ES2320726T3

ES2320726T3 - Procedimiento de analisis inmunologico.

Info

Publication number: ES2320726T3
Application number: ES01270772T
Authority: ES
Inventors: Kunihiko c/o Mitsubishi Kagaku Iatron Inc. NAKAHARA; Tokio c/o Mitsubishi Kagaku Iatron Inc. SAWAI
Original assignee: Mitsubishi Kagaku Iatron Inc
Current assignee: Mitsubishi Kagaku Iatron Inc
Priority date: 2000-12-11
Filing date: 2001-12-11
Publication date: 2009-05-28
Anticipated expiration: 2021-12-11
Also published as: EP1343009A4; WO2002048711A1; CN101446586A; ATE423971T1; JP3899029B2; DE60137792D1; CN1404577A; EP1343009B1; US20040106157A1; JPWO2002048711A1; EP1343009A1

Abstract

Un procedimiento de agregación de látex que comprende las etapas de: (1) puesta en contacto de una muestra que posiblemente contiene una substancia a analizar con un antígeno o anticuerpo conjugado con biotina contra dicha substancia a analizar y, a continuación, puesta en contacto del conjunto con una partícula de látex conjugada con avidina, conteniendo dicho antígeno o anticuerpo conjugado con biotina una molécula de biotina; y (2) análisis de dicha substancia a analizar mediante la detección del grado de agregación entre dicha partícula de látex conjugada con avidina, y un inmunocomplejo formado a partir de dicha substancia a analizar y dicho anticuerpo o antígeno conjugado con biotina.

Description

Procedimiento de análisis inmunológico.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento de análisis inmunológico. Más particularmente, la presente invención se refiere a un procedimiento de análisis que usa una reacción de agregación producida mediante una reacción inmunológica. El término "analizar" o "análisis" tal como se usa aquí, incluye una medición para determinar cuantitativamente o semi-cuantitativamente una cantidad de una substancia a analizar, y una detección para juzgar una presencia o ausencia de una substancia a analizar.

Técnica antecedente

Como un procedimiento de análisis cuantitativamente de un componente traza en un líquido extraído de un cuerpo vivo, frecuentemente se usa un procedimiento de medición inmunológico implica el uso de un anticuerpo o antígeno contra la substancia a analizar. Como el procedimiento de medición inmunológico, se llevan a cabo un ensayo neferométrico y un inmunoensayo turbidimétrico en los cuales se mide ópticamente un inmunocomplejo formado mediante la reacción antígeno-anticuerpo, y un radioinmunoensayo o inmunoensayo enzimático en los cuales se usa como un marcador un radioisótopo o una enzima. Actualmente, está muy difundido el uso de un analizador automatizado capaz de manipular muchas muestras en un corto plazo de tiempo, y se desea una alta sensibilidad. De acuerdo con ello, está muy difundido el uso de un procedimiento de agregación de látex que usa la reacción con una partícula de látex que porta un anticuerpo (o un antígeno). En el procedimiento de agregación de látex, una substancia a analizar se mide mediante la detección del grado de agregación de las partículas de látex, que se forma mediante la reacción entre el anticuerpo (o un antígeno) de unión a la partícula de látex y la substancia a analizar. Como el procedimiento para la detección del grado de agregación, puede mencionarse, por ejemplo, un procedimiento en el cual se observa visualmente la agregación, o un procedimiento en el cual se mide una luz dispersada o una luz transmitida producida por irradiación de luz en un líquido de reacción. El procedimiento de análisis óptico se usa para determinar cuantitativamente un antígeno o un anticuerpo en una muestra.

Los Documentos WO-A-87/01791, EP-A-0 464 554 y EP-A-0 302 715, divulgan composiciones de substancias que comprende un antígeno/anticuerpo conjugado con biotina y partículas de látex conjugadas con avidina.

