CN1766626A - 检测雌二醇的酶联免疫试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测雌二醇的酶联免疫试剂盒，该试剂盒的组成为：包被了抗抗体或雌二醇抗原的酶标板、酶标记物、标准品溶液、抗体工作液、底物显色液、浓缩洗涤液、终止液、浓缩复溶液。本发明还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测雌二醇的方法，它包括以下步骤：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明的检测雌二醇的酶联免疫试剂盒能同时快速检测大量样品，检验方法方便易行，具有高特异性、高灵敏度、高精确度、高准确度等特点。
Description
技术领域
本发明涉及兽药残留检测分析技术领域，具体地说是一种检测动物组织、饲料、尿液等样品中雌二醇的酶联免疫试剂盒及方法。
背景技术
雌二醇(Estradiol，E2)是应用广泛的甾类同化激素，被大量用于促进反刍动物的生长。因其可以促进动物成长及提高畜禽瘦肉比，在禽兽养殖业曾经应用。但由于雌二醇可在动物组织内高残留，通过食物链危害人类健康，使女性儿童提前发育，男性儿童乳腺发育呈女性化；男性生殖系统发育异常或引起病变；并导致女性乳腺癌和子宫内膜异位症发生率上升，且雌二醇存在明显的致癌性，欧美等发达国家已相继禁止或严格禁止使用。中华人民共和国中务院令第226号文件，《饲料和饲料添加剂管理条例》中规定雌二醇在饲料中不得检出。
由于常用的气相色谱(GC)分析法样本前处理及测定操作繁琐且费用高，不适合现场监控和大量样本筛查，推广应用受到限制。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本筛查的检测雌二醇残留的酶联免疫试剂盒。
(二)技术方案
本发明是一种检测雌二醇的酶联免疫试剂盒，其特征在于它含有：
(1)包被了雌二醇抗原的酶标板或抗抗体的酶标板；
(2)酶标记物；
(3)雌二醇标准品溶液；
(4)抗体工作液；
(5)底物显色液；
(6)浓缩洗涤液；
(7)终止液；
(8)浓缩复溶液。
本发明所述的试剂盒中包被雌二醇抗原的酶标板在制备过程中，所用包被原是采用水溶性碳化二亚胺法将雌二醇和载体蛋白进行偶联得到的；所述的包被抗抗体的酶标板在制备过程中，所用的抗抗体可为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体。
本发明所述的试剂盒中羊抗鼠抗抗体是以鼠源抗体作为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到，羊抗兔抗抗体是以兔源抗体作为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到。
本发明所述的试剂盒中，洗涤液为0.01M、pH 7.4、含有0.8％～1.2％吐温20、0.5％的叠氮化钠防腐剂磷酸盐缓冲液；当标记酶为辣根过氧化物酶时，底物显色液A液为过氧化氢或过氧化脲、底物显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺、终止液为1～2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，底物液为对硝基磷酸盐缓冲液、终止液为2mol/L的氢氧化钠。
在磷酸盐缓冲液中加入一定量的吐温20和叠氮化钠的作用在于：磷酸盐缓冲液中的吐温20能减少抗体的非特异性吸附，还能对蛋白起到一定的保护作用，加入叠氮化钠后，则叠氮化钠在溶液中抑制细菌的生长，对溶液的稳定性起到一个保护作用。
本发明所述的试剂盒中，雌二醇标准品溶液的浓度分别为0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L。
本发明所述的试剂盒中，抗体工作液浓度为雌二醇单克隆抗体或多克隆抗体的工作液，浓度为0.5-5.0μg/L
本发明所述的试剂盒中，酶标记物为酶标记抗抗体或酶标记雌二醇抗原，酶标记抗抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与抗抗体进行偶联得到，酶标记雌二醇抗原是采用混合酸酐法将标记酶与雌二醇半抗原进行偶联得到。
本发明所述的试剂盒中，标记酶可为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶。
优选地，标记酶为辣根过氧化物酶。
本发明还提供了一种检测雌二醇的方法，包括以下步骤：
(1)样品前处理；
(2)用试剂盒进行检测；
(3)分析检测结果。
其中当酶标板包被的是雌二醇抗原时，试剂盒检测方法为向酶标板微孔中加入标准品溶液或样品溶液及加入抗体工作液，温育后洗涤拍干，然后再加酶标抗抗体，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；当酶标板包被的是抗抗体时，试剂盒检测方法为向酶标板微孔中加入抗体工作液，温育后洗涤拍干，然后加标准品溶液或样品溶液及酶标抗原，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值。
所获得的每个浓度标准品溶液或样本吸光度值的平均值(B)除以第一个标准(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100％，即百分吸光度值。
百分吸光度值(％)＝(B/B0)×100％
公式中B为标准溶液或样本溶液的平均吸光度值，B0为0μg/L标准溶液的平均吸光度值。以雌二醇浓度(μg/L)的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。
