CN101929999B

CN101929999B - 一种用于检测抗膜突蛋白抗体的试剂盒

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Publication number: CN101929999B
Application number: CN2009100535087A
Authority: CN
Inventors: 曾小峰; 李梦涛; 尹雷; 艾军; 赵久良; 王迁; 张玥; 黄岚; 杨超文; 李春梅; 孙宏彬; 钱杰
Original assignee: Shanghai Kexin Biotech Co Ltd
Current assignee: Shanghai Kexin Biotech Co Ltd
Priority date: 2009-06-19
Filing date: 2009-06-19
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2029-06-19
Also published as: CN101929999A; WO2010145173A1

Abstract

本发明公开了一种用于检测抗膜突蛋白抗体的试剂盒，所述试剂盒中含有固相载体和膜突蛋白抗原蛋白，所述膜突蛋白抗原蛋白为全长人膜突蛋白。本发明的试剂盒可以应用于对CTD相关肺脏受累进行早期预测和病情评估的方法，主要通过采集受试者的生物样本，并检测该生物样本中抗膜突蛋白抗体的量进行评估。本发明利用蛋白质组学技术和基因重组技术制备膜突蛋白，提供了一种用于检测抗膜突蛋白抗体的ELISA检测试剂盒，该试剂盒对于CTD相关肺脏受累的检出率可达51.7％。

Description

一种用于检测抗膜突蛋白抗体的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测抗膜突蛋白抗体的试剂盒。

背景技术

自身免疫病(autoimmune diseases，AID)是以自身免疫应答反应导致组织器官损伤和相应功能障碍为主要发病机制的一类疾病。自身免疫疾病有器官特异性和非器官特异性两大类。而弥漫性结缔组织病，简称结缔组织病(connective tissue disease，CTD)属于非器官特异性自身免疫病。该类疾病往往具有下列共同特点：患者血液中常常出现高滴度的自身抗体和(或)与自身组织成分起反应的致敏淋巴细胞；而患者体内产生的自身抗体或致敏淋巴细胞，与相应的自身组织抗原结合，通过不同的方式造成组织器官的免疫损伤和功能障碍而致病。同时往往自身免疫应答反应的强度与自身免疫病的病情密切相关。因而，结缔组织病自身抗体反应的特异性和致病性显示其在对该疾病的诊断分类、病情评估、以及判断预后中的价值。

肺脏受累是结缔组织病常见的并发症之一，几乎所有CTD均有肺脏受累，并且可能为CTD的首发症状。该类并发症起病隐匿，早期诊断困难，并且往往治疗效果不佳，是导致CTD患者死亡的重要原因之一。但是，目前临床中常用的自身抗体检测指标均不能够提示CTD相关肺脏受累，并且临床上没有一项血清学指标用于诊断结缔组织病相关肺脏受累。其中以肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)和间质性肺病(interstitial lungdisease，ILD)为甚，目前已经成为风湿免疫科和呼吸内科医师面临的一大难题。

CTD肺脏受累(主要包括PAH和ILD)的病因未明，但是血管炎症是其免疫病理机制之一。许多研究表明，白细胞，内皮细胞和细胞外基质的相互作用在免疫系统的功能中发挥重要作用。这些相互作用对于CTD相关肺脏损伤同样重要，其中抗内皮细胞的自身抗体(Anti-endothelial cell antibodies，AECA)也参与血管损伤。有研究发现在系统性硬化症中AECA与血沉增快、肺动脉高压、肺纤维化、乃至肺泡-毛细血管受损密切相关(参见SavageCOS，Pottinger BE.Vascular damage in Wegener’s granulomatosis and microscopic polyarteritispresence of anti-endothelial cell antibodies and their relation to anti-neutrophil cytoplasmanti-bodies.Clin Exp Immunol 1991；85：14-19)。近年来一些研究发现，AECA与CTD相关的PAH有较为密切的关系，应用ELISA法研究SSc(systemic scleroderma，系统性硬皮病)、MCTD(mixed connective tissue disease，混合性结缔组织病)及SLE(Systemic LupusErythematosus，系统性红斑狼疮)患者，发现合并PAH组AECA阳性率明显高于无PAH组，已有研究应用免疫印迹法发现SSc患者AECA-75KD条带出现的频率较高，但由于AECA识别的抗原是分子量范围广泛的一组蛋白质，在探讨其致病机制方面存在很大困难。本发明者以EA.hy926细胞为底物，通过细胞-ELISA法和免疫印迹法检测患者血清AECA，结果显示CTD患者AECA阳性率明显高于IPAH患者、COPD患者，但在CTD患者各不同组之间无明显差异。通过应用SDS-PAGE、双向电泳、免疫印迹、质谱分析等一系列方法鉴定得到CTD相关PAH患者的靶抗原(78KD内皮细胞蛋白质)成分为膜突蛋白(membrane-organizing extension spike protein，moesin)；并利用免疫组化方法在人肺微血管内皮细胞水平进行证实。

膜突蛋白是1988年在牛的子宫平滑肌细胞中被首次发现的，理论分子量为68KD，实际分子量为78KD，等电点6.08，由577个氨基酸残基组成，在细胞中以休眠和激活两种状态存在，第558位苏氨酸残基(T)磷酸化被认为是其激活的方式。1991年Lankes WT等提出膜突蛋白与细胞膜下根蛋白-埃兹蛋白共同构成了ERM蛋白家族(ezrin/radixin/moesin，埃兹蛋白/根蛋白/膜突蛋白)(参见Lankes WT，Furthmayr H.Moesin：amember of the protein 4.1-talin-ezrin family of proteins.Proc Natl Acad Sci U S A.1991，88(19)：8297-301.)。膜突蛋白通过介导细胞质膜与肌动蛋白细胞骨架的连接，在细胞的生长、运动、迁移、有丝分裂以及信号转导等方面发挥重要作用(参见Polesello C，Payre F.Small is beautiful：what flies tellus about ERM protein function in development.Trends Cell Biol，2004，14：294-302.)。ERM蛋白可通过调节细胞皮质层肌动蛋白的重新分布、参与细胞内信号转导途径等作用，参与自身免疫病的发生、发展过程。

抗ERM抗体与自身免疫病相关，一项关于类风湿关节炎(RA)的研究发现，患者的血清中存在抗ERM蛋白抗体，通过重组蛋白、原核表达，对71份RA血清检测，发现12例(17％)，11例(15％)，10例(14％)分别有抗r(重组的)-埃兹蛋白，r-根蛋白和r-膜突蛋白抗体。抗r-ERM的检出率要低于RA33抗体(36％)和抗Sa的检出率。在这项试验中，原发性干燥综合征和SLE患者未发现抗ERM抗体阳性，正常人有一例阳性。RA患者中抗ERM抗体的阳性情况与类风湿因子和抗核抗体无关(参见Wagatsuma M，Kimura M，Suzuki R，et al.Ezrin，radixin and moesin are possible auto-immune antigens in rheumatoid arthritis.Mol Immunol.1996，33(15)：1171-1176.)。该项研究并未进一步探讨抗膜突蛋白(membrane-organizing extension spikeprotein，moesin)抗体在RA的发病机制，以及RA相关肺脏损伤的发病机制中的作用，同时也未涉及抗moesin抗体在RA的早期诊断，判断预后方面的作用，并且至今，国内外均无文献报告相关内容。