Sin embargo, para llevar a cabo el procedimiento de agregación de látex, es necesario preparar una partícula de látex que porte un anticuerpo (o antígeno) contra la substancia a analizar. Como este procedimiento, puede mencionarse por ejemplo, un procedimiento de inmovilización en el cual el anticuerpo (o antígeno) está unido a la partícula de látex mediante mezclado, o un procedimiento de unión química en el cual el anticuerpo (o antígeno) está covalentemente unido a la partícula de látex. Estos procedimientos son complicados, y una demostrado ser uno de los problemas en el procedimiento de agregación de látex. Otro e importante problema en el procedimiento de agregación de látex es la auto-agregación de las partículas de látex. Más particularmente, cuando el anticuerpo (o antígeno) es portado sobre la partícula de látex, se altera el equilibrio de una doble capa eléctrica, la cual mantiene la dispersabilidad de la partícula de látex per se en una solución. Como un resultado de ello, se produce la auto-agregación de las partículas de látex independientemente de la reacción del antígeno-anticuerpo. Esta auto-agregación es la causa de una medición inexacta y, a veces, puede observarse con el trascurso del tiempo un incremento o disminución de la sensibilidad, debido a que se reduce per se la estabilidad al almacenamiento de la partícula de látex.

Además, cuando el anticuerpo (o antígeno) contra la substancia a analizar se lleva cabo sobre la partícula de látex, el anticuerpo (o antígeno) tal como una proteína puede a veces ser inactivada por adsorción del anticuerpo (o antígeno) en la superficie de la partícula de látex. Si se produce una inactivación de este tipo, se produce un cambio en la reactividad del anticuerpo (o antígeno) contra la substancia a analizar. Como un resultado de ello, no se produce la reacción inmunológica deseada, o se produce otra reacción, y, en consecuencia, la fiabilidad de la medición se reduce de manera significativa.

Hasta ahora, para resolver los problemas anteriores, se han examinado diversos procedimientos en los cuales el anticuerpo (o antígeno) pueda ser portado fácilmente sobre la partícula de látex y pueda inhibirse la auto-agregación, mejorando un componente contenido en la partícula de látex o un procedimiento para la fabricación de la partícula de látex. Sin embargo, aunque esta vía es beneficiosa para un fabricante, o un suministrador, un comprador de la partícula de látex no puede participar. Según las circunstancias, se han propuesto diversos procedimientos en los cuales un estabilizador tal como un detergente o polisacáridos coexisten en un líquido de almacenamiento que contiene la partícula de látex que porta el anticuerpo (o antígeno). Sin embargo, no se ha encontrado ningún procedimiento que pueda resolver todos los problemas anteriores.

Con el objetivo de resolver los problemas anteriormente mencionados en la reacción de agregación de látex, los autores de la presente invención han llevado a cabo intensos estudios y, como un resultado de ellos, han logrado con éxito un procedimiento en el cual el anticuerpo (o antígeno) contra la substancia a analizar no está directamente portado sobre la partícula de látex, y puede analizarse el grado de agregación entre partículas de látex.

La presente invención está basada en los hallazgos anteriores.

Divulgación de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento de agregación de látex que comprende las etapas de:

(1) puesta en contacto de una muestra que posiblemente contiene una substancia a analizar con un antígeno o anticuerpo conjugado con biotina contra dicha substancia a analizar y, a continuación, puesta en contacto del conjunto con una partícula de látex conjugada con avidina, conteniendo dicho antígeno o anticuerpo conjugado con biotina una molécula de biotina; y

(2) análisis de dicha substancia a analizar mediante la detección del grado de agregación entre dicha partícula de látex conjugada con avidina, y un inmunocomplejo formado a partir de dicha substancia a analizar y dicho anticuerpo o antígeno conjugado con biotina.

Lo que se divulga aquí es un reactivo de análisis inmunológico que comprende:

(1) una composición que comprende un antígeno o anticuerpo conjugado con biotina contra una substancia a analizar (denominada aquí en adelante a veces como la primera composición), y

(2) una composición que comprende una micropartícula conjugada con avidina (denominada aquí en adelante a veces como la segunda composición), en la que el antígeno o anticuerpo conjugado con biotina contiene una cantidad de biotina que no se aglutina de manera substancial con la micropartícula conjugada con avidina en la ausencia de la substancia a analizar.

En el reactivo de análisis inmonológico descrito aquí, una molécula de biotina se conjuga con el antígeno o anticuerpo en el antígeno o anticuerpo conjugado con biotina contenido en la primera composición.

En el reactivo de análisis inmonológico descrito aquí, la micropartícula conjugada con avidina contenida en la segunda composición es una partícula de látex conjugada con avidina.

En el reactivo de análisis inmunológico descrito aquí, una molécula de biotina se conjuga con el antígeno o anticuerpo en el antígeno o anticuerpo conjugado con biotina.

