CN102721809A - 林可霉素检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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杨利
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林可霉素检测试剂盒及其制备方法，本发明涉及生物学免疫方法的测定技术领域。本发明的试剂盒由样品垫(1)、胶体金垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸样垫(4)和PVC支撑板(5)组成，在PVC支撑板上依次连续粘附有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸样垫。胶体金垫为胶体金标记的林可霉素单克隆抗体聚酯膜，硝酸纤维素膜上依次包被了林可霉素偶联载体蛋白作为检测线(T线)，羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线(C线)。本发明利用胶体金免疫层析技术，运用被测样品中可能含有的林可霉素与硝酸纤维素膜上包被的林可霉素偶联载体蛋白竞争结合胶体金标记的林可霉素单克隆抗体的原理检测样品中的林可霉素。

Description

林可霉素检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物学免疫方法的测定技术领域，特别是涉及一种利用胶体金免疫层析技术制作的一种林可霉素检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
林可霉素，英文名Lincomycin。作用于敏感菌核糖体的50S亚基，阻止脓链的延长，从而抑制细菌细胞的蛋白质合成。林可霉素一般系抑菌剂，但在高浓度下，对高度敏感细菌也具有杀菌作用。林可霉素除了在临床主要用于敏感菌引起的各种感染外，在动物饲养及动物疾病治疗中也广泛应用。虽然林可霉素的毒性不大，但动物长期服用，也会对人畜具有潜在的危害性，因此各国对食品中林可霉素的含量进行了限制，例如蜂王浆的主要进口国日本和欧盟对林可霉素药物残留限量(MRLs)一般以最低检测限(LOD)10μg/kg为标准。
目前，关于林可霉素残留的检测分析方法主要为液相色谱串联质谱法(LC/MS/MS)、气相色谱-质谱法(GC/MS)、高效液相色谱法(HPLC)、微生物杯碟法等方法。这些方法灵敏度高，结果准确，但是具有需要昂贵的仪器，检测繁琐、费时，检测人员需要一定的专业培训等缺点。
本发明采用胶体金免疫层析技术制备了一种林可霉素检测试剂盒。发明具有操作简单、检测快速、灵敏度高、无需复杂仪器等特点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单、快捷、灵敏度高、成本低的林可霉素检测试剂盒及其制备方法。
一种林可霉素检测试剂盒，包括样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫和PVC支撑板，在PVC支撑板上依次紧密粘附有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸样垫。所述样品垫为玻璃纤维；所述胶体金垫为胶体金标记的林可霉素单克隆抗体聚酯膜；所述硝酸纤维素膜上依次包被有检测线(T线)和质控线(C线)，其中检测线(T线)上包被了林可霉素偶联载体蛋白，质控线(C线)上包被了羊抗鼠IgG多克隆抗体；所述吸样垫为吸水纸。
偶联林可霉素的载体蛋白为牛血清白蛋白，或卵清白蛋白，或血蓝蛋白。
本发明采用纳米胶体金技术及抗原抗体特异性反应，应用免疫竞争抑制反应的原理制备而成，通过待检样本中可能含有的林可霉素与硝酸纤维素膜上检测线(T线)包被的林可霉素偶联载体蛋白竞争结合胶体金标记的林可霉素抗体的反应，使T线显现一条肉眼可见的红色条带，从而判定待检样本中是否含有林可霉素。
