CN101256188A - 检测林可霉素药物的酶联免疫试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测林可霉素药物的酶联免疫试剂盒，它含有：包被有包被原的酶标板，酶标记物，林可霉素特异性抗体工作液(当酶标板上包被抗原且酶标记物为酶标记抗抗体或酶标板上包被抗抗体且酶标记物为酶标记抗原时含有)，林可霉素标准品溶液，底物显色液，终止液，浓缩洗涤液，浓缩复溶液。本发明还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测林可霉素的方法，它包括：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明提供的酶联免疫试剂盒可用于检测动物组织(肌肉、肝脏)和蜂蜜等样品中林可霉素的残留量，其操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本的筛查。

Description

检测林可霉素药物的酶联免疫试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测林可霉素药物的酶联免疫试剂盒，其特别适于动物组织和蜂蜜中林可霉素药物残留的检测。
技术背景
林可霉素(lincomycin)又称洁霉素或林肯霉素，是由链霉菌发酵产生的林可酰胺类抗生素(结构式如图1)，有较强的抑菌活性。其残留通过食物链进入人体后累积可以导致细菌耐药性，因此，各国都对其作出限量要求，我国农业部235号文件规定其残留限量为0.05ppm(鸡蛋)，日本肯定列表规定其残留限量为0.02ppm(鸡可食用内脏)。
林可霉素残留量的常规检测方法主要有高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)、纸色谱等，由于复杂的仪器设备和繁琐的过程以及对检验人员的高技能要求，不适合现场监控和大量样本的筛查。
发明内容
本发明的目的在于针对上述不足提供一种用于林可霉素检测的酶联免疫试剂盒，其操作简单适，适合现场大批量样品的筛选。
本发明试剂盒，它含有：
(1)包被有包被原的酶标板(包被原为抗原、抗体或抗抗体)；
(2)酶标记物(为酶标记半抗原(某些地方写的是酶标记半抗原，请确认并统一)、酶标记抗体或酶标记抗抗体)；
(3)林可霉素特异性抗体工作液(当酶标板上包被抗原且酶标记物为酶标记抗抗体或酶标板上包被抗抗体且酶标记物为酶标记抗原时含有)；
(4)林可霉素标准品溶液；
(5)底物显色液；
(6)终止液；
(7)浓缩洗涤液；
(8)浓缩复溶液。
本发明所提供的检测林可霉素的酶联免疫试剂盒，包括林可霉素特异性抗体工作液及预包被包被原的酶标板和酶标记物工作液；所述酶标记物为酶标记的抗抗体，酶标记林可霉素半抗原或酶标记林可霉素特异性抗体；所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体。
所述林可霉素半抗原是林可霉素通过琥珀酸酐法得到的。
所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标记的羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与抗抗体进行偶联得到的；酶标记林可霉素半抗原是采用混合酸酐或碳化二亚胺法将标记酶与林可霉素半抗原偶联得到的；酶标记特异性抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与特异性抗体偶联得到的，辣根过氧化物酶可采用现有技术中的多种方法将其与抗抗体进行偶联，如戊二醛法，过碘酸钠法等，本发明经过长期的劳动创造将过碘酸钠法进行了改良，使其省时、降低辣根过氧化物酶(HRP)与抗抗体的浓度比率，节省了原材料。
所述林可霉素特异性抗体可为林可霉素单克隆抗体或林可霉素多克隆抗体；它们均是用林可霉素半抗原与载体蛋白采用混合酸酐法或碳化二亚胺法得到的偶联物作为免疫原得到的；所述林可霉素多克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体，所述林可霉素单克隆抗体优选为林可霉素鼠单克隆抗体，所述林可霉素多克隆抗体优选为林可霉素兔多克隆抗体。
所述林可霉素单克隆抗体优选为林可霉素的单克隆杂交瘤细胞株C-1-3CGMCC No.2398分泌的单克隆抗体。
所述林可霉素单克隆杂交瘤细胞株C-1-3CGMCC No.2398(分类命名：对林可霉素药物的单克隆杂交瘤细胞株)已于2008年03月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。
以上抗体均可以用林可霉素半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原制备。所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白(BCG)、牛血清蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白和纤维蛋白原等常用载体蛋白；所述林可霉素半抗原与载体蛋白的偶联物可通过将林可霉素半抗原和载体蛋白用混合酸酐法或碳化二亚胺法进行偶联得到。
为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括林可霉素标准品溶液、显色剂、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液。
所述浓缩洗涤液优选为1.0％～1.5％吐温20和0.5％硫柳汞防腐剂的磷酸盐缓冲液。
当标记酶为辣根过氧化物酶时，显色剂由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，所述显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为终止液为1～2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为碱性磷酸酯酶时，显色液为对硝基磷酸盐缓冲液、终止液为1～2mol/L氢氧化钠溶液。