En otra realización preferida del procedimiento de análisis inmunológico de acuerdo con la presente invención, la muestra que posiblemente contiene la substancia a analizar se pone en contacto con el antígeno o anticuerpo conjugado con biotina contra la substancia a analizar y, a continuación, el conjunto se pone en contacto con la micropartícula conjugada con avidina.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una gráfica que muestra los resultados obtenidos comparando un cambio de absorbancia en el caso cuando se usa el reactivo analítico constituido por dos componentes de acuerdo con la presente invención preparado en el Ejemplo 1, con el caso cuando se usa el látex sensibilizado con el anticuerpo SF preparado en los Ejemplos Comparativos 1 y 2.

Mejor modo de realizar la invención

Los conjugados usados en el procedimiento de la presente invención son tal como se describen en la reivindicación 1. El conjugado contenido en la primera composición es un conjugado en el cual se conjuga una cantidad predeterminada de biotina con un antígeno o anticuerpo contra una substancia a analizar. Como el conjugado, se usa un antígeno o anticuerpo conjugado con biotina que contiene una cantidad de biotina que no se aglutina de manera substancial con la micropartícula conjugada con avidina en la ausencia de una substancia a analizar (preferiblemente una molécula de biotina).

Por ejemplo, como el conjugado se prepara un conjugado en el cual dos moléculas de biotina están conjugadas con un antígeno o anticuerpo contra una substancia a analizar. Cuando coexisten el conjugado y una micropartícula conjugada con avidina, se formará un complejo en el cual la micropartícula conjugada con avidina, el conjugado, y otra micropartícula conjugada con avidina están unidas en este orden secuencial y, a continuación, se producirá la auto-agregación, dado que la avidina puede unirse de manera específica a la biotina salvo que coexista la substancia a analizar.

El término "una cantidad de biotina que no se aglutina de manera substancial con la micropartícula conjugada con avidina en la ausencia de una substancia a analizar" tal como se usa aquí, significa una cantidad de biotina en la cual, cuando la micropartícula conjugada con avidina y el antígeno o anticuerpo conjugado con biotina contra una substancia analizar coexisten en la ausencia de la substancia a analizar, no se produce de manera substancial auto-agregación. En relación con esto, el 'termino "no se aglutina de manera substancial" significa que los resultados obtenidos mediante la realización del procedimiento de análisis no son afectados.

\newpage

Tal como se ha descrito anteriormente, el conjugado en el cual dos moléculas de biotina están conjugadas con un antígeno o anticuerpo produce auto-agregación. De acuerdo con ello, la cantidad de biotina que puede conjugarse con el antígeno o anticuerpo en el conjugado no es más de dos moléculas. Preferiblemente, la cantidad es de una molécula.

El conjugado puede prepararse de acuerdo con un procedimiento conocido. Por ejemplo, puede obtenerse mediante la unión química de una o más moléculas de biotina (preferiblemente una molécula) al antígeno o anticuerpo mediante el uso de un agente de biotinilación o, como alternativa, mediante la unión física de una o más moléculas de biotina (preferiblemente una molécula) al antígeno o anticuerpo, eliminando la biotina remanente que no se adsorbe o une al antígeno o anticuerpo, y diluyéndola con un tampón hasta una concentración apropiada. Puede juzgarse si la cantidad de biotina conjugada con el antígeno o anticuerpo es o no una "cantidad de biotina que no se aglutina de manera substancial con la micropartícula conjugada con avidina en la ausencia de una substancia analizar", analizando si se produce o no de manera substancial auto-agregación cuando el conjugado resultante y la micropartícula conjugada con avidina coexisten en la ausencia de la substancia a analizar.

El líquido diluido puede usarse como la primera composición, sin ninguna modificación, o mediante la adición de un aditivo apropiado tal como un estabilizador bien conocido. Como alternativa, la primera composición puede prepararse en forma de polvo mediante la liofilización del líquido diluido, sin modificación o después de la adición de un aditivo apropiado tal como un estabilizador bien conocido. El estabilizador puede ser, por ejemplo, una sal inorgánica, tal como cloruro sódico o azida sódica, una proteína tal como albúmina de suero bovino, o cloruro de colina.