检测结果的分析也可以采用回归方程法，计算出样品溶液浓度。
半抗原合成：100mg雌二醇溶于4mL丙酮中，加入0.42mM的溴代丁酸乙酯，70-80℃水浴恒温回流反应4h，抽干溶剂后加入2N NaOH 4mL继续回流1.5h后用6N HCL调节到pH2左右，用石油醚提取二次，合并二次的有机相，旋干得到淡黄色的固体粉末即半抗原。
效果：将雌二醇和溴代丁酸乙酯通化合反应合成雌二醇半抗原，给雌二醇接出了一个含苯环的间隔臂，这样突出了雌二醇的特征结构，同时也增加了半抗原的抗原性。可以制备出高效价的雌二醇抗体并且对雌二醇的特异性很好。
免疫原制备：将半抗原和人血清白蛋白(HSA)、血蓝蛋白(KLH)等载体蛋白，分别采用水溶性碳二亚胺法(EDC)、混合酸酐法(氯甲酸异丁酯)、活性酯法(DCC、NHS)进行偶联得到免疫原。
包被原制备：将雌二醇半抗原和卵清蛋白(OVA)、兔血清白蛋白(RSA)、鼠血清白蛋白(MSA)等载体蛋白，分别采用水溶性碳化二亚胺法(EDC)、混合酸酐法(氯甲酸异丁酯)、活性酯法(DCC、NHS)进行偶联得到包被原。
本发明的抗体制备过程如下：
a.雌二醇单克隆抗体的制备
动物免疫程序：采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以雌二醇半抗原与载体蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为80～100μg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2～3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞。
细胞融合与克隆化：取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5～10∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
细胞冻存和复苏：取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成1～5×106个/ml的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
单克隆抗体的制备与纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7～14天后腹腔注射杂交瘤细胞5×105～106个/只，7～10天后采集腹水。经辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，小瓶分装，-20℃保存。
b.雌二醇兔多克隆抗体的制备：
采用新西兰大白兔作为免疫动物，以雌二醇与载体蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为1mg/kg，首次免疫时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3-4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫7-10天后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。
c.抗抗体的制备：以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到羊抗鼠抗抗体，以兔源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到羊抗兔抗抗体。
d.酶标记物的制备
酶标抗体或酶标抗原的制备：其中所述的标记酶可为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标记抗抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将辣根过氧化物酶与抗抗体进行偶联得到，酶标记雌二醇抗原是采用混合酸酐法将辣根过氧化物酶与雌二醇半抗原进行偶联得到。
过碘酸钠法标记抗体的原理：传统的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭辣根过氧化物酶(HRP)上残留的α-和ε-氨基以避免酶分子之间的交联。本发明改用在低pH值下使NaIO4氧化辣根过氧化物酶(HRP)，从而省去了二硝基氟苯封闭辣根过氧化物酶步骤。辣根过氧化物酶经NaIO4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH4(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。
用改良的过碘酸钠法优点在于：(1)省去了氨基的封闭过程，因为能产生自身连接的氨基实际很少；(2)降低酶/抗体的摩尔浓度比至2∶1，改良后的方法比传统的方法简便，对酶活性的损失也减少。
本发明的酶标板有两种，一种是包被雌二醇与载体蛋白偶联物的酶标板，另一种是包被抗抗体的酶标板，其制备方法如下：
a.包被雌二醇与载体蛋白偶联物的酶标板制备方法
用包被缓冲液(pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液)将雌二醇与载体蛋白偶联物稀释成0.1-1μg/mL，每孔加入100μL，37℃温育2h，并4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150-200μL封闭液，37℃温育1-2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
