CN1928562A - 一种检测狂犬病病毒的酶联免疫试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测狂犬病病毒的酶联免疫试剂盒。该试剂盒包括包被有包被原的酶标板和酶标记物；包被有包被原的酶标板为包被有狂犬病病毒N蛋白的酶标板；所述酶标记物为酶标狂犬病病毒抗抗体。本发明试剂盒的特异性达到95％；灵敏度为0.25IU/ml；精密性(变异系数C·V)为8.68％。本发明的试剂盒生产及使用无安全隐患，生产成本大大降低，操作简便快捷，可在1小时内完成，较目前市场上的ELISA试剂盒更加便于使用。

Description

一种检测狂犬病病毒的酶联免疫试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测狂犬病病毒的酶联免疫试剂盒。

背景技术

狂犬病是由狂犬病病毒引起的中枢神经系统感染的人兽共患传染病，其发病后死亡率为100％。我国狂犬病死亡人数高居世界第二位，仅次于印度。狂犬病的病死率和死亡人数在我国甲、乙类传染病中居首位。

根据《全国狂犬病监测方案》，国内对狂犬病的检测主要采取①病原检测法：包括免疫荧光法检测抗原和快速狂犬病酶联免疫吸附法检测抗原；②RT-PCR核酸检测法；③病毒分离法：包括细胞培养法分离病毒和乳小白鼠接种法分离病毒；和④抗体检测法：包括特异性抗体检测和中和抗体检测。由于以上检测方法需要操作实验室固定毒、由病人或动物分离的街毒，以及狂犬病病毒感染的病理材料，因此必须在P2(实验室固定毒)或P3(街毒、病毒感染的病理材料)生物安全实验室内进行。而且，以上这些方法必需专业的实验技术和设备，往往需要数日甚至数周才能得到结果，根本无法满足大范围快速诊断的需要。虽然目前国内也有狂犬病ELISA检测试剂盒的研究报道，但是它们研究所用的抗原均采用灭活的狂犬病病毒，由于狂犬病病毒极易通过破损的皮肤和粘膜传播，所以无疑增加了操作人员的危险性。而且，如果生产过程中狂犬病病毒灭活不彻底，将会造成更大范围的污染和传播。

发明内容

本发明的目的是提供检测狂犬病病毒的酶联免疫试剂盒。

本发明所提供的检测狂犬病病毒的酶联免疫试剂盒，包括包被有包被原的酶标板和酶标记物；所述包被原为狂犬病病毒N蛋白；所述酶标记物为包括包被有包被原的酶标板和酶标记物；所述包被原为狂犬病病毒N蛋白；所述酶标记物为酶标抗抗体。

所述狂犬病病毒N蛋白，其制备方法包括以下步骤：1)将狂犬病病毒N蛋白基因通过表达载体导入宿主细胞，筛选得到表达狂犬病病毒N蛋白的工程细胞；2)培养步骤1)得到的工程细胞，表达得到狂犬病病毒N蛋白；所述狂犬病病毒N蛋白，其氨基酸序列是序列表中序列1。

所述狂犬病病毒N蛋白基因的编码区的核苷酸序列来自狂犬病病毒株AVO1(N蛋白基因的编码区是自GENBANK号为X13357的5′端第70-1422位脱氧核苷酸)。

所述表达载体可为pBV220，pET系列，pQE系列表达载体；优选为pET-His。

所述狂犬病病毒N蛋白基因插入pET-His的BamHI和HindIII的酶切位点间。

所述宿主细胞为任一可表达外源基因的原核或真核细胞；所述原核细胞可为大肠杆菌，如E.coli DH5α、E.coli TB1或E.coli BL21 DE3等；所述真核细胞可为酵母细胞、哺乳动物细胞或植物细胞等，如酵母菌SMD1168H、酵母菌GS115、酵母菌X-33、酵母菌KM71H，COS-7、CHO或BHK-21等。

所述宿主优选为大肠杆菌BL21(DE3)。所述工程细胞在37℃下，用终浓度为0.4mmol/L的IPTG诱导表达。所述诱导表达后工程细胞菌体经超声破碎，得到包涵体，将包涵体用pH 8.0，含有0.02mol/L PB(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄)和8mol/L尿素的缓冲液溶解后，用镍柱分离纯化得到纯的狂犬病病毒N蛋白。

