ES2243939T3

ES2243939T3 - Procedimiento de medicion usando sangre completa.

Info

Publication number: ES2243939T3
Application number: ES95926519T
Authority: ES
Inventors: Nobuhiro Mitsubishi Kagaku Iatron Inc. HOSHINO; Michiko Mitsubishi Kagaku Iatron Inc. Kawamoto; Mitoshi Mitsubishi Kagaku Iatron Inc. Shimamoto
Original assignee: Mitsubishi Kagaku Iatron Inc
Current assignee: Mitsubishi Kagaku Iatron Inc
Priority date: 1994-07-29
Filing date: 1995-07-28
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2015-07-28
Also published as: US6143510A; DE69534294D1; WO1996004558A1; DE69534294T2; EP0722087B1; EP0722087A4; EP0722087A1

Abstract

Un procedimiento para medir cuantitativamente una sustancia que se va a examinar, caracterizado en que (i) una muestra de sangre completa se pone en contacto con una perla como un vehículo insoluble revestida con un primer compañero específicamente enlazable a la mencionada sustancia que se va a examinar en una cantidad suficiente para permitir el movimiento libre de la perla en su interior durante un tiempo de contacto en el que la reacción de enlace de la mencionada sustancia que se va a examinar y el mencionado primer compañero no alcanza un punto final de la misma, y estando el mencionado tiempo de enlace incluido en un intervalo de tiempo dentro del cual el resultado de la mencionada muestra de sangre completa sea idéntico al de una muestra de suero o plasma obtenido a partir de la sangre completa; (ii) un complejo de la mencionada sustancia que se va a examinar y el mencionado primer compañero se ponen en contacto con un segundo compañero que está marcado y que es capaz de enlazar específicamente con la mencionada sustancia que se va a examinar, estando el mencionado complejo transportado sobre la mencionada perla; (iii) se separan un complejo resultante de la mencionada perla- el mencionado primer compañero- la mencionada sustancia que se va a examinar- el mencionado segundo compañero marcado, y una porción sin el mencionado complejo resultante, unos respecto de los otros; y (iv) se detecta una señal originada en el mencionado marcador contenido en una de las mencionadas porciones separadas.

Description

Procedimiento de medición usando sangre completa.

La presente invención se refiere a un procedimiento para medir una sustancia que se va a examinar en una muestra de sangre completa usando dicha muestra de sangre completa tal como está. De manera más particular, la presente invención se refiere a un procedimiento parar medir una sustancia que se va a examinar en una muestra de sangre completa usando dicha muestra de sangre completa tal como está, sin preparar una muestra de suero o plasma de una sangre recogida de un paciente o similar.

Se ha usado ampliamente el inmunoensayo cuando se está midiendo una sustancia que se va a examinar (analito) en una muestra, de manera particular el analito presente en una cantidad traza en una muestra biológica. La mayor parte de dichos analitos traza está contenida generalmente en la muestra sólo en cantidad de unidades en \mug/ml o menos. Por ejemplo, existe un límite a la detectabilidad en un procedimiento de inmunodifusión o con nefelómetro láser en el que se mide de manera directa un complejo producido a partir de una reacción antígeno-anticuerpo. Por tanto, dichos analitos traza en la muestra biológica se pueden medir de manera más precisa mediante un procedimiento en el que el antígeno o anticuerpo se marquen con una sustancia adecuada y se detectara una señal que se origina desde aquel, a saber, un inmunoensayo marcado, o similar. El inmunoensayo marcado se puede llevar a cabo de muchas maneras. Por ejemplo, se puede mencionar un ensayo tipo sándwich hacia delante o un ensayo tipo sándwich retardado en una etapa en los que una muestra se pone en contacto con un vehículo insoluble recubierto con un primer compañero inmunológico de un analito; tras un tratamiento de lavado que se lleva a cabo de manera opcional, el complejo primer compañero inmunológico- analito - complejo transportado en el vehículo insoluble se pone en contacto con un segundo compañero inmunológico marcado; el complejo resultante del vehículo insoluble- primer compañero inmunológico- analito- segundo compañero inmunológico marcado, y una porción que no contiene dicho complejo se separan; y se detecta una señal que se origina a partir del marcado contenido en uno de los complejos o de la porción sin dicho complejo: un ensayo tipo sándwich en una etapa en el que una muestra se pone en contacto con un vehículo insoluble recubierto con un primer compañero inmunológico de un analito, y al mismo tiempo con un segundo compañero inmunológico marcado; el complejo resultante del vehículo insoluble- primer compañero inmunológico- segundo compañero inmunológico marcado, y una porción que no contiene dicho complejo se separan; y se detecta una señal que se origina a partir del marcador contenido en uno de los complejos o en la porción sin dicho complejo: un ensayo tipo sándwich inverso en el que se pone en contacto una muestra con un primer compañero inmunológico marcado de un analito; el complejo resultante del primer compañero inmunológico marcado- analito se pone en contacto con un segundo compañero inmunológico transportado sobre un vehículo insoluble; el complejo resultante del primer compañero inmunológico marcado- segundo compañero inmunológico- vehículo insoluble, y la porción que no contiene dicho complejo se separan; y se detecta una señal que se origina a partir del marcador contenido en uno de los complejos o en la porción sin dicho complejo: un procedimiento de inmunoinhibición en el que se pone en contacto una muestra con un primer compañero inmunológico marcado (de manera preferible en el caso de un anticuerpo, un anticuerpo monoclonal marcado) de un analito, y a continuación con una sustancia que muestre una misma función que la del analito y se transporta en un vehículo insoluble, o un compañero inmunológico del analito, siendo transportado dicho compañero en un vehículo insoluble; se separan el compañero inmunológico resultante- sustancia que muestra la misma función que la del analito- complejo de vehículo insoluble, y una porción que no contiene dicho complejo; y se detecta una señal que se origina a partir del marcador contenido en uno de los complejos o en la porción sin dicho complejo: o un procedimiento competitivo en el que se pone en contacto una muestra de forma competitiva con un vehículo insoluble recubierto con el compañero inmunológico de un analito, y una sustancia que muestra una misma función que la del analito; el vehículo insoluble resultante- compañero inmunológico- sustancia que muestra la misma función que la del complejo del analito; y se detecta una señal que se origina a partir del marcador contenido en uno de los complejos o en la porción sin dicho complejo.

De manera adicional, el inmunoensayo marcado se puede clasificar, según el tipo de marcador usado, en, por ejemplo, un EIA en el que se usa un enzima como marcador, un procedimiento de inmunoaglutinación en el que se usan eritrocitos o partículas de látex como vehículo, y los agregados resultantes se observan visualmente, RIA en el que se usa un isótopo como marcador, y similares. En estos procedimientos, la cantidad de complejo producido aumenta con el tiempo de contacto de la muestra con el compañero inmunológico del analito. Por tanto, la puesta en contacto de la muestra con el compañero inmunológico se alarga hasta alcanzar el estado de equilibrio, a saber, hasta que la cantidad de complejo producido no cambia.