Takamatsu等在2007年(参见Takamatsu H，Feng X，Chuhjo T，et al.Specific antibodiesto moesin，a membrane-cytoskeleton linker protein，are frequently detected in patients withacquired aplastic anemia.Blood，2007，109：2514-2520.)研究发现部分再生障碍性贫血患者存在抗膜突蛋白抗体，并认为这类再生障碍性贫血和CTD存在相似的病理机制：即某种因素破坏了机体对膜突蛋白的免疫耐受，导致特异性抗膜突蛋白抗体的产生，进一步介导了造血细胞的损伤(参见Takamatsu H，Espinoza JL，Lu XZ，et al.Anti-moesin antibodies in theserum of patients with aplastic anemia stimulate peripheral blood mononuclear cells to secreteTNF-αand IFN-γ.J Immunol，2009，182：703-710.及Graham A，Ford I，Morrison R，et al.Anti-endothelial antibodies interfere in apoptotic cell clearance and promote thrombosis in patientswith antiphospholipid syndrome.J Immuno，2009，182：1756-1762.)。

大部分结缔组织病的特点是有较为特异的自身抗体，是一组病因复杂的疾病，其基础疾病的不同，治疗时机的差异对预后有重要影响。CTD相关PAH在临床表现隐匿，CTD患者筛查PAH的主要方法是超声心动图，由于缺乏敏感的实验室诊断指标和病情监测指标，很多患者在发现时已处于中晚期，错过了最佳治疗时机。一些研究发现，内皮细胞形态和行为异常是CTD相关PAH的重要始动环节，而AECA是可以与血管内皮细胞上多种蛋白质成分相结合的自身抗体，具有潜在的致病作用。抗内皮细胞抗体(AECA)是70年代初在肾活检标本中发现的自身抗体，为血管受损和血管炎的标记，可以与内皮细胞上多种成分相结合，具有潜在的致病性；与一些自身免疫病的临床表现、病情活动、预后有很大的相关性。AECA是一组抗体的总称，其抗原是位于内皮细胞膜或细胞浆的多种成分，在很多CTD中都有较高的检出率，目前常用的检测方法为细胞-ELISA法和免疫印迹法。在SLE中的检出率可达40～50％，且与肺动脉高压、雷诺现象、浆膜炎等联系密切；在SSc的检出率可达40～54％；在炎性肌病的早期也可检测到。一些研究用免疫印迹法检测，发现不同结缔组织病的阳性条带不同，如125KD可能对韦格纳肉芽肿(WG)比较特异，而200KD对SLE患者更加特异，在SSc中则以90KD的抗原最常见。另外，同一种疾病中某个特定的条带可能与特定的症状有关，如SLE中狼疮肾炎、低补体血症与抗60KD条带抗体有关，血小板减少症与抗55KD有关，胸膜炎与抗18KD有关。

近年来一些研究发现，AECA与CTD相关的PAH有相关性，用细胞酶联免疫吸附法(ELISA)研究SSc、MCTD及SLE患者，发现合并PAH患者的AECA滴度明显高于无PAH组，但由于AECA识别的抗原是分子量范围广泛的一组蛋白质，细胞-ELISA方法无法识别特定的蛋白质组份，在探讨其致病机制方面存在很大困难。2005年Tamby等应用免疫印迹法对肺动脉高压的患者的AECA做了分子量定位，发现SSc患者靶抗原为75KD的AECA阳性率较高，而IPAH组没有出现，但SSc患者中是否伴有PAH之间没有显著差异。基于目前的研究背景，研究者采用细胞ELISA和免疫印迹法检测CTD相关PAH患者血清中AECA的阳性率，研究AECA与PAH的关系，为探讨AECA的致病机制及临床应用提供依据。

经研究发现，在健康人群、肿瘤患者、以及不同自身免疫疾病患者的外周血中，CTD患者的抗moesin抗体的滴度显著增高，并与合并肺脏受累显著相关，提示抗moesin抗体是参与CTD相关肺脏损伤的重要免疫致病因子。因此抗moesin抗体可以作为CTD相关肺脏受累早期诊断及预后的特异性指标。目前，国际上尚无膜突蛋白及其抗体参与CTD相关肺脏受累发病机制的研究。结合CTD相关肺脏受累具有自身免疫性炎症和血管病变的特点，必然存在共同的自身免疫机制导致肺微血管内皮细胞损伤的过程。因此，需要一种快速有效检测抗膜突蛋白抗体的方法，用于对CTD相关肺脏受累进行早期预测，病情评估和预后判断。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种用于检测抗膜突蛋白抗体的试剂盒。

本发明第一方面提供了一种用于检测抗膜突蛋白抗体的检测板，所述的检测板包括：固相载体和包被于所述固相载体的膜突蛋白抗原蛋白，所述膜突蛋白抗原蛋白为全长人膜突蛋白。

所述抗膜突蛋白抗体为IgG型抗体。

优选的，所述固相载体为酶标反应板。

本发明第二方面，提供了所述用于检测抗膜突蛋白抗体的检测板的制备方法，包括如下步骤：

a)包被：用包被缓冲液稀释膜突蛋白抗原蛋白，然后将该抗原蛋白溶液加入到固相载体上进行包被，包被完毕后洗涤并干燥；

b)封闭：加入封闭液后进行封闭，封闭完毕后洗涤并干燥；

c)制板：以室温20℃～25℃真空干燥2小时，干燥过程中的压强不超过-0.094Mpa；然后进行真空密封，2℃～8℃储存。

优选的，所述步骤a)中的包被缓冲液为PBS溶液。

优选的，所述步骤a)中的抗原蛋白溶液的浓度为2～5μg/ml。

优选的，所述步骤a)中的包被在2℃～8℃的温度下进行12～16小时。

优选的，所述步骤b)中封闭液为10mM PBS溶液，pH7.0～pH7.4，其中含有质量百分比为5～10％的山羊血清以及质量百分比为10％的蔗糖。

优选的，所述步骤b)中的封闭在37℃的温度下进行2h。

本发明第三方面提供了一种用于检测抗膜突蛋白抗体的检测试剂盒，所述的检测试剂盒含有上述检测板，或者分别包装的固相载体和膜突蛋白抗原蛋白，所述膜突蛋白抗原蛋白为全长人膜突蛋白。

所述试剂盒中还包括标记抗体，该标记抗体上标记有能产生检测信号的物质，且能够与抗膜突蛋白抗体相结合。

优选的，所述能产生检测信号的物质选自：过氧化物酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。

更优选的，所述标记抗体为辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗人IgG抗体。

在该用于检测抗膜突蛋白抗体的试剂盒中，所述固相载体、膜突蛋白抗原蛋白和标记抗体分别独立包装，且膜突蛋白抗原蛋白和标记抗体均为混悬液。

所述膜突蛋白抗原蛋白和标记抗体混悬液的溶剂可以是常规的适合抗原抗体反应的溶剂体系，如：HEPES缓冲液体系，Tris缓冲液体系等。其中，膜突蛋白抗原蛋白混悬液的溶剂优选：Tris缓冲液、PBS+1％BSA，PBS+1％BSA+50％甘油；标记抗体混悬液的溶剂优选为商品化抗体稀释液，如：Guardian^TM Peroxidase Conjugate Stabilizer/Diluent。上述各种溶剂中还可添加起封闭和蛋白保护作用的物质如BSA以及防止微粒聚集的稳定试剂如Tween20，出于对试剂防腐以及长期储存的考虑还可在溶剂中添加防腐剂，防腐剂可选叠氮钠、硫柳汞，优选为叠氮钠。

优选的，所述试剂盒中还包括与能产生检测信号的物质相对应的显色液。

更优选的，所述显色液包括显色剂A和显色剂B，其中，显色剂A的组成为：柠檬酸.H₂O9.33g/L、Na₂HPO₄.12H₂O 36.8g/L和过氧化脲0.2g/L；显色剂B的组成为：柠檬酸.H₂O 2.1g/L、TMB 0.2g/L、EDTA-Na₂ 0.3g/L、无水乙醇46.5ml/L和丙酮3.5ml/L，显色剂A和显色剂B的溶剂均为水。

用于检测抗膜突蛋白抗体时，上述试剂盒中还可包括阳性对照、阴性对照，以及参考样品，上述参考样品为含有确定浓度抗膜突蛋白抗体的溶液。上述阳性对照、阴性对照，以及参考样品分别独立包装。含有确定浓度抗膜突蛋白抗体的溶液中抗膜突蛋白抗体的浓度为抗膜突蛋白抗体临床参考临界值(cutoff值)对应的浓度。