b.包被抗抗体的酶标板制备方法
用包被缓冲液(pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液)将抗抗体稀释成0.1-1μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h，并4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150-200μl封闭液，37℃温育1-2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
本发明试剂盒的检测原理为：试剂盒采用间接竞争ELISA方法，当微孔条上预包被偶联抗原时，样本中的残留物雌二醇将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗雌二醇抗体，加入酶标抗抗体后，用底物显色剂显色；当微孔条上为包被抗抗体时，样本中的残留物雌二醇将和酶标抗原竞争雌二醇抗体，显色；样本吸光值与其所含残留物雌二醇的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物雌二醇的含量。同时根据酶标板上样本颜色的深浅，与系列浓度的标准品溶液颜色的比较可以判断出样本的浓度范围。
本发明的样品前处理方法为：
(1)动物组织(鸡肉/肝、猪肉/肝、虾、鱼等)、饲料前处理方法
用均质器均质组织、饲料样品，加入乙腈/氢氧化钠(0.2M)，振荡后离心，取乙腈/氢氧化钠(0.1M)在氮气流下完全干燥，用三氯甲烷充分混合，加入氢氧化钠(1M)溶液进行反萃取，强烈振荡后室温离心，静置分层后取上层氢氧化钠溶液。加入三氯甲烷进行萃取，离心(反复两次)，合并下层有机相在氮气流下完全干燥，用复溶液溶解干燥的残留物，取水相进行分析。
(2)尿液前处理方法
尿液在室温离心至澄清，移取到离心管中，加三氯甲烷进行萃取，室温离心(反复两次)，合并下层有机相在氮气流下完全干燥，用复溶液溶解干燥的残留物，取水相进行分析。
(三)有益效果
本发明的检测雌二醇的酶联免疫试剂盒主要采用ELISA方法定性或定量检测动物组织(肌肉、肝脏等)、饲料、尿液等样品中雌二醇的残留量使用本发明的试剂盒进行检测，对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品；检验方法方便易行；具有高特异性、高灵敏度、高精确度、高准确度等特点。
附图说明
图1：雌二醇试剂盒曲线图
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1试剂盒组分的制备
1.抗原合成
a.半抗原合成100mg雌二醇溶于4mL丙酮中，加入0.42mM的溴代丁酸乙酯，70℃水浴恒温回流反应4h，抽干溶剂后加入2N NaOH 4mL继续回流1.5h后，用6N HCL调节至pH2，用石油醚提取二次，合并二次的有机相，旋干得到淡黄色的固体粉末即半抗原。
b.免疫原的合成称取上述制备的半抗原20mg用1mLN，N’-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，加入用1mL去离子水溶解的40mg羟琥珀酰亚胺(NHS)、40mg碳化二亚胺(EDC)、30mgN，N’-二环己基碳化二亚胺(DCC)溶液，搅拌反应过夜，将上述的溶液逐滴加到用30％N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)溶解20mg血蓝蛋白(KLH)溶液中，反应过夜，经透析后得到。
c.包被原的合成将雌二醇半抗原和兔血清蛋白(RSA)采用水溶性碳化二亚胺法(EDC)进行偶联得到包被原。
2.抗体制备
a.雌二醇单克隆抗体的制备
动物免疫程序：采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以雌二醇半抗原与卵请蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为80μg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞。
细胞融合与克隆化：取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
细胞冻存和复苏：取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成1×106个/ml的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
单克隆抗体的制备与纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5×105个/只，7天后采集腹水。经辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，小瓶分装，-20℃保存。
b.抗抗体的制备 以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到羊抗鼠抗抗体。
c.酶标抗抗体的制备 羊抗鼠抗抗体和辣根过氧化物酶采用过碘酸钠法进行偶联，得到辣根过氧化物酶标记的抗抗体。
过碘酸钠法标记抗体的原理：传统的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭辣根过氧化物酶(HRP)上残留的α-和ε-氨基以避免酶分子之间的交联。本发明改用在低pH值下使NaIO4氧化辣根过氧化物酶(HRP)，从而省去了二硝基氟苯封闭辣根过氧化物酶步骤。辣根过氧化物酶经NaIO4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH4(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。