El antígeno o anticuerpo que se conjuga con la biotina en el conjugado no está particularmente limitado, siempre y cuando que este pueda producir la reacción de antígeno-anticuerpo con la substancia a analizar. Como el anticuerpo que incluye un anticuerpo monoclonal y un anticuerpo policlonal, puede usarse una molécula de inmunoglobulina per se o un fragmento de anticuerpo [tal como, Fab, Fab', F(ab')_{2}]. A este respecto, cuando un anticuerpo monoclonal se conjuga con biotina, puede usarse dos o más tipos de anticuerpos monoclonales los cuales se unen independientemente con la substancia a analizar como un antígeno en sitios diferentes, o un tipo de anticuerpo monoclonal que tiene dos o más sitios de reconocimiento del antígeno.

La micropartícula conjugada con biotina contenida en la segunda composición es una micropartícula que se preparar conjugando muchas moléculas de avidina con micropartículas inorgánicas u orgánicas. Como la micropartícula, puede usarse partículas de materiales orgánicos de alto peso molecular, por ejemplo, partículas de látex [es decir, micropartículas de látex, tal como poliestireno, copolímero de estireno-ácido metacrílico, copolímero de estireno-glicidil(met)acrilato, o copolímero de estireno-sulfato de estireno].

No está limitado de manera particular un tamaño de partícula promedio de la micropartícula, pero preferiblemente es de 0,01 hasta 1,0 \mum. Cuando se usan partículas de látex, el tamaño de partícula promedio puede seleccionarse de manera apropiada dentro del intervalo de 0,05 hasta 1,0 \mum (preferiblemente 0,05 hasta 0,5 \mum) de acuerdo con un equipo de medición usado, o una concentración de detección de la substancia a analizar.

Como la avidina, puede usarse cualquier avidina que pueda unirse de manera específica con la biotina, por ejemplo una avidina de clara de huevo, una estreptoavidina, o una avidina preparada mediante técnica de manipulación genética (es decir, avidina recombinante).

La micropartícula conjugada con avidina puede prepararse, por ejemplo, mediante la adición a micropartículas (tales como partículas de látex) de un reactivo para la síntesis de péptidos (tal como carbodiimida soluble en agua) seguido de avidina, agitación y centrifugación del conjunto, y dispersión del residuo en agua. Las micropartículas conjugadas con avidina resultantes (particularmente partículas de látex conjugadas con avidina) pueden diluirse con un tampón que pueda mantener la dispersabilidad de las partículas conjugadas con avidina. El líquido diluido puede usarse como la segunda composición, sin modificación, o mediante la adición de un aditivo apropiado tal como un estabilizador bien conocido. Como alternativa, la segunda composición puede prepararse en forma de polvo mediante la liofilización del líquido diluido, sin modificación o después de la adición de un aditivo apropiado tal como un estabilizador bien conocido.

El tampón que puede mantener la dispersabilidad de las micropartículas conjugadas con avidina (particularmente partículas de látex conjugadas con avidina) puede prepararse mediante la adición de un agente de dispersión (tal como TWEEN 20) a un tampón convencional [tal como 10 mmol/l de tampón de fosfato (pH 7,0)]. Como el estabilizador para la preparación de la segunda composición, puede usarse el estabilizador descrito para la preparación de la primera composición.

Mediante el uso de la primera y segunda composiciones preparadas en los procedimientos anteriormente mencionados, puede prepararse, por ejemplo, un kit de ensayo constituido por dos reactivos, es decir, el primer reactivo en forma líquida o de polvo conteniendo el conjugado y el segundo reactivo en forma líquida o de polvo conteniendo la micropartícula conjugada con avidina. A este respecto, la composición en forma de polvo se usa después de la adición de un tampón apropiado para producir una forma líquida antes de su uso.

En el procedimiento de análisis inmunológico, una substancia a analizar en una muestra puede analizarse poniendo en contacto (a) la muestra que posiblemente contiene la substancia analizar, (b) un antígeno o anticuerpo conjugado con biotina contra la substancia a analizar, y (c) una micropartícula conjugada con avidina, y detectando el grado de agregación entre la micropartícula conjugada con avidina, y un inmunocomplejo formado a partir de la substancia a analizar y el antígeno o anticuerpo conjugado con biotina. En este caso, el antígeno o anticuerpo conjugado con biotina contiene una cantidad de biotina que no se aglutina de manera substancial con la micropartícula conjugada con avidina en la ausencia de la substancia a analizar (preferiblemente un molécula de biotina). El reactivo de análisis inmunológico anteriormente mencionado es adecuado para la realización del procedimiento de análisis inmunológico.