El procedimiento RIA requiere equipamiento particular y tiene un problema de residuos radioactivos, y de esta manera, se ha ido reemplazado gradualmente con el procedimiento EIA o similar. De manera adicional, cuando se usa una muestra de sangre en todos los procedimientos convencionales anteriormente mencionados, la muestra de sangre completa recogida no se usó tal cual, sino que se preparó una muestra de suero o plasma a partir de la muestra de sangre completa, y a continuación se llevó a cabo el ensayo. Cuando se usa una muestra de sangre completa que contiene componentes insolubles tales como hemocitos en procedimientos generales diferentes de los procedimientos anteriores, los componentes insolubles podrían posiblemente interferir con el valor medido. Por ejemplo, cuando se miden las luces como señales detectoras que se originan en los marcadores en un intervalo de luz visible en un ensayo homogéneo en el que no se lleva a cabo la separación B/F, se puede obtener un error con un valor positivo. En la aglutinación, no se puede llevar a cabo una determinación precisa debido a sustancias tales como los hemocitos, que producen turbidez independientemente de que exista la aglutinación deseada. Por otra parte, el ensayo de separación B/F se puede realizar haciendo reaccionar una muestra de sangre completa con un anticuerpo inmovilizado en un vehículo insoluble, lavado de la sangre completa, y haciéndola reaccionar a continuación con un anticuerpo marcado o similar. Sin embargo, el resultado del ensayo anterior es diferente del de un ensayo que usa una muestra de suero, debido a que existen muchos componentes de hemocitos en la muestra de sangre completa. De manera adicional, los resultados no se pueden ajustar multiplicando por un coeficiente constante, debido a que cada individuo tiene una cantidad diferente de hemocitos. Por tanto, el resultado obtenido de una muestra de sangre completa debería ajustarse midiendo un valor de hematocrito de la sangre examinada con el fin de obtener un criterio de diagnóstico de la muestra de sangre completa. Teniendo en cuenta dicho procedimiento problemático, se usan las muestras de suero o plasma preparadas a partir de una muestra de sangre completa incluso en un ensayo en el que se lleve a cabo la separación B/F.

Se han hecho muchos intentos para evitar la influencia de los componentes insolubles. Por ejemplo, la Publicación de Patente Examinada japonesa (Kokoku) Nº 02- 51150 describe un procedimiento para evitar la influencia de los componentes insolubles añadiendo un agente hemolizante a la sangre completa antes de la aglutinación. La Publicación de Patente No Examinada Japonesa (Kokai) Nº 01- 237454 describe un procedimiento para mejorar la detectabilidad mediante la digestión enzimática o exposición a un ácido débil para eliminar sustancias que interfieren y exponer los emplazamientos de enlace en una muestra de sangre completa. La publicación de Patente No Examinada Japonesa (Kokai) Nº 01- 165964 describe un procedimiento para reducir la influencia de los componentes insolubles tratando una muestra de sangre completa con neuroaminidasa para liberar antígenos asociados a tumores latentes. De manera adicional, como un intento de realizar la medida sin eliminar componentes insolubles, en la Publicación de Patente No Examinada Japonesa (Kokai) Nº 64- 63868 se describe un procedimiento para detectar el virus de la hepatitis mediante un filtro de sangre seco. En este procedimiento, un filtro de papel teñido con sangre se seca al aire, el filtro de papel seco se corta en trozos con un área superficial determinada, y los trozos, un tampón para extraer los componentes de la sangre contenidos en los trozos, y se hacen reaccionar con perlas recubiertas de anticuerpos durante aproximadamente 20 horas. Sin embargo, el procedimiento anterior requiere los procedimientos de pretratamiento del secado al aire de la sangre sobre el filtro de papel y el corte del papel seco. El procedimiento anterior no usa una muestra de sangre completa como tal, sino que usa los componentes de la sangre extraídos del filtro de papel.

De manera adicional a los procedimientos anteriormente mencionados usando la inmunoreacción en un líquido, se puede detectar un analito usando una muestra de sangre completa, con un procedimiento que usa un elemento de inmunoensayo en seco que se denomina química en seco [Publicación de Patente No Examinada Japonesa (Kokai) Nº 0'1- 112159], usando un procedimiento denominado biosensor [Publicación de Patente No Examinada japonesa (Kokai) Nº 04- 502671], o usando un procedimiento de inmunocromatografía [Publicación de Patente No Examinada japonesa (Kokai) Nº 06- 94718].

En los procedimientos convencionales anteriormente mencionados en los que la inmunorreacción se lleva a cabo en medio liquido, se requiere un procedimiento adicional (pretratamiento) antes de la inmunorreacción y de esta manera el procedimiento de ensayo llega a ser problemático. En muchos casos, los procedimientos anteriores no son adecuados para tratar muchas muestras para muchos temas de examen. El procedimiento que usa un elemento de inmunoensayo en seco y una muestra de sangre completa no satisface con precisión. Los procedimientos que usan un biosensor o inmunocromatografía requieren equipamiento particular.

Se puede detectar un anticuerpo en una muestra de sangre completa poniendo esta en contacto con un vehículo insoluble que es una varilla aforada que comprende una membrana porosa sobre la cual se esparce un antígeno sobre en el anticuerpo a través de ventanas contenida en la anterior. Este sistema es adecuado para detectar la presencia de una variedad de anticuerpos específicos pero no la cantidad de un anticuerpo (EP- A- 0 301 141).

De acuerdo con esto, el objetivo de la presente invención es proporcionar un medio de ensayo capaz de medir con rapidez un analito en una muestra de sangre completa, usando una sangre completa como muestra sin pretratamiento de la sangre. De manera más particular, el objetivo es proporcionar un medio de ensayo capaz de obtener un resultado de un analito a partir de una muestra de sangre completa, idéntica a la de la muestra convencional, tal como suero o plasma, incluso cuando se encuentra un problema asociado con la muestra de sangre completa, tal como la variación problemática de la relación existente de componentes insolubles a componentes solubles, por tanto, que permita un examen rápido sin pretratamiento de la muestra de sangre completa recogida y ahorre mucho trabajo en un examen general.

De acuerdo con la presente invención, se puede determinar una concentración de una sustancia que se va a examinar (analito) en una muestra de sangre completa usando un ensayo simple y rápido, de manera particular un inmunoensayo, tal como en un procedimiento en el que se usa una muestra de suero o plasma. De esta manera, el procedimiento de separar suero o plasma resulta innecesario. De manera adicional, una muestra de sangre completa se pone en contacto con un vehículo insoluble, que es una perla recubierta con compañeros específicos de enlace (de manera particular compañeros inmunológicos) durante un corto período de tiempo en la presente invención, y de esta manera, se puede obtener un resultado rápidamente.

