CN102507564B - 快速检测燕窝中亚硝酸盐的试剂盒及其在燕窝检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明的快速检测燕窝中亚硝酸盐的试剂盒，包括盒体和试剂，其中：盒体内置海绵支架，海绵支架上有孔和凹槽，装有Griess溶液A即检测液A的棕色试剂瓶、装有Griess溶液B即检测液B的棕色试剂瓶、装有蛋白质沉淀剂即检测液C的棕色试剂瓶安插在海绵支架的孔中，玻璃样品杯、滴管、透明玻璃比色管、透明玻璃亚硝酸盐富集柱放于海绵支架的凹槽中，用黑色塑料袋封好的比色卡置于盒体中。该试剂盒可以应用于检测食品特别是燕窝中亚硝酸盐含量。本发明所述试剂盒及其用于燕窝检测时具有取样少、检测限低、检测范围宽、样品前处理简单等特点。
Description
技术领域
本发明涉及亚硝酸盐的检测，特别是食品中亚硝酸盐的检测，具体是快速检测燕窝中亚硝酸盐的试剂盒及其在燕窝检测中的应用。
背景技术
亚硝酸盐，是一类无机化合物的总称。主要指亚硝酸钠(英文名Sodium nitrite, CAS号：7632-00-0, 分子式：NaNO2)。亚硝酸钠为白色至淡黄色粉末或颗粒状，味微咸，易溶于水。外观及滋味都与食盐相似，在工业、建筑业中使用广泛。
亚硝酸盐能够使肉与肉制品呈现良好的色泽,并具有防腐保鲜作用。在我国肉制品加工生产中经常被大量使用。由于价格低廉，许多燕窝产品、不少蔬菜腌制品和瓜子炒货产品都非法使用亚硝酸盐，导致亚硝酸盐严重超标。
亚硝酸盐可与食物或胃中的仲胺类物质反应生成亚硝胺，而亚硝胺是国际确认对人体的食管癌、鼻咽癌、胃癌、膀胱癌发病密切相关。此外，该类物质还可通过胎盘可致使胎儿畸形及中毒死亡。亚硝酸盐的人中毒剂量为0.3-0.5g，致死量为3g。
世界各国对亚硝酸盐的使用范围和使用量都有明确严格的规定。我国对食品中的亚硝酸盐含量也有明确的限量规定，其中蔬菜4mg/kg、酱腌菜20mg/kg、肉制品最高30mg/kg，其他食品均小于10mg/kg ，而燕窝的限量规定是30 mg/kg。
燕窝为雨燕科动物金丝燕及多种同属燕类用唾液与绒羽等混合凝结所筑成的巢窝，形似元宝，窝外壁由横条密集的丝状物堆垒成不规则棱状突起，窝内壁由丝状物织成不规则网状，窝碗根却坚实，两端有小坠角，一般直径6-7厘米，深3-4厘米。主要产于我国南海诸岛及东南亚各国。燕窝因采集时间不同可分为三种。
1. 白燕：金丝燕为产卵育雏做的第一个窝，完全用唾液组成。雪白透明，个大壁厚，涨发率高，为燕窝上品，古代曾列为贡品，故又称宫燕。
2. 毛燕：金丝燕做的第二个窝，由于唾液已消耗较多，金丝燕只好用身上的绒毛和唾液筑窝。窝壁里夹杂着较多的黑毛，品质较次。
3. 血燕：金丝燕做的第三个窝，此时唾液几乎耗尽，只好用刚吃进去的，未及消化的小鱼、海藻做窝。窝中杂着血丝，个小壁薄，毛多，质地最差。
燕窝的营养较高，其主要成分是人体必需的多种高级蛋白质，含氮物质、膳食纤维、矿物质，维生素及独特的表皮生长因子，具很好的滋补养生作用。 燕窝营养分析：燕窝含促进细胞分裂的激素和表皮生长因子，能促进细胞再生，增强免疫能力，增加身体对X光及其他放射线损害的抵御能力，燕窝独特的蛋白质成分和大量生物活性分子有助人体组织生长发育，病后复原，可以养阴，润燥、养颜、延缓衰老，并且清虚热，治虚损，对咯血吐血、久咳痰喘，阴虚发热等导致津液脱失的病症有良好效果。燕窝以碗大壁厚，根脚小，羽毛少，棱条粗状，色泽白而有泽为上品。
作为中国人的传统保健品，燕窝（尤其是血燕）价格高昂，然而，却潜伏着重大安全隐患。如浙江省工商局2011年8月15日召开的新闻发布会宣布，抽检发现，燕窝市场中血燕的亚硝酸盐含量严重超标，问题血燕产品多达3万多盏，含量最高达11000毫克/千克。据悉，这些血燕产品主要进口自马来西亚等国家。广东检验检疫局“燕窝及其制品的真假鉴别方法研究”项目课题组近年来也从一些所谓“血燕”、“黄燕”等染色燕窝中检出高浓度的亚硝酸盐，有的含量甚至达到几千毫克/公斤。而香港科大抽查市面47款燕窝样本，发现全部含防腐剂亚硝酸盐，最严重的一个血燕样本每公斤含6400毫克亚硝酸盐，较香港肉食亚硝酸盐含量标准高出31倍。由此可见燕窝行业“亚硝酸盐”含量超标问题的严重性。