El contacto entre la muestra (a), el conjugado (b), y la micropartícula conjugada con avidina puede realizarse al mismo tiempo. Como alternativa, la muestra (a) puede ponerse primeramente en contacto con el conjugado (b) y, a continuación, el conjunto puede ponerse en contacto con la micropartícula conjugada con avidina (c). Cuando la muestra contiene la substancia a analizar, se forma un inmunocomplejo mediante la reacción antígeno-anticuerpo producida por el contacto entre la muestra (a) y el conjugado (b), y se forma un complejo biotina-avidina mediante la reacción biotina-avidina producida por el contacto entre el conjugado (b) y la micropartícula conjugada con avidina (c). Por ejemplo, se forma un inmunocomplejo mediante la reacción de antígeno-anticuerpo producida por el contacto entre la muestra (a) y el conjugado (b) y, a continuación, la biotina del inmunocomplejo se une a la avidina en la micropartícula conjugada con avidina mediante la reacción biotina-avidina. La substancia a analizar contenida en el inmunocomplejo formado se pone en contacto con otro conjugado (b) para formar otro inmunocomplejo. Este último inmunocomplejo se une posteriormente a otra micropartícula conjugada con avidina y, a continuación, se produce la agregación. Además, existen muchas moléculas de avidina en la micropartícula conjugada con avidina y producen la reacción similar de biotina-avidina y la reacción de antígeno-anticuerpo, y, a continuación, tiene lugar la agregación.

Como un procedimiento para la detección del grado de agregación, puede usarse un procedimiento conocido tal como un ensayo de agregación sobre portaobjetos o un ensayo de agregación sobre una microplaca. Cuando el grado de agregación de las partículas de látex es detectado ópticamente, puede usarse, por ejemplo, un equipo óptico conocido para la medición de una intensidad de luz dispersada, de absorbancia, o una intensidad de luz transmitida. La longitud de onda de medición preferible es de 300 hasta 800 nm.

El procedimiento para la detección del grado de agregación puede llevarse a cabo de acuerdo con un procedimiento conocido, por ejemplo, mediante la selección de un tamaño de partícula de látex usado, una concentración de látex, un tiempo de reacción de la reacción de antígeno-anticuerpo, y/o un tiempo de reacción de la reacción de biotina-avidina, y medición de un incremento o disminución, o una combinación de los mismos, en una intensidad de luz dispersada, de absorbancia, o una intensidad de luz transmitida.

En el procedimiento de análisis inmunológico, puede seleccionarse de manera apropiada una concentración del anticuerpo o antígeno contenido en el sistema de reacción antígeno-anticuerpo, una cantidad de biotina contenida en el conjugado, o una cantidad de la micropartícula conjugada con avidina, de acuerdo con la muestra o la substancia a analizar. Por ejemplo, el intervalo de medición de una concentración de igG (como la substancia a analizar) en suero (como la muestra) es de hasta 50 mg/ml y, de acuerdo con ello, la cantidad usada puede seleccionarse dentro del intervalo de medición. De manera similar, el intervalo de medición de una concentración de elastasa 1 (como la substancia a analizar) es de hasta 50 ng/ml y, de acuerdo con ello, la cantidad usada puede seleccionarse dentro del intervalo de medición.

En el procedimiento de análisis inmunológico, las condiciones de la reacción antígeno-anticuerpo entre la muestra y el conjugado son las mismas que las del procedimiento de análisis inmunológico convencional. En el procedimiento de análisis inmunológico, es necesario que las condiciones sean adecuadas para la reacción de biotina-avidina, dado que la reacción de biotina-avidina entre el conjugado y la micropartícula conjugada con avidina se lleva a cabo en el mismo sistema de reacción que el de la reacción antígeno-anticuerpo.

Como un medio de reacción para la reacción antígeno-anticuerpo y la reacción de biotina-avidina, puede seleccionarse un tampón apropiado de acuerdo con la substancia a analizar. Como un tampón de este tipo, puede usarse uno que tenga una concentración de iones y pH apropiados que no inactive la substancia a analizar y que no inhiba la reacción antígeno-anticuerpo y la reacción de biotina-avidina. Por ejemplo, puede usarse un tampón de Good, un tampón de glicina, o un tampón Tris. El pH en la reacción antígeno-anticuerpo y la reacción de biotina-avidina es preferiblemente de 5 hasta 10, más preferiblemente de 6 hasta 8. La temperatura de reacción es preferiblemente de 0 hasta 50ºC, más preferiblemente de 20 hasta 40ºC. El tiempo de reacción puede seleccionarse de manera apropiada.

