CN107576806A - 一种粒细胞集落刺激因子检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents
一种粒细胞集落刺激因子检测试剂盒及其使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种粒细胞集落刺激因子检测试剂盒，包括试剂R1：MES缓冲液、NaCl、NaN3、BSA、EDTA、Tween‑20、PEG‑8000、生物素偶联的抗体共价物，溶剂为纯化水；试剂R2：MES缓冲液、NaCl、NaN3、BSA、甘油、乳胶亲和素共价物，溶剂为纯化水。本发明还公开了一种粒细胞集落刺激因子检测试剂盒的使用方法。本发明的优点在于：(1)试剂盒具有较高的灵敏度和准确度，操作简单、快速；(2)稳定性佳，特异性强；(3)在抗原抗体反应的基础上增加了生物素‑亲合素系统，大大提高检测的灵敏度；(3)无需大型仪器配合使用，成本低；(4)用于全自动生化分析仪，可大规模开展和推广。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域，尤其涉及一种粒细胞集落刺激因子检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种糖蛋白，含有174个氨基酸，分子量约为20000，主要由内毒素、TNF-α和IFN-γ可活化单核细胞和巨噬细胞产生。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的基因全长2.5kb，包括5个外显子和4个内含子，G-CSF有5个半胱氨酸，Cys 36与Cys42，Cys74与Cys64之间形成两对二硫键，Cys17为不配对半胱氨酸，二硫键对于维持G-CSF生物学功能是必须的因素。人和小鼠G-CSF在氨基酸水平上有73％同源性，并具有相互交叉的生物学活性。
粒细胞集落刺激因子主要作用于中性粒细胞系造血细胞的增殖、分化和活化。重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，其重要作用是刺激粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及噬酸性细胞的多种功能。
粒细胞集落刺激因子临床主要用于预防和治疗肿瘤放疗或化疗后引起的白细胞减少症、治疗骨髓造血机能障碍及骨髓增生异常综合征、预防白细胞减少可能潜在的感染并发症、以及使感染引起的中性粒细胞减少的恢复加快。
目前，检测粒细胞集落刺激因子的方法主要是酶联免疫吸附法和基因芯片。其中，酶联免疫吸附法操作繁琐、定量检测效果不佳，且结果受人为因素影响结果较大；基因芯片虽灵敏度高，但一次检测项目多，不能独立，经济费用高。
因此，目前急需一种操作简单、检测准确、成本低的粒细胞集落刺激因子检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种操作简单、检测准确、成本低的粒细胞集落刺激因子检测试剂盒及其使用方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种粒细胞集落刺激因子检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
其溶剂为纯化水；
试剂R2：
其溶剂为纯化水。
作为本发明的优选方式之一，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
其溶剂为纯化水；
试剂R2：
其溶剂为纯化水。
作为本发明的优选方式之一，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
其溶剂为纯化水；
试剂R2：
其溶剂为纯化水。
作为本发明的优选方式之一，所述试剂R1的MES缓冲液的pH为6.1。
作为本发明的优选方式之一，所述试剂R2的MES缓冲液的pH为7.5。
作为本发明的优选方式之一，所述试剂R2中的乳胶亲和素共价物与试剂R1中的生物素偶联的抗体共价物的质量比为1:4。
一种粒细胞集落刺激因子检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)将待测样品与试剂R1混合，37℃孵育5min；
(2)用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度A1；
(3)再与试剂R2混合，37℃反应5min；
(4)用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度A2；
(5)根据吸光度变化值计算出样本中粒细胞集落刺激因子的浓度。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)的试剂R1和步骤(3)的试剂R2的体积比为3:1。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)的待测样品与试剂R1和试剂R2构成的试剂液之间的体积比为1:40。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)和步骤(4)中，在波长550nm处测定吸光度A1和A2。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(5)中，吸光度变化值为ΔA，即A2减去A1后的值。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)本发明试剂盒具有较高的检测灵敏度和准确度，操作简单、快速，从检测到出结果只需10分钟；
(2)本发明所形成的抗原抗体复合物，稳定性佳，在特定波长下有一定的吸光度，特异性强；此外，在抗原抗体反应的基础上增加了生物素-亲合素系统，大大提高了检测的灵敏度；
(3)本发明试剂盒无需大型仪器设备配合使用，成本低；