优选的，所述试剂盒中还可包括：包被缓冲液、样品缓冲液、封闭液、洗涤缓冲液和终止液中的一种或多种。

优选的，所述包被缓冲液为PBS缓冲液。

优选的，所述样品缓冲液为磷酸盐缓冲液-吐温溶液(PBST)，以pH7.0～7.4为宜，其中含有质量百分比为0.5～2％的牛血清白蛋白(BSA)。

优选的，所述封闭液为10mM的PBS溶液，以pH7.3～7.4为宜，其中含有质量百分比为8～10％的山羊血清以及质量百分比为10％的蔗糖。

优选的，所述洗涤缓冲液为磷酸盐缓冲液-吐温溶液(PBST)。

优选的，所述终止液为浓度为2M的H₂SO₄溶液。

本发明第四方面提供了所述用于检测抗膜突蛋白抗体的检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

①、抗原抗体反应：将膜突蛋白抗原蛋白包被在固相载体上，然后在固相载体的微孔内分别加入待测样品；

②、酶联反应：将标记抗体溶液加入各孔，振荡、孵育；然后洗涤；在每个微孔中加入对应于能产生检测信号的物质的底物和显色剂，避光孵育，在每个微孔加入终止液，终止反应；

③、测定光吸收值(OD)。

优选的，所述步骤①中的待测样品选自血液、血清和血浆，更优选的，所述待测样品在使用前需要用样品稀释液按1∶100的比例稀释。

优选的，所述步骤①中，每个微孔中待测样品的加样量为100μl。

优选的，所述步骤②中的标记抗体的稀释度为1∶15000～40000，更优选为1∶20000。

优选的，所述步骤②中，每个微孔中标记抗体的加样量为100μl。

优选的，所述步骤②中的所述孵育在20℃～25℃的温度下进行0.5h；所述步骤③中的所述孵育在20℃～25℃的温度下进行15～30min。

优选的，所述步骤④中的所述测定光吸收值时，主波长为450nm，参考波长为620～650nm。

优选的，所述步骤④中还包括根据含有确定浓度抗膜突蛋白抗体的参考样品计算待测样品中抗膜突蛋白抗体的浓度，并判断是否达到临床参考临界值(cutoff值)。

本发明第五方面提供了一种检测抗膜突蛋白抗体的方法，包括如下步骤：

(a)将待测样品加样于包被有膜突蛋白抗原蛋白的固相载体，从而使待测样品中的抗膜突蛋白抗体与固相载体上的膜突蛋白抗原蛋白结合，形成“抗膜突蛋白抗体-膜突蛋白抗原蛋白”二元复合物；所述膜突蛋白抗原蛋白为全长人膜突蛋白；

(b)将标记抗体加样于步骤a)中获得的二元复合物，形成“标记抗体-抗膜突蛋白抗体-膜突蛋白抗原蛋白”三元复合物；所述标记抗体为标记有检测信号产生工具，且能够与抗膜突蛋白抗体相结合的抗体；

(c)通过使用与检测信号相匹配的检测工具对三元复合物产生的信号进行检测，从而确定待测样品中抗膜突蛋白抗体的含量及是否达到临床参考临界值(cutoff值)。

本发明提供了一种由用于缔组织病相关肺脏受累早期诊断的血清学特异性抗原膜突蛋白抗原蛋白制成的试剂盒，该蛋白可以特异性的识别缔组织病相关肺脏受累患者外周血中的特异性抗体——抗膜突蛋白抗体，该抗体可通过一些较为简便的免疫学检测方法(如：酶联免疫吸附法)检测出来。同现有的细胞ELISA法和免疫印迹法检测相关抗体比较具有很高的敏感性和特异性，并且该法适合临床各级实验室常规开展，实现高通量检测，检测结果重复性好且易于标准化。能够达到通过血清学方法诊断结缔组织病相关肺脏受累的疾病的目的，为结缔组织病相关肺脏受累的疾病的临床诊断提供客观依据。本发明的用于检测抗膜突蛋白抗体的检测试剂盒可以应用于对CTD相关肺脏受累进行早期预测和病情评估的方法，主要通过采集受试者的生物样本，并检测该生物样本中抗膜突蛋白抗体的量，从而进行评估。本发明利用蛋白质组学技术和基因重组技术制备膜突蛋白抗原蛋白，提供一种用于检测抗膜突蛋白抗体的ELISA检测试剂盒，该试剂盒对于CTD相关肺脏受累的检出率可达51.7％。

附图说明

图1不同患者AECA免疫印迹结果。

图2AECA-EA-78胰蛋白酶酶解后的质谱总离子流图。

图3膜突蛋白(Moesin)的氨基酸组成及质谱分析可匹配的氨基酸序列(加粗且下划线标记为可匹配的氨基酸序列)

图4HPMEC膜成分为底物验证(ECL显色)。

图5膜突蛋白在HPMEC的分布(×1000倍)。

图6pET32a(+)图谱。

图7pET28a(+)图谱。

图8重组质粒pET32a-moesin的酶切鉴定电泳图。

图9纯化的pET32a-moesin的电泳结果。

图10pET28a-mosein纯化图；其中左图为一次上样后的电泳图谱；右图为二次上样后的电泳图谱。

图11不同CTD疾病抗moesin抗体OD均值比较示意图。

图12不同肺脏受累CTD患者膜突蛋白抗体滴度示意图。

图13免疫组化技术检测抗moesin抗体结果。

具体实施方式

实施例1CTD相关PAH的AECA主要靶抗原moesin的确定

第一步：CTD相关PAH患者的AECA检测

通过细胞-ELISA法和免疫印迹法检测CTD相关PAH患者中抗内皮细胞抗体的阳性率，分析AECA与CTD相关PAH特异性及疾病临床活动指标的关系。

1.研究对象与方法

1.1研究对象

研究对象为2006年1月至2007年5月在北京协和医院风湿免疫科门诊、病房诊治的结缔组织病相关肺动脉高压患者，实验组选取68例CTD相关PAH(CTD-PAH)患者(只合并肺动脉高压而无肺间质、肾脏、神经系统等内脏受累的患者)，对照组为12例特发性肺动脉高压(IPAH)患者、61例CTD无PAH的患者，其中CTD单纯合并肾小球病变(CTD-GN)患者21例、单纯合并间质性肺炎患者(CTD-ILD)20例、无内脏受累患者20例、慢性阻塞性肺疾病相关肺动脉高压(COPD-PAH)患者20例及健康对照20名。不同CTD患者均为符合相应的临床诊断或分类标准的确诊患者，入选患者的抗磷脂抗体均为阴性。收集患者临床、实验室资料，采集血清-20℃保存备用。每位患者用免疫荧光法检测抗核抗体，用免疫双扩散法和免疫印迹法检测抗可提取性核抗原(ENA)抗体，包括抗U1核糖体核蛋白(RNP)抗体和抗Ro(SSA)抗体。同时，还包括MCTD(mixed connective tissuedisease，混合性结缔组织病)和UCTD(undifferentiated connective tissue disease，未分化结缔组织病)患者两组。患者情况具体如表1及表2所示。

表1：68例CTD-PAH患者基本情况

组别	例数	性别(男/女)	年龄(岁，X±SD)	CTD病程(年，中位数)	PAH病程(月，中位数)
						SLE	25	2/23	27±8	5(0.25，9)	4(0.5，36)
MCTD	10	1/9	39±14	3(0.5，11)	2(0.5，24)
						SSc	7	1/6	41±12	3(0.25，7)	3(0.5，30)
UCTD	11	0/11	43±14	2.5(0.5，21)	8(0.5，36)
						PSS	8	2/6	45±13	4(0.25，14)	8(0.5，60)
PM/DM	7	1/5	48±6	2(0.25，6)	6(0.5，18)

