CN1844927A - 检测氟甲喹药物的酶联免疫试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测氟甲喹药物的酶联免疫试剂盒，它含有：包被有包被原的酶标板，酶标记物，氟甲喹特异性抗体工作液(当酶标板上包被抗原且酶标记物为酶标记抗抗体或酶标板上包被抗抗体且酶标记物为酶标记抗原时含有)，氟甲喹标准品溶液，底物显色液，终止液，浓缩洗涤液，浓缩复溶液。本发明还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测氟甲喹的方法，它包括步骤：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明提供的酶联免疫试剂盒可用于检测动物组织如鸡肉、虾肉等样品中氟甲喹的残留量，其操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本筛查。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测动物组织中氟甲喹药物的酶联免疫试剂盒及方法。
背景技术
氟甲喹是第二代氟喹酮类抗菌药，对大肠杆菌、支原体、嗜水气单胞菌引起的畜、禽及水生动物疾病有较好疗效，由于其具有高安全性、耐受性、在组织中高生物活性和独具的高渗透性因此被广泛使用，被大量用于治疗、预防和促生长。其耐药性和潜在的致癌性，使得其在应用同时受到了残留监控的重视。
检测氟甲喹残留量的化学方法主要有薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气-质联机(GC/MS)、液-质联机(HPLC/MS)、毛细管电泳(CE)等，由于复杂的仪器设备和繁琐的过程，不适合现场监控和大量样本筛查。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明提高了药物残留检测的灵敏度，节省操作时间，价格便宜、便于携带，并适合现场大量样本的筛选，改变了传统的药物残留检测方法，具有高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测的优点。
(二)技术方案
本发明的检测原理为：
当在微孔条上预包被氟甲喹偶联抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入氟甲喹特异性抗体溶液，样本中残留的氟甲喹药物与酶标板上包被的氟甲喹偶联抗原竞争氟甲喹特异性抗体，加入酶标记抗抗体进行发大作用，用显色液显色，样本吸光值与氟甲喹药物的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中氟甲喹的残留含量。同时根据酶标板上的颜色的深浅，与系列浓度的氟甲喹标准品溶液颜色的比较可判断样品中氟甲喹残留量的浓度范围。
当在微孔条上预包被氟甲喹特异性抗体时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记氟甲喹半抗原溶液，样本中残留的氟甲喹药物与酶标记抗原竞争包被在酶标板上的氟甲喹特异性抗体，用显色液显色，样本吸光值与氟甲喹药物的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中氟甲喹的残留含量。同时根据酶标板上的颜色的深浅，与系列浓度的氟甲喹标准品溶液颜色的比较可判断样品中氟甲喹残留量的浓度范围。
当在微孔条上预包被氟甲喹偶联抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记氟甲喹特异性抗体溶液，样本中残留的氟甲喹药物与酶标板上包被的氟甲喹抗原竞争氟甲喹特异性抗体，用显色液显色，样本吸光值与氟甲喹药物的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中氟甲喹的残留含量。同时根据酶标板上的颜色的深浅，与系列浓度的氟甲喹标准品溶液颜色的比较可判断样品中氟甲喹残留量的浓度范围。
当在微孔条上预包被抗抗体时，加入氟甲喹抗体孵育后，加入样本溶液或标准品溶液，再加入酶标记氟甲喹偶联抗原溶液，样本中残留的氟甲喹药物与酶标记氟甲喹偶联抗原竞争氟甲喹特异性抗体，用显色液显色，样本吸光值与氟甲喹药物的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中氟甲喹的残留含量。同时根据酶标板上的颜色的深浅，与系列浓度的氟甲喹标准品溶液颜色的比较可判断样品中氟甲喹残留量的浓度范围。
本发明提供了一种用于检测氟甲喹物的酶联免疫试剂盒，它含有：
(1)包被有包被原的酶标板(包被原为抗原、抗体或抗抗体)；
(2)酶标记物(为酶标记抗原、酶标记抗体或酶标记抗抗体)；
(3)氟甲喹特异性抗体工作液(当酶标板上包被抗原且酶标记物为酶标记抗抗体或酶标板上包被抗抗体且酶标记物为酶标记抗原时含有)；
(4)氟甲喹标准品溶液；
(5)底物显色液；
(6)终止液；
(7)浓缩洗涤液；
(8)浓缩复溶液。
本发明所提供的检测氟甲喹的酶联免疫试剂盒，包括氟甲喹特异性抗体工作液及预包被包被原的酶联板和酶标记物工作液；所述酶标记物为酶标记的抗抗体，酶标记氟甲喹半抗原或酶标记氟甲喹特异性抗体；所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体。
所述氟甲喹半抗原是将氟甲喹和6-氨基己酸通过酰化方法得到的。
所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标记的羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与抗抗体进行偶联得到的，辣根过氧化物酶可采用现有技术中的多种方法将其与抗抗体进行偶联，如戊二醛法，过碘酸钠法等，本发明经过长期的劳动创造将过碘酸钠法进行了改良，使其省时、降低辣根过氧化物酶(HRP)与抗抗体的浓度比率，节省了原材料。