La muestra que puede analizarse mediante el procedimiento de análisis de la presente invención no está particularmente limitada, siempre y cuando sea una muestra que posiblemente contenga un antígeno o anticuerpo como la substancia a analizar. Como la muestra, puede mencionarse, por ejemplo, un líquido extraído a partir de un cuerpo vivo y generalmente usado en diagnosis clínico, tal como sangre, suero, plasma, u orina, o una muestra experimental.

La substancia a analizar en el procedimiento de análisis de la presente invención no está particularmente limitada, siempre y cuando que sea una substancia (particularmente una substancia activa fisiológicamente) la cual generalmente puede ser analizada mediante el uso de la reacción antígeno-anticuerpo. Como la substancia a analizar, pueden mencionarse, por ejemplo, proteínas o lípidos, tales como antígenos, anticuerpos, receptores o enzimas. Más particularmente, pueden mencionarse, por ejemplo, proteína reactiva C (CRP), factor reumatoide, ferritina, microglobulina \beta-2, \alpha-fetoproteína (AFT), un anticuerpo anti-estreptolisina O, IgE, un anticuerpo Treponema pallidum, un anticuerpo anticardiolipina, virus de la Hepatitis B (un anticuerpo HBS, un antígeno HBS, un anticuerpo HBc, y un anticuerpo HBe), dímero D, productos de degradación de fibrin(ógeno) (FDP), fibrina soluble (SF), complejo inhibidor de plasmina-\alpha2-plasmina (PPI), un antígeno específico de la próstata (PSA), elastasa 1, elastasa XDP, trombomodulina, o un anticuerpo anti-ADN.

Ejemplos

La presente invención se ilustrará a continuación adicionalmente mediante los Ejemplos siguientes, pero de ningún modo sin limitarse a ellos.

Ejemplo 1 Medición de fibrina soluble (1) Preparación de una solución de biotina conjugada con anticuerpo de fibrina soluble

Como un anticuerpo monoclonal contra fibrina soluble (SF), se usó anticuerpo monoclonal FM No. 43-1 secretado por el hibridoma FM No. 43-1 descrito en la Patente WO 95/12617. El hibridoma se depositó para uso nacional en el International Patent Organism Depositary National Institute of Advanced Industrial Science and Technology [(Nombre anterior) National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology (Dirección: AIST Tskuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome Tukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japón)] el 27 de octubre de 1993, y fue transferido a un depósito internacional el 27 de octubre de 1994. El número de depósito internacional (un número entre paréntesis [] seguido del número de depósito internacional es un número de depósito nacional) es FERM BP-4846 [FERM P-13925].

Más particularmente, se llevó a cabo el procedimiento siguiente de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 2(b) de la Patente WO 95/12617. Se preparó una ascitis que contenía el anticuerpo monoclonal contra fibrina soluble (SF). Una fracción bruta purificada procedente de la ascitis mediante el uso de sulfato amónico se trató con una resina de intercambio de iones (DEAE) seguido por digestión con pepsina para obtener F(ab')_{2}. Al F(ab')_{2} resultante, se agregó 2-mercaptoetil amina para obtener un fragmento de anticuerpo Fab'. El anticuerpo resultante se disolvió en 50 mmol/l de un tampón de fosfato (pH 7,1) a una concentración de 2,5 mg/ml, se agregaron 0,6 mg de biotina maleimida (fabricada por Funakoshi Co. Ltd.) a la solución, y la sensibilización se llevó a cabo a temperatura ambiente durante un día. Se recogió un conjugado del anticuerpo Fab' y biotina mediante filtración de gel sobre Superdex G-25 Superfine y, a continuación, el conjugado se agregó a 0,1 mol/l de un tampón de fosfato (pH 6,5) a una concentración de 0,05 mg/ml, para preparar una solución de biotina conjugada con anticuerpo SF.

(2) Preparación de una suspensión de látex de avidina

Se agregó carbodiimida soluble en agua (WSC) a 0,1 ml de partículas de látex al 10% (tamaño de partícula: 0,3 \mum) hasta una concentración final de 2,5 mg/ml, y el conjunto se dejó reposar durante 10 minutos. Después de agregar 0,8 mg/ml de estreptoavidina, el conjunto se agitó durante una hora. La mezcla se centrifugó, y al precipitado resultante se agregaron 0,5 ml de agua destilada. El conjunto se agitó para obtener una dispersión de látex de avidina al 2%. La dispersión resultante se diluyó con 10 mmol/l de suspensión de MOPS (pH 7,0) para preparar una suspensión de látex de avidina al 0,5%.