表2：不同组别病例基本情况

组别	例数	性别(男/女)	年龄(岁，mean±SD)	CTD病程(年，中位数)	脏器受累病程(月，中位数)
						CTD-PAH	68	7/61	38±14	3.75(0.25，21)	3.5(0.5，60)
CTD-ILD	20	4/16	51±9	4(0.25，11)	2.5(0.5，30)
						CTD-GN	21	3/18	39±9	3(0.25，7)	3.3(0.5，22)
CTD无内脏受累	20	3/17	36±7	3(0.25，11)	无
						IPAH	12	7/5	43±14	无	24(1，96)
COPD-PAH	20	11/9	69±8	无	72(12，300)
						健康人	20	10/10	43±12	无	无

1.2.实验方法

1.2.1利用EA.hy926细胞株(EA.hy926细胞株是1983年Edgell CJ将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)与人肺癌细胞株A549融合而来。)通过细胞-ELISA法检测抗内皮细胞抗体。

1.2.2利用EA.hy926细胞株，通过免疫印迹法检测抗内皮细胞抗体(AECA)：提取内皮细胞膜及浆蛋白，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜后检测AECA阳性条带。

1.3实验结果

1.3.1细胞-ELISA方法检测AECA结果

本项实验结果显示：CTD患者AECA阳性率明显高于非CTD患者，但CTD患者各组之间无显著性差异；CTD相关PAH患者AECA的阳性率明显高于IPAH患者和COPD合并PAH的患者，差异有显著性(如表3所示)。

表3：不同组别患者Cyto-ELISA检测AECA结果

组别	患者例数	AECA阳性例数	AECA阳性百分比
				CTD-PAH	68	52	76.4％
CTD-GN	21	17	81.0％
				CTD无内脏受累	20	14	70.0％
CTD-ILD	20	17	85.0％
				IPAH	12	2	16.7％^**
COPD-PAH	20	1	5.0％^**
				健康对照	20	0	0

与CTD-PAH比较，^**P＜0.01。

1.3.2免疫印迹法检测AECA的结果

免疫印迹法检测初筛结果显示，大部分CTD-PAH的患者有共同的AECA条带，即78KD条带(参见图1)。如图所示，大部分CTD-PAH的患者有共同的AECA条带，即78KD条带。进一步将实验组和对照组比对发现，AECA-78KD条带的阳性率在CTD合并PAH患者明显高于特发性肺动脉高压患者、结缔组织病无内脏受累患者、COPD合并PAH患者和正常对照组(P＜0.05或P＜0.01)，AECA-78KD条带的阳性率分别为：结缔组织病合并肺动脉高压患者为79.4％(54/68)，结缔组织病合并肾小球病变的患者71.4％(15/21)，特发性肺动脉高压患者8.3％(1/12)、结缔组织病无内脏受累患者50.0％(10/20)(如表4所示)。

表4：实验组及对照组中AECA-78KD的阳性率

组别	例数	AECA-78KD阳性例数	AECA-78KD阳性率
				CTD-PAH	68	54	79.4％
CTD-GN	21	15	71.4％
				CTD无内脏受累	20	10	50.0％^*
IPAH	12	1	8.3％^**##
				COPD-PAH	20	0	0
健康人	20	0	0

注：与CTD-PAH比较，^*P＜0.05^**P＜0.01；

与CTD-GN比较，#P＜0.05##P＜0.01

1.3.3AECA与疾病临床特征及病情活动性的关系

1)有无雷诺现象：有雷诺现象的患者的血清AECA-78KD检出率明显高于无雷诺现象的患者，差异有显著性(P＜0.01)。抗U1RNP抗体和抗SSA抗体是否阳性与AECA-78KD的检出率无明显关系。

2)AECA-78KD与CTD患者炎性指标的关系：AECA-78KD的阳性情况与血沉、CRP、血白细胞之间均无显著相关性。因此实验结果及临床资料分析显示，CTD患者的各组炎性指标水平与78KD-AECA无明显相关性。

3)AECA-78KD与CTD病程及PAH病程之间的关系：结果显示CTD病程大于5年的患者AECA-78KD阳性率明显大于CTD病程小于5年的患者，差异有显著性。而与PAH病程无明显相关性(如表5所示)。

表5：CTD患者AECA-78KD与临床指标及病程的关系

1.4结论

1.4.1以EA.hy926细胞为底物，细胞ELISA法和免疫印迹法检测AECA阳性情况显示：CTD不同靶器官受累的患者AECA-78KD条带的阳性率不同，合并PAH和肾小球病变的患者明显高于无内脏受累的患者；

1.4.2CTD有雷诺现象的患者AECA-78KD的阳性率明显高于没有雷诺现象的患者，CTD病程大于五年的患者AECA-78KD的阳性率明显高于病程小于五年的患者。与患者的炎性指标及抗U1RNP、SSA抗体之间无明显相关性。

第二步：证实抗内皮细胞抗体-78Kd的靶抗原为moesin蛋白

应用SDS-PAGE、双向电泳、免疫印迹、质谱分析技术，分离和鉴定CTD相关PAH患者高频率出现的AECA-78KD靶抗原。

2.1材料与方法

2.1.1所用细胞

人肺微血管内皮细胞(原代HPMEC)购自Sciencell公司，入室后经过VWF(yonWillebrand factor)、八因子和CD31(P-CMA)抗体检测，均为阳性体现内皮源性。人肺微血管内皮细胞HIV、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母菌和真菌检测均为阴性。

2.1.2实验方法

提取细胞膜蛋白，并进行样品浓缩，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹。根据免疫印迹的阳性条带以及Marker和参照条带，定位凝胶上的目标蛋白条带，取出后进行上质谱仪前样本处理后，做质谱分析及数据库检索(送交天津生物芯片技术有限责任公司)。

2.2试验结果

1)样品：将单向SDS-PAGE分离的78KD的AECA-EC条带，标记为AECA-EA-78。

2)AECA-EA-78抗原的鉴定：

图2为AECA-EA-78抗原由LC-ESI-IT-MS/MS分析质量肽谱的总离子流图。MS确定了酶解所得到的每一肽段的分子量，选择相对强度较强的肽段进行二级质谱分析。对MS检测到的肽段，我们通过MS/MS测定了氨基酸序列。MS确定了酶解所得到的每一肽段的分子量，如图所示纵坐标为相对强度，横坐标为质荷比。

Sequest检索结果：在检索结果中选择分子量、Xcorr、Delta Cn、Sp、Rsp及Icons等参数比较符合的进行分析。选择其中Moesin[Homo sapiens][gi：16878176]来进行分析，Moesin[Homo sapiens][gi：16878176]鉴定分数为139分。Moesin[Homo sapiens][gi：16878176]的理论分子量是68KD，等电点为6.08，是ERM蛋白家族的成分，由577个氨基酸组成。质谱分析搜索到的肽段数为65个，可匹配的肽段为23个，序列覆盖率为33％，氨基酸序列参见SEQ ID NO：1。

2.3结论

CTD相关PAH患者相对特异的AECA-78KD的相应抗原为moesin蛋白。

第三步：moesin在人肺微血管内皮细胞膜表达的验证

本部分内容主要为通过抗moesin单抗应用Western Blot验证阳性条带和阴性条带位置，以及抗moesin单抗作用于人肺微血管内皮细胞验证moesin表达。

3.1材料和方法

3.1.1标本来源：培养的人肺微血管内皮细胞(HPMEC)，本部分实验选取第5代至第7代的细胞。

3.1.2方法：

1)Western Blot验证阳性条带和阴性条带位置：方法同前，膜突蛋白单抗1∶5000稀释，ECL显色。

2)免疫荧光形态学观察moesin蛋白在HPMEC的分布。

3.2结果

3.2.1Western Blot法验证阳性条带和阴性条带位置结果：详见图4，图4为HPMEC膜成分为底物验证(ECL显色)，其中从左到右起，泳道1为Marker、泳道2-3为阳性血清、泳道4为单抗、泳道5为阴性血请。HPMEC膜成分为底物验证(ECL显色)。