所述氟甲喹特异性抗体可为氟甲喹单克隆抗体或氟甲喹多克隆抗体；它们均是用氟甲喹半抗原与载体蛋白采用混合酸酐法得到的偶联物作为免疫原得到的；所述氟甲喹多克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体，所述氟甲喹单克隆抗体优选为氟甲喹鼠单克隆抗体，所述氟甲喹多克隆抗体优选为氟甲喹兔多克隆抗体。
所述氟甲喹单克隆抗体优选为氟甲喹的单克隆杂交瘤细胞株B-1-2CGMCC No.1707分泌的单克隆抗体。
所述氟甲喹的单克隆杂交瘤细胞株B-1-2 CGMCC No.1707已于2006年4月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。
以上抗体均可以用氟甲喹半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原按碳化二亚氨法制备。所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白(BCG)、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白等常用载体蛋白；所述氟甲喹半抗原与载体蛋白的偶联物可通过将氟甲喹半抗原和载体蛋白用碳化二亚氨法进行偶联得到。
为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括氟甲喹标准品溶液、显色剂、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液。
所述浓缩洗涤液为0.02M，pH 7.4，含有0.8％～1.2％吐温80和0.5％硫柳汞防腐剂的磷酸盐缓冲液。
所述当标记酶为辣根过氧化物酶时，显色剂由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，所述显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1～2mol/L硫酸；当标记酶为碱性磷酸酯酶时，显示液为对硝基苯磷酸酯缓冲液，终止液为1～2mol/L氢氧化钠溶液。
所述浓缩复溶液为含0.2M-0.5M含有2％卵清蛋白的5×浓缩磷酸盐缓冲液。
其中酶标板在制备过程中所用的包被缓冲液为pH6.8，0.05mol/L的柠檬酸缓冲液；所用的封闭液含有3～10％小牛血清，2％酪蛋白的磷酸盐缓冲液。
本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成0.05-0.2μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h，再4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150-200μl封闭液，37℃温育1-2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。
本发明中抗原的合成过程为：
1.半抗原的合成
将氟甲喹和6-氨基己酸通过酰化方法得到的。
2.氟甲喹抗体的制备
将氟甲喹半抗原与载体蛋白采用碳化二亚氨法进行偶联得到免疫原。
免疫原的具体制备方法：氟甲喹是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。因此将氟甲喹和6-氨基己酸合成氟甲喹半抗原，给氟甲喹接出了一个含6个碳的间隔臂，这样突出了氟甲喹分子结构中的特征基团，使制备的氟甲喹抗体对氟甲喹的特异性很高。
氟甲喹鼠单克隆抗体的制备
动物免疫程序：采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以氟甲喹半抗原与载体蛋白偶联物为免疫原，得到较好的多克隆抗体，取出肝脏进行细胞融合。
细胞融合与克隆化：取免疫BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选细胞株，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
氟甲喹兔多克隆抗体的制备
采用新西兰大白兔作为免疫动物，以氟甲喹与载体蛋白偶联物为免疫原对新西兰大白兔进行免疫，多次免疫后测定血清抗体效价得到多克隆抗体。
本发明抗抗体的制备过程：羊抗鼠抗抗体是以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病菌体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体；羊抗兔抗抗体是以羊作为免疫动物，以兔源抗体为免疫原对无病菌体羊进行免疫，得到羊抗兔抗抗体。
本发明所述试剂盒中氟甲喹标准品溶液：标准品溶液6瓶，0μg/L，1μg/L，3μg/L，9μg/L，27μg/L，81μg/L，3ml/瓶。
本发明还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测氟甲喹药物的方法，它包括步骤：
(1)样品前处理；
(2)用试剂盒进行检测；
(3)分析检测结果。
本发明提供氟甲喹在鸡肉、虾肉样本中的处理，用匀质器匀质样本后，称取样本于离心管中，加入PB缓冲液上下混合后，加入而二氯甲烷，混匀离心，氮气吹干，复溶，取样分析。
本发明中用试剂盒检测是：当包被原为氟甲喹偶联抗原时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液再加入抗体，温育后洗涤拍干，再加入酶标抗抗体，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；当包被原为氟甲喹偶联抗原时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液再加入酶标记抗体，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；当包被原为氟甲喹特异性抗体时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液再加入酶标记氟甲喹半抗原，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；当包被原为抗抗体时，向酶标板微孔中加入氟甲喹抗体，温育后洗涤拍干，再加入标准品溶液或样品溶液后加入酶标氟甲喹半抗原，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值。