标记步骤：
(1)称取5mg辣根过氧化物酶(HRP)溶解于0.5ml蒸馏水中，加入新配制的0.06mol/L NaIO4水溶液0.5ml，混匀，置4℃，30min；
(2)取出后加入0.16mol/L乙二醇水溶液0.5ml，室温放置30min；
(3)加入含5mg纯化抗体的水溶液1ml，混匀，并装入透析袋，对0.05mol/LpH9.5碳酸盐缓缓搅拌透析6h，使之结合；
(4)加0.2ml新配的5mg/ml NaBH4液，混匀，置4℃中2h；
(5)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃，30min，离心，去上清，沉淀以少许0.02mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液溶解，装入透析袋，以同样液体在4℃透析过夜；
(6)次日取出离心，以除去不溶物，即得酶-抗体的结合物，加0.02mol/LpH7.4磷酸缓冲液至5ml；
(7)效价测定合格后，加入等量优质甘油，小瓶分装，低温保存。
3.雌二醇与卵清蛋白偶联物包被的酶标板制备方法
用pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液将雌二醇与卵清蛋白(OVA)偶联物稀释成1μg/mL，每孔加入100μL，37℃温育2h，4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入200μL封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
实施例2试剂盒组分的制备
1、抗原和抗体的制备
(1)包被原的制备 以羊为免疫动物，以兔源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到。
(2)多克隆抗体的制备 采用新西兰大白兔作为免疫动物，以雌二醇与血蓝蛋白(KLH)偶联物为免疫原，免疫剂量为1mg/kg，首次免疫时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫10天后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。
(3)抗抗体的制备 以羊为免疫动物，以兔源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到。
(4)酶标抗原的制备 取2g雌二醇半抗原溶于20ml，0.5M的氢氧化钠溶液中，再取2g羟琥珀酰亚胺(NHS)活性酯溶于8ml纯水中。雌二醇半抗原溶液和羟琥珀酰亚胺活性酯溶液在室温混合搅拌2小时。取22g载体蛋白溶于75ml pH9碳酸盐缓冲液中，再将辣根过氧化物酶滴加到半抗原中4℃搅拌过夜。将反应完的人工抗原在0.2M的磷酸盐缓冲液透析7天，每天换液4次，最后得到酶标抗原。
2、酶标板的制备方法为：
用包被缓冲液将羊抗兔抗抗体稀释成1μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h并4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入200μl封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
实施例3检测雌二醇的酶联免疫试剂盒的组建
组建检测雌二醇的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：
(1)包被了雌二醇与卵清蛋白偶联物的酶标板；
(2)辣根过氧化物酶标记羊抗鼠的抗抗体稀释液；
(3)雌二醇标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L；
(4)雌二醇单克隆抗体工作液为浓度为0.5μgL；
(5)底物显色液A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；
(6)浓缩洗涤液为含有0.01M pH 7.4，含有0.8％吐温20和0.5％叠氮化钠防腐剂的磷酸盐缓冲液；
(7)终止液为1mol/L盐酸；
(8)浓缩复溶液为含0.2％N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸盐缓冲液。
实施例4检测雌二醇的酶联免疫试剂盒的组建
组建检测雌二醇的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：
(1)包被了羊抗鼠抗抗体的酶标板；
(2)碱性磷酸酯酶标记雌二雌抗原的稀释液；
(3)雌二醇标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L；
(4)雌二醇多克隆抗体浓度为5.0μg/L；
(5)底物显色液为硝基磷酸盐缓冲液；
(6)浓缩洗涤液为含有0.01M pH 7.4，含有1.2％吐温20和0.5％叠氮化钠防腐剂的磷酸盐缓冲液；
(7)终止液为2mol/L氢氧化钠；
(8)浓缩复溶液为含0.5％N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸盐缓冲液。
实施例5检测雌二醇的酶联免疫试剂盒的组建
组建检测雌二醇的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：
(1)包被了羊抗兔抗抗体的酶标板；
(2)辣根过氧化物酶标记雌二醇抗原工作液；