3.2.2免疫荧光形态学观察膜突蛋白在HPMEC的分布：免疫荧光图见图5，由图5中可以看出：荧光显示为moesin，主要分布在细胞膜上。

实施例1的实验结果证明：抗内皮细胞抗体-78Kd的靶抗原为moesin蛋白，同时moesin在人肺微血管内皮细胞膜表达，可以确定CTD相关PAH的AECA主要靶抗原为moesin蛋白。

实施例2moesin蛋白基因克隆、原核表达与纯化

第一步：膜突蛋白的基因重组

1.1重组蛋白moesin克隆模板的获得：从胃癌组织中提取RNA，反转录为cDNA。

1.2根据genebank提供的moesin蛋白全长cDNA序列如下，

1.2.1核苷酸序列：(序列参见＞gi|53729335：199-1932Homo sapiens moesin(MSN)，mRNA1734bp)。

1.2.2蛋白序列：参见SEQ ID NO：1及图3。图3中，膜突蛋白(Moesin)的氨基酸组成及质谱分析可匹配的氨基酸序列(加粗且下划线标记为可匹配的氨基酸序列)。

1.2.3moesin蛋白扩增引物序列设计如下：

Moesin-top(EcoR I)对应序列为SEQ ID NO：2

5’-CCGGAATTCATGCCCAAAACGATCAGT-3’

Moesin-bottom(Hind III)对应序列为SEQ ID NO：3

5’-CCCAAGCTTTTACATAGACTCAAATTCGTC-3’

1.3采用大肠杆菌表达系统，将扩增所得全长序列克隆入载体，选用pET32a(+)和pET28a(+)两种，连接产物转化宿主菌：大肠杆菌BL21(DE3)，进行诱导培养。pET32a(+)克隆位点详见图6中所示，图6中，M为DL2000marker、泳道1为pET32a-moesin质粒、泳道2为pET32a-moesin质粒EcoR I/Hind III双酶切。pET28a(+)克隆位点详见图7中所示。

1.4对克隆产物进行酶切鉴定，产物大小符合预期，参见图8，图8为重组质粒pET32a-moesin的酶切鉴定电泳图，其中从左到右，M为DL2000marker、泳道1为pET32a-moesin质粒、泳道2为pET32a-moesin质粒EcoR I/Hind III双酶切。进一步对重组质粒进行测序，pET32a-moesin的测序由上海英俊公司完成，测序结果通过序列比对可知成功获得了moesin全长，序列完全正确，符合预期。然后将测序正确的pET32a-moesin进行EcoR I和Hind III双酶切，同时pET28a进行同样酶切，构建pET28a-moesin重组质粒。

第二步：重组moesin蛋白表达

2.1moesin的克隆表达

将测序正确的pET32a-moesin和pET28a-moesin进行划板，挑取单克隆在含有相应抗生素的培养基中培养过夜，次日按1∶100进行接种，200rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀＝0.3～0.4，加入终浓度为1mM的诱导剂IPTG，培养4小时后收菌。

2.2moesin的纯化

取适量菌体进行超声，上清离心后，经SDS-PAGE电泳显示moesin在两种表达载体中均获得了可溶性表达。

2.2.1pET32a-moesin的纯化

3g菌体用30ml的20mM的PB缓冲液(pH＝8.0)冰裕搅拌混匀，然后进行超声破碎，4度，12000rpm，40min，离心取上清，用0.45μm的滤膜过滤。用平衡液(20mMPB，0.15MNaCl，20mM的咪唑)平衡镍柱，然后样品进行上样，1ml/min。上样完毕后用平衡液冲柱后用洗脱液1(50mM咪唑，20mMPB，0.15MNaCl)和洗脱2(100mM咪唑，，20mMPB，0.15MNaCl)洗脱，收集相应洗脱峰，见图9。图9中，从左到右，M为protein marker(94.0，66.2，45，35，24，20，14.4kDa)、泳道1为moesin超声后的上清、泳道2为洗脱液1洗脱产物、泳道3为洗脱液2洗脱产物。

2.2.2pET28a-mosein纯化

4g菌体用40ml的20mM的Tris-HCL缓冲液(pH＝8.0)冰裕搅拌混匀，后进行超声破碎。4度12000rpm，40min离心取上清，用0.45μm的滤膜过滤。

用平衡液(20mM Tris-HCL，0.15M NaCl，20mM咪唑，pH＝8.0)平衡镍柱，然后进行上样，上样速度为1ml/min。上样完毕后用平衡液冲柱后用洗脱液1(20mM Tris-HCL，0.15MNaCl，50mM咪唑，pH＝8.0)和洗脱液2(20mM Tris-HCL，0.15M NaCl，100mM咪唑，pH＝8.0)进行洗脱，收集相应洗脱峰。电泳结果见图10(左)。图10(左)中，从左到右，M为蛋白marker(94.0，66.2，45，35，24，20，14.4kDa)，泳道1为28a-moesin诱导后全菌、泳道2为28a-moesin诱导后全菌上样穿液、泳道3为洗脱液1产物、泳道4为洗脱液1洗脱产物、泳道5为洗脱液2洗脱产物、泳道6为28a-moesin诱导后全菌超声离心沉淀。

将洗脱所得的样品，用20mM的Tris-HCL缓冲液(pH＝8.0)稀释至咪唑浓度为5mM二次上柱，平衡后，再用洗脱液1(20mM Tris-HCL，0.15M NaCl，50mM咪唑，pH＝8.0)和洗脱液2(20mM Tris-HCL，0.15M NaCl，100mM咪唑，pH＝8.0)洗脱，收集洗脱峰。电泳结果见图10(右)。图10(右)中，从左到右，M为蛋白marker、泳道1为样品、泳道2为穿液、泳道3为洗脱液1、泳道4为洗脱液2。

实施例2的结果证实通过原核表达纯化技术获得高纯度moesin全长蛋白。

实施例3抗moesin抗体检测试剂盒的制备

第一步：最优反应条件的摸索实验

1.1两种重组蛋白的抗原性评价和选择依据

对两种重组蛋白抗原通过间接法酶联免疫法进行抗原性评估，具体方法为：将抗原稀释成1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、10μg/ml后包被酶标板，临床收集的抗moesin体检测结果为强阳、弱阳及阴性的血清样本各1份。在上述抗原包被的浓度范围内，抗原1#选择能明显区分三份不同血清样本，且差异显著者，因此将抗原1#作为检测用抗原蛋白，认为其具有较强的抗原性(灵敏度)和较低的背景值(特异性)。见表6。

表6：不同抗原的抗原性鉴定结果

1.2标记抗体稀释液的选择

选用商品化Pierce过氧化物酶稀释液，其商品名为“Guardian^TM Peroxidase ConjugateStabilizer/Diluent”作为标记抗体稀释液，该稀释液能满足试剂盒的性能要求(见试剂盒稳定性实验)。

1.3封闭液的确定

用含0.5％、1％、2％、3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液为封闭液，结果表明含1％～3％BSA封闭液较其它浓度有较好的封闭效果，但正常人检测OD均值在0.2左右(参见图11)，换用另一种封闭系统后得到很好的效果，在基本不降低阳性值的前提下，较好地压低了本底。最终选择了10mM pH7.3～7.4PBS+8～10％山羊血清+10％蔗糖作为封闭液。