所述浓缩复溶液液优选为含有5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。
其中酶标板在制备过程中所用的包被缓冲液优选为pH值为6.7，0.05mol/L醋酸缓冲液，所用封闭液为含有5～10％山羊血清，10％酪蛋白的磷酸盐缓冲液。
本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成0.05～0.2μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h，再4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150～200μl封闭液，37℃温育1～2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。
本发明中抗原的合成过程为：
1.半抗原的合成
将林可霉素采用琥珀酸酐法得到，技术路线如图2。
2.林可霉素抗体的制备
将林可霉素半抗原与载体蛋白采用混合酸酐法进行偶联得到免疫原。
免疫原的具体制备方法：林可霉素是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。因此将林可霉素通过琥珀酸酐法合成林可霉素半抗原，这样突出了林可霉素分子结构中的特征基团，使制备的林可霉素抗体对林可霉素的特异性很高。
林可霉素鼠单克隆抗体的制备
动物免疫程序：采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以林可霉素半抗原与载体蛋白偶联物为免疫原，得到较好的多抗血清后，取出脾脏进行细胞融合。
细胞融合与克隆化：取免疫Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选细胞株，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
林可霉素兔多克隆抗体的制备
采用新西兰大白兔作为免疫动物，以林可霉素半抗原与载体蛋白偶联物为免疫原对新西兰大白兔进行免疫，多次免疫后测定血清抗体效价得到多克隆抗体。
本发明抗抗体的制备过程：羊抗鼠抗抗体是以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病菌体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体；羊抗兔抗抗体是以羊作为免疫动物，以兔源抗体为免疫原对无病菌体羊进行免疫，得到羊抗兔抗抗体。
本发明所述试剂盒中林可霉素标准品溶液：标准品溶液6瓶，0μg/L，0.2μg/L，0.6μg/L，1.8μg/L，5.4μg/L，16.2μg/L。
本发明的检测原理为：
当在微孔条上预包被林可霉素偶联抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入林可霉素特异性抗体溶液，样本中残留的林可霉素药物与酶标板上包被的林可霉素偶联抗原竞争林可霉素特异性抗体，加入酶标记抗抗体进行放大作用，用显色液显色，样本吸光值与林可霉素药物的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中林可霉素的残留量。同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的林可霉素标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中林可霉素残留量的浓度范围。
当在微孔条上预包被林可霉素特异性抗体时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记林可霉素半抗原溶液，样本中残留的林可霉素药物与酶标记抗原竞争包被在酶标板上的林可霉素特异性抗体，用显色液显色，样本吸光值与林可霉素药物的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中林可霉素的残留含量。同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的林可霉素标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中林可霉素残留量的浓度范围。
当在微孔条上预包被林可霉素偶联抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记林可霉素特异性抗体溶液，样本中残留的林可霉素药物与酶标板上包被的林可霉素偶联抗原竞争林可霉素特异性抗体，用显色液显色，样本吸光值与林可霉素药物的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中林可霉素的残留含量。同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的林可霉素标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中林可霉素残留量的浓度范围。
当在微孔条上预包被抗抗体时，加入林可霉素抗体孵育后，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记林可霉素偶联抗原溶液，样本中残留的林可霉素药物与酶标记林可霉素偶联抗原竞争林可霉素特异性抗体，用显色液显色，样本吸光值与林可霉素药物的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中林可霉素的残留含量。同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的林可霉素标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中林可霉素残留量的浓度范围。