De manera más específica, se puede alcanzar el objetivo anterior mediante la presente invención relacionada con un procedimiento para medir cuantitativamente una sustancia que se va a examinar, caracterizado en que

(i): se pone en contacto una muestra de sangre completa con una perla como un vehículo insoluble recubierto con un primer compañero específicamente enlazable a dicha sustancia que se va a examinar, en una cantidad suficiente para permitir el movimiento libre de la perla durante un tiempo de contacto en el que la reacción de enlace de dicha sustancia que se va a examinar y dicho primer compañero no alcance un punto final de la misma, y estando incluido dicho tiempo de enlace en un intervalo de tiempo dentro del cual el resultado de dicha muestra de sangre completa es idéntico al de la muestra de suero o plasma obtenidos a partir de la sangre completa;

(ii): un complejo de la sustancia que se va a examinar y dicho primer compañero se pone en contacto con un segundo compañero que está marcado y es capaz de enlazarse de manera específica con dicha sustancia que se va a examinar, siendo dicho complejo transportado sobre dicha perla;

(iii): se separan uno respecto del otro un complejo resultante de dicha perla- dicho primer compañero- dicha sustancia que se va a examinar- dicho segundo compañero marcado, y una porción sin dicho complejo resultante; y

(iv): se detecta una señal que se origina a partir de dicho marcador contenido en un de dichas porciones separadas.

El primer compañero puede ser el mismo o diferente del segundo compañero. El primer y segundo marcadores se puede seleccionar de manera apropiada en función del analito

La Figura 1 es una gráfica que ilustra la correlación entre una muestra de suero y una muestra de sangre completa, en el caso del ensayo del antígeno HBs.

La Figura 2 es una gráfica que ilustra la correlación entre una muestra de suero y una muestra de sangre completa, en el caso del ensayo del anticuerpo HBs.

La presente invención se describirá en detalle a partir de ahora en el presente documento.

La presente invención comprende usar una muestra de sangre completa tomada de un paciente o similar mediante cualquier procedimiento, tal como extracción de sangre, o una muestra sintética que contiene un analito o un análogo del mismo, y medir inmunológicamente el analito en dicha muestra. El término "muestra de sangre completa" usado en el presente documento significa una muestra que no se ha tratado para eliminar los componentes insolubles de la sangre y tomada de un paciente o similar, y de esta manera contiene componentes insolubles. Por tanto, una muestra de suero o una muestra de plasma no quedan definidas como muestra de sangre completa. La muestra de sangre completa implica una muestra preparada añadiendo, a una sangre recogida, un anticoagulante, tal como EDTA, citrato de sodio, heparina, fluoruro de sodio, u oxalato de sodio, y/o un conservante de la sangre, tal como CPD que comprende citrato de sodio, ácido cítrico, glucosa y dihidrógenofosfato de sodio, o similar. De manera adicional, queda también definida en la muestra de sangre completa anterior una muestra preparada diluyendo una sangre recogida de un paciente o similar con, por ejemplo, un tampón que tenga una función anticoagulante. Queda también definida en la muestra de sangre completa anterior una muestra preparada tratando una sangre extraída de un paciente o similar de la manera anterior, y dejándola estar durante un largo período de tiempo, por ejemplo, durante el término de duración de un conservante de la sangre, es decir, durante 21 días o más de 4 a 6ºC. La "muestra sintética que contiene un analito o un análogo del mismo" es una muestra para uso en la determinación cuantitativa de la presente invención, o para el control de la exactitud de la presente invención. La muestra sintética puede contener o no necesita contener componentes insolubles naturales o sintéticos, tales como hemocitos, perlas de látex o similares. De manera preferible, la muestra sintética no debe contener componentes insolubles con vistas a la capacidad de trabajo. De manera adicional, la muestra sintética no necesita contener un analito o un análogo del mismo, si contiene una sustancia que muestre correlación con el analito.

No está limitado el analito en la presente invención, con tal que esté contenido de manera general en la sangre, de manera particular en una cantidad traza. Se pueden mencionar, por ejemplo, proteínas, polisacáridos, lípidos, haptenos, ácidos nucleicos, o un complejo o fragmento de los mismos. De manera más particular, el analito es, por ejemplo, un marcador relacionado con una enfermedad infecciosa, tal como un antígeno HBs, anticuerpo HBs, anticuerpo VIH-1, anticuerpo VIH-2, anticuerpo HTLV-I o anticuerpo del treponema, un antígeno asociado a tumor, tal como AFP, CRP ó CEA, un marcador relacionado con la coagulación- fibrinogenolisis, tal como plasminógeno, antitrombina-III, dímero-D, o trombina-antitrombina-III, una hormona, una citosina, un enzima, o u fármaco, tal como un antiepiléptico o digoxina. De manera adicional, el analito es también ADN o ARN que tengan una secuencia específica, o un fragmento de polinucleótido de los mismos.

El compañero que enlaza de manera específica con el analito es un compañero que enlaza inmunológicamente de manera específica con el analito, es decir, un compañero inmunológico, por ejemplo, una sustancia inmunológica, tal como un antígeno o un anticuerpo, a proteínas, polisacáridos, lípidos, ácidos nucleicos, o un complejo o fragmento de los mismos. Por ejemplo, el compañero es un antígeno o anticuerpo de un marcador relacionado con enfermedad infecciosa, o un anticuerpo de un antígeno asociado con tumor, de manera más particular un anticuerpo HBs cuando el analito es un anticuerpo VIH-1. De manera adicional, cuando el analito es un ácido nucleico, el compañero no puede ser sólo el anticuerpo de ello, sino también el ácido nucleico complementario, tal como ADN o ARN complementario, o un fragmento del mismo preparado tratando con un enzima de restricción, o un polinucleótido sintético del mismo, que tenga al menos una parte de, de manera preferible todo de, la secuencia complementaria a la del ácido nucleico que se va a examinar. El anticuerpo, como el compañero inmunológico puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal, o un fragmento preparado tratando con un enzima. Se puede usar también una inmunoglobulina que no se trata o se trata con un enzima, tal como IgG ó F(ab')_{2} preparada mediante digestión con pepsina. Tal como el antígeno, se puede usar también un producto obtenido de un lisado de virus mediante un proceso común, tal como centrifugación en gradiente de densidad, o un péptido, o una proteína recombinante que corresponda a una parte del antígeno. El compañero específicamente enlazante sin un marcador se inmoviliza en un vehículo insoluble, y se usa el compañero específicamente enlazante con un marcador como el segundo compañero específicamente enlazante. Se describirá a partir de ahora en el presente documento la presente invención en la que se usan compañeros inmunológicos tal como los compañeros específicamente enlazantes. Se entenderá que la siguiente descripción se puede aplicar también a la presente invención en la que los se usan los ácidos nucleicos complementarios como compañeros específicamente enlazantes.

Cuando la presente invención se lleva a cabo, una perla tal como un vehículo insoluble se recubre con el primer compañero inmunológico para el analito, por ejemplo, mediante un procedimiento convencional conocido, tal como la adsorción física o enlace covalente tal como se ha descrito en "Koso-Meneki-Sokutei-Ho (Inmunoensayo con Enzima)". De manera más particular, el procedimiento comprende hacer entrar en contacto el vehículo insoluble con una solución que contiene el compañero inmunológico a temperatura ambiente durante varias horas, lavando con un tampón apropiado, y si es necesario, secando al aire. Después que el vehículo se recubre con el compañero inmunológico, si es necesario, el vehículo se puede bloquear con, por ejemplo, albúmina de suero bovino o leche desnatada, o los grupos funcionales en exceso se pueden bloquear con, por ejemplo, lisina, para evitar que otros componentes que el analito se adsorban en el vehículo insoluble. El vehículo insoluble resultante recubierto con el compañero inmunológico se puede almacenar como tal, o como una forma aumentada en un tampón adecuado, tal como tampón fosfato.

