CN105572392A - 除草剂草甘磷的免疫胶体金检测卡及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明草甘磷的免疫胶体金检测卡及其制备方法，涉及动物源食品兽药残留检测技术领域。本发明的检测卡外壳中的试纸条，由PVC胶板、样品垫、胶体金结合垫、包被膜和吸水垫组成；胶体金膜为含草甘磷单克隆抗体的玻璃纤维素膜，包被膜是硝酸纤维素膜，其上设有T线和C线，T线包被有草甘磷蛋白质偶联物，C线包被有羊抗鼠IgG抗体。本发明有效用于快速检测草甘磷，方便、快捷、结果准确。
Description
技术领域
本发明涉及环境激素检测技术领域，特别是涉及草甘磷的免疫胶体金检测卡及其制备方法。
背景技术
随着农业科技的不断发展,我国很多制药厂能生产出高效、广谱、低毒的除草剂，草甘膦便是其中的1种。草甘膦为内吸传导型广谱灭生性草甘膦,主要通过抑制植物体内烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶，从而抑制莽草素向苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的转化，使蛋白质的合成受到干扰导致植物死亡。
草甘膦以内吸传导性强而著称,不仅能通过茎叶传导到地下部分，而且在同一植株的不同分蘖间也能进行传导，对多年生深根杂草的地下组织破坏力很强，能达到一般农业机械无法达到的深度。因此，能除去田间400多种杂草，为农村的每个家庭节省了很多劳动力,为我国的农业生产作出了很大贡献。但在我国农业生产发展中，由于只研究了草甘膦的除草作用，却没有研究中毒后的解救方法，所以草甘膦也给我国的畜牧业发展和人类带来一定的危害。
目前，环境激素污染物的分析方法主要分为以GC-MS、HPLC与LC-MS技术为代表的仪器分析方法以及基于抗原抗体反应的免疫分析技术，这些常规的残留分析技术通常操作程序复杂，效率较低，分析成本较高，不利于推广使用，难以适应大量样本和现场检测的要求。基于环境激素污染物的危害性、代表性及目前的研究热点，本发明涉及一种除草剂草甘磷检测卡及其制备方法。本发明的检测卡具有简便快捷、易于操作、成本低廉等优点，并且能同时检测水样中这二种环境激素污染物质，产生了良好的社会效益和经济效益。
发明内容
本发明的草甘磷胶体金检测卡，包括包被了单克隆抗体胶体金标记物的胶体金结合垫、包被了草甘磷-BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、样品垫、吸水垫、PVC胶板和塑料模具组成，在PVC胶板的一端依次粘附样品垫、结合垫，中间黏贴硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫。
本发明的草甘磷胶体金检测卡的制备方法，是由以下步骤实现：
(1)胶体金溶液制备：取1L三角烧瓶1个，加入超纯水495mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4·3H2O)5mL，配制成500mL0.01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)溶液5-7mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃保存备用；
(2)抗体的预处理：将要标记的草甘磷抗体在1000r/min,4℃条件下，离心20min，取上清，用0.01mol/LPBS稀释成1mg/mL；或者用0.01mol/LPBS稀释成1mg/ml，过0.22μm滤膜；
(3)胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液40mL，用0.25mol/LK2CO3调节胶体金溶液pH至8.5，电磁搅拌器250r/min搅拌，逐滴加入4mL含0.3mg抗体蛋白的蛋白溶液，反应10min；逐滴加入4mL10%BSA，继续搅拌反应10min；金标抗体溶液常温低速（1500r/min）离心10min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000r/min离心20min，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1mL，制备成草甘磷单克隆抗体胶体金标记物；
(4)胶体金膜的制备：将步骤(3)草甘磷蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5μL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37℃烘干3h，制成含草甘磷蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；
(5)包被膜制备：将羊抗鼠IgG抗体、草甘磷蛋白质偶联物稀释成1mg/mL，用划膜仪依次以1μL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37℃包被2h后，室温自然晾干或者37℃烘干；
(6)样品垫前处理：将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；
(7)检测卡的组装：PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组装成试纸条，切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。
所述步骤(5)中所包被的检测线T设在质控线C的下方；
所述步骤(6)中的样品垫处理液是由1g小牛血清蛋白(BSA)和0.8g氯化钠(NaCl)，用含有0.5%TRITON-100的0.01mol/LPBS定容至100mL；
本发明可有效用于测定草甘磷，方法简单，方便、快捷，结果准确。
附图说明
图1为本发明草甘磷的免疫胶体金检测卡的结构图：图中1.加样孔2.检测线3.质控线4.检测孔5.试纸条6.检测卡外壳。
图2为本发明草甘磷的免疫胶体金检测卡内的试纸条的剖视结构图，图中7.样品垫8.胶体金结合垫9.PVC胶板10.硝酸纤维素膜11.吸水垫。
具体实施方式
实施例1
图1、图2所示的实施例：图中9为PVC胶板；7为样品垫；8为胶体金结合垫，该胶体金结合垫上包被了单克隆抗体胶体金标记物；10为包被膜，即硝酸纤维素膜，该硝酸纤维素膜上包被了草甘磷-BSA和羊抗鼠IgG；11为吸水垫，由吸水材料如滤纸制成。