本发明还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒监测林可霉素药物的方法，它包括步骤：
(1)样品前处理；
(2)用试剂盒进行检测；
(3)分析检测结果。
样品的前处理主要是为了从样品中获得林可霉素溶液，从而用于后续的检测。下面是常见的几种样品的前处理方法：
1、鸡肉、肝脏样品的前处理方法：称取2.0g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入10ml甲醇-盐酸溶液，振荡5min，3000g以上，室温离心5min，移取200μl上清液，加入600μl复溶液充分混匀，取50μl用于分析；
2、蜂蜜样品前处理方法：称取1.0蜂蜜至50ml聚苯乙烯离心管中，加入5ml去离子水，用涡旋仪涡动至蜂蜜全部溶解，再使用振荡器振荡5min；3000g以上，室温离心5min；取上层清液1ml，加入1ml复溶液用涡旋仪涡动30s；取50μl用于分析。
本发明中用试剂盒检测时：当包被原为林可霉素偶联抗原时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液再加入抗体，温育后洗涤拍干，再加入酶标抗抗体，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；当包被原为林可霉素偶联抗原时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液再加入酶标记抗体，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；当包被原为林可霉素特异性抗体时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液再加入酶标记林可霉素半抗原，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；当包被原为抗抗体时，向酶标板微孔中加入林可霉素抗体，温育后洗涤拍干，再加入标准品溶液或样品溶液后加入酶标林可霉素半抗原，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值。
本发明中检测结果分析过程为：用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准溶液(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100％，即百分吸光度值。计算公式为：
百分吸光度值(％)＝(B/B0)×100％
以林可霉素标准品溶液的浓度(μg/L)的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度则可从标准曲线上读出样本中林可霉素的残留量。
本发明中检测结果的分析也可以采用回归方程法，计算出样品溶液浓度。
本发明中检测结果的分析还可以利用计算机专业软件，此法更便于大量样品的快速分析，整个检测过程只需1.5小时可以完成。
本发明检测林可霉素的酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测样品中林可霉素的残留量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批量样品；采用高特异性的林可霉素单克隆抗体，主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本发明的酶联免疫试剂盒，结构简单、使用方便、价格便宜、携带便利、检测方法高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量。
本发明的试剂盒将在林可霉素的检测中发挥重要作用。
附图说明
图1：林可霉素类抗生素化学结构通式；
图2：林可霉素半抗原合成技术路线；
图3：标准品林可霉素浓度。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。
实施例1试剂盒组分的制备
1.抗原的合成
a.半抗原的合成
将林可霉素采用琥珀酸酐法得到具有羧基官能团的半抗原。
半抗原的具体步骤：称取2.3g林可霉素和0.5g琥珀酸酐放入50ml圆底烧瓶中加无水吡啶至完全溶解，70℃加热搅拌反应24h。反应结束后，减压蒸馏去溶剂，残余物用丙酮洗涤数次，用乙酸乙酯-正己烷使其结晶，得半抗原林可霉素-琥珀酸酐。
b.免疫原合成
将林可霉素半抗原与牛血清白蛋白采用混合酸酐法进行偶联得到免疫原。
免疫原的制备过程：取5.8mg林可霉素半抗原用0.1ml DMF溶解，冷却至10℃，加2μl氯甲酸异丁酯，10℃搅拌反应30分钟，60mg牛血清白蛋白用2ml 50mmol/L Na2CO3溶解，10℃反应4小时，然后4℃过夜，过柱，用缓冲液平衡和洗脱，合并含有牛血清白蛋白的洗脱管内液体，进一步纯化后得到免疫原。
c.包被原林可霉素偶联抗原的制备
将林可霉素半抗原与卵清蛋白偶联得到包被原。
包被原的制备过程：
取5.8mg林可霉素半抗原用0.1ml DMF溶解，冷却至10℃，加2μl氯甲酸异丁酯，10℃搅拌反应30分钟，30mg卵清蛋白用2ml50mmol/L Na2CO3溶解，10℃反应4小时，然后4℃过夜，过柱，用缓冲液平衡和洗脱，合并含有卵清蛋白的洗脱管内液体，进一步纯化后得到包被原。
单克隆抗体的制备
a.动物免疫
将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为100μg/只，使其产生多克隆抗体血清。
b.细胞融合和克隆化
小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按7∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
