mg抗HBsAg多克隆抗体，用20mmol/L磷酸盐缓冲液稀释至1.0mg/mL，然后加入100μL浓度为2mmol/L的吖啶酯，室温下避光混匀反应30min，然后加入100μL浓度10mg/mL的赖氨酸溶液，室温下避光混匀反应10min，然后用脱盐柱离心脱盐纯化。收集离心管中的液体，即得到吖啶酯标记的抗HBsAg多克隆抗体加入等体积甘油-20℃以下保存。
取100mL的缓冲液(20mM磷酸盐、9.00g/L氯化钠、10.00g/L酪蛋白、10.00g/L海藻糖、20mg/L 4-氨基安替比林、0.1mL/L Triton X-100、10mL/L丙三醇、1.00mL/L proclin-300)向其中加入10μL上述吖啶酯标记的抗HBsAg多克隆抗体，混匀，即得到试剂2。依此方法制备了含2.0μg/mL、4.0μg/mL和6.0μg/mL吖啶酯标记的抗乙肝前S1抗原多克隆抗体。
实施例三:PreS1-Ag校准品制备
将乙型肝炎病毒前S1抗原用缓冲液(20mM pH7.4PBS，10g/L酪蛋白，20g/L海藻糖，10mL/L丙三醇，0.5mL/L吐温，1mL/L proclin-300)配制成浓度为0μg/mL和10μg/mL，即为校准品1和校准品2。
实施例四:乙型肝炎病毒前S1抗原测定试剂盒的性能测试
采用全自动化学发光免疫分析仪检测、仪器依次加入50μL样品，25μL HBsAg多克隆抗体包被的亲和素化的磁微粒、50μL吖啶酯标记的HBsAg多克隆抗体，反应30min后，磁分离、清洗，加入发光底物液A液(A液是0.10mol/L H2O2溶液)、B液(B液是0.15mol/L NaOH溶液)检测发光信号。化学发光免疫分析仪例如可以是迈克生物的型号的以下仪器：maccurai3000、maccura i3000L、maccura i3000S、maccura i2000、maccura i2000L、maccurai2000S、maccura i1000、maccura i1000L、maccura i1000S。校准品信息通过条码扫描到分析仪上，分析仪通过扫描读取的校准品信息自动校准检测系统。
校准：用i 3000自动校准或将校准1、2作为样本检测重复3次，校准1信号值不大于1000，校准2信号值CV应不大于15％。
质控：质控1结果S/CO值不大于0.5，质控2应在标示值±40％范围内。
1.试剂盒的灵敏度实验
通过四川大家医学检验中心收集到两例小三阳样本记为Sa1、Sa2，分别用达安基因公司的乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)、科华生物和英科新创公司生产的乙型肝炎病毒前S1抗原检测试剂盒(酶联免疫法)及本发明试剂盒检测结果如下：
表1本发明试剂盒的灵敏度实验结果1
说明：S/CO值≥1即为阳性，S/CO值<1为阴性
经对比该两份低值样本只有本发明试剂盒能检出perS1-Ag为阳性，符合HBV-DNA检测结果。
当将试剂1中甘露醇替换为山梨糖醇，试剂盒中其它成分保持不变时，根据上述相同方法得当的试剂盒也能检测出Sa1和Sa2样本；当将试剂2中海藻糖替换为蔗糖，试剂盒中其它成分保持不变时，试剂盒两份样本同样能检出，如下表所示。
表2本发明试剂盒的灵敏度实验结果2
样品 甘露醇替换为山梨糖醇 海藻糖替换为蔗糖
Sa1 1.242 1.124
Sa2 2.595 1.853
2.试剂盒的重复性实验
检测中等强度2例乙型肝炎病毒前S1抗原阳性样本，每个样本检测10次，分别计算每个样本的变异系数(CV)，结果表明该试剂盒变异系数CV均小于5％。