本发明中检测结果分析过程为：用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准溶液(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100％，即百分吸光度值。计算公式为：
百分吸光度值(％)＝(B/B0)×100％
以氟甲喹标准品溶液的浓度(μg/L)的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度则可从标准曲线上读出样本中氟甲喹的残留量。
本发明中检测结果的分析也可以采用回归方程法，计算出样品溶液浓度。
本发明中检测结果的分析还可以利用计算机专业软件，此法更便于大量样品的快速分析，整个检测过程只需1.5小时可以完成，最低检测限为1.2μg/L。
(三)有益效果
本发明检测氟甲喹的酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测样品中氟甲喹的残留量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品；采用高特异性的氟甲喹单克隆抗体，主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本发明的酶联免疫试剂盒，结构简单、使用方便、价格便宜、携带便利，检测方法高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量。本发明的试剂盒将在氟甲喹的检测中发挥重要作用。本发明的方法高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测。
附图说明
图1：氟甲喹的检测标准曲线图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。
实施例1 试剂盒组分的制备
1.抗原的合成
a.半抗原的合成
将氟甲喹和6-氨基己酸通过酰化方法得到的。
半抗原的具体步骤：取200mg氟甲喹和100mg 6-氨基己酸和50mgNHS(活化酯)用水搅拌反应过夜。
b.免疫原合成
将氟甲喹半抗原与兔血清白蛋白采用碳化二亚氨法进行偶联得到免疫原。
c.包被原氟甲喹偶联抗原的制备
将氟甲喹半抗原与人血清白蛋白采用碳化二亚氨法进行偶联得到免疫原。
免疫原的制备过程：取EDC100mg，用pH8.0的10mmol/LPBS液2.5ml使之充分融解(I液)；取氟甲喹半抗原15g，用0.2oml/LnaOH溶液2ml溶解(II液)；取兔血清白蛋白30mg，溶于10mmol/LPBS(pH8.0)溶液中，(III液)；将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液(余下0.5ml)；室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液；4℃搅拌12小时。静置10小时(4℃)；用蒸馏水使之充分透吸(约48小时)，得到免疫原。
2.单克隆抗体的制备
a.动物免疫
将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为100μg/只，使其产生多克隆抗体。
b.细胞融合和克隆化
取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株-氟甲喹的单克隆杂交瘤细胞株B-1-2 CGMCC No.1707。
c.细胞冻存和复苏
将氟甲喹的单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×106个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
d.单克隆抗体的制备与纯化
将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.4ml/只，7天后腹腔注射氟甲喹的单克隆杂交瘤细胞株5×105个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。
3.多克隆抗体的制备
采用新西兰大白兔作为免疫动物，以氟甲喹与卵清蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为1.5mg/kg，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3～4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫10天后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，用硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。
4.羊抗鼠抗抗体的制备过程：以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体；羊抗兔抗抗体的制备：以羊作为免疫动物，以兔源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗兔抗抗体。
5.酶标板的制备
用包被缓冲液将氟甲喹偶联抗原、抗体或抗抗体稀释成0.05-0.2μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h或4℃过夜，倾去包被液，用稀释20倍的浓缩洗涤液洗涤2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入200μl封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