(3)雌二醇标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L；
(4)雌二醇单克隆抗体工作液为浓度为0.5μg/L；
(5)底物显色液A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；
(6)浓缩洗涤液为含有0.01M pH 7.4，含有0.8％吐温20和0.5％叠氮化钠防腐剂的磷酸盐缓冲液；
(7)终止液为1mol/L硫酸；
(8)浓缩复溶液为含0.5％N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸盐缓冲液。
实施例6检测雌二醇的酶联免疫试剂盒的组建
组建检测雌二醇的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：
(1)包被了羊抗兔抗抗体的酶标板；
(2)碱性磷酸酯酶标记雌二醇抗原工作液；
(3)雌二醇标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L；
(4)雌二醇多克隆抗体工作液为浓度为0.5μg/L；
(5)底物显色液为硝基磷酸盐缓冲液；
(6)浓缩洗涤液为含有0.01M pH 7.4，含有1.2％吐温20和0.5％叠氮化钠防腐剂的磷酸盐缓冲液；
(7)终止液为2mol/L氢氧化钠；
(8)浓缩复溶液为含0.5％N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸盐缓冲液。
实施例7鸡肉中雌二醇的检测
(1)样品前处理
用均质器均质鸡肉样品，称2g均质物，加入10mL乙腈/氢氧化钠(0.2M)，振荡10min，室温4000g，离心10min，取1mL乙腈/氢氧化钠(0.1M)在氮气流下完全干燥，用1mL三氯甲烷充分混合，加入4mL氢氧化钠(1M)溶液进行反萃取，强烈振荡1min后，室温4000g离心10min，静置分层后取1mL上层氢氧化钠溶液。加入5mL三氯甲烷进行萃取振荡10min，室温3000g以上，离心10min(反复两次)，合并下层有机相在氮气流下完全干燥，用2mL复溶液溶解干燥的残留物，取50μL水相进行分析。
(2)用试剂盒检测
向雌二醇与卵清蛋白偶联物包被的酶标板微孔中加系列标准品溶液或样品溶液(各2孔)50μL，然后加入雌二醇单克隆抗体工作液50μL，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min。倒出孔中液体，每孔加入250μL洗涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体工作液100μL，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min。取出酶标板，如前述洗板5次。每孔加入底物显色液A液50μL，再加B液50μL，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色30min。每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值(OD值)。
(3)检测结果分析
所获得的每个浓度标准品溶液或样本吸光度值的平均值(B)除以第一个标准(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100％，即百分吸光度值。
百分吸光度值(％)＝(B/B0)×100％
公式中B为标准溶液或样本溶液的平均吸光度值，B0为0μg/L标准溶液的平均吸光度值。以雌二醇浓度(μg/L)的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图，如图1所示。相对应每一个样品中雌二醇的浓度可以从标准曲线上读出。
实施例8饲料中雌二醇的检测
(1)样品前处理
用均质器均质饲料样品，称2g均质物，加入10mL乙腈/氢氧化钠(0.2M)，振荡10min，室温3000g，离心10min，取1mL乙腈/氢氧化钠(0.1M)在氮气流下完全干燥，用1mL三氯甲烷充分混合，加入4mL氢氧化钠(1M)溶液进行反萃取，强烈振荡1min后，室温3000g离心10min，静置分层后取1mL上层氢氧化钠溶液。加入5mL三氯甲烷进行萃取振荡10min，室温3000g以上，离心10min(反复两次)，合并下层有机相在氮气流下完全干燥，用2mL复溶液溶解干燥的残留物，取50μL水相进行分析。
用试剂盒检测及结果分析同实施例7。
实施例9尿液中雌二醇的检测
尿液前处理方法取2mL尿液到离心管中，室温3000g离心10min至澄清，移取1mL尿液到离心管中，加入5mL三氯甲烷进行萃取振荡10min，室温4000g，离心10min(反复两次)，合并下层有机相在氮气流下完全干燥，用2mL复溶液溶解干燥的残留物，取50μL水相进行分析。
用试剂盒检测及结果分析同实施例7。
实施例10鸡肉中雌二醇的检测
(1)样品前处理
用均质器均质鸡肉样品，称2g均质物，加入10mL乙腈/氢氧化钠(0.2M)，振荡10min，室温4000g，离心10min，取1mL乙腈/氢氧化钠(0.1M)在氮气流下完全干燥，用1mL三氯甲烷充分混合，加入4mL氢氧化钠(1M)溶液进行反萃取，强烈振荡1min后，室温4000g离心10min，静置分层后取1mL上层氢氧化钠溶液。加入5mL三氯甲烷进行萃取振荡10min，室温3000g以上，离心10min(反复两次)，合并下层有机相在氮气流下完全干燥，用2mL复溶液溶解干燥的残留物，取50μL水相进行分析。
(2)用试剂盒检测