表3本发明试剂盒的S/CO值重复性测定结果
实施例五:乙型肝炎病毒前S1抗原测定试剂盒不同组分对性能的影响实验1.试剂1中甘露醇对试剂盒灵敏度影响的实验
具体实验方案与试剂盒的灵敏度实验方案类似，根据实验结果可以得出在试剂1中加入甘露醇后试剂的灵敏度有明显提高，下表为试剂1不含甘露醇或山梨糖醇时检测样本Sa1为阴性。
表4本发明的试剂1不含甘露醇时灵敏度检测结果
样本 试剂1中不含甘露醇时S/CO值
Sa1 0.596
Sa2 1.132
依照上述方法，当试剂盒中其它组分不变时，改变试剂1中甘露醇浓度时，试剂盒灵敏度数据如下：
表5本发明的试剂1含不同浓度甘露醇时灵敏度检测结果
由以上结果可见，当甘露醇浓度为5g/L～50g/L时，试剂盒灵敏度较好。
2.试剂1中缓冲液对于试剂盒性能影响的实验
在试剂1中其他组份不变和其它实验条件不变的情况下，分别改变其缓冲液、蛋白、表面活性剂，筛选出其中效果好的试剂组分。
表6本发明的试剂1中不同缓冲液筛选的结果
从上述实验结果表面，试剂1中选用PBS缓冲液较Tris、MES和HEPES缓冲液，从信号强度和阴阳性样本区分度来说，PBS缓冲液的效果最好，各缓冲液使用的浓度是20mM。
表7本发明的试剂1中不同蛋白筛选的结果
从上述实验结果表面，试剂1中选用BSA较Casein，从信号强度和阴阳性关系来说，BSA缓冲液的效果最好；各蛋白使用的浓度是1％。
表8不同表面活性剂筛选的结果
从表8实验结果可看出，试剂1中选用从信号强度和阴阳性关系来说，TritonX-100表面活性最优，使用的表面活性剂的浓度是0.1mL/L。
表9不同PBS缓冲液浓度筛选的结果
从上述实验结果表面，试剂1中选用PBS缓冲液浓度从灵敏度、信号强度来说，PBS缓冲液浓度值最优值为20mM，优选范围为5-100mM，使用的PBS缓冲液pH值为7.4。
3.试剂1中BSA浓度对于试剂性能的影响实验
在试剂1组份不变，比较试剂1中含不同浓度BSA时检测校准品结果的信号值和信噪比，筛选出其中信号值和信噪比最优的条件。
表10不同BSA浓度筛选的结果
从上述实验结果表面，试剂1中选用BSA浓度从灵敏度、信号强度和线性关系来说，BSA缓冲液浓度值最优值为10g/L，优选范围为1g/L～50g/L。
4.试剂1中TritonX-100浓度对于试剂性能的影响实验
在试剂1组份不变，比较试剂1中含不同浓度TritonX-100时检测校准品结果的信号值和信噪比，筛选出最优的条件。
表11不同TritonX-100浓度筛选的结果
从上述实验结果表面，试剂1中选用TritonX-100浓度从灵敏度、信号强度和线性关系来说，TritonX-100浓度值最优值为0.1mL/L，优选范围为0.05～0.2mL/L。
5.试剂2中海藻糖对试剂灵敏度影响的实验
实验方案与上述灵敏度检测方案类似，下表为试剂2不含海藻糖或蔗糖时检测样本Sa1与Sa2均为阴性；根据实验结果可以得出在试剂2中加入海藻糖后试剂的灵敏有明显提高。
表12试剂2中不含海藻糖时灵敏检测结果
样品 试剂2中不含海藻糖时S/CO值
Sa1 0.472
Sa2 0.821
表13试剂2中含不同浓度海藻糖灵敏度结果
由以上结果可见，当海藻糖浓度为5g/L～50g/L时，试剂盒灵敏度较好。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

Claims (10)