6.酶标记羊抗鼠抗抗体的置备
将抗抗体与辣根过氧化物酶(HRP)采用改良后的过碘酸钠法进行偶联。传统的过碘酸钠法要求反映体系中酶与抗抗体的摩尔浓度比为4∶1；由于辣根过氧化物酶在强氧化的作用下产生许多与抗抗体结合的位点，这样活化的辣根过氧化物酶分子充当了连接各分子的桥梁，降低了酶标记物的酶活性，使制备的偶联物中混有许多聚合体，为了解决这个问题，我们将传统的方法进行了改良，即：
1)省去了氨基的封闭过程，因为能产生自身氨基连接的氨基实际很少。
2)降低了辣根过氧化物酶：抗抗体的摩尔浓度比率至2∶1，改良后的方法比传统的方法简便，对酶的活性的损失减少。
实施例2 检测氟甲喹的酶联免疫试剂盒的组建
组建检测氟甲喹的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：
(1)包被氟甲喹偶联抗原的酶标板；
(2)用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；
(3)氟甲喹单抗体工作液；
(4)氟甲喹标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/L、81μg/L；
(5)底物显色液由A液和B液组成，底物显色液A液为过氧化脲，底物显色液B液为四甲基联苯胺；
(6)终止液为2mol/L盐酸；
(7)浓缩洗涤液为0.02M，pH 7.4，含有0.8％～1.2％吐温80和0.5％硫柳汞防腐剂的磷酸盐缓冲液；
(8)浓缩复溶液为0.2M-0.5M含有2％卵清蛋白的5×浓缩磷酸盐缓冲液。
实施例3 样品中氟甲喹残留的检测
1.样品前处理
动物组织(鸡肉、虾肉)：称2.0g均质过的组织样本于50ml离心管中，加入8ml PB缓冲液。充分上下混合30min，加入10ml的二氯甲烷，充分混匀10min，3000g以上，15℃离心10min，取5ml上层有机相到干燥瓶中(清亮无杂质)，50℃旋转蒸发至干/氮气吹干，用1ml稀释了的复溶液涡动30s，溶解干燥的残留物，加入正己烷1ml混合30s，3000g以上，15℃离心10min(若下层有明显混浊，请重复此步)，轻吸掉上层有机相和中间部份液体，取下层100μl+100μl PB缓冲液混匀即可分析。(该样品被稀释了2倍)
2.用试剂盒检测
向包被有羊抗兔抗抗体的酶标板微孔中加入氟甲喹抗体工作液100μl，37℃反应30min。倒出孔中液体，每孔加入稀释后的洗涤液，30s后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。加入系列标准品溶液或样品溶液50μl，同时加入碱性磷酸酯酶标记的氟甲喹半抗原工作液50μl，37℃反应30min。取出酶标板，如前述洗板5次。每孔加入底物显色液对硝基苯磷酸酯100μl，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15～30min。每孔加入终止液50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪波长设定在405nm处，测定每孔吸光度值(OD值)。
3.检测结果分析
用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。以氟甲喹标准品浓度(μg/L)的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度，则可从标准曲线上读出氟甲喹的残留量。
实验例1
标准品精密度试验：
分别从三个不同的时间段制备的酶标板中各抽出一批酶标板，每批各抽取10个试剂盒，每板各抽出20个微孔，测定9.0μg/L标准溶液的吸光度值，计算变异系数。
表1 标准可重复性试验(CV％)
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | ||
| CV％ | 01批 | 8.5 | 9.4 | 11.7 | 10.4 | 7.5 | 3.4 | 5.4 | 2.9 | 4.6 | 8.7 |
| 03批 | 5.1 | 4.9 | 7.6 | 8.7 | 6.3 | 3.8 | 4.1 | 2.8 | 7.6 | 8.1 | |
| 06批 | 8.8 | 7.6 | 9.5 | 5.4 | 7.6 | 11.4 | 8.7 | 9.3 | 7.5 | 6.8 |
通过上述试验结果可以得出，每批试剂盒各10次标准品变异系数在2.9％-11.7％之间，符合精密度小于或等于25％的规定。
实验例2
样本精密度和准确度试验
a.样品精密度试验：
取氟甲喹标样，添加到样品中，分别取三个不同批次的试剂盒各三个，每个浓度重复5次，分别计算变异系数，结果见表。
表2 鸡肉样品可重复性试验
| 批号 | 实测值(μg/kg) | 变异系数CV％ | ||||
| 050600105070040507007 | 14.313.716.411.617.418.817.415.412.7 | 18.416.418.522.413.613.416.216.416.2 | 16.318.519.518.418.517.513.518.418.4 | 13.714.615.716.512.916.418.517.417.6 | 19.521.420.714.320.719.212.915.922.7 | 15.318.411.524.619.913.615.57.2120.7 |
表3 虾样品可重复性试验
| 批号 | 实测值(μg/kg) | 变异系数CV％ | ||||
| 050600805070030507009 | 18.417.416.418.217.312.71811.918.8 | 16.219.417.219.516.213.416.220.815.4 | 13.713.419.521.717.217.517.413.813.9 | 18.417.416.417.413.516.419.316.717.6 | 19.512.917.413.621.722.721.815.420.4 | 13.417.57.3116.517.224.111.521.415.1 |