向羊抗鼠抗抗体包被的酶标板微孔中加入雌二醇单克隆抗体工作液100μL，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min。倒出孔中液体，每孔加入250μL洗涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。然后加入碱性磷酸酯酶标记的羊抗鼠抗抗体和系列标准品或样本各50μL，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min。倒出孔中液体，每孔加入250μL洗涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。每孔加入底物显色液硝基磷酸盐缓冲液100μL，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15min。每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值(OD值)。
(3)检测结果分析
所获得的每个浓度标准品溶液或样本吸光度值的平均值(B)除以第一个标准(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100％，即百分吸光度值。
百分吸光度值(％)＝(B/B0)×100％
公式中B为标准溶液或样本溶液的平均吸光度值，B0为0μg/L标准溶液的平均吸光度值。以雌二醇浓度的自然对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图，如图1所示。相对应每一个样品中雌二醇的浓度可以从标准曲线上读出。
实施例11蜂蜜的前处理同实施例7，饲料、尿液的前处理方法分别同实施例8、9，用试剂盒检测及结果分析同实施例10。
实施例12试剂盒精密度、准确度和保存期试验
(1)试剂盒精密度试验
标准可重复性试验：
从三批试剂盒中各取10个试剂盒，每块酶联板中抽出20个微孔，测定4.5μg/L标准溶液的吸光度值(OD值)，计算变异系数。测定结果见表1。
表1标准可重复性试验(CV％)
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | ||
| CV％ | 01批 | 8.2 | 7.9 | 4.6 | 8.5 | 7.9 | 6.4 | 5.8 | 7.7 | 6.4 | 7.7 |
| 03批 | 9.8 | 8.0 | 7.4 | 10.3 | 8.9 | 7.5 | 73 | 8.4 | 6.9 | 8.1 |
| 06批 | 7.0 | 7.9 | 8.4 | 7.6 | 7.3 | 8.4 | 8.6 | 7.3 | 10.4 | 8.6 |
三批试剂盒，各10次标准精密度的测定范围在4.6％～10.4％之间，符合了变异系数小于20％的规定，说明本试剂盒标准品精密度达到了《农业部文件》农医发[2005]17号附件2试剂盒备案参考评判标准中第4点精密度和准确度的精密度标准。
样品可重复性：
取雌二醇标样，添加到样品中，分别取三个不同批次的试剂盒各三个，每个浓度重复5次，分别计算变异系数，结果见表。
表2鸡肉样品可重复性试验
| 批号 | 实测值(μg/kg) | 变异系数CV％ | ||||
| 050800205080070509008 | 15.220.615.421.320.918.716.620.124.5 | 24.924.818.923.621.819.424.818.721.6 | 19.823.517.519.818.724.917.219.624.7 | 24.722.415.321.616.524.824.322.315.6 | 19.515.618720.615.320.621.924.517.2 | 19.516.710.16.614.813.118.411.120.1 |
表3饲料样品可重复性试验
| 批号 | 实测值(μg/kg) | 变异系数CV％ | ||||
| 05080020508007 | 18.827.320.320.919.8 | 27.426.519.624.823.6 | 19.320.123.626.527.1 | 20.319.827.124.326.5 | 24.918.925.619.221.6 | 17.117.914.012.913.1 |
| 0509008 | 20.323.620.419.8 | 23.126.525.620.3 | 26.521.624.124.3 | 24.118.918.920.9 | 27.219.319.121.3 | 11.414.314.18.2 |
表4尿样品可重复性试验
| 批号 | 实测值(μg/kg) | 变异系数CV％ | ||||
| 050800205080070509008 | 17.619.823.620.319.824.720.323.617.8 | 27.420.624.918.923.628.924.924.819.6 | 24.623.118.717.524.921.324.621.518.8 | 21.325.619.518.927.819.817.920.623.6 | 25.627.417.617.525.618.718.419.826.3 | 16.613.815.318.812.118.215.79.416.9 |
结果表明鸡肉样品的变异系数均小于20％，饲料样品的变异系数均小于20％，尿样品的变异系数均小于20％，符合了变异系数小于35％的规定，说明本试剂盒样本测定的精密度达到了《农业部文件》农医发[2005]17号附件2试剂盒备案参考评判标准中第4点精密度和准确度的精密度标准。
(2)试剂盒的准确度
取两个浓度的雌二醇标样，对样品进行添加回收试验，每个浓度做4个平行，分别计算回收率。
表5准确度试验
| 样本 | 鸡肉 | ||
| 添加浓度(μg/kg) | 25 | 50 | |