El vehículo se puede fabricar de material natural o sintético, tal como celulosa, poliamida, poliestireno o polietileno, o una combinación de los mismos, o un material preparado añadiendo un material inorgánico tal como el mismo hierro para obtener una fuerza adecuada. La superficie del vehículo insoluble se trata de manera preferible mediante un procedimiento conocido, por ejemplo, se introducen grupos de aniones adecuados en la superficie, para evitar diferentes sustancias que las del analito o el compañero inmunológico marcado de la adsorción no específica en la superficie. De manera adicional, los grupos funcionales adecuados, tales como un grupo carboxilo o amino, se introducen de manera preferible en la superficie de un vehículo insoluble mediante un procedimiento conocido de manera que el vehículo insoluble se pueda recubrir fácilmente con el compañero inmunológico para el analito. La perla, tal como el compañero inmunológico puede ser porosa o no porosa, pero siendo preferible una no porosa con buena capacidad de lavado.

El diámetro de la perla es de manera preferible de 0,1 \mum a 7 mm. Cuando la perla se lava mediante filtración usando un filtro o succión usando una boquilla, se usa de manera más preferible a perla que tiene un diámetro mayor que aquellos de los componentes insolubles en una muestra de sangre completa, por ejemplo 10 \mum o más. La perla que contiene un material magnético, tal como ferrita, se puede lavar recogiendo las perlas mediante un imán, sin un filtro, y de esta manera, el diámetro de dicha perla puede ser de 10 \mum o menos, de manera preferible de 0,1 a 5 \mum.

El compañero inmunológico resultante- vehículo insoluble recubierto que es una perla se pone a continuación en contacto con una muestra de sangre completa para formar un complejo del analito y del compañero inmunológico del vehículo insoluble. En esta etapa de la presente invención, es preferible que no esté contenido un lote de sustancias líquidas tal como un tampón para diluir la muestra.

Un sistema de ensayo en el que se lleva a cabo una inmunoreacción durante un período largo de tiempo se denomina generalmente un ensayo de punto final, y está basado en la realización de la inmunoreacción de todos los analitos añadidos en la muestra al sistema de ensayo. Cuando se usa una sangre completa que tiene un valor de hematocrito del 30% como una muestra en este ensayo, la cantidad de analito es el 70% del contenido en la misma cantidad de suero, y de esta manera se encontraría que el resultado es el 70% del obtenido del ensayo correspondiente usando la misma cantidad de muestra de suero. Si se usa una sangre completa que tiene un valor de hematocrito del 50% como una muestra en este ensayo, se encontraría que el resultado es el 50% del obtenido del ensayo correspondiente usando la misma cantidad de muestra de suero. Por tanto se puede hacer un ajuste mediante un valor de hematocrito con el fin de asegurar la intercambiabilidad del resultado con el obtenido del ensayo usando una muestra de suero.

Por el contrario, la presente invención se caracteriza porque se pone en contacto una muestra de sangre completa con el compañero inmunológico- vehículo insoluble recubierto durante un corto período de tiempo a partir de un estado inicial de la reacción, y la reacción se suspende o se lleva a cabo la medida antes del punto final de la reacción. De esta manera, no todos los analitos en la muestra reaccionan con los compañeros inmunológicos sobre los vehículos insolubles, pero los analitos se hacen reaccionar con los compañeros dentro de un tiempo limitado en una cantidad dependiente en y proporcional a la concentración de los analitos. En este caso, la concentración de analito en una sangre completa es la misma que en el suero. Por tanto, los hemocitos presentes en la muestra no interfieren los resultados. El resultado obtenido de una muestra de sangre completa corresponde excelentemente de manera inesperada con el obtenido de una muestra de suero. El tiempo de contacto concreto varía con una clase o concentración del analito usado, una clase del compañero inmunológico usado, un área superficial del vehículo insoluble, o similares. El intervalo del tiempo de reacción dentro del cual el resultado de una muestra de sangre completa es idéntico al de una muestra de suero o plasma obtenido de dicha sangre completa se puede determinar fácilmente mediante un ensayo piloto simple.

La muestra de sangre completa se puede poner en contacto con las perlas usadas como vehículo insoluble en tal cantidad que las perlas se muevan libremente allí. La cantidad de muestra de sangre completa que se pone en contacto con el vehículo insoluble recubierto con el compañero inmunológico se puede determinar mediante el siguiente ensayo.

Por ejemplo, cuando el analito es un antígeno y el compañero inmunológico del mismo es un anticuerpo, las perlas de poliestireno (diámetro 100 \mum) se recubren con una cantidad predeterminada de anticuerpos, y se lleva a cabo un ensayo cambiando la cantidad de la muestra de sangre completa y el tiempo de reacción por una cantidad constante predeterminada de perlas. A continuación, se pueden encontrar las condiciones para obtener resultados idénticos a aquellos de una muestra de suero.

Por ejemplo, cuando se usa un antígeno HBs como analito, se usan 1,7 \mug y 0,12 \mug de anticuerpos de conejo anti HBs (F(ab')_{2} como el primer y segundo compañeros inmunológicos, respectivamente, y se usan 5 mg de perlas de poliestireno (diámetro = 100 \mum; área superficial = 2,5 cm^{2}) como vehículo insoluble, el tiempo de contacto puede ser de 24 horas o menos, de manera preferible 30 segundos a 30 minutos, de manera más preferible 1 a 10 minutos.

Un complejo del analito y la muestra de sangre completa y el primer compañero inmunológico sobre el vehículo insoluble que es una perla, se forma por el mencionado contacto y a continuación se lava con un tampón fosfato o similar, si es necesario. El lavado no es necesario pero se aconseja realizarlo. Esto es debido a que si se usa el tampón que contiene el segundo compañero inmunológico marcado después de la adición del segundo compañero en la siguiente etapa la muestra de sangre completa se diluye con el tampón y la cantidad de analito cambia sustancialmente. Por el contrario sin embargo, respecto de los datos de la etapa anterior, es posible minimizar la influencia del resto de los componentes líquido en los cuales pueda estar contenido el segundo compañero inmunológico. Por ejemplo, se puede reducir la influencia añadiendo el segundo compañero inmunológico marcado una vez que el analito de la muestra 7 el compañero inmunológico del vehículo insoluble casi alcancen el estado de equilibrio, o añadiendo el tampón que contiene el segundo compañero inmunológico marcado en una cantidad menor que la de la muestra de sangre completa. La influencia se puede reducir todavía más combinando los dos procedimientos anteriores. Si no es necesario llevar a cabo el procedimiento de lavado, cuando el segundo compañero inmunológico marcado es un material en polvo o material purulento, los compañeros deben encapsularse. Si se lleva a cabo el lavado, el tampón que contiene el segundo compañero inmunológico marcado usado tras la adición del segundo compañero en la siguiente etapa no afecta si el resultado de la muestra de sangre completa se hace idéntico al resultado de las muestras de suero plasma obtenidas a partir de dicha muestra de sangre completa.