在PVC胶板9的一端上(样品端)粘附样品垫7、结合垫8，样品垫7和结合垫8为并排结构。
在PVC胶板9的中间粘附硝酸纤维素膜10。在硝酸纤维素膜10上设置有羊抗鼠IgG质控线3和草甘磷-BSA检测线2。
在PVC胶板9的另一端粘附吸水垫11。硝酸纤维素膜10的一端与结合垫8略交叉，另一端与吸水垫11略交叉。该试纸条5可装入有塑料模具制成的检测卡外壳6中，制成检测卡，在检测卡外壳6的上盖上设有加样孔1和检测孔4，样品垫7正对加样孔1，硝酸纤维素膜10正对检测孔4。
实施例2
草甘磷胶体金检测卡制备，是由以下步骤具体实现：
胶体金溶液制备：取1L三角烧瓶1个，加入超纯水495mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4·3H2O)5mL，配制成500mL0.01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)溶液5-7mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃保存备用；
抗体的预处理：将要标记的草甘磷抗体在1000r/min,4℃条件下，离心20min，取上清，用0.01mol/LPBS稀释成1mg/mL；或者用0.01mol/LPBS稀释成1mg/ml，过0.22μm滤膜；
胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液40mL，用0.25mol/LK2CO3调节胶体金溶液pH至8.5，电磁搅拌器250r/min搅拌，逐滴加入4mL含0.3mg抗体蛋白的蛋白溶液，反应10min；逐滴加入4mL10%BSA，继续搅拌反应10min；金标抗体溶液常温低速（1500r/min）离心10min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000r/min离心20min，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1mL，制备成草甘磷单克隆抗体胶体金标记物；
胶体金膜的制备：将步骤(3)草甘磷蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5μL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37℃烘干3h，制成含草甘磷蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；
包被膜制备：将羊抗鼠IgG抗体、草甘磷蛋白质偶联物稀释成1mg/mL，用划膜仪依次以1μL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37℃包被2h后，室温自然晾干或者37℃烘干；
样品垫前处理：将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；
检测卡的组装：PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组装成试纸条，切割成一定宽度长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。
Claims (2)
1.草甘磷胶体金检测卡，其特征在于按照下述步骤制备得到：
(1)胶体金溶液制备：取1L三角烧瓶1个，加入超纯水495mL，而后加入1%氯金酸HAuCl4·3H2O)5mL，配制成500mL0.01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠Na3C6H5O7·2H2O溶液5-7mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃保存备用；
(2)抗体的预处理：将要标记的草甘磷抗体在1000r/min，4℃条件下，离心20min，取上清，用0.01mol/LPBS稀释成1mg/mL；或者用0.01mol/LPBS稀释成1mg/ml，过0.22μm滤膜；
(3)胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液40mL，用0.25mol/LK2CO3调节胶体金溶液pH至8.5，电磁搅拌器250r/min搅拌，逐滴加入4mL含0.3mg抗体蛋白的蛋白溶液，反应10min；逐滴加入4mL10%BSA，继续搅拌反应10min；金标抗体溶液常温1500r/min离心10min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000r/min离心20min，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1mL，制备成草甘磷单克隆抗体胶体金标记物；
(4)胶体金膜的制备：将步骤(3)草甘磷蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5μL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37℃烘干3h，制成含草甘磷蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；
(5)包被膜制备：将羊抗鼠IgG抗体、草甘磷蛋白质偶联物稀释成1mg/mL，用划膜仪依次以1μL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37℃包被2h后，室温自然晾干或者37℃烘干；
(6)样品垫前处理：将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；
(7)检测卡的组装：PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组装成试纸条，切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。
2.根据权利要求1所述的草甘磷胶体金检测卡，其特征在于所述步骤(5)中所包被的检测线T设在质控线C的下方；
所述步骤(6)中的样品垫处理液是由1g小牛血清蛋白(BSA)和0.8g氯化钠(NaCl)，用含有0.5%TRITON-100的0.01mol/LPBS定容至100mL。
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