经筛选得到林可霉素的单克隆杂交瘤细胞株C-1-3CGMCCNo.2398。林可霉素的单克隆杂交瘤细胞株可以无限量的产生林可霉素特异性抗体，且该抗体特异性是针对林可霉素的，灵敏度能达到0.2μg/L。
c.细胞冻存和复苏
将林可霉素的单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×106个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
d.单克隆抗体的生产与纯化
将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射林可霉素的单克隆杂交瘤细胞株5×107个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。
2.多克隆抗体的制备
采用新西兰大白兔作为免疫动物，以林可霉素与牛血清白蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为1.5mg/kg，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3～4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫10天后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，用硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。
3.羊抗鼠抗抗体的制备过程：以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体；羊抗兔抗抗体的制备：以羊作为免疫动物，以兔源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗兔抗抗体。
4.酶标板的制备
用包被缓冲液将林可霉素偶联抗原、抗体或抗抗体稀释成0.05-0.2μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h或4℃过夜，倾去包被液，用稀释20倍的浓缩洗涤液洗涤2次，每次30秒，拍干，然后再每孔中加入200μl封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
5.酶标记羊抗鼠抗抗体的置备
将抗抗体与辣根过氧化物酶(HRP)采用改良后的过碘酸钠法进行偶联。传统的过碘酸钠法要求反映体系中酶与抗抗体的摩尔浓度比为4∶1；由于辣根过氧化物酶在强氧化的作用下产生许多与抗抗体结合的位点，这样活化的辣根过氧化物酶分子充当了连接各分子的桥梁，降低了酶标记物的酶活性，使制备的偶联物中混有许多聚合体，为了解决这个问题，我们将传统的方法进行了改良，即：
1)省去了氨基的封闭过程，因为能产生自身氨基连接的氨基实际很少。
2)降低了辣根过氧化物酶：抗抗体的摩尔浓度比率至2∶1，改良后的方法比传统的方法简便，对酶的活性的损失减少。
实施例2检测林可霉素的酶联免疫试剂盒的组建
组建检测林可霉素的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：
(1)包被林可霉素偶联抗原的酶标板；
(2)用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；
(3)林可霉素单克隆抗体工作液；
(4)林可霉素标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.2μg/L、0.6μg/L、1.8μg/L、5.4μg/L、16.2μg/L；
(5)底物显色液由A液和B液组成，底物显色液A液为过氧化脲，底物显色液B液四甲基联苯胺；
(6)终止液为2mol/L盐酸；
(7)浓缩洗涤液为1.0％～1.5％吐温20和0.5％硫柳汞防腐剂的磷酸盐缓冲液。
(8)浓缩复溶液为含有5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。
实施例3  样品中林可霉素的检测
1.样品前处理
a)动物组织(鸡肉、鸡肝、猪肉、猪肝等)
称取2.0g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入10ml甲醇-盐酸溶液，振荡5min，3000g以上，室温离心5min，移取200μl上清液，加入600μl复溶液充分混匀，取50μl用于分析。
b)蜂蜜样本
蜂蜜样本中处理方法称取1.0g蜂蜜至50ml聚苯乙烯离心管中，加入5ml去离子水，用涡旋仪涡动至蜂蜜全部溶解，再使用振荡器振荡5min，3000g以上，室温离心5min，取上层清液1ml，加入1ml复溶液用涡旋仪涡动30s，取50μl用于分析。
2.用试剂盒检测
向包被有林可霉素偶联抗原的酶标板微孔中加入林可霉素标准品溶液或样品溶液50μl，再加入林可霉素单克隆抗体工作液50μl，用盖板模封板，25℃恒温箱中反应30min，倒出孔内液体，每孔加入250μl洗涤液，30s后倒出孔内液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体工作液100μl，25℃恒温箱中反应30min，倒出孔内液体，重复洗板步骤，每孔加入底物显色液A液过氧化脲，底物显色液B液四甲基联苯胺(TMB)，轻轻振荡混匀，25℃恒温箱避光显色15min，每孔加入2mol/L终止液盐酸50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪波长设定在450nm处，测定每孔吸光度值(OD值)。
3.检测结果分析