En la siguiente etapa, el segundo compañero inmunológico marcado con un material de marcado adecuado se pone en contacto con el complejo. El tiempo de contacto entre el segundo compañero inmunológico marcado y el complejo compañero inmunológico- vehículo insoluble recubierto y el analito no se limita de forma concreta, pero puede ser de varias horas o menos como en un procedimiento convencional. Con vista a un ensayo rápido, el tiempo de contacto es de 1 hora o menos, de manera preferible 30 minutos o menos, de manera más preferible 10 minutos o menos. En esta etapa se forma un complejo del compañero inmunológico sobre el vehículo insoluble- el analito- el segundo compañero inmunológico marcado, y se lava con un tampón adecuado para eliminar la porción no ligada del segundo compañero inmunológico marcado.

En la presente invención se puede utilizar cualquier material de marcado conocido de manera convencional. Por ejemplo, se pueden usar como marcador un enzima como la peroxidasa o la alcalina fosfatasa; una sustancia bioluminiscente, como la luciferina- luciferasa; una sustancia quimioluminiscente como luminol, derivado de acridina o derivado de adamantano; una sustancia fluorescente, como isotiocanato de fluoresceína; un metal, como coloide de oro; un material radioactivo, como ^{32}P o similar. El marcado se puede sensibilizar con una ciclación del enzima o similar. Es preferible usar la sustancia quimioluminiscente, como luminol, derivado de acridina o derivado de adamantano.

El segundo compañero inmunológico se puede marcar con el material de marcado mediante un procedimiento conocido. Por ejemplo, el material de marcado se puede ligar con el segundo compañero inmunológico mediante un procedimiento de enlace físico en el que se premezclan de forma directa el material y el compañero; un procedimiento de glutaraldehído, en el que el material y el compañero se enlazan mediante un enlazante adecuado; un procedimiento de periodato, un procedimiento de maleimida, un procedimiento de disulfuro de piridina, un procedimiento en el que el material y el compañero se enlazan mediante avidina y biotina o similar. El material marcado resultante se puede almacenar en una solución adecuada, de manera preferible en tampón fosfato. Se puede añadir al complejo la cantidad necesaria de solución, tras dilución si es necesario. En esta etapa, se puede añadir un agente bloqueante conocido por conveniencia tal como albúmina de suero bovino o leche desnatada; un conservante como la azida de sodio o un agente amplificador de la señal tal como p- yodo- fenol.

El complejo entre el compañero inmunológico del vehículo insoluble- el analito- el segundo compañero inmunológico marcado que se forma en la etapa anterior se lava con un tampón adecuado para separar una porción que contiene el complejo (residuo lavado) y la otra porción que no contiene el complejo (lavados). A continuación se puede detectar la señal que se origina en el marcador de cualquiera de las porciones separadas, de manera preferible en la porción que contiene el complejo (residuo lavado) a fin de determinar de forma cualitativa o cuantitativa el analito presente en la muestra.

Cuando se usa un enzima como marcador, se pueden añadir un sustrato y un cromógeno o similares. Después que se realiza la reacción en un término predeterminado, se puede medir un color fuerte espectroscópicamente. Cuando se usa como marcador, una sustancia quimioluminiscente, tal como un derivado de acridina, se pueden añadir peróxido de hidrógeno y una solución alcalina mediante la cual emite el derivado de acridina, al mismo tiempo o separadamente. Después que se realiza la reacción en un término predeterminado, se puede medir una intensidad de quimioluminiscencia mediante un fotomultiplicador. En este caso, se puede añadir un agente amplificador de la señal, tal como ácido clorhídrico si es necesario, antes de la adición de peróxido de hidrógeno y la solución alcalina, o junto con el peróxido de hidrógeno: Se puede medir el analito en la muestra de sangre completa en un período corto de tiempo midiendo la señal resultante originada a partir del marcador.

De acuerdo con la presente invención, tal como se ha explicado anteriormente, se puede medir rápidamente el analito en la muestra de sangre completa, usando la sangre completa sin pretratamiento, como una muestra. De manera adicional, la presente invención puede acortar el tiempo de contacto de la muestra y la del compañero inmunológico. Además, un efecto sorprendentemente ventajoso del analito resulta que la muestra de sangre completa muestra una correlación con el analito que resulta de la muestra convencional, tal como una muestra de suero o plasma, se puede obtener seleccionando las condiciones preferibles del tiempo de contacto, la cantidad de muestra, la cantidad de vehículo insoluble que es una perla de vidrio(el área superficial del vehículo o la cantidad de compañero inmunológico recubierto), y se continúa de la misma forma. Debido a que se puede omitir el pretratamiento de la sangre recogida que se requiere en los procedimientos convencionales, y a que el tiempo de contacto se puede acortar tal como anteriormente, de esta manera, la presente invención puede conseguir un examen rápido y mucho ahorro en mano de obra en un examen general. La presente invención se puede aplicar no sólo al anterior ensayo tipo sándwich hacia delante o ensayo tipo sándwich en una etapa retardada, sino también a todos los inmunoensayos marcados en general, tales como un ensayo tipo sándwich en una etapa, ensayo tipo sándwich inverso, o ensayo competitivo. La muestra que se puede usar en la presente invención, no está limitada sólo a la muestra de sangre completa, sino que se puede medir en el resto de los componentes biológicos, tales como suero, plasma, orina o similares.

La presente invención se ilustrará ahora más ampliamente mediante, pero sin limitarse a, los siguientes ejemplo.

Ejemplo 1 Preparación de perlas recubiertas con anticuerpos anti-HBs

El antisuero obtenido de un conejo inmunizado con antígenos HBs se purificó como sigue. El antisuero se trató con una columna Sepharose 4B para inmovilizar el antígeno HBs, y los componentes del suero no enlazados se lavaron completamente con tampón fosfato 20 mM, pH 7,0 (denominado a partir de ahora en el presente documento como PBS) que contenía NaCl 0,15 M. A continuación se eluyeron los anticuerpos específicos mediante PBS que contenía tiocianato de sodio 3 M, y el eluido se dializó con tampón acetato 50 mM (pH 4,5) Los anticuerpos específicos se digirieron con 2% en peso (en función del peso de los anticuerpos) de pepsina a 37ºC durante 16 horas. Se añadió una solución tris 1 M y se ajustó el pH a pH 8 para interrumpir la reacción. Después de eso, F(ab')_{2} se fraccionó a través de una columna Sephacril S- 200 (equilibrada con PBS). La fracción de F(ab')_{2} del anticuerpo específico anti-HBs resultante se diluyó con PBS a 100 \mug/ml. Se añadieron a ello perlas de poliestireno (diámetro = 100 \mum) en una cantidad de 0,35 g/1 ml de la solución de anticuerpos, y se premezclaron con lo mismo mediante un agitador a 37ºC durante 4 horas para obtener perlas recubiertas. Las perlas se lavaron con PBS tres veces, y se almacenaron en forma de suspendió hasta 10% en PBS.