1.4血清稀释度的选择

根据阴阳性样本检测值的差异大小及控制本底的角度，最终选择了1∶100。实验数据见表7。

表7：血清稀释度的选择实验结果

血清稀释缓冲液为：PBST pH7.3～pH7.4+1％BSA，储存温度：2℃～8℃。

1.5酶标羊抗人IgG稀释度的选择

在确定了抗原蛋白最适包被浓度(4μg/ml)基础上，运用棋盘试验法，选择抗原的最佳包被浓度和酶标羊抗人IgG的稀释度，选取依据为阴阳性样本检测值差别拉大即信噪比高，阳性血清的OD₄₅₀值大于1.60，阴性血清的OD₄₅₀小于0.15，但又不造成包被抗原和酶标羊抗人IgG的浪费。最终选择的酶标羊抗人IgG稀释度为1∶20000。实验数据见表8。

表8：包被抗原浓度和酶标羊抗人IgG稀释度的选择试验结果

注：1)各种稀释度和包被浓度对应的数据是OD₄₅₀-OD₆₃₀。

2)(+)：抗moesin抗体阳性血清，(-)：抗moesin抗体阴性血清。

1.6参考临界值(cutoff值)的确定

检测400份正常人血清，根据400份血清的检测OD值计算检测平均值x和标准差SD。以x+2SD作为cutoff值，此cutoff值代表95％的可信度。结果见表9。

表9：正常人群的检测结果(OD值)的均值和标准差

n＝400		SD	+2SD
				OD₄₅₀-OD₆₃₀	0.093	0.022	0.159

第二步：完成本实施例的方式

2.1.制备96孔包被板

1)包被：以PBS溶液作为包被缓冲液稀释抗原蛋白至4μg/ml，每孔加液量100μl，包被温度为2℃～8℃，包被时间：12～16小时，抗原包被后倒去包被液，以PBS洗涤板孔1次后甩去板中液体并扣干。

2)封闭：加封闭液：10mM pH7.3～pH7.4PBS(溶液配方见后)+8～10％山羊血清+10％蔗糖，200μl/孔，置于37℃孵育箱中封闭2小时，倒去封闭液，以PBS洗涤板孔1次后甩去板中液体并扣干。

3)制板：以室温20℃～25℃真空干燥2小时，压强-0.09MPa，以不超过-0.094Mpa为宜。将酶标板装入密封袋，真空密封，2℃～8℃储存。

2.2所需溶液的配制方法，优选方案：

1)样品稀释缓冲液：PBST pH7.3～pH7.4+1％BSA。储存温度：2℃～8℃。

2)酶标记抗体工作液：

酶标记抗体：辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗人IgG抗体。

酶标记抗体稀释液：采用Pierce的商品化抗体稀释液，“Guardian^TM PeroxidaseConjugate Stabilizer/Diluent”。两者配制比例：1∶20000，储存温度：2℃～8℃。

3)洗涤缓冲液：0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液-吐温溶液(PBST)，试剂盒提供洗涤液为10倍浓缩液，配方中各成分及含量为：Na₂HPO₄.12H₂O(11.5g)、NaH₂PO₄.2H₂O(2g)和NaCl(87g)，用去离子水800ml充分溶解后，调pH值至7.4，加5ml Tween-20，定容至1000ml，2～8℃贮存。

4)显色系统：采用H₂O₂/TMB显色系统，试剂盒内含显色剂A和显色剂B，使用时每孔加入A、B液各50μl。

显色剂A：柠檬酸.H₂O(9.33g)、Na₂HPO₄.12H₂O(36.8g)和过氧化脲(0.2g)。充分溶解后，用去离子水定容至1000ml，2～8℃贮存。

显色剂B：柠檬酸.H₂O(2.1g)、TMB(0.2g)、EDTA-Na₂(0.3g)、无水乙醇(46.5ml)和丙酮(3.5ml)。充分溶解后，用去离子水定容至1000ml，2～8℃贮存。

5)终止液：2M：H₂SO₄(98％)110ml，加纯化H₂O至1L。

第三步：抗moesin抗体检测操作程序

3.1准备工作：

1)将试剂平衡至室温，约需30分钟，各试剂在使用前应充分混匀。

2)配制应用洗涤液：将试剂盒中的浓缩洗涤液(10×)用纯化水按1∶10倍稀释。如果一次不需使用整块板进行测试，则根据测试样本孔数，取相应量浓缩的洗涤液，按1∶10倍的比例稀释。稀释后的应用洗涤液可在2～8℃环境下保存一周。

3)稀释待检血清：将待检血清用样品稀释液按1∶100的比例稀释。检测待检血清建议做复孔。稀释后的血清样本应在8小时内使用。

3.2实验步骤

1)将所需moesin抗原包被的微孔板条放置在酶标板架上，不需要的板条应立即放回包装袋中，并将其密封好，尽量减少与水蒸汽的接触，切勿将袋内干燥剂丢弃。

2)检测时，将阳性对照、阴性对照和稀释好的待检血清一起孵育。

3)加样品：每孔100μl，用封板膜把板条口封好，室温(20℃～25℃)孵育半小时(加完最后一个样本后开始计时)。阳性对照、阴性对照为实验可靠性的内部对照，每次实验都必须做。如室温低于20℃，需在20℃～25℃的恒温培养箱中孵育。

4)洗板：手洗时，把反应孔内的溶液倒出，每孔加入应用洗涤液300μl，在微量震荡器上震荡1分钟，震荡后再静置半分钟，然后把反应孔内的溶液倒出，把板条倒扣扣干，反应孔内应无肉眼可见的液体残留量和气泡，如此重复3次。机洗时每孔加应用洗涤液350μl，洗涤液在孔中保留1分钟，重复3次，最后把板条倒扣扣干。

5)加酶标抗体工作液：每孔100μl，室温(20℃～25℃)孵育半小时。

6)洗板：同步骤4，共洗5次。

7)显色：每孔加入显色A、B液各50μl，在室温(20℃～25℃)避光反应15分钟。

8)终止反应：每孔加入50μl终止液，轻轻震荡混匀，终止反应。

9)测定光吸收值(OD)：主波长为450nm，参考波长为620nm～650nm之间，优选630nm。测定各孔OD值。

3.3结果详见实施例4。

实施例4临床患者群体中验证

对于大样本量的CTD患者(主要包括RA，SLE，SSC，SV，RA和MCTD等)以及肿瘤患者(主要为乳腺癌)进行外周血抗moesin抗体筛查，比较不同疾病的群体间抗moesin抗体的差异。

1研究对象与方法

1.1研究对象

研究对象为2007年4月至2009年5月在北京协和医院风湿免疫科门诊和病房诊治的结缔组织病患者，试验组选取159例血管炎患者(主要为白塞氏病，MPA，TAA)，SLE 81例，MCTD 37例，SSc 83例，对照组为30例健康对照和20例疾病对照(主要包括COPD，DPLD，肺癌，IPAH以及糖尿病，冠心病等常见疾病)(如表10所示)。所有CTD诊断皆符合美国风湿病学会(ACR)或相应的国际分类诊断标准^[1]。收集患者临床信息、实验室检查资料，采集血清或血浆，-20℃保存备用。每位患者用免疫荧光法检测抗核抗体，用免疫双扩散法和免疫印迹法检测抗可提取性核抗原(ENA)抗体，包括抗U1核糖体核蛋白(RNP)抗体和抗Ro(SSA)抗体。同时每位患者均进行肺功能检测(通气功能+弥散功能)。

表10：不同组别患者基本情况

组别	例数(n)	性别(男/女)	年龄(岁，mean±SD)	CTD病程(月，mean±SD)
					SLE	81	1/80	33±9	51±47
MCTD	37	2/35	37±11	47±44
					SSc	83	9/74	45±11	85±70
血管炎	159	22/137	31+12	50+71
					疾病对照^*	20	5/15	48±6
健康对照	30	3/27	46+5

1.2方法

1.2.1通过对于患者外周血(血清/血浆)应用ELISA方法检测抗moesin抗体，具体步骤详见实施例3。根据实施例3中第一步中确定的OD值的cut-off数值为0.159进行结果阴性或阳性判断。