1.一种乙肝前S1抗原化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括试剂1和试剂2，所述试剂1包括缓冲液、磁微粒、生物素标记的抗乙肝前S1抗原单克隆抗体和多羟基醇；和所述试剂2包括缓冲液、吖啶酯标记的抗乙肝前S1抗原多克隆抗体和多羟基糖。
2.根据权利要求1所述的乙肝前S1抗原化学发光检测试剂盒，所述缓冲液是pH6.0～8.0、5mM～100mM的PBS缓冲液。
3.根据权利要求1所述的乙肝前S1抗原化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述试剂1包括0.2mg/mL～0.6mg/mL磁微粒、4μg/mL～12μg/mL生物素标记的抗乙肝前S1抗原单克隆抗体和5g/L～50g/L甘露醇或山梨糖醇；和所述试剂2包括2.0μg/mL～6.0μg/mL吖啶酯标记的抗乙肝前S1抗原多克隆抗体和5g/L～50g/L海藻糖或蔗糖。
4.根据权利要求3所述的乙肝前S1抗原化学发光检测试剂盒，所述试剂1还包括1g/L～50g/L牛血清白蛋白、5mL/L～20mL/L丙三醇、0.05mL/L～0.2mL/L TritonX-100、10mg/L～50mg/L 4-氨基安替比林和0.5mL/L～5mL/L proclin-300；优选地所述试剂1包括0.4mg/mL磁微粒、8μg/mL抗乙肝前S1抗原单克隆抗体、20mM pH7.4PBS缓冲溶液、10g/L牛血清白蛋白、20g/L甘露醇或山梨糖醇、10mL/L丙三醇、0.1mL/L TritonX-100、20mg/L 4-氨基安替比林和1mL/L proclin-300。
5.根据权利要求3所述的乙肝前S1抗原化学发光检测试剂盒，所述试剂2还包括1g/L～50g/L酪蛋白、5mL/L～20mL/L丙三醇、0.05mL/L～0.2mL/L TritonX-100、0.5mL/L～5mL/Lproclin-300和10mg/L～50mg/L 4-氨基安替比林。
6.根据权利要求5所述的乙肝前S1抗原化学发光检测试剂盒，所述试剂2包括4.0μg/mL吖啶酯标记的抗乙肝前S1抗原多克隆抗体、20mM pH7.4PBS缓冲溶液、10g/L酪蛋白、10g/L海藻糖或蔗糖、10mL/L丙三醇、0.1mL/L TritonX-100、1mL/L proclin-300和20mg/L 4-氨基安替比林。
7.根据权利要求1-6任一所述的乙肝前S1抗原化学发光检测试剂盒，所述试剂盒还包括校准品，所述校准品包括PBS缓冲液、酪蛋白、海藻糖或蔗糖、丙三醇、吐温和proclin-300。
8.根据权利要求7所述的乙肝前S1抗原化学发光检测试剂盒，所述校准品包括0μg/mL或10μg/mL乙型肝炎病毒前S1抗原、5mM～100mM、pH6.0～8.0PBS缓冲溶液、5g/L～20g/L酪蛋白、5g/L～50g/L海藻糖或蔗糖、5mL/L～20mL/L丙三醇、0.1mL/L～1.0mL/L吐温和0.5mL/L～5mL/L proclin-300。
9.根据权利要求8所述的乙肝前S1抗原化学发光检测试剂盒，所述校准品包括0μg/mL或10μg/mL乙型肝炎病毒前S1抗原、20mM pH7.4PBS缓冲溶液、10g/L酪蛋白、20g/L海藻糖或蔗糖、10mL/L丙三醇、0.5mL/L吐温和1mL/L proclin-300。
10.根据权利要求1-6任一所述的乙肝前S1抗原化学发光检测试剂盒，所述试剂盒还包括化学发光底物液，所述化学发光底物液包括A液和B液；所述A液为H2O2溶液，所述B液为NaOH溶液。
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