本发明提供了一种林可霉素检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备林可霉素偶联载体蛋白
将林可霉素与载体蛋白偶联，合成林可霉素偶联载体蛋白作为免疫原和包被原。
(2)制备林可霉素单克隆抗体
采用林可霉素偶联载体蛋白为免疫原免疫BALB/C小鼠，制备林可霉素单克隆抗体。
(3)制备胶体金
取0.01％的氯金酸水溶液，加热煮沸。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液1ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒的大小为20-40nm。
(4)制备胶体金垫
取颗粒大小为20-40nm的胶体金溶液，用0.2mol/L K2CO3将胶体金溶液的pH值调至7.0-9.0，室温放置30分钟；在上述溶液中加入林可霉素单克隆抗体，使林可霉素单克隆抗体的浓度为20-100μg/ml胶体金，混合均匀后，室温放置30分钟；取初始胶体金溶液体积5％的量的胶体金复溶液于上述溶液中，混合均匀，室温放置10分钟；上述溶液于12000转离心30分钟，仔细吸取上清液，弃去，剩余的沉淀用30-70％初始胶体金体积的胶体金复溶液溶解，得到林可霉素单克隆抗体-胶体金标记物；将林可霉素单克隆抗体-胶体金标记物按15-35μl/cm2的比例均匀的铺在聚酯膜上，放入45℃干燥箱干燥2.5-3小时，制成胶体金垫。
上述胶体金复溶液为含0.30％的Tris，5％蔗糖，0.50％g PVP，0.30％Casein-Na，pH值7.0-9.0的溶液。
(5)包被林可霉素偶联载体蛋白、羊抗鼠IgG多克隆抗体
将NC膜粘贴在PVC板上，吸水纸贴到PVC板上压住膜1-1.5mm。打开划膜仪，按清洗键清洗划膜仪，将贴好的PVC板放在划膜仪上，设置划膜仪参数为C线1.0μl/cm，T线1.0μl/cm；
将贴好的PVC板放在划膜仪上，用C、T线包被液在NC膜上分别划C、T线。划膜不合格的用红记号笔标出，将包被板置干燥箱设置45℃，干燥1-1.5小时。
其中，T线包被液为0.8-4.0mg/ml的林可霉素偶联载体蛋白；C线包被液为0.6-2.0mg/ml的羊抗鼠IgG多克隆抗体。
(6)样品垫的处理
将玻璃纤维浸泡于0.01M pH 7.0-8.0的磷酸盐缓冲溶液中20-40min，其中磷酸盐缓冲溶液中含0.5-1.5％BSA，0.5-1.0％Tweeen-20，于烘干箱中38℃烘干，保存，备用
(7)组装试剂盒
取上述制备好的胶体金垫、PVC板及样品垫，将胶体金垫切成宽度为10mm的条型，然后胶体金垫贴于PVC板上NC膜的靠近T线端，压NC膜1-1.5mm，样品垫贴于胶体金垫的上方，露出金垫2-3mm(如图1所示)。打开切条机，按产品要求设置裁切宽度，将上述组装好的PVC板放于切条机上，按设置宽度进行切条，得到所述用于检测林可霉素的试纸条；试纸条可以装入塑料卡内，组装成检测卡。
本发明所述试剂盒的检测方法为：将被检样品平衡至室温；取出林可霉素检测装置，水平放置；在样品垫中加入2-3滴样品，5-10分钟时观察并记录C、T线的显色情况，判断检测结果；或将林可霉素检测试纸条样品垫末端浸入被测样品溶液中约10秒钟后，水平放置；5-10分钟时观察并记录C、T线的显色情况，判断检测结果。
本发明所述的试剂盒采用胶体金免疫层析技术测定林可霉素，检测时，将被测样品加在试剂盒上的样品垫上，可以直接观察到免疫反应的结果，完成样品检测。本发明可用于检测样本中可能存在的林可霉素，具有使用方便、操作简单、反应迅速、经济实用等特点。
附图说明
图1林可霉素检测试剂盒结构示意图；
附图符号说明：
1：样品垫；
2：胶体金垫(胶体金标记林可霉素单克隆抗体的聚酯膜)
3：硝酸纤维素膜(T：包被了林可霉素偶联载体蛋白的检测线；C：包被了羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控线)；
4：吸样垫；
5：PVC支撑板；
图2本发明试剂盒的检测结果示意图。
自左至右依次为C线一条线阳性检测结果；T、C两条线阴性检测结果；无效。
实施例1：林可霉素检测试剂盒的制备
1.制备林可霉素偶联牛血清白蛋白
将林可霉素与牛血清白蛋白偶联，合成林可霉素偶联牛血清白蛋白做为免疫原和包被原。
2.制备林可霉素单克隆抗体
采用林可霉素偶联牛血清白蛋白为免疫原免疫BALB/C小鼠，制备林可霉素单克隆抗体。
3.制备胶体金
取0.01％的氯金酸水溶液，加热煮沸。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液1ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒的大小为20-40nm。
4.制备胶体金垫
取颗粒大小为20-40nm的胶体金溶液5ml，用0.2mol/L K2CO3将胶体金溶液的pH值调至8.0，室温放置30分钟；在上述溶液中加入50μl浓度为3.0mg/ml的林可霉素单克隆抗体，混合均匀后，室温放置30分钟；取250μl的胶体金复溶液于上述溶液中，混合均匀，室温放置10分钟；上述溶液于12000转离心30分钟，仔细吸取上清液，弃去，剩余的沉淀用2.5ml的胶体金复溶液溶解，得到林可霉素单克隆抗体-胶体金标记物；将林可霉素单克隆抗体-胶体金标记物按20μl/cm2的比例均匀的铺在聚酯膜上，放入45℃干燥箱干燥3小时，制成胶体金垫。
上述胶体金复溶液为含0.30％的Tris，5％蔗糖，0.50％PVP，0.30％Casein-Na，pH值8.0的溶液。
5.包被林可霉素偶联牛血清白蛋白、羊抗鼠IgG多克隆抗体
将NC膜粘贴在PVC板上，吸水纸贴到PVC板上压住膜1-1.5mm。打开划膜仪，按清洗键清洗划膜仪，设置划膜仪参数为C线1.0μl/cm，T线1.0μl/cm。
将贴好的PVC板放在划膜仪上，用C、T线包被液在NC膜上分别划C、T线。划膜不合格的用红记号笔标出，将包被板置干燥箱设置45℃，干燥1小时。
其中，T线包被液为2.0mg/ml的林可霉素偶联牛血清白蛋白；C线包被液为1.0mg/ml的羊抗鼠IgG多克隆抗体。
6.样品垫的处理
将玻璃纤维浸泡于0.01M pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液中20-40min，其中磷酸盐缓冲溶液中含1.0％BSA，0.5％Tweeen-20，于烘干箱中38℃烘干，保存，备用
7.组装试剂盒
取上述制备好的胶体金垫、PVC板及样品垫，将胶体金垫切成宽度为10mm的条型，然后胶体金垫贴于PVC板上NC膜的靠近T线端，压NC膜1-1.5mm，样品垫贴于胶体金垫的上方，露出金垫2-3mm(如图1所示)。打开切条机，设置裁切宽度为3.8mm，将上述组装好的PVC板放于切条机上，按设置宽度进行切条，得到所述用于检测林可霉素的试纸条；试纸条可以装入塑料卡内，组装成检测卡。
实施例2：林可霉素检测试剂盒的检测
1.样品的处理
血清：抽取血清，离心或静置后取透明上清液使用；
尿液：用尿液直接进行测试，若尿液呈可见的混浊状，需先离心、过滤或待其沉淀后取上清液检测；
牛奶：4℃、3000r/min离心15min，去除上层脂肪后检测。
蜂蜜、蛋：用0.01mol/L，pH 7.5的PBS制成1∶2的待测样品悬浮液，震荡10min，3000r/min离心15min，取上清液检测。
组织样品：取5-10g组织样品捣碎后，加入20-30ml(0.01mol/L，pH 7.5)PBS，震荡10min，37℃恒温箱中反应30min后，水浴10min，于4℃、3000r/min离心15min，去除上层脂肪，取上清液检测。
饲料：取0.5-2g磨碎的待测饲料，加入8-20ml(0.01mol/L，pH 7.5)PBS，37℃恒温箱中反应30min后，水浴10min，于4℃、3000r/min离心15min，取上清液检测。
2.检测方法：
取出林可霉素检测试剂盒，水平放置；在样品垫上滴入3滴样品，10分钟后观察并记录C、T线的显色情况，判断检测结果。
3.结果判定
阳性：T线不显色，仅C线显色，判定为阳性结果；
阴性：T线、C线均显色，判定为阴性结果；
无效：C线不显色，说明不正确操作或试剂盒已经变质损坏。
检测样品时，样品因毛细管作用向吸样垫一端层析。若被测样品中含有林可霉素，它们将和检测线(T线)上包被的林可霉素偶联牛血清白蛋白竞争结合胶体金标记的林可霉素单克隆抗体上有限的抗体结合位点，当样品中的林可霉素达到一定浓度时，与胶体金标记的林可霉素单克隆抗体发生免疫反应并完全饱和，此时胶体金复合物已无空余的位点和检测线上包被的林可霉素偶联牛血清白蛋白结合，此时T线不显色，此为阳性结果；若被测样品中不含林可霉素，标记了林可霉素单克隆抗体的胶体金颗粒将随同样品层析至T线位置后，与T线上包被的林可霉素偶联牛血清白蛋白发生免疫结合反应，胶体金颗粒在T线位置堆积使得T线呈现出一条肉眼可见的红色条带，此为阴性结果。无论被测样品中是否含有林可霉素，胶体金标记物均会与C线包被的羊抗鼠IgG反应形成一条肉眼可见的红色条带，C线显色与否，是判定是否有足够样本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。

Claims (6)

1.一种林可霉素检测试剂盒及其制备方法，其特征在于由样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫和PVC支撑板组成，在PVC支撑板上依次紧密粘附有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸样垫。所述样品垫为玻璃纤维；所述胶体金垫为胶体金标记的林可霉素单克隆抗体聚酯膜；所述硝酸纤维素膜上依次包被有检测线(T线)和质控线(C线)，其中检测线(T线)上包被了林可霉素偶联载体蛋白，质控线(C线)上包被了羊抗鼠IgG多克隆抗体；所述吸样垫为吸水纸。
2.一种权利要求1所述的林可霉素检测试剂盒及其制备方法，其特征在于所述的林可霉素偶联载体蛋白为林可霉素偶联牛血清白蛋白，或卵清白蛋白，或血蓝蛋白；所述的林可霉素单克隆抗体由林可霉素偶联载体蛋白作为免疫原免疫BALB/C小鼠获得。
3.一种权利要求1所述的林可霉素检测试剂盒及其制备方法，其特征在于所述的胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂枸橼酸三钠作用下制成大小为20-40nm的胶体金颗粒。
4.一种权利要求1所述的林可霉素检测试剂盒及其制备方法，其特征在于所述的胶体金垫的制备方法为：取颗粒大小为20-40nm的胶体金溶液，用0.2mol/L K2CO3将胶体金溶液的pH值调至7.0-9.0，室温放置30分钟；在上述溶液中加入林可霉素单克隆抗体，使林可霉素单克隆抗体的浓度为20-100μg/ml胶体金，混合均匀后，室温放置30分钟；取初始胶体金溶液体积5％的量的胶体金复溶液于上述溶液中，混合均匀，室温放置10分钟；上述溶液于12000转离心30分钟，仔细吸取上清液，弃去，剩余的沉淀用30-70％初始胶体金体积的胶体金复溶液溶解，得到林可霉素单克隆抗体-胶体金标记物；将林可霉素单克隆抗体-胶体金标记物按15-35μl/cm2的比例均匀的铺在聚酯膜上，放入45℃干燥箱干燥2.5-3小时，制成胶体金垫。
5.一种权利要求1所述的林可霉素检测试剂盒及其制备方法，其特征在于所述的胶体金复溶液为含0.30％的Tris，5％蔗糖，0.50％PVP，0.30％Casein-Na，pH值7.0-9.0的溶液。
6.一种权利要求1所述的林可霉素检测试剂盒及其制备方法，其特征在于所述的硝酸纤维素膜上T、C线的包被方法为：将NC膜粘贴在PVC板上，吸水纸贴到PVC板上压住膜1-1.5mm。打开划膜仪，按清洗键清洗划膜仪，设置划膜仪参数为C线1.0μl/cm，T线1.0μl/cm；将贴好的PVC板放在划膜仪上，用C、T线包被液在NC膜上分别划C、T线。划膜不合格的用红记号笔标出，将包被板置干燥箱设置45℃，干燥1-1.5小时。其中，T线包被液为0.8-4.0mg/ml的林可霉素偶联载体蛋白；C线包被液为0.6-2.0mg/ml的羊抗鼠IgG多克隆抗体。
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