1.2.2通过免疫组化技术检测抗moesin抗体

1.2.2.1细胞爬片的处理：用玻璃刀将标准盖玻片划成1/4大小，清洗、消毒，包被L-多聚赖氨酸(2ug/cm²)，置于24孔板中，待检细胞按常规消化、计数，按实验计划种到细胞培养板上，使细胞铺后板后达到50～80％，用0.01mol/L pH7.2PBS洗两次，3.7％多聚甲醛固定30min以上，-20℃保存。

1.2.2.2免疫荧光法检测抗moesin抗体：

1)去固定液，用洗涤液洗2次，每次3-5分钟，吸尽液体。

2)用封闭液(1％牛血清白蛋白BSA)封闭60分钟，在摇床上轻轻摇动。

3)去封闭液，加稀释的抗moesin抗体血清(1∶50～1∶100)，每玻片20ul，于37℃湿盒内作用60分钟，或湿盒内4℃作用过夜(覆盖封口膜，避免干燥)。

4)用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。

5)去除洗涤液，每玻片加入兔抗鼠荧光二抗稀释液(1∶50)20ul，湿盒内室温作用60分钟。

6)用洗涤液洗涤2次，每次3-5分钟。

7)滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。使细胞接触封片液，切勿弄反。

8)荧光显微镜观察、拍照。

1.2.2.3骨架蛋白F-actin染色

1)鬼笔毒素母液的准备：购买的荧光鬼笔毒素300units溶于1.5ml的甲醇溶解。

2)固定洗好的细胞爬片，置于0.1％X-100Triton PBS中萃取3到5分钟，用PBS洗两次。

3)将鬼笔毒素母液按1∶40稀释，加到爬片上，湿盒内室温60min。

4)滴加抗荧光衰减剂封片，或继续行下述操作。

1.2.2.4细胞核染色：

1)将100μg/ml 1μl Hoechst 33342原液用PBS稀释成1ug/ml，加到爬片上，37℃恒温孵育30分钟。

2)滴加抗荧光衰减剂封片。

1.2.2.5激光共聚焦显微镜拍照，(红色荧光激发波长545nm，绿色荧光激发波长488nm，蓝色荧光激发波长356nm)。观察细胞形态。

1.3实验结果

表11：不同组别患者检测抗moesin抗体结果

组别	例数	抗moesin抗体阳性例数	抗moesin抗体阳性率
				SSc	83	34	41.0％^**
MCTD	37	15	40.5％^**
				SLE	81	41	50.6％^**
血管炎	164	39	23.8％
				疾病对照组	20	2	10％
健康人	34	3	8.8％

^**SSc，MCTD，和SLE组阳性率与疾病对照组和健康对照组之间卡方检验结果P＜0.001。

2、CTD不同脏器受累的moesin抗体阳性率判断

选择57例SSc患者为例，分析不同脏器受累患者的抗moesin抗体阳性率结果，应用卡方检验分析，结果提示呼吸系统受累中抗moesin抗体的阳性率存在差异(如表12所示)。

表12不同脏器受累患者的抗moesin抗体阳性率结果

3、不同CTD相关肺脏受累的moesin抗体OD值的均值比较

PAH组，ILD组，和PAH&ILD各组与健康对照组之间P值均＜0.05；无肺脏受累组与健康对照之间P＝0.292；PAH组与无肺脏受累组比较，p＝0.723；ILD组与无肺脏受累组比较，p＝0.467；PAH&ILD组与无肺脏受累组比较，p＝0.001(one-way ANOVA)，具体结果参见图12。图12中，其中PAH组，ILD组，和PAH&ILD各组与健康对照组之间P值均＜0.05；无肺脏受累组与健康对照之间P＝0.292；PAH组与无肺脏受累组比较，p＝0.723；ILD组与无肺脏受累组比较，p＝0.467；PAH&ILD组与无肺脏受累组比较，p＝0.001(one-way ANOVA)

4、抗moesin抗体定性判断与PFTs各项指标的统计分析

选择MCTD和SSc患者为研究对象，通过肺功能检查反向验证抗moesin抗体的定性判断的临床意义，结果发现抗moesin抗体阳性的患者于阴性患者相比较，其TLC，FVC和FEV1均有显著差异，提示抗moesin抗体阳性和阴性的患者之间在肺脏的表现上，阳性组患者限制性通气功能障碍更明显(如表13所示)。

表13：不同抗膜突蛋白抗体患者肺功能特点

参数	anti-moesin抗体阴性组(n＝62)	anti-moesin抗体阳性(n＝44)	p-值(t检验)
				TLC	90.7±14.0	83.3±10.5	0.004^**
FVC	83.7±18.2	77.2±11.9	0.035^*
				FEV1	85.1±13.8	75.9±12.0	0.000^**
FEV1/FVC	83.2±9.1	83.1±6.9	0.975
				DLCO	69.2±21.0	63.8±17.19	0.166
DLCOVA	84.9±26.3	80.8±19.4	0.476

^*p＜0.05

5、同一患者治疗前后抗体滴度比较

表14同一患者治疗前后抗体滴度比较

6、moesin定性判断与PFTs各项指标的单因素方差分析

表15：不同抗膜突蛋白抗体患者肺功能特点

参数	anti-moesin抗体阴性组(n＝38)	anti-moesin抗体阳性(n＝26)	p-值(t检验)
				TLC	89.5±14.3	82.4±9.7	0.027^*
FVC	84.6±17.4	76.0±12.7	0.040^*
				FEV1	84.7±16.4	76.2±11.5	0.028^*
FEV1/FVC	83.5±7.3	85.5±6.2	0.258
				DLCO	72.3±23.4	57.7±16.5	0.014^*
DLCOVA	83.3±27.1	74.6±17.6	0.209

^*p＜0.05。

7、其他抗体指标与肺脏受累之间的关系(卡方检验)

表16其他抗体指标与肺脏受累之间的关系

临床中常见的抗体往往在诊断某种CTD具有一定特异性。例如抗dsDNA抗体和Sm抗体诊断系统性红斑狼疮，ANCA对于诊断系统性血管炎有一定提示意义，抗SSA和抗SSB阳性有助于诊断干燥综合征，但是目前没有一项临床中常用的抗体能够提示CTD相关肺脏受累，主要包括PAH和ILD。根据上表所示常见ENA中各个抗体阴性和阳性与肺脏受累与否之间没有显著差异，因而提示临床常用抗体不能够提示肺脏受累。

8、通过免疫组化技术检测抗moesin抗体

结果见图13荧光染色显示结果：其中，正常培养的细胞(×1000)，箭头3所示为绿色荧光是膜突蛋白，箭头1所示为红色荧光是细胞骨架F-actin，箭头2所示为蓝色荧光是细胞核，可见膜突蛋白主要在细胞膜表达，呈散点状或颗粒状分布；正常状态细胞周边的F-actin，线条完整连续，显示出典型的鹅卵石样内皮细胞轮廓，称为外周致密束。细胞浆内细胞骨架排列整齐，着色均匀。细胞核为圆形或椭圆形，核的周围也有少量分布形成核骨架。

1.4结论

结缔组织病相关肺脏受累患者群体中存在抗moesin抗体，该自身抗体的产生对结缔组织病相关肺脏受累具特异性，提示通过检测患者外周血中的抗moesin抗体具有临床诊断价值。