Ejemplo 2 Preparación de éster de acridinio marcado con anticuerpos anti-HBs

La fracción F(ab')_{2} de anticuerpos anti-HBs preparada en el Ejemplo 1 se diluyó con tampón fosfato 0,1 M (pH 8,0) hasta 0,25 mg/ml. Al anticuerpo líquido (1 ml) se añadió una solución (50 \mul) de 0,125 mg/ml de fluorosulfonato de 10 metil-9-{4-[2(succinidiloxicarbonil)-etil] feniloxicarbonil}-acridinio en dimetiformamida. La reacción se llevó a cabo bajo agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de eso se añadieron 0,5 ml de tampón glicina 0,2 M (pH 8,0) como agente bloqueante, y la reacción se llevó a cabo bajo agitación durante 1 hora más. La mezcla de reacción se trató a través de una columna PD- 10 (Pharmacia) equilibrada con una solución de sal fisiológica para eliminar las sustancias luminiscentes de bajo peso molecular.

Ejemplo 3 Medida de las concentraciones de antígeno HBs en una muestra de sangre completa

A partir de las perlas recubiertas con anticuerpos HBs que contienen la suspensión preparada en el Ejemplo 1, se tomó una alícuota que contenía 5 mg de perlas mediante una pipeta en un recipiente de reacción. Se añadieron 100 \mul de una muestra de sangre completa con EDTA de la misma y la reacción se llevó a cabo a 37ºC durante 3 minutos bajo agitación. La mezcla de reacción se lavó cuatro veces con una solución de lavado (tampón fosfato 10 mM, pH 7,0, que contenía NaCl 0,15 M y 0,1% de Tween 20). Tras añadir 100 \mul a la misma de un líquido preparado diluyendo la sustancia luminiscente marcada con anticuerpo HBs preparada en el Ejemplo 2 con la anterior solución de lavado a 1/100 y 200 \mul de una solución de dilución (PBS conteniendo 0,05% de Tween 20), la reacción se llevó a cabo a 37ºC durante 5 minutos bajo agitación. A continuación, la mezcla de reacción se lavó cuatro veces con la solución de lavado. Se produjo la emisión añadiendo 100 \mul de solución acuosa de HCl 0,1 N y a continuación 300 \mul de solución de hidróxido de sodio 0,1 M que contenía peróxido de hidrógeno 20 mM. La intensidad quimioluminiscente se midió mediante un fotomultiplicador.

Como ensayo control, se repitió el procedimiento anterior excepto en que se usó la muestra de suero preparada a partir de la muestra de sangre completa anterior, y se obtuvo la intensidad quimioluminiscente. En la Fig. 1 se muestra la correlación entre la muestra de suero y la muestra de sangre completa. El coeficiente de correlación para 287 muestras fue 0,9958, y la recta de regresión fue y = 0,9863 x + 114 (x = suero; y = sangre completa). Las intensidades quimioluminiscentes en ambos casos estuvieron bien correlacionadas.

Ejemplo 4 Cambios en el resultado de la concentración del antígeno HBs para el tiempo de permanencia de las muestras de sangre completa

Las muestras de sangre completa se tomaron de pacientes HBs- negativo y HBs- positivo mediante un tubo de extracción de sangre con EDTA añadido (Terumo) y se colocaron en tubos de ensayo en una cantidad de 5 ml. Tras dejar sedimentar durante 15 minutos, 30 minutos, o 60 minutos, se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 3, y se midió una intensidad quimioluminiscente originada a partir del antígeno HBs. Las muestras de sangre completa se agitaron sólo brevemente tras haberse recogido y se dejaron sedimentar a temperatura ambiente. Los resultados se muestran en la Tabla 1

TABLA 1

	Intensidades quimioluminiscente (conteos) tras la extracción de sangre (minutos)
	0 min más tarde	15 min más tarde	30 min más tarde	60 min más tarde
Muestra HBs- negativo	2.185	2.159	2.226	2.148
Muestra HBs- positivo	46.666	46.270	46.136	47.253

Se observó visualmente la precipitación de los hemocitos a la vez que el tiempo transcurrido después que las muestras de sangre completa se colocaran en los tubos de ensayo. Sin embargo, no se observaron diferencias sustanciales debidas al tiempo de permanencia. Cuando se llevó a cabo el procedimiento de inmunoensayo, se tomaron 100 \mul de alícuota de la muestra en el tubo de ensayo, en la posición de los 3 mm por debajo del nivel del líquido del mismo.

Ejemplo 5 Preparación de perlas recubiertas de antígeno HBs

Se fraccionó plasma humano con antígeno HBs- positivo mediante centrifugación en gradiente de densidad (densidad del cloruro de cesio = 1,04 a 1,20; 48000 rpm; 210 minutos) para obtener partículas de virus. Las partículas de virus se solubilizaron con Tween 80 para obtener el antígeno HBs. La electroforesis del antígeno HBs solubilizado reveló que este contenía principalmente de antígeno HBs que tenían pesos moleculares de 24.000 y 27.000. El antígeno HB s se diluyó con tampón glicina- NaOH 0,1 M hasta 40 \mug/ml. A 1 ml de la dilución, se añadieron 0,35 g de perlas de estireno (diámetro = 100 \mum), y el completo se agitó a 37ºC durante 16 horas para recubrir las perlas con los antígenos. Las perlas recubiertas se lavaron cinco veces con PBS, y se almacenaron como una suspensión al 10% en PBS.

Ejemplo 6 Preparación de éster de acridinio marcado con antígenos HBs

El antígeno HB s preparado en el Ejemplo 5 se diluyó con tampón fosfato 0,1 M (pH 8,0) hasta 0,25 mg/ml. Al antígeno líquido (1 ml), se añadió una solución (50 \mul) de 0,12 mg/ml de fluorosulfonato de 10-metil-9-{4-[2-(succinimidiloxicarbonil)-etil]feniloxicarbonil}-acridinio en dimetilformamida. La reacción se llevó a cabo bajo agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de eso, se añadieron 0,5 ml de tampón glicina 0,2 M (pH 8,0) como agente bloqueante, y la reacción se llevó a cabo bajo agitación durante 1 hora más. La mezcla de reacción se dializó tres veces en una solución de sal fisiológica para preparar la sustancia luminiscente marcada con antígeno HBs.

Ejemplo 7 Medida de las concentraciones de anticuerpo HBs en la muestra de sangre completa

Se tomó una alícuota de la suspensión que contenía perlas recubiertas de antígenos HBs del Ejemplo 5, mediante una pipeta en un recipiente de reacción. Se añadieron 100 \mul de una muestra de sangre completa con EDTA y la reacción se llevó a cabo a 37ºC durante 5 minutos bajo agitación. A continuación se añadieron 50 \mul de un líquido preparado diluyendo la sustancia luminiscente marcada con antígeno HBs preparada en el Ejemplo 6 con la solución de lavado anterior hasta 1/100, y la reacción se llevó a cabo durante 5 minutos bajo agitación. La mezcla de reacción se lavó cuatro veces con la solución de lavado. Se produjo la emisión añadiendo 100 \mul de solución acuosa de HCl 0,1 N y a continuación 300 \mul de solución de hidróxido de sodio 0,1 N y a continuación 300 \mul de solución de hidróxido de sodio 0,1 N que contenía peróxido de hidrógeno 20 mM. La intensidad quimioluminiscente se midió mediante un fotomultiplicador.