结果表明，鸡肉样本变异系数均低于25％，虾样本的变异系数均低于25％。
b.样本准确度试验
取两个浓度的氟甲喹标准品溶液分别为20μg/kg(L)和50μg/kg(L)，分别对样品进行添加回收试验，每个浓度做4个平行，具体方法如实施例1中样品前处理步骤，分别计算准确度。
表4 试剂盒的准确度
| 样本 | 鸡肉 | 虾 | |||
| 添加浓度(μg/kg) | 20 | 50 | 20 | 50 | |
| 准确度％平均值％ | 1234 | 63.481.475.494.578.7 | 84.593.5112.786.494.3 | 75.462.882.475.674.1 | 102.792.483.574.988.4 |
结果表明鸡肉样品添加准确度在63.4％-112.7％之间，虾样品添加准确度在62.8％-102.7％之间。
实验例3
交叉反应率试验：
选择与氟甲喹有类似结构和类似功能的3种药物测定交叉反应率。通各种药物的标准曲线分别得到其50％抑制浓度。用下式计算试剂盒对其它药物的交叉反应率。交叉反应越大，那么此试剂盒对氟甲喹的检测的特异性就越好。
交叉反应率(％)＝(引起50％抑制氟甲喹的浓度/引起50％抑制的类似物浓度)×100％
表5 试剂盒的特异性
| 药物名称 | 交叉反应率(％) |
| 氟甲喹 | 100 |
| 恩诺沙星 | ＜0.1 |
| 环丙沙星 | ＜1.0 |
| 氧氟沙星 | ＜0.5 |
| 诺氟沙星 | ＜1.0 |
| 洛美沙星 | ＜0.1 |
| 达氟沙星 | ＜0.1 |
实验例4
试剂盒保存条件为2-8℃，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、氟甲喹添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置6天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃至少可以保存6个月以上。
Claims (11)
1、一种检测氟甲喹药物的酶联免疫试剂盒，其特征在于它含有：
(1)包被有包被原的酶标板；
(2)酶标记物；
(3)氟甲喹标准品溶液；
(4)底物显色液；
(5)终止液；
(6)浓缩洗涤液；
(7)浓缩复溶液。
2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：包被原为抗原、抗体或抗抗体，酶标记物为酶标记抗原、酶标记抗体或酶标记抗抗体，所用包被缓冲液为pH6.8，0.05mol/L的柠檬酸缓冲液，所用的封闭液为3～10％小牛血清，2％酪蛋白的磷酸盐缓冲液。
3、如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，当酶标板上包被抗原且酶标记物为酶标记抗抗体或酶标板上包被抗抗体且酶标记物为酶标记抗原时还含有：
(8)氟甲喹特异性抗体工作液。
4、如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：酶标板中包被的包被原为氟甲喹半抗原与载体蛋白的偶联物、氟甲喹特异性抗体或抗抗体；所述载体蛋白为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白；氟甲喹特异性抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；所述氟甲喹单克隆抗体为氟甲喹的单克隆杂交瘤细胞株B-1-2CGMCC No.1707分泌的单克隆抗体；抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体。
5、如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：酶标记物为酶标记抗抗体、酶标记氟甲喹半抗原或酶标记特异性抗原；抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体；标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶氟甲喹半抗原是将氟甲喹和6-氨基己酸通过酰化方法得到的半抗原。
6、如任一权利要求1-5所述的试剂盒，其特征在于：标记酶为辣根过氧化物酶，底物显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，底物显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1～2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液。
7、如任一权利要求1-5所述的试剂盒，其特征在于：标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶，底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液、终止液为2mol/L的氢氧化钠。
8、如权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，浓缩洗涤液为0.02M，pH7.4，含有0.8％～1.2％吐温80和0.5％硫柳汞防腐剂的磷酸盐缓冲液；复溶液为0.2M-0.5M含有2％卵清蛋白的5×浓缩磷酸盐缓冲液。
9、如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：制备抗体所需要的免疫原采用混合酸酐法或碳化二亚氨法将氟甲喹半抗原与载体蛋白偶联得到。
10、如权利要求1或9所述的试剂盒，其特征在于：氟甲喹标准品溶液的浓度分别为0μg/L，1μg/L，3μg/L，9μg/L，27μg/L，81μg/L。
11、一种检测样品氟甲喹药物残留的方法，包括步骤：
(1)样品前处理；
(2)用任一权利要求1-10所述的试剂盒进行检测；
(3)分析检测结果。
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