序列表

<110>上海富莼科芯生物技术股份有限公司

<120>一种用于检测抗膜突蛋白抗体的试剂盒

<130>090654

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>577

<212>PRT

<213>人工合成

<400>1

Met Pro Lys Thr Ile Ser Val Arg Val Thr Thr Met Asp Ala Glu Leu

1 5 10 15

Glu Phe Ala Ile Gln Pro Asn Thr Thr Gly Lys Gln Leu Phe Asp Gln

20 25 30

Val Val Lys Thr Ile Gly Leu Arg Glu Val Trp Phe Phe Gly Leu Gln

35 40 45

Tyr Gln Asp Thr Lys Gly Phe Ser Thr Trp Leu Lys Leu Asn Lys Lys

50 55 60

Val Thr Ala Gln Asp Val Arg Lys Glu Ser Pro Leu Leu Phe Lys Phe

65 70 75 80

Arg Ala Lys Phe Tyr Pro Glu Asp Val Ser Glu Glu Leu Ile Gln Asp

85 90 95

Ile Thr Gln Arg Leu Phe Phe Leu Gln Val Lys Glu Gly Ile Leu Asn

100 105 110

Asp Asp Ile Tyr Cys Pro Pro Glu Thr Ala Val Leu Leu Ala Ser Tyr

115 120 125

Ala Val Gln Ser Lys Tyr Gly Asp Phe Asn Lys Glu Val His Lys Ser

130 135 140

Gly Tyr Leu Ala Gly Asp Lys Leu Leu Pro Gln Arg Val Leu Glu Gln

145 150 155 160

His Lys Leu Asn Lys Asp Gln Trp Glu Glu Arg Ile Gln Val Trp His

165 170 175

Glu Glu His Arg Gly Met Leu Arg Glu Asp Ala Val Leu Glu Tyr Leu

180 185 190

Lys Ile Ala Gln Asp Leu Glu Met Tyr Gly Val Asn Tyr Phe Ser Ile

195 200 205

Lys Asn Lys Lys Gly Ser Glu Leu Trp Leu Gly Val Asp Ala Leu Gly

210 215 220

Leu Asn Ile Tyr Glu Gln Asn Asp Arg Leu Thr Pro Lys Ile Gly Phe

225 230 235 240

Pro Trp Ser Glu Ile Arg Asn Ile Ser Phe Asn Asp Lys Lys Phe Val

245 250 255

Ile Lys Pro Ile Asp Lys Lys Ala Pro Asp Phe Val Phe Tyr Ala Pro

260 265 270

Arg Leu Arg Ile Asn Lys Arg Ile Leu Ala Leu Cys Met Gly Asn His

275 280 285

Glu Leu Tyr Met Arg Arg Arg Lys Pro Asp Thr Ile Glu Val Gln Gln

290 295 300

Met Lys Ala Gln Ala Arg Glu Glu Lys His Gln Lys Gln Met Glu Arg

305 310 315 320

Ala Met Leu Glu Asn Glu Lys Lys Lys Arg Glu Met Ala Glu Lys Glu

325 330 335

Lys Glu Lys Ile Glu Arg Glu Lys Glu Glu Leu Met Glu Arg Leu Lys

340 345 350

Gln Ile Glu Glu Gln Thr Lys Lys Ala Gln Gln Glu Leu Glu Glu Gln

355 360 365

Thr Arg Arg Ala Leu Glu Leu Glu Gln Glu Arg Lys Arg Ala Gln Ser

370 375 380

Glu Ala Glu Lys Leu Ala Lys Glu Arg Gln Glu Ala Glu Glu Ala Lys

385 390 395 400

Glu Ala Leu Leu Gln Ala Ser Arg Asp Gln Lys Lys Thr Gln Glu Gln

405 410 415

Leu Ala Leu Glu Met Ala Glu Leu Thr Ala Arg Ile Ser Gln Leu Glu

420 425 430

Met Ala Arg Gln Lys Lys Glu Ser Glu Ala Val Glu Trp Gln Gln Lys

435 440 445

Ala Gln Met Val Gln Glu Asp Leu Glu Lys Thr Arg Ala Glu Leu Lys

450 455 460

Thr Ala Met Ser Thr Pro His Val Ala Glu Pro Ala Glu Asn Glu Gln

465 470 475 480

Asp Glu Gln Asp Glu Asn Gly Ala Glu Ala Ser Ala Asp Leu Arg Ala

485 490 495

Asp Ala Met Ala Lys Asp Arg Ser Glu Glu Glu Arg Thr Thr Glu Ala

500 505 510

Glu Lys Asn Glu Arg Val Gln Lys His Leu Lys Ala Leu Thr Ser Glu

515 520 525

Leu Ala Asn Ala Arg Asp Glu Ser Lys Lys Thr Ala Asn Asp Met Ile

530 535 540

His Ala Glu Asn Met Arg Leu Gly Arg Asp Lys Tyr Lys Thr Leu Arg

545 550 555 560

Gln Ile Arg Gln Gly Asn Thr Lys Gln Arg Ile Asp Glu Phe Glu Ser

565 570 575

Met

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>引物

<400>2

ccggaattca tgcccaaaac gatcagt 27

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>引物

<400>3

cccaagcttt tacatagact caaattcgtc 30

Claims

1.一种用于检测抗膜突蛋白抗体的检测板，所述的检测板包括：固相载体和包被于所述固相载体的膜突蛋白抗原蛋白，所述膜突蛋白抗原蛋白为全长人膜突蛋白，其特征在于，所述用于检测抗膜突蛋白抗体的检测板采用如下方法制备获得：

a)包被：用包被缓冲液稀释膜突蛋白抗原蛋白，然后将该抗原蛋白溶液加入到固相载体上进行包被，包被完毕后洗涤并干燥，所述抗原蛋白溶液的浓度为2～5μg/ml；

b)封闭：加入封闭液后进行封闭，封闭完毕后洗涤并干燥；所述封闭液为10mMPBS溶液，pH7.0～pH7.4，其中含有质量百分比为5～10%的山羊血清以及质量百分比为10%的蔗糖；

c)制板：以室温20℃～25℃真空干燥2小时，干燥过程中的压强不超过-0.094Mpa；然后进行真空密封，2℃～8℃储存；

所述抗膜突蛋白抗体为IgG型；所述固相载体为酶标反应板。

2.权利要求1所述用于检测抗膜突蛋白抗体的检测板的制备方法，包括如下步骤：

a）包被：用包被缓冲液稀释膜突蛋白抗原蛋白，然后将该抗原蛋白溶液加入到固相载体上进行包被，包被完毕后洗涤并干燥，所述抗原蛋白溶液的浓度为2～5μg/ml；

b）封闭：加入封闭液后进行封闭，封闭完毕后洗涤并干燥，所述封闭液为10mM PBS溶液，pH7.0～pH7.4，其中含有质量百分比为5～10%的山羊血清以及质量百分比为10%的蔗糖；

c）制板：以室温20℃～25℃真空干燥2小时，干燥过程中的压强不超过-0.094Mpa；然后进行真空密封，2℃～8℃储存。

3.如权利要求2所述用于检测抗膜突蛋白抗体的检测板的制备方法，其特征在于，所述步骤a）中的包被缓冲液为PBS溶液。

4.如权利要求2所述用于检测抗膜突蛋白抗体的检测板的制备方法，其特征在于，所述步骤a）中的所述包被在2～8℃的温度下进行17小时。

5.一种用于检测抗膜突蛋白抗体的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包含权利要求1中所述用于检测抗膜突蛋白抗体的检测板，或者分别包装的固相载体和膜突蛋白抗原蛋白，所述膜突蛋白抗原蛋白为全长人膜突蛋白。

6.如权利要求5所述用于检测抗膜突蛋白抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括标记抗体，该标记抗体上标记有能产生检测信号的物质，且所述抗体能够与抗膜突蛋白抗体相结合。

7.如权利要求5所述用于检测抗膜突蛋白抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述能产生检测信号的物质选自：过氧化物酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。

8.如权利要求5所述用于检测抗膜突蛋白抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括与能产生检测信号的物质相对应的显色液。

9.如权利要求5所述用于检测抗膜突蛋白抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：包被缓冲液、样品缓冲液、封闭液、洗涤缓冲液和终止液中的一种或多种。