(3) Reactivo para el análisis de un antígeno SF

Un reactivo para el análisis de antígeno SF humano en el ejemplo presente, es un kit de ensayo constituido por dos reactivos, es decir, el primer reactivo constituido por la solución de biotina conjugada con anticuerpo SF preparada en el apartado (1) anterior y el segundo reactivo constituido por la suspensión de látex de avidina preparada en el apartado (2) anterior.

(4) Antígeno SF patrón líquido

Un coágulo obtenido mediante la reacción de un fibrinógeno comercialmente disponible (libre de factor XIII, fabricado por Kabi Diagnostica AB) con trombina, se solubilizó con ácido acético, y se agregó a plasma para preparar un antígeno SF. Se usaron plasmas humanos que contenían el antígeno a una concentración de 0 \mug/ml, 10 \mug/ml, 20 \mug/ml, 40 \mug/ml, 60 \mug/ml, ó 80 \mug/ml.

(5) Procedimiento de análisis

A continuación, 130 \mul de la solución de biotina conjugada con anticuerpo SF preparada en el apartado (1) anterior, se mezclaron con 3 \mul del antígeno SF patrón líquido preparado en el apartado (4) anterior, y el conjunto se dejó reposar a 37ºC durante 5 minutos. Después de agregar 130 \mul de suspensión de látex de avidina preparada en el apartado (2) anterior, el conjunto se agitó. A partir de la adición, se midió la absorbancia a la longitud de onda de 600 nm durante 10 minutos. Una cantidad de cambio en la absorbancia (\DeltaAbs) fue la cantidad de cambio en la absorbancia durante 10 minutos. La medición se llevó a cabo mediante el uso de un analizador automático LPIA-S500. En la Figura 1 se muestra el resultado.

Ejemplo Comparativo 1

(1) Adsorción física de anticuerpo a látex

El fragmento F(ab')_{2} del anticuerpo monoclonal anti-SF preparado en el Ejemplo 1(1) se disolvió hasta una concentración de 0,5 mg/ml en 10 mmol/l de un tampón Tris-HCl (pH 8,0) para preparar un anticuerpo líquido. A 5 ml del anticuerpo líquido, se agregaron 5 ml de látex de poliestireno (contenido en sólidos = 5% (p/v), tamaño de partícula promedio = 0,3 \mum; JSR Corporation), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos.

A la mezcla, se agregaron 100 mmol/l de un tampón Tris-HCl (pH 8,0) que contenía suero de albúmina bovino al 0,3% (p/v). El conjunto se agitó a temperatura ambiente durante 60 minutos y, a continuación, se centrifugó a
20.000 rpm.

Al precipitado resultante, se agregaron 10 ml de 10 mmol/l de un tampón Tris-HCl (pH 8,0) que contenía NaN_{3} al 0,05%. El conjunto se agitó para preparar un reactivo de látex para comparación sensibilizado con el anticuerpo anti-SF.

(2) Medición de SF

A continuación, se mezclaron 130 ml de 0,1 mol/l de tampón de fosfato (pH 6,5) con 3 \mul de antígeno SF patrón líquido preparado en el Ejemplo 1(4), y el conjunto se dejó reposar a 37ºC durante 5 minutos. Después de agregar 130 \mul del reactivo de látex sensibilizado con el anticuerpo anti-SF preparado en el Ejemplo Comparativo 1(1), el conjunto se agitó. A partir de la adición, se midió durante 10 minutos la absorbancia a la longitud de onda de 600 nm. En la Figura 1 se muestra el resultado.

Ejemplo Comparativo 2

(1) La solución de biotina conjugada con el anticuerpo SF preparada en el Ejemplo 1(1), se disolvió a una concentración de 0,5 mg/ml en 10 mmol/l de un tampón MOPS (pH 7,0). A la solución, se agregó látex de avidina usado en el Ejemplo 1(2) a una concentración del 1%. El conjunto se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos para preparar látex sensibilizado con anticuerpo SF. El látex sensibilizado con anticuerpo SF resultante se diluyó con 10 mmol/l de suspensión de MOPS (pH 7,0) para preparar una suspensión de látex sensibilizado con anticuerpo SF al 0,5%, como un reactivo de látex para comparación sensibilizado con el anticuerpo anti-SF.