| 回收率％ | 1234 | 92.482.476.1102.7 | 76.587.273.193.4 |
| 平均值 | 88.4 | 82.5 | |
| 样本 | 饲料 | ||
| 添加浓度(μg/kg) | 25 | 50 | |
| 回收率％ | 1234 | 82.794.179.595.6 | 83.276.593.482.7 |
| 平均值 | 87.9 | 83.9 | |
| 样本 | 尿液 | ||
| 添加浓度(μg/kg) | 10 | 20 | |
| 回收率％ | 1234 | 120.783.472.998.4 | 106.597.183.482.7 |
| 平均值 | 93.8 | 92.4 | |
结果表明鸡肉样本的添加回收率为73.1％～102.7％；饲料样本添加回收率76.5％～95.6％；尿液样本的添加回收率为72.9％～120.7％。
(3)试剂盒保存期试验
试剂盒保存条件为2-8℃，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、雌二醇添加实际测定值均在正常范围之内。
考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置6天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。
考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃保存6个月以上。
Claims (10)
1、一种检测雌二醇的酶联免疫试剂盒，其特征在于它含有：
(1)包被了雌二醇抗原的酶标板或抗抗体的酶标板；
(2)酶标记物；
(3)雌二醇标准品溶液；
(4)抗体工作液；
(5)底物显色液；
(6)浓缩洗涤液；
(7)终止液；
(8)浓缩复溶液。
2、如权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其中所述的包被雌二醇抗原的酶标板在制备过程中，所用包被原是采用水溶性碳化二亚胺法将雌二醇和载体蛋白进行偶联得到，载体蛋白为卵清蛋白、兔血清白蛋白、鼠血清白蛋白、血蓝蛋白；所述的包被抗抗体的酶标板在制备过程中，所用的抗抗体可为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体。
3、如权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其中所述的羊抗鼠抗抗体是以鼠源抗体作为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到，羊抗兔抗抗体是以兔源抗体作为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到。
4、如权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的洗涤液为0.01M、pH 7.4、含有0.8％～1.2％吐温20、0.5％叠氮化钠防腐剂的磷酸盐缓冲液；当标记酶为辣根过氧化物酶时，底物显色液A液为过氧化氢或过氧化脲、显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺、终止液为1～2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，底物液为对硝基磷酸盐缓冲液、终止液为2mol/L的氢氧化钠。
5、如权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的雌二醇标准品溶液的浓度分别为0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L。
6、如权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的雌二醇单克隆抗体或多克隆抗体的工作液浓度为0.5-5.0μg/L。
7、如权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的酶标记物为酶标记抗抗体或酶标记雌二醇抗原，酶标记抗抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与抗抗体进行偶联得到，酶标记雌二醇抗原是采用混合酸酐法将标记酶与雌二醇半抗原进行偶联得到。
8、如权利要求7所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的标记酶可为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶。
9、一种检测雌二醇的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)样品前处理；
(2)用权利要求1～8之任一所述的试剂盒进行检测；
(3)分析检测结果。
10、如权利要求9所述的方法，其中当酶标板包被的是雌二醇抗原时，试剂盒检测方法为向酶标板微孔中加入标准品溶液或样品溶液及加入抗体工作液，温育后洗涤拍干，然后再加酶标抗抗体，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；当酶标板包被的是抗抗体时，试剂盒检测方法为向酶标板微孔中加入抗体工作液，温育后洗涤拍干，然后加标准品溶液或样品溶液及酶标抗原，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值。
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