所述酶标抗抗体可以下述动物的IgG为免疫原按常规方法制备：犬(如实验犬、宠物犬和普通犬感染狂犬病病毒)、人、猫、牛、猪、马、骡、驴、狼、山狗、浣熊、蝙蝠、狐、鼠、猴或獾。

所述酶标抗抗体具体可为酶标抗犬IgG，优选为酶标兔抗犬IgG。

所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；辣根过氧化物酶标记抗抗体可采用现有技术中的多种方法如戊二醛法或过碘酸钠法将酶交联在抗抗体上。

为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括样品稀释液、狂犬病病毒阳性血清、阴性血清、显色剂、终止液和浓缩洗涤液。

所述样品稀释液为含有2.1％ NaCl和4％ PEG6000的溶液；所述浓缩洗涤液为1L中含有KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，吐温-205ml的溶液。

所述显色剂由显色底物A和显色底物B组成；所述显色底物A为3.3’-5.5’-四甲基联苯胺溶液；显色底物B为双氧水溶液。所述终止液为2mol/L硫酸溶液。

上述百分含量均为质量百分含量。

本发明的酶联免疫试剂盒，是利用间接酶联免疫吸附试验检测狂犬病病毒感染的试剂盒。

本发明的试剂盒采用狂犬病病毒N蛋白作为检测抗原，未涉及狂犬病活病毒，与用灭活病毒作为检测抗原相比，其生产及使用无安全隐患。狂犬病病毒N蛋白可通过大肠杆菌和毕赤酵母表达，实现大规模发酵生产，其生产成本大大降低。由于在表达的狂犬病病毒N蛋白中排除了其他无关杂蛋白，保证了本发明的酶联免疫试剂盒检测具有较高的特异性，生产及使用也非常安全。本发明的试剂盒的样品稀释液含有聚乙二醇，利于抗原抗体的结合，使孵育时间缩短，加快了检测；实验表明，本发明试剂盒的特异性达到95％，灵敏度为0.25IU/ml，精密性(变异系数C·V)为8.68％，可用于检测各种犬(如实验犬、宠物犬和普通犬感染狂犬病病毒)、人、猫、牛、猪、马、骡、驴、狼、山狗、浣熊、蝙蝠、狐、鼠、猴和獾等可感染狂犬病病毒的动物是否被狂犬病病毒感染，也可用于狂犬疫苗的效果评价。

本发明的剂盒操作简便快捷，可在1小时内完成，较目前市场上的ELISA试剂盒更加便于使用。本发明的试剂盒操作简单，不需要在专业实验室进行，一个普通技术人员经过简单培训即可开展，每天可检测上千个样品，非常适合大规模排查工作。

附图说明

图1为狂犬病病毒N蛋白的大肠杆菌表达产物的SDS-PAGE检测结果

图2为狂犬病病毒N蛋白的大肠杆菌表达产物纯化后的SDS-PAGE检测结果

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中所用百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、检测狂犬病病毒的酶联免疫试剂盒的制备

一、检测狂犬病病毒的酶联免疫试剂盒的制备

狂犬病病毒的酶联免疫试剂盒，其组成为：

1)包被有狂犬病病毒N蛋白的酶标板

2)样品稀释液：含有2.1％NaCl和4％PEG6000的溶液   10ml

3)阳性血清                                       0.5ml

4)阴性血清                                       0.5ml

5)辣根过氧化酶(HRP)标记抗犬IgG                   10ml

6)浓缩洗涤液：                                   20ml

7)显色剂：显色底物A：3.3’-5.5’-四甲基联苯胺溶液5ml；显色底物B：双氧水溶液5ml；

9)终止液：用蒸馏水稀释后的2mol/L硫酸溶液    5ml

上述各组分的制备方法如下：

1、包被有狂犬病病毒N蛋白的酶标板的制备

1)包被原-狂犬病病毒N蛋白的制备：

A、引物设计

根据狂犬病病毒N蛋白的基因序列(GENBANK号为X13357)设计一对引物，分别引入BamHI和HindIII酶切位点，引物序列如下：

P1：5’-CA GGATCCGATGCCGACAAGATTGTGTT-3’( BamHI)

P2：5’-CCG AAGCTTATGAGTCATTCGAATACGTCTTG-3’( HindIII)

B、病毒RNA的提取

取灭活狂犬病病毒株AVO1病毒液200μl(购自荷兰英特威公司)，采用小量病毒RNA/DNA抽提试剂盒(购自上海华舜生物工程有限公司，W6751)提取病毒RNA，具体操作参照产品说明书。

C、RT-PCR扩增狂犬病病毒N蛋白基因

以提取的狂犬病病毒RNA为模板，在引物P1和引物P2的引导下，利用QIAGENone-step RT-PCR试剂盒(QIAGEN公司)并参照试剂盒说明书进行N蛋白基因的扩增，反应条件为：首先50℃ 30min；其次94℃ 10min；再次94℃ 30sec，50℃ 30sec，72℃ 2min，共35个循环；最后72℃ 5min。将PCR产物于4℃保存。

D、测序及序列分析

将PCR扩增的大小约1360bp左右的目的DNA亚克隆入T载体pGEM-T(promega公司)中，经筛选后挑取单克隆测序，测序结果与GENBANK报道序列完全一致(具有自GENBANK号为X13357的5′端第70-1422位脱氧核苷酸)，将鉴定表明含有N蛋白基因的编码区的质粒命名为pGEM-T-NP。

E、表达载体的构建

将上述获得的含有狂犬病病毒N蛋白基因的质粒pGEM-T-NP用BamHI和HindIII双酶切后插入载体pET-His(美国基因动力公司产品)的BamHI和HindIII酶切位点之间，转化大肠杆菌DH5α。经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组菌，将经鉴定表明含有N蛋白基因的重组载体命名为pETHis/N。

F、N蛋白的表达和纯化

将pETHis/N转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含50mg/L氨苄青霉素的LB平板，在37℃培养，待菌落长出后，挑取单个克隆接种于含50mg/L氨苄青霉素的LB培养基试管中，37℃振摇培养菌液OD₆₀₀至0.6，加入终浓度为0.4mM IPTG，在37℃下诱导5小时。培养结束后，对发酵液10000g、离心10分钟，取沉淀进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果如图1所示(泳道M为低分子量蛋白Marker，泳道1为诱导前全菌，泳道2为诱导后全菌)，结果表明，在50kD左右处出现一条蛋白条带(箭头示)，与预期结果相符，表明狂犬病病毒N蛋白基因在大肠杆菌中正确表达。将发酵液在5000g离心10分钟收集菌体，超声破碎(300w，10s/10s)20分钟，然后10000g离心10分钟，沉淀为包涵体，将包涵体分别用2mol/L尿素，1mol/L NaCl和PBS各洗一遍，用pH 8.0，含有0.02mol/L PB(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄)和8mol/L尿素的缓冲液溶解包涵体，10000g离心10分钟，用相同的缓冲液平衡镍柱，将已溶解的包涵体过柱，用pH8.0，含有0.02mol/L PB(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄)和8mol/L尿素的缓冲液洗涤除去杂蛋白，用pH 3.0，含有0.02mol/L PB(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄)和8mol/L尿素的缓冲液洗脱目的蛋白，获得纯的狂犬病病毒N蛋白，对纯化产物进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果如图2所示(泳道M为低分子量蛋白Marker，泳道1为纯化产物)，结果表明在得到52kD的纯狂犬病病毒N蛋白(箭头示)，作为包被抗原，-20℃冻存。

2)包被板的制备：

将上述得到的包被原-狂犬病病毒N蛋白用包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释成10μg/ml，包被8×12孔酶标板，每孔100μl，4℃过夜；倒掉包被液，每孔加满封闭液(含有1％牛血清白蛋白，5％蔗糖的溶液)，4℃过夜，晾干，4℃保存备用；包被液的制备方法为：将碳酸钠1.59g、碳酸氢钠2.93g溶于1000ml双蒸水中，高压灭菌备用。

包被板的检定：观察外观，结果表明孔底均匀透明，无水气、污点、尘粒。均质性检测：随机抽取1条预包被后的酶标板条，同一份阳性血清同时检测两端和中间共3孔，结果表明，读值变异系数小于10％。

2、HRP标记兔抗犬IgG的制备：

兔抗犬IgG的制备和辣根过氧化物酶标记：提取纯化犬IgG，免疫家兔，三免后取血清；经辛酸-硫酸铵法纯化后用过碘酸盐氧化法进行辣根过氧化物酶标记；标记物加入1％牛血清白蛋白和50％的中性甘油，测定工作浓度后，-20℃保存备用。具体方法如下所述：

1)犬IgG的提取、纯化：选择狂犬病病毒抗体阴性的6月龄健康比格犬，颈动脉放血，分离血清。取犬血清，加同体积的生理盐水稀释：搅拌下滴加2倍体积饱和硫酸铵溶液(硫酸铵的终浓度为50％)，置4℃30分钟，3000g离心30分钟，去上清；沉淀用是犬血清2倍体积的生理盐水溶解，搅拌下滴加与犬血清等体积的饱和硫酸铵溶液(硫酸铵的终浓度为33％)，置4℃30分钟，5000g离心30分钟，去上清；用PBS(0.01mol/L，pH7.4)将沉淀溶解，装入透析袋，对PBS透析48小时，期间换液4-5次；将透析除盐的IgG溶液上DEAE-Sephadex层析柱，上样量不超过柱床体积的10％，用0.01mol/L，pH7.4的PBS洗脱，流速为1ml/min，分管收集，第一个洗脱峰为IgG，收集洗脱液，即为纯化的犬IgG。

2)纯化的IgG检定：含量测定：用紫外分光光度计测出纯化的IgG溶液OD₂₈₀和OD₂₆₀的读值，按公式蛋白浓度(mg/ml)＝(1.45×OD₂₈₀-0.74×OD₂₆₀)×稀释倍数，结果表明纯化的IgG浓度为20mg/ml。纯度检定：用SDS-PAGE非还原电泳检测IgG纯度，结果得到一分子量为150KD的蛋白。

3)兔抗犬IgG的制备：用纯化的犬IgG常规免疫家兔；兔抗犬IgG的提取、纯化检定同犬IgG的提取、纯化。

4)辣根过氧化物酶(HRP)标记：称取4mg HRP(RZ≥3.0，Sigma)溶于1ml去离子水。加200μl新配制的0.1M NaIO₄，室温闭光轻搅20min。此时溶液呈棕绿色。然后于4℃，在pH值为4.4，1mol/L的醋酸钠缓冲液中透析过夜或30min换液一次，透析4小时，每次1000ml。然后，加入20μl 0.2M碳酸盐缓冲液，使溶液pH提升至9～9.5(用精密试纸比对即可，视情况可加减缓冲液的量)。立即加入8mg待标记抗体兔抗犬IgG 1ml(用新鲜配制的0.01M pH 9.5碳酸盐缓冲液调浓度至8mg/ml)。室温闭光轻搅2h。加入新配制的NaBH₄ 100μl，4℃反应2h。于4℃，在pH值为7.4，0.01mol/L PBS缓冲液中透析24h，期间更换缓冲液1～2次。10000g离心10min，弃去沉淀的蛋白，上清即为HRP标记兔抗犬IgG产物。测定A403nm、A280nm后加入BSA补到10mg/ml蛋白浓度，加入30％-50％的中性甘油，于-20℃分管保存。

5)HRP标记兔抗犬IgG酶标产物检定：外观：应为澄清透明溶液(浅棕红色)，如有不溶物，应离心出去。当标记率A403nm/A280nm的比值为0.3～0.6时为合格。结果表明上述HRP标记兔抗犬IgG为澄清透明溶液，标记率A403nm/A280nm的比值为0.45。

3、样品稀释液的制备：将质量百分比为2.1％NaCl和质量百分比为4％PEG6000溶于双蒸水，高压灭菌。

4、浓缩洗涤液的制备：

将KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，吐温-205ml，溶于1000ml双蒸水。

5、显色底物A的制备：

将3.3’-5.5’-四甲基联苯胺50mg，无水乙醇5ml，0.1mol/L柠檬酸5ml，0.1mol/L EDTA 0.5ml，加蒸馏水至100ml。

6、显色底物B的制备：

0.2mol/L Na₂HPO₄ 51.4ml，0.1mol/L柠檬酸48.6ml，用HCl调pH值至5.0～5.4，加入30％ H₂O₂ 67μl。

7、终止液的制备：将纯硫酸与蒸馏水按体积比为1∶17的比例混合得到2mol/L硫酸溶液。

8、阳性血清的制备

挑选体格健壮的6月龄比格犬5只，免疫兽用狂犬疫苗(购自荷兰英特威公司)，待血清抗体ELISA效价达到1∶10000以上(采用上述制备的试剂盒中的试剂测定)，采血分离血清，用小午血清将分离的阳性血清稀释到工作浓度(OD₄₅₀值控制在0.5-1.0)。其中，抗原为狂犬病病毒N蛋白，浓度为10μg/ml。

9、阴性血清的制备

采集未接种过疫苗，且采用上述制备的试剂盒中的试剂测定OD₄₅₀值小于0.1的比格犬血清。其中，抗原为狂犬病病毒N蛋白，浓度为10μg/ml。

将上述制备好的包被板、酶标抗体、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色底物A、显色底物B、终止液、阳性血清、阴性血清按试剂盒配制定量分装，制成检测狂犬病病毒的酶联免疫试剂盒。

二、检测狂犬病病毒的酶联免疫试剂盒检测方法

将待检样本用样品稀释液作1∶100稀释，加入包被板两孔中，每孔加100μl。同时做阳性血清(1孔，每孔加100μl)、阴性血清(1孔，每孔加100μl)对照和空白对照(直接加入100μl样品稀释液)，37℃孵育30分钟；洗涤液(用蒸馏水稀释100倍的浓缩洗涤液)洗涤酶标板5次，然后每孔加上述制备的HRP标记兔抗犬IgG 100μl，37℃孵育30分钟；洗涤液(用蒸馏水稀释100倍的浓缩洗涤液)洗板5次，加显色底物A、B各50μl，室温静置10分钟；滴加50μl终止液终止反应。用酶标仪测OD₄₅₀值。

结果判断：临界值设为阴性对照值的2.1倍，阴性对照值如不到0.1，按0.1计算。样品读值大于临界值判为阳性。

实施例2、检测狂犬病病毒的酶联免疫试剂盒的效果实验

1、试剂盒特异性检测：

分别采集20份狂犬病病毒阴性血清和20份狂犬病病毒阳性血清，用荧光抗体病毒中和试验(FAVN)确定，具体操作参照文献报道(Cliquet F，Aubert M，SagnéL.Development of a fluorescent antibody virus neutralisation test(FAVN)forthe quantitation of rabies-neutralising antibody.Journal of ImmunologicalMethods，1998，212：79-87)用实施例1的方法制备的检测狂犬病病毒的酶联免疫试剂盒检测，结果表明，检测阳性血清中有18份为阳性，阴性血清中20份阴性，表明检测准确率为95％。

2、灵敏度检测：对标准狂犬病病毒阳性血清(军事医学科学院长春兽医研究所)用实施例1制备的样品稀释液进行梯度稀释，用实施例1的方法制备的检测狂犬病病毒的酶联免疫试剂盒检测，以样品稀释液为空白对照，以实施例1制备的阳性血清为阳性对照，以实施例1制备的阴性血清为阴性对照，结果如表1所示，表明该酶联免疫试剂盒检测狂犬病抗体的最低检出值(检测限)为0.25IU/ml，表1中P表示阳性对照；表1中N表示阴性对照。

                                表1.狂犬病病毒的酶联免疫试剂盒灵敏度检测

标准血清抗体滴度(IU/ml)	4	2	1	0.5	0.25	0.125	P	N	空白对照
										OD450读值	2.11	1.58	0.92	0.56	0.33	0.11	0.56	0.06	0.00

3、精密度检测：随机抽取按照实施例1的方法制备的10个不同批次检测狂犬病病毒的酶联免疫试剂盒对同一份血清(0.7IU/ml标准阳性血清)进行检测，测定吸光度值OD₄₅₀，计算OD₄₅₀的变异系数(C.V)值。结果表明如表2所示，表明变异系数为8.68％。

                        表2.狂犬病病毒的酶联免疫试剂盒的精密度检测

批号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	变异系数
												OD450	0.65	0.73	0.79	0.70	0.63	0.61	0.68	0.74	0.77	0.66	8.68

4、稳定性检测：将1个按照实施例1的方法制备的试剂盒置37℃放置5天；另将1个按照实施例1的方法制备的试剂盒在4℃存放5天，同步检测10个不同稀释度的标准阳性血清，检测结果如表3所示，表明其读值变化率≤25％，在正常范围内。

                    表3.狂犬病病毒的酶联免疫试剂盒的稳定性检测

批号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											4℃/OD450	1.55	1.40	1.22	0.98	0.85	0.76	0.69	0.57	0.45	0.31
37℃/OD450	1.49	1.36	1.06	0.93	0.79	0.72	0.63	0.51	0.41	0.29

5、检测狂犬病病毒的酶联免疫试剂盒现场试用实验：

从长春采集200份犬血清，同时用文献(Cliquet F，Aubert M，SagnéL.Development of a fluorescent antibody virus neutralisation test(FAVN)forthe quantitation of rabies-neutralising antibody.Journal of ImmunologicalMethods，1998，212：79-87)描述的狂犬病抗体检测标准方法荧光抗体病毒中和试验(FAVN)和按照实施例1的方法制备的试剂盒进行检测，对检测数据进行统计分析。结果表明，荧光抗体病毒中和试验检测结果阳性血清中有148份阳性血清，阴性血清中52份为阴性；而按照实施例1的方法制备的试剂盒进行检测结果阳性血清中有132份阳性血清，阴性血清中45份为阴性；两种检测方法的相关系数为0.92。

                        序列表

<160>1

<210>1

<211>450

<212>PRT

<213>狂犬病病毒(Rabies virus)

<400>1

Met Asp Ala Asp Lys Ile Val Phe Lys Val Asn Asn Gln Val Val Ser

1               5                   10                  15

Leu Lys Pro Glu Ile Ile Val Asp Gln Tyr Glu Tyr Lys Tyr Pro Ala

            20                  25                  30

Ile Lys Asp Leu Lys Lys Pro Cys Ile Thr Leu Gly Lys Ala Pro Asp

        35                  40                  45

Leu Asn Lys Ala Tyr Lys Ser Val Leu Ser Gly Met Asn Ala Ala Lys

    50                  55                  60

Leu Asp Pro Asp Asp Val Cys Ser Tyr Leu Ala Ala Ala Met Gln Phe

65                  70                  75                  80

Phe Glu Gly Thr Cys Pro Glu Asp Trp Thr Ser Tyr Gly Ile Leu Ile

                85                  90                  95

Ala Arg Lys Gly Asp Arg Ile Thr Pro Asn Ser Leu Val Glu Ile Lys

            100                 105                 110

Arg Thr Asp Val Glu Gly Asn Trp Ala Leu Thr Gly Gly Met Glu Leu

        115                 120                 125

Thr Arg Asp Pro Thr Val Ser Glu His Ala Ser Leu Val Gly Leu Leu

    130                 135                 140

Leu Ser Leu Tyr Arg Leu Ser Lys Ile Ser Gly Gln Asn Thr Gly Asn

145                 150                 155                 160

Tyr Lys Thr Asn Ile Ala Asp Arg Ile Glu Gln Ile Phe Glu Thr Ala

                165                 170                 175

Pro Phe Val Lys Ile Val Glu His His Thr Leu Met Thr Thr His Lys

            180                 185                 190

Met Cys Ala Asn Trp Ser Thr Ile Pro Asn Phe Arg Phe Leu Ala Gly

        195                 200                 205

Thr Tyr Asp Met Phe Phe Ser Arg Ile Glu His Leu Tyr Ser Ala Ile

    210                 215                 220

Arg Val Gly Thr Val Val Thr Ala Tyr Glu Asp Cys Ser Gly Leu Val

225                 230                 235                 240

Ser Phe Thr Gly Phe Ile Lys Gln Ile Asn Leu Thr Ala Arg Glu Ala

                245                 250                 255

Ile Leu Tyr Phe Phe His Lys Asn Phe Glu Glu Glu Ile Arg Arg Met

            260                 265                 270

Phe Glu Pro Gly Gln Glu Thr Ala Val Pro His Ser Tyr Phe Ile His

        275                 280                 285

Phe Arg Ser Leu Gly Leu Ser Gly Lys Ser Pro Tyr Ser Ser Asn Ala

    290                 295                 300

Val Gly His Val Phe Asn Leu Ile His Phe Val Gly Cys Tyr Met Gly

305                 310                 315                 320

Gln Val Arg Ser Leu Asn Ala Thr Val Ile Ala Ala Cys Ala Pro His

                325                 330                 335

Glu Met Ser Val Leu Gly Gly Tyr Leu Gly Glu Glu Phe Phe Gly Lys

            340                 345                 350

Gly Thr Phe Glu Arg Arg Phe Phe Arg Asp Glu Lys Glu Leu Gln Glu

        355                 360                 365

Tyr Glu Ala Ala Glu Leu Thr Lys Ser Asp Val Ala Leu Ala Asp Asp

    370                 375                 380

Gly Thr Val Asn Ser Asp Asp Glu Asp Tyr Phe Ser Gly Glu Thr Arg

385                 390                 395                 400

Ser Pro Glu Ala Val Tyr Thr Arg Ile Met Met Asn Gly Gly Arg Leu

                405                 410                 415

Lys Arg Ser His Ile Arg Arg Tyr Val Ser Val Ser Ser Asn His Gln

            420                 425                 430

Ala Arg Pro Asn Ser Phe Ala Glu Phe Leu Asn Lys Thr Tyr Ser Asn

        435                 440                 445

Asp Ser

    450

Claims (10)

1、一种检测狂犬病病毒的酶联免疫试剂盒，包括包被有包被原的酶标板和酶标记物；所述包被原为狂犬病病毒N蛋白；所述酶标记物为酶标抗抗体。

2、根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述狂犬病病毒N蛋白按照包括下述步骤的方法制备：1)将狂犬病病毒N蛋白基因通过表达载体导入宿主细胞，筛选得到表达狂犬病病毒N蛋白的工程细胞；2)培养步骤1)得到的工程细胞，表达得到狂犬病病毒N蛋白；所述狂犬病病毒N蛋白，其氨基酸序列是序列表中序列1。

3、根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述狂犬病病毒N蛋白基因的编码区的核苷酸序列为自GENBANK号为X13357的5′端第70-1422位脱氧核苷酸。

4、根据权利要求3所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述表达载体为pET-His；所述宿主为大肠杆菌BL21(DE3)。

5、根据权利要求4所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述狂犬病病毒N蛋白的编码基因插入pET-His的BamHI和HindIII的酶切位点间。

6、根据权利要求5所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述工程细胞在37℃下，用终浓度为0.4mmol/L的IPTG诱导表达。

7、根据权利要求6所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述狂犬病病毒N蛋白的制备方法中还包括下述步骤：将诱导表达后工程细胞菌体经超声破碎，得到包涵体，将包涵体用pH 8.0，含有0.02mol/L PB(Na₂HPO4-NaH₂PO4)和8mol/L尿素的缓冲液溶解后，用镍柱分离纯化得到纯的狂犬病病毒N蛋白。

8、根据权利要求1-7任一所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述酶标抗抗体以下述动物的IgG为免疫原按常规方法制备：犬、人、猫、牛、猪、马、骡、驴、狼、山狗、浣熊、蝙蝠、狐、鼠、猴或獾。

9、根据权利要求8所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述酶标抗抗体为酶标抗犬IgG，优选为酶标兔抗犬IgG；所述酶标抗抗体的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶。

10、根据权利要求1-9中任一所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括样品稀释液、狂犬病病毒阳性血清、阴性血清、显色剂、终止液和浓缩洗涤液；

所述样品稀释液为含有2.1％NaCl和4％PEG6000的溶液；所述浓缩洗涤液为1L中含有KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，吐温-20 5ml的溶液；所述显色剂由显色底物A和显色底物B组成，所述显色底物A为3.3’-5.5’-四甲基联苯胺溶液；显色底物B为双氧水溶液；所述终止液为2mol/L硫酸溶液；所述百分含量均为质量百分含量。