(2) A continuación, se mezclaron 130 \mul de 0,1 mol/l de tampón de fosfato (pH 6,5) con 3 \mul del antígeno SF patrón líquido preparado en el Ejemplo 1(4). Después de 5 minutos, se agregaron 130 \mul del reactivo de látex sensibilizado con el anticuerpo anti-SF preparado en el Ejemplo Comparativo 2(1), y el conjunto se agitó. A partir de la adición, se midió durante 10 minutos la absorbancia a la longitud de onda de 600 nm. En la Figura 1 se muestra el resultado.

En la Figura 1, el símbolo \blacksquare muestra el resultado del reactivo de látex sensibilizado con el anticuerpo anti-SF preparado en el Ejemplo Comparativo 1, y el símbolo \blacklozenge muestra el resultado del reactivo de látex sensibilizado con el anticuerpo anti-SF preparado en el Ejemplo Comparativo 2. Los símbolos \medbullet y \medcirc muestran los resultados del kit de ensayo constituido por dos reactivos de la presente invención en el Ejemplo 1(5). El símbolo \cdot muestra el resultado en el cual la concentración de la biotina conjugada con anticuerpo SF fue de 0,0250 mg/ml, y el símbolo o muestra el resultado en el cual la concentración de la biotina conjugada con anticuerpo SF fue de 0,05 mg/ml. El símbolo A muestra el resultado en la ausencia de la biotina conjugada con anticuerpo SF (es decir, concentración de la biotina conjugada con anticuerpo SF = 0,00 mg/ml) en el Ejemplo 1(5).

Tal como resulta obvio a partir de la Figura 1, de acuerdo con el reactivo de análisis, el cual es un kit de ensayo constituido por dos reactivos, es decir, el primer reactivo constituido por la solución de biotina conjugada con anticuerpo SF y el segundo reactivo constituido por la suspensión de látex de avidina, se obtuvo una reactividad excelente igual o superior a la obtenida mediante el procedimiento de látex convencional (Ejemplo Comparativo 1). Además, de acuerdo con el reactivo de análisis, no se produjo auto-agregación y, en consecuencia, la cantidad de cambio en la absorbancia en la ausencia del antígeno SF (es decir, concentración = 0) fue baja, en comparación con el procedimiento en el cual el anticuerpo biotinilado fue previamente unido al látex de avidina (Ejemplo Comparativo 2). Este resultado es muy importante para mejorar una sensibilidad de la medición.

Aplicabilidad industrial

De acuerdo con la presente invención, no es necesario un procedimiento complicado en el cual se porte un antígeno o anticuerpo sobre una micropartícula tal como una partícula de látex. Además, no se produce la auto-agregación de partículas de látex y, en consecuencia, se mejora la estabilidad de almacenamiento. Además, a diferencia de la técnica anterior, cuando un anticuerpo o antígeno contra una substancia a analizar se porta sobre látex, no se produce inactivación de la proteína por adsorción con la superficie de látex. En consecuencia, la reactividad contra la substancia a analizar no resulta afectada y, por ello, puede llevarse a cabo una medición precisa de la sustancia a analizar. Además, en la medición de la substancia a analizar basada en la reacción de agregación inmunológica, los valores de absorbancia se incrementaron y se mejoró la sensibilidad, en comparación con el procedimiento que usa un látex sensibilizado con un anticuerpo (o antígeno) convencional (un procedimiento de inmovilización). Además, de acuerdo con la presente invención, en comparación con el procedimiento en el cual el anticuerpo biotinilado está previamente unido al látex de avidina, el valor en blanco pasa a ser bajo y, en consecuencia, se mejora la exactitud, cuando el sujeto tiene una concentración más baja del objeto de medición, y puede obtenerse una excelente reactividad, cuando el sujeto tiene una concentración más alta del objeto de medición. El reactivo de análisis de la presente invención es adecuado para uso como un reactivo de análisis para un equipo de análisis automático.

Como se ha mencionado anteriormente, la presente invención se explica con referencia a realizaciones particulares, pero las modificaciones y mejoras obvias para los expertos en la técnica, se encuentran incluidas dentro del ámbito de la presente invención.

Claims

1. Un procedimiento de agregación de látex que comprende las etapas de: