CN102901819A

CN102901819A - 苯乙醇胺a的免疫胶体金检测卡及其制备方法

Info

Publication number: CN102901819A
Application number: CN2012103667893A
Authority: CN
Inventors: 杜道林; 洪霞; 张祯; 薛永来
Original assignee: Jiangsu Wise Science and Technology Development Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Wise Science and Technology Development Co Ltd
Priority date: 2012-09-27
Filing date: 2012-09-27
Publication date: 2013-01-30

Abstract

本发明苯乙醇胺A的免疫胶体金检测卡及其制备方法，涉及β-肾上腺素受体激动剂检测技术领域。本发明的检测卡外壳中的试纸条，由PVC胶板、样品垫、胶体金结合垫、包被膜和吸水垫组成；胶体金膜为含苯乙醇胺A单克隆抗体的玻璃纤维素膜，包被膜是硝酸纤维素膜，其上设有T线和C线，T线包被有苯乙醇胺A蛋白质偶联物，C线包被有羊抗鼠IgG抗体。本发明有效用于快速检测苯乙醇胺A，方便、快捷、结果准确。

Description

苯乙醇胺A的免疫胶体金检测卡及其制备方法

技术领域

本发明涉及β-肾上腺素受体激动剂检测技术领域，特别是涉及苯乙醇胺A的免疫胶体金检测卡及其制备方法。

背景技术

近年来，接连不断的瘦肉精事件已成为中国食品安全领域挥之不去的幽灵。去年，湖南省成功破获一起涉及福建、湖南、浙江三省的瘦肉精生产、销售案件，并从饲料中检测出以前从未出现过的苯乙醇胺A，这种瘦肉精新品种的出现，再次敲响了我国食品安全警钟。

苯乙醇胺A，又称“克伦巴胺”，可被非法添加于猪和牛的饲料中，有刺激动物生长，加强蛋白质在动物体内沉积，提高基础代谢水平，使体脂趋于分解等作用，也可促进猪生长速度加快、使其皮红毛亮、瘦肉率提高。人食用含这种瘦肉精的肉后，会出现恶心、头晕、四肢无力、手颤等中毒症状，甚至诱发高血压、心脏病等。因此，近期被农业部第1519号公告列为“禁止在饲料和动物饮水中使用的物质”。

现有技术对于苯乙醇胺A的检测主要是高效液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱法等检测方法，但这些技术的缺陷明显：设备昂贵、操作复杂、难以推广。所以，建立一种简单、有效、适合基层使用的测定方法是极其必要的。本发明的目的是研制一种更适合企业进行现场检测且快捷简便、成本低廉的定性检测方法。

发明内容

针对以上情况，本发明的目的就是为了克服现有技术存在的缺陷而提供一种苯乙醇胺A的免疫胶体金检测卡及其制备方法，可有效解决能快速、简便地检测出β-肾上腺素受体激动剂苯乙醇胺A的问题。

本发明的苯乙醇胺A胶体金检测卡，包括包被了单克隆抗体胶体金标记物的胶体金结合垫、包被了苯乙醇胺A-BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、样品垫、吸水垫、PVC胶板和塑料模具组成，在PVC胶板的一端依次粘附样品垫、结合垫，中间黏贴硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫。

本发明的苯乙醇胺A胶体金检测卡的制备方法，是由以下步骤实现：

(1)胶体金溶液制备：取1 L 三角烧瓶1个，加入超纯水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl₄·3H₂O) 5 mL，配制成500 mL 0.01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)溶液5-7 mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5 min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃保存备用；

(2)抗体的预处理：将要标记的苯乙醇胺A抗体在1000 r/min, 4℃条件下，离心20 min，取上清，用0.01 mol/L PBS稀释成1 mg/mL；或者用0.01 mol/L PBS稀释成1 mg/mL，过0.22 μm滤膜；

(3)胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液40 mL，用0.25 mol/L K₂CO₃调节胶体金溶液pH至 8.5，电磁搅拌器250 r/min搅拌，逐滴加入4 mL 含0.3 mg 抗体蛋白的蛋白溶液，反应10 min；逐滴加入4 mL 10% BSA，继续搅拌反应10 min；金标抗体溶液常温低速（1500 r/min）离心10 min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000 r/min 离心20 min，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1 mL，制备成苯乙醇胺A单克隆抗体胶体金标记物；

(4)胶体金膜的制备：将步骤(3)苯乙醇胺A单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5 μL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37℃烘干3 h，制成含苯乙醇胺A单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；

(5)包被膜制备：将羊抗鼠IgG抗体、苯乙醇胺A蛋白质偶联物稀释成1 mg/mL，用划膜仪依次以1 μL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37℃包被2 h后，室温自然晾干或者37℃烘干；

(6)样品垫前处理：将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；

(7)检测卡的组装：PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水垫，组装成试纸条，切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。

所述步骤(5)中所包被的检测线T设在质控线C的下方；

所述步骤(6)中的样品垫处理液是由1 g小牛血清蛋白(BSA)和0.8 g氯化钠(NaCl)，用含有0.5%TRITON-100的0.01 mol/L PBS定容至100 mL；

本发明可有效用于测定β-肾上腺素受体激动剂苯乙醇胺A，方法简单，方便、快捷，结果准确。

附图说明

图1为本发明苯乙醇胺A的免疫胶体金检测卡的结构图：图中1.加样孔 2.检测线 3.质控线 4.检测孔 5.试纸条 6.检测卡外壳；

图2为本发明苯乙醇胺A的免疫胶体金检测卡内的试纸条的剖视结构图，图中7.样品垫 8.胶体金结合垫 9.PVC胶板 10.硝酸纤维素膜 11.吸水垫。

具体实施方式

实施例1

图1为本发明苯乙醇胺A的免疫胶体金检测卡的结构图、图2为本发明苯乙醇胺A的免疫胶体金检测卡内的试纸条的剖视结构图：图中9为PVC胶板；7为样品垫；8为胶体金结合垫，该胶体金结合垫上包被了单克隆抗体胶体金标记物；10为包被膜，即硝酸纤维素膜，该硝酸纤维素膜上包被了苯乙醇胺A-BSA和羊抗鼠IgG；11为吸水垫，由吸水材料如滤纸制成。

在PVC胶板9的一端上(样品端)粘附样品垫7、胶体金结合垫8，样品垫7和胶体金结合垫8为并排结构。

在PVC胶板9的中间粘附硝酸纤维素膜10。在硝酸纤维素膜10上设置有羊抗鼠IgG质控线3和苯乙醇胺A-BSA检测线2。

在PVC胶板9的另一端粘附吸水垫11。硝酸纤维素膜10的一端与结合垫8略交叉，另一端与吸水垫11略交叉。该试纸条5可装入有塑料模具制成的检测卡外壳6中，在检测卡外壳6的上盖上设有加样孔1和检测孔4，样品垫7正对加样孔1，硝酸纤维素膜10正对检测孔4。

实施例2

苯乙醇胺A胶体金检测卡制备，是由以下步骤具体实现：

(3)胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液40 mL，用0.25 mol/L K₂CO₃调节胶体金溶液pH至 8.5，电磁搅拌器250 r/min搅拌，逐滴加入4 mL 含0.3 mg 抗体蛋白的蛋白溶液，反应10 min；逐滴加入4 mL 10% BSA，继续搅拌反应10 min；金标抗体溶液常温低速(1500 r/min)离心10 min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000 r/min 离心20 min，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1 mL，制备成苯乙醇胺A单克隆抗体胶体金标记物；

(7)检测卡的组装：PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组装成试纸条，切割成一定宽度长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。

实施例3

最低检出限量试验

苯乙醇胺A最低检出限量试验

准确称量0.500 g苯乙醇胺A标准品溶于超纯水并定容至100 mL，标为A₁溶液，取A₁溶液1 mL于容量瓶加超纯水并定容至1000 mL，形成A₂溶液，取A₂溶液1 mL于容量瓶加超纯水并定容至1000 mL，形成A₃溶液，则A3溶液的浓度为5 ng/mL(5ppb)。取A₃溶液1 mL于4支试管中，并分别标号1~4，往试管中分别加入往9 mL、4 mL、1 mL、0 mL超纯水，配成苯乙醇胺A标准品溶液浓度分别是：0.5 ng/mL、1 ng/mL、2.5 ng/mL、5 ng/mL；另取一支空试管，加入5 mL超纯水，标为5号试管。取上述1~5号试管中液体作为样品滴加到苯乙醇胺A检测卡上，加样后5 min观察结果，检测线2和质控线3的显色结果见表1。

表1 苯乙醇胺A最低检出限量试验

经多次检验，苯乙醇胺A的检出率达99%，最低检出限量为5 ng/mL。

Claims

1.苯乙醇胺A胶体金检测卡，其特征在于按照下述步骤制备得到：

胶体金溶液制备：取1 L 三角烧瓶1个，加入超纯水495 mL，而后加入1%氯金酸HAuCl₄·3H₂O 5 mL，配制成500 mL 0.01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠Na₃C₆H₅O₇·2H₂O溶液5-7 mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5 min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃保存备用；

抗体的预处理：将要标记的苯乙醇胺A抗体在1000 r/min, 4℃条件下，离心20 min，取上清，用0.01 mol/L PBS稀释成1 mg/mL；或者用0.01 mol/L PBS稀释成1 mg/mL，过0.22 μm滤膜；

胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液40 mL，用0.25 mol/L K₂CO₃调节胶体金溶液pH至 8.5，电磁搅拌器250 r/min搅拌，逐滴加入4 mL 含0.3 mg 抗体蛋白的蛋白溶液，反应10 min；逐滴加入4 mL 10% BSA，继续搅拌反应10 min；金标抗体溶液常温1500 r/min离心10 min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000 r/min 离心20 min，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1 mL，制备成苯乙醇胺A单克隆抗体胶体金标记物；

胶体金膜的制备：将步骤(3)苯乙醇胺A单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5 μL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37℃烘干3 h，制成含苯乙醇胺A单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；

包被膜制备：将羊抗鼠IgG抗体、苯乙醇胺A蛋白质偶联物稀释成1 mg/mL，用划膜仪依次以1 μL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37℃包被2 h后，室温自然晾干或者37℃烘干；

样品垫前处理：将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；

检测卡的组装：PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水垫，组装成试纸条，切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。

2.根据权利要求1所述的苯乙醇胺A胶体金检测卡，其特征在于所述步骤(5)中所包被的检测线T设在质控线C的下方；

所述步骤(6)中的样品垫处理液是由1 g小牛血清蛋白和0.8 g氯化钠，用含有0.5%TRITON-100的0.01 mol/L PBS定容至100 mL。