用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。以林可霉素标准品浓度(μg/L)的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度，则可从标准曲线上读出林可霉素的残留量。
实验例1  标准品精密度试验：
分别从三个不同的时间段制备的酶标板中各抽出一批酶标板，每批各抽取10个试剂盒，每板各抽出20个微孔，测定1.8μg/L标准溶液的吸光度值，计算变异系数。
表1标准可重复性试验(CV％)
Figure A20081010412900151
通过上述试验结果可以得出，每批试剂盒各10次标准品变异系数在4.2％-15.7％之间，符合精密度小于或等于25％的规定。
实验例2  样本精密度和准确度试验
1.样品精密度试验：
以20μg/L浓度的林可霉素对肌肉、肝脏、蜂蜜进行添加测定，分别取三个不同批次的试剂盒各五个，每个浓度重复5次，分别计算变异系数，结果见表2～4。
表2 肌肉样本可重复性试验
Figure A20081010412900161
表3 肝脏样本可重复性试验
Figure A20081010412900162
表4 蜂蜜样本可重复性试验
Figure A20081010412900171
结果表明肌肉、肝脏、蜂蜜样本的变异系数均在3.7％-15.8％之间，符合了《农业部文件》农医发【2005】17号附件2试剂盒备案参考评判标准中第四点精密度标准。
b.样本准确度试验
取两个浓度的林可霉素标准品溶液分别为20μg/kg(L)、40μg/kg(L)，分别对样品进行添加回收试验，每个浓度做4个平行，分别计算准确度。
表5 试剂盒的准确度
结果表明肌肉样本添加回收率在78.2％-98.3％之间，肝脏样本的添加回收率在75.6％-97.2％之间，蜂蜜样本添加回收率在86.7％-107.4％之间。
实验例3 交叉反应率试验：
选择与林可霉素有类似结构和类似功能的5种药物测定交叉反应率，通过各种药物的标准曲线分别得到其50％抑制浓度。用下式计算试剂盒对其它药物的交叉反应率。交叉反应率越大，那么此试剂盒对林可霉素的检测的特异性就越好。
交叉反应率(％)＝(引起50％抑制林可霉素的浓度/引起50％抑制的类似物浓度)×100％
表6 试剂盒的特异性
Figure A20081010412900181
实验例4
试剂盒保存条件为2～8℃，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、林可霉素添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置6天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2～8℃至少可以保存6个月以上。

Claims (10)

1、一种检测林可霉素药物的酶联免疫试剂盒，其特征在于它含有：
(1)包被有包被原的酶标板；
(2)酶标记物；
(3)林可霉素标准品溶液；
(4)底物显色液；
(5)终止液；
(6)浓缩洗涤液；
(7)浓缩复溶液，
所述包被原为林可霉素抗原、抗体或抗抗体，所述酶标记物为酶标记林可霉素抗原、酶标记林可霉素抗体或酶标记抗抗体，
当酶标板上包被抗原且酶标记物为酶标记抗抗体或酶标板上包被抗抗体且酶标记物为酶标记抗原时还含有林可霉素特异性抗体工作液。
2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述林可霉素抗原是由林可霉素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述林可霉素抗体是由所述抗原制备获得，其中所述林可霉素半抗原为林可霉素-琥珀酸酐。
3、如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述林可霉素抗体为单克隆抗体。
4、如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述林可霉素抗体由杂交瘤细胞株C-1-3CGMCC No.2398分泌产生。
5、如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述载体蛋白为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。
6、如权利要求书1或2所述的试剂盒，其特征在于所用包被缓冲液为pH值为6.7，0.05mol/L醋酸缓冲液，所用封闭液为含有5～10％山羊血清，10％酪蛋白的磷酸盐缓冲液。
7、如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，当标记酶为辣根过氧化物酶时，底物显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，底物显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1～2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液、终止液为1～2mol/L氢氧化钠。
8、如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：浓缩洗涤液为1.0％～1.5％吐温20和0.5％硫柳汞防腐剂的磷酸盐缓冲液；浓缩复溶液为含有5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，林可霉素标准品溶液的浓度分别为0μg/L，0.2μg/L，0.6μg/L，1.8μg/L，5.4μg/L，16.2μg/L。
9、权利要求1～8任一项所述的试剂盒在检测林可霉素药物残留中的应用。
10、一种检测样品林可霉素药物残留的方法，包括步骤：
(1)样品前处理；
(2)用权利要求1-8任一项所述的试剂盒进行检测；
(3)分析检测结果。
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