(4)本发明试剂盒使用时，无需手工操作；可用于全自动生化分析仪上，适合全自动测试，可大规模的开展和推广。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种粒细胞集落刺激因子检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
其溶剂为纯化水；
试剂R2：
其溶剂为纯化水。
实施例2
本实施例的一种粒细胞集落刺激因子检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
其溶剂为纯化水；
试剂R2：
其溶剂为纯化水。
实施例3
本实施例的一种粒细胞集落刺激因子检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
其溶剂为纯化水；
试剂R2：
其溶剂为纯化水。
实施例4
本实施例的一种粒细胞集落刺激因子检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
其溶剂为纯化水；
试剂R2：
其溶剂为纯化水。
实施例5
本实施例的一种上述实施例中粒细胞集落刺激因子检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制试剂R1：
①按照上述实施例中试剂R1的组分含量，配制MES缓冲液并调节pH；
②按照上述实施例中试剂R1的组分含量，将NaCl、NaN3、BSA、EDTA、Tween-20、PEG-8000溶于MES缓冲液中，搅拌均匀，待所有原料充分溶解，制得R1缓冲液；
③按照上述实施例中试剂R1的组分含量，将生物素偶联的抗体共价物溶于R1缓冲液中，搅拌均匀，即得试剂R1；
(2)配制试剂R2：
①按照上述实施例中试剂R2的组分含量，配制MES缓冲液并调节pH；
②按照上述实施例中试剂R2的组分含量，将NaCl、NaN3、BSA、甘油溶于MES缓冲液中，搅拌均匀，即得R2缓冲液；
③制备乳胶亲和素共价物：
a.取粒径为120nm的胶乳微球于100mM MES缓冲液中，加入50g/L EDAC溶液，混匀后于37℃环境中孵育混匀1h，离心去上清；再加入50g/L NHS溶液恢复至原体积后，混匀于37℃环境中孵育混匀1h，离心去上清；
b.将剩余物质分散于MES缓冲液中，加入亲和素，37℃下反应4h，离心，将沉淀物分散于原体积的PBS缓冲液中，反复3次；最后将沉淀物分散于原体积的NHS缓冲液中，加入酪蛋白30g/L；
c.5℃封存48h，得最终所需的乳胶亲和素共价物；
④用R2缓冲液来溶解得到的乳胶亲和素共价物，超声分散，最终制得试剂R2。
实施例6
本实施例的一种上述实施例中粒细胞集落刺激因子检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)将5uL待测样品与150uL试剂R1混合，37℃孵育5min；
(2)用全自动生化分析仪在波长550nm处测定反应后的吸光度A1；
(3)再与50uL试剂R2混合，37℃反应5min；
(4)用全自动生化分析仪在波长550nm处测定反应后的吸光度A2；
(5)根据吸光度变化值ΔA＝A2-A1，计算出样本中粒细胞集落刺激因子的浓度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种粒细胞集落刺激因子检测试剂盒，其特征在于，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
试剂R2：
2.根据权利要求1所述的粒细胞集落刺激因子检测试剂盒，其特征在于，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
试剂R2：
3.根据权利要求1所述的粒细胞集落刺激因子检测试剂盒，其特征在于，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
试剂R2：
4.根据权利要求1-3任一项所述的粒细胞集落刺激因子检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1的MES缓冲液的pH为6.1。
5.根据权利要求1-3任一项所述的粒细胞集落刺激因子检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R2的MES缓冲液的pH为7.5。
6.一种使用如权利要求1-3任一项所述的粒细胞集落刺激因子检测试剂盒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将待测样品与试剂R1混合，37℃孵育5min；
(2)用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度A1；
(3)再与试剂R2混合，37℃反应5min；
(4)用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度A2；
(5)根据吸光度变化值计算出样本中粒细胞集落刺激因子的浓度。
7.根据权利要求6所述的粒细胞集落刺激因子检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(1)的试剂R1和步骤(3)的试剂R2的体积比为3:1。
8.根据权利要求6所述的粒细胞集落刺激因子检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(1)的待测样品与试剂R1和试剂R2构成的试剂液之间的体积比为1:40。
9.根据权利要求6所述的粒细胞集落刺激因子检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(4)中，在波长550nm处测定吸光度A1和A2。
10.根据权利要求6所述的粒细胞集落刺激因子检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(5)中，吸光度变化值为ΔA，即A2减去A1后的值。
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