Como ensayo de control, se repitió el procedimiento anterior excepto en que se usó la muestra de suero preparada a partir de la muestra de sangre completa anterior, y se obtuvo la intensidad quimioluminiscente. En la Fig. 2 se muestra la correlación entre la muestra de suero y la muestra de sangre completa. El coeficiente de correlación para las 286 muestras fue 0,9937, y la recta de regresión fue y = 1,017 x + 207 (x = suero; y = sangre completa). Las intensidades quimioluminiscentes en ambos casos estuvieron bien correlacionadas.

Ejemplo 8 Preparación de anticuerpo anti-HBs recubierto de perlas magnéticas

Se recogieron perlas magnéticas (tosilación activada Dynabeads; tamaño de partícula = 0,5 \mum; 2 ml) mediante un imán (MPC) para eliminar el sobrenadante. Las perlas se lavaron añadiendo 4 ml de tampón borato 50 mM (pH 9,5), y a continuación se recogieron mediante MPC. Se eliminó el sobrenadante mediante succión, y se añadió a las perlas 1 ml del tampón anterior para obtener la suspensión.

La fracción F(ab')_{2} del anticuerpo anti- HBs específico preparada en el Ejemplo 1 se dializó en tampón borato 50 mM 8pH 9,5). A 1 ml de anticuerpo líquido preparado ajustando la concentración hasta 0,5 mg/ml, se añadió la suspensión de perlas gota a gota, y se premezcló con agitación suave en una estufa a 37ºC durante 24 horas. Después que se recogieran las perlas mediante el MPC, se eliminó el sobrenadante con succión. A las perlas se añadieron 4 ml de albúmina de suero bovino (BSA) líquida preparada ajustando la concentración hasta 1 mg/ml con tampón fosfato 20 mM (pH 7,0) que contenía NaCl 0,15 M, y el completo se agitó a 4ºC durante la noche para bloquear el exceso de grupos funcionales. Tras lavar cuatro veces con PBS como anteriormente, las perlas se almacenaron en 2 ml de PBS que contenían 0,05% de azida de sodio y 1 mg/ml de BSA.

Ejemplo 9 Relación entre el tiempo de reacción y las concentraciones de antígeno HBs

A partir de la suspensión que contenía perlas recubiertas de anticuerpos HBs preparada en el Ejemplo 1, se tomó una alícuota que contenía 5 mg de las perlas mediante una pipeta en un recipiente de reacción. Se añadieron 100 \mul de una muestra de sangre completa con EDTA (antígeno HBs = 25 U/ml) y la reacción se llevó a cabo a 37ºC durante 1 minuto, 3 minutos, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 3 horas, 7 horas, 24 horas, o 48 horas bajo agitación. La mezcla de reacción se lavó cuatro veces con una solución de lavado (tampón fosfato 10 mM, pH 7,0, conteniendo NaCl 0,15 M y 0,1% de Tween 20). Después de añadir al anterior 100 \mul de un líquido preparado diluyendo la sustancia luminiscente marcada con anticuerpo HB s preparada en el Ejemplo 2 con la solución de lavado anterior hasta 1/100 y 200 \mul de una solución de dilución (PBS conteniendo 0,05% de Tween 20), la reacción se llevó a cabo a 37ºC durante 5 minutos bajo agitación. A continuación, la mezcla de reacción se lavó cuatro veces con la solución de lavado. Se produjo la emisión añadiendo 100 \mul de solución acuosa de HCl 0,1 N y a continuación 300 \mul de solución de hidróxido de sodio 0,1 M que contenía peróxido de hidrógeno 20 mM. La intensidad quimioluminiscente se midió mediante un fotomultiplicador.

Como ensayo de control se repitió el procedimiento anterior excepto en que se preparó la muestra de suero a partir de la sangre completa anterior. En la Tabla 2 se muestran los resultados. Resulta aparente a partir de la Tabla 2 que las medidas (intensidades quimioluminiscentes) son al menos las mismas en el intervalo de 1 a 30 minutos del tiempo de contacto de la muestra y las perlas con anticuerpo, entre la muestra de sangre completa con EDTA añadido y la muestra de suero de la anterior.

TABLA 2

Tiempo	Sangre completa	Suero
1 minuto	6114	5850
3 minutos	16026	16164
5 minutos	25060	24940
15 minutos	52368	53176

TABLA 2 (continuación)

Tiempo	Sangre completa	Suero
30 minutos	79953	87234
1 hora	92035	121869
3 horas	108694	145286
7 horas	113945	169346
24 horas	116523	172345
48 horas	118692	176692

Ejemplo 10 Relación entre las concentraciones de antígeno HBs y los valores del hematocrito

Se tomó una muestra de sangre de un paciente HBs- positivo mediante un tubo de extracción de sangre con adición de EDTA (Terumo) y se ajustó el valor del hematocrito del mismo hasta el 70%. A continuación, se prepararon muestras de sangre que tenían valores del hematocrito de 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, y 70% diluyendo la muestra de sangre completa con el plasma tomado del mismo paciente. A continuación, se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 3 y se midió la intensidad quimioluminiscente originada a partir del antígeno HBs. En la Tabla 3 se muestran los resultados. En este Ejemplo, no se usaron las muestras de sangre que tenían valores del hematocrito de más del 70%, debido a que dichas muestras fueron difíciles de recoger.

Ejemplo 11 Cambio de las concentraciones de antígeno HBs mediante dilución de las muestras

A partir de la suspensión que contenía perlas recubiertas de anticuerpos HBs preparada en el Ejemplo 1, se tomó una alícuota que contenía 5 mg de perlas mediante una pipeta en un recipiente de reacción. De manera adicional, se añadieron 100 \mul de cada una de las muestras de sangre completa preparadas diluyendo para tener los valores del hematocrito anteriores tal como en el Ejemplo 10, y 100 \mul de la solución de lavado usada en el Ejemplo 3 del anterior. A continuación, se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 3, y se midió una intensidad quimioluminiscente originada a partir del antígeno HBs. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Ejemplo 12 Cambios de las concentraciones de antígeno HBs sin lavado primario (1)

A partir de la suspensión que contenía perlas recubiertas de anticuerpos HBs preparada en el Ejemplo 1, se tomó una alícuota que contenía 5 mg de perlas mediante una pipeta en un recipiente de reacción. De manera adicional se añadieron 100 \mul de cada una de las muestras de sangre completa preparadas diluyendo para tener los valores del hematocrito anteriores tal como en el Ejemplo 10 del anterior, y la reacción se llevó a cabo a 37ºC durante 5 minutos bajo agitación. Después de añadir a la mezcla de reacción 100 \mul de un líquido preparado diluyendo la sustancia luminiscente marcada con anticuerpo HBs preparada en el Ejemplo 2 con la solución de lavado usada en el Ejemplo 3 hasta 1/100 y 100 \mul de una solución de dilución (PBS conteniendo 0,05% de Tween 20), la reacción se llevó a cabo a 37ºC durante 5 minutos bajo agitación. A continuación, se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 3, y se midió una intensidad quimioluminiscente originada a partir del antígeno HBs.

Ejemplo 13 Cambios de las concentraciones de antígeno HBs sin lavado primario (2)

A partir de la suspensión que contenía perlas recubiertas de anticuerpos HBs preparada en el Ejemplo 1, se tomó una alícuota que contenía 5 mg de perlas mediante una pipeta en un recipiente de reacción. De manera adicional, se añadieron 100 \mul de cada una de las muestras de sangre completa preparadas diluyendo para tener los valores del hematocrito anteriores tal como en el Ejemplo 12 del anterior, y la reacción se llevó a cabo a 37ºC durante 5 minutos bajo agitación. Después de añadir a la mezcla de reacción 10 \mul de un líquido preparado diluyendo la sustancia luminiscente marcada con anticuerpo HBs preparada en el Ejemplo 2 con la solución de lavado usada en el Ejemplo 3 hasta 1727,5, la reacción se llevó a cabo a 37ºC durante 5 minutos bajo agitación. A continuación se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 3, y se midió una intensidad quimioluminiscente originada a partir del antígeno HBs. Los resultados se muestran en la Tabla 3

TABLA 3

Valor del hematocrito		Muestras diluidas	Sin lavado 1	Sin lavado 2
	Ejemplo 10	Ejemplo 11	Ejemplo 12	Ejemplo 13
0 5	17764	17566	16486	18182
10%	17506	16376	16284	18286
20%	17682	15250	15752	17978
80%	17340	14122	15426	18000
40%	17982	12874	14876	17620
50%	17860	11700	14720	17782
60%	17886	10258	14450	17894
70%	17368	7974	13118	17460
\hskip0.5cm (las Figuras son conteos de emisiones)

A partir de los resultados de los Ejemplos 10 a 13 se confirmó que el valor del hematocrito no produce una diferencia de o no afecta la emisión si están ausentes el resto de componentes del líquido después de poner en contacto la muestra de sangre completa que contenía los antígenos HBs y las perlas recubiertas con anticuerpos HBs (Ejemplo 10); y que los cambio en las medidas debidos a los valores del hematocrito son muy pequeños cuando se añadieron anticuerpos HBs marcados con ésteres de acridinio en 1/10 de la cantidad de la muestra, tras poner en contacto la muestra de sangre completa que contenía los antígenos HBs y las perlas recubiertas con anticuerpos HBs, pero sin llevar a cabo el procedimiento de lavado (Ejemplo 13) La razón es asumir que la formación del complejo del antígeno HBs en la muestra de sangre completa y la perla recubierta con anticuerpos HBs sucede antes de que se añadan los anticuerpos HBs marcados con ésteres de acridinio, y la influencia por la adición es muy pequeña en comparación con la de las medidas por el cambio de la muestra calculada a partir del valor del hematocrito.

Ejemplo 14 Medida de las concentraciones de antígeno HBs en la muestra de sangre completa usando perlas magnéticas

Se colocó en un recipiente de reacción la suspensión (50 \mul) de perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos HBs preparada en el Ejemplo 8, y se recogió mediante el MPC para eliminar los componentes líquidos mediante succión. Después de añadir 100 \mul de la muestra de sangre completa con EDTA añadido, se hizo reaccionar el completo a 37ºC durante 3 minutos bajo agitación. La mezcla de reacción se lavó cuatro veces con la solución de lavado descrita en el Ejemplo 3. Después de añadir al anterior 100 \mul de un líquido preparado diluyendo la sustancia luminiscente marcada con anticuerpo HBs preparada en el Ejemplo 2 con la solución de lavado anterior hasta 1/100 y 200 \mul de la solución de dilución descrita en el Ejemplo 3, la reacción se llevó a cabo a 37ºC durante 5 minutos bajo agitación. A continuación, la mezcla de reacción se lavó cuatro veces con la solución de lavado. Se produjo la emisión añadiendo 100 \mul de solución acuosa de HCl 0,1 N y a continuación 300 \mul de solución de hidróxido de sodio 0,1 M que contenía peróxido de nitrógeno 20 mM. La intensidad quimioluminiscente se midió mediante un fotomultiplicador. Como ensayo de control, se repitió el procedimiento anterior excepto que la muestra de suero se preparó a partir de la sangre completa anterior, y se midió la intensidad quimioluminiscente. El coeficiente de correlación para 50 muestras fue 0,9892, y la recta de regresión fue y = 0,9739 x + 189 (x = suero; y = sangre completa). Las intensidades quimioluminiscentes de ambos casos estuvieron bien correlacionadas.

De acuerdo con la presente invención, la sangre completa se puede usar como una muestra sin pretratamiento, y el analito en la muestra de sangre completa se puede medir rápidamente. Por tanto, la presente invención permite un examen rápido sin el pretratamiento de la sangre recogida que se necesita en los procedimientos convencionales y permite un ahorro de trabajo excepcional en un examen general.

Claims

1. Un procedimiento para medir cuantitativamente una sustancia que se va a examinar, caracterizado en que

(i): una muestra de sangre completa se pone en contacto con una perla como un vehículo insoluble revestida con un primer compañero específicamente enlazable a la mencionada sustancia que se va a examinar en una cantidad suficiente para permitir el movimiento libre de la perla en su interior durante un tiempo de contacto en el que la reacción de enlace de la mencionada sustancia que se va a examinar y el mencionado primer compañero no alcanza un punto final de la misma, y estando el mencionado tiempo de enlace incluido en un intervalo de tiempo dentro del cual el resultado de la mencionada muestra de sangre completa sea idéntico al de una muestra de suero o plasma obtenido a partir de la sangre completa;

(ii): un complejo de la mencionada sustancia que se va a examinar y el mencionado primer compañero se ponen en contacto con un segundo compañero que está marcado y que es capaz de enlazar específicamente con la mencionada sustancia que se va a examinar, estando el mencionado complejo transportado sobre la mencionada perla;

(iii): se separan un complejo resultante de la mencionada perla- el mencionado primer compañero- la mencionada sustancia que se va a examinar- el mencionado segundo compañero marcado, y una porción sin el mencionado complejo resultante, unos respecto de los otros; y

(iv): se detecta una señal originada en el mencionado marcador contenido en una de las mencionadas porciones separadas.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la mencionada muestra de sangre completa se mantiene en contacto con el mencionado vehículo insoluble recubierto con el mencionado primer compañero durante 30 minutos o menos.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el mencionado primer compañero y el mencionado segundo compañero son compañeros inmunológicos.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3 que es un procedimiento inmunológico.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el mencionado procedimiento inmunológico es un inmunoensayo de quimioluminiscencia.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el mencionado procedimiento inmunológico es un inmunoensayo con enzima.

7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la mencionada sustancia que se va a examinar es un antígeno HBs.