目前我国燕窝产品质量标准仍为空白，燕窝产品中亚硝酸盐含量标准也为空白。国际上一般参照燕窝主产国之一马来西亚标准（马来西亚食用燕窝（EBN）标准指南MS 2334:2010），其限量标准为：亚硝酸盐最高30mg/kg。
目前，检测燕窝制品中亚硝酸盐的方法主要有：高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC-MS）、离子色谱法（IC）、毛细管电泳法（CE）、分光光度法（spectrophotometry）等。如安徽亳州市产品质量监督检验所黄艳梅等成功采用碳酸根体系等度淋洗，利用离子色谱阴离子分析柱对燕窝中亚硝酸盐进行分离测定，以保留时间定性，标准曲线峰面积定量，22分钟同时完成8种阴离子的测定，取得较好的效果。作者还进行比对试验，结果表明离子色谱法与分光光度法测定结果基本一致。浙江省台州市食品药品检验所的李兆奎等应用紫外分光光度法,以亚硝酸钠为标准溶液的标准曲线法测定燕窝样品中亚硝酸盐的含量,检测波长为538nm。结果:亚硝酸盐的线性范围为0～10.0μg，回归方程Y=0.0636x+0.0032，r=0.9993,平均加样回收率97.7%，RSD=2.0%(n=5)。
HPLC法、GC-MS法、离子色谱法（IC）及CE法等方法检测燕窝制品中亚硝酸盐，优点是检测精确度高，但缺点是检测时间长，操作复杂，需配置较贵重仪器，甚至还需配备各种型号的昂贵色谱柱，对操作人员也有一定要求，一些仪器还需专人及特定环境维护，检测成本昂贵。而分光光度法同样需要配置专门仪器及具有一定经验的操作人员，因而不容易推广。目前，国际上日益重视应用格里斯（Griess）比色法来检测食品中亚硝酸盐含量: 该方法亚硝酸盐方法检出限为1 mg/kg， 样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸性条件下，亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后，再与N－1萘基乙二胺偶合形成红色染料，即测得亚硝酸盐含量。国内外学者应用该方法做了大量尝试，渤海大学生物与食品科学学院、锦州市产品质量监督检验所刘岩等开展了香肠类肉制品中亚硝酸盐的快速检测法，该快速检测法的检测结果与常规法相比，虽然存在误差，但对香肠类肉制品中亚硝酸盐含量的定性和半定量分析的结果是令人满意的。韩山师范学院的郑晓宏等通过实验确定了微孔板式亚硝酸盐试剂盒中显色剂的混合比例(对氨基苯磺酸：盐酸萘乙二胺=1：1)及用量(0.06mL，相对于微孔板的体积)。研制出一种利用微孔板快速检测多个样品中亚硝酸盐含量的新仪器，具有使用试剂量少，污染小，检出限低，灵敏度较高，操作简单，方便携带等优点，可用于火腿中亚硝酸盐的测定。
广州康利有限公司等单位则推出了水质亚硝酸盐测定试剂盒，可测定矿泉水、地表水、地下水、生活污水、工业废水、食品等样品中亚硝酸盐含量。北京六角体科技发展有限公司则开展了牛奶中亚硝酸盐快速检测试剂盒的商用开发，英国的Aquarium公司及美国的Gatwick Koi公司等也相继推出了水池水样中或腌制品中亚硝酸盐含量测试试剂盒产品。
但燕窝组成与其它普通食品或水样有显著差异，燕窝中除蛋白质外，还有含氮物质、膳食纤维及矿物质等组分，样品前处理及检测步骤相对特殊，不可能照搬水样、牛奶或火腿中亚硝酸盐检测方法及试剂盒，而且由于燕窝较其它食品价格相对昂贵的多，因而取样应尽可能少，本试剂盒采用大孔树脂富集亚硝酸盐组成，尽可能减小燕窝样品的消耗，并提高测定准确度。
但目前尚未见专门快速检测燕窝中亚硝酸盐含量的试剂盒产品，相关检测技术仍很薄弱。国内针对燕窝中亚硝酸盐的快速检测方法及试剂盒产品更是空白。而燕窝作为我国的传统保健品，每年需求量很大，其中潜伏的亚硝酸盐危害也很大。因此，研制专门针对燕窝制品中亚硝酸盐含量的快速检测方法具有重要的经济和社会意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测燕窝中亚硝酸盐的试剂盒。
本发明的快速检测燕窝中亚硝酸盐的试剂盒，包括盒体和试剂，其中：盒体内置海绵支架，海绵支架上有孔和凹槽，装有Griess溶液A即检测液A的棕色试剂瓶、装有Griess溶液B即检测液B的棕色试剂瓶、装有蛋白质沉淀剂即检测液C的棕色试剂瓶安插在海绵支架的孔中，玻璃样品杯、滴管、透明玻璃比色管、透明玻璃亚硝酸盐富集柱放于海绵支架的凹槽中，用黑色塑料袋封好的比色卡置于盒体中。
所述的检测液A是对氨基苯磺酸的水和冰乙酸溶液，检测液B 是N-1-萘基乙二胺溶液乙酸溶液，检测液C是硫酸钠饱和溶液和饱和硼砂溶液的混合液，检测液A、检测液B和检测液C均置棕色试剂瓶中。
本发明优选检测液A是按照4 g 对氨基苯磺酸溶于700 mL水和300 mL冰乙酸中的比例配制而成；检测液B是按照0.1 g N-1-萘基乙二胺加100 mL 60%乙酸的比例溶解而成；检测液C是按照硫酸钠饱和溶液：和硼砂饱和溶液=32：68 ml/ ml混合而成。将检测液A与检测液B等体积混合，即可制备得到Griess试剂。
本发明中，透明玻璃亚硝酸盐富集柱底部安置砂芯滤板，柱中的填料选自国产D201大孔树脂、美国Amberlite IRA-900树脂或德国Lewatit MP-500树脂，填料充填量为2.0-3.0克，
本发明提供的比色卡上建立由浅至深的色标，并标注对应的亚硝酸钠含量依次为0.1、0.25、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0、15.0、17.0、20.0、21.0、23.0、25.0、27.0、30.0、 50.0、100.0、200.0、380.0 mg/kg。
比色卡的制备方法，包括下述过程：预先配置不同浓度的亚硝酸钠标准溶液，各吸取上述溶液依次滴加在白色卡片纸上，分别滴加对氨基苯磺酸和N-1-萘基乙二胺溶液，使其反应并呈现深浅不同的颜色，标注各颜色对应的亚硝酸盐浓度后，将此卡片塑封，即为比色卡；或者对此卡片拍照印制再过塑成为比色卡。
在实际应用上，本发明的试剂盒的盒体可选用ABS、PVC、PE、PP等材质，滴管选用玻璃材质，也可以用一次性塑料滴管替代，
本发明的另一目的是提供快速检测燕窝中亚硝酸盐的试剂盒在燕窝检测中的应用。
该试剂盒，可以应用于检测食品中亚硝酸盐含量。
该试剂盒在燕窝检测中的应用的步骤如下：
（1）、将燕窝样品捣碎研磨，随后称取0.1-0.2克于玻璃样品杯中，加入5-7毫升蒸馏水或纯净水，加入1.0-2 ml检测液C，搅拌均匀，静置10-15分钟，取上清液；
（2）、用滴管取2-3 ml上清液至透明玻璃比色管，用滴管滴加等体积的检测液A和检测液B各3-4滴，得混合溶液；
（3）、往透明玻璃亚硝酸盐富集柱中滴入2-3 ml蒸馏水或纯净水，再将步骤（2）中的混合溶液倒入该玻璃富集柱中，10-15分钟后，将该玻璃富集柱中的液体放入到玻璃样品比色管中，对着自然光观察，并与比色卡上的颜色比较；
（4）、如果玻璃样品比色管中的颜色与比色卡某一色标一致，则表明该燕窝样品的亚硝酸盐含量与对应该色标所标示的亚硝酸盐含量一致；如果比比色卡上某一色标深，但比邻近的某一色标浅，则该燕窝样品亚硝酸含量在这两个色标对应的亚硝酸盐含量之间。
在实际检测中，需要注意如下事项：
1、燕窝样品取样量尽量准确；
2、取样时，应取燕窝样品中有代表性的部分；
3、对检测超标的样品应重复检测一次再确定；
3、一般以填充2.0-3.5克大孔树脂为宜，大孔树脂可活化后循环使用；
4、根据马来西亚食用燕窝（EBN）标准指南MS 2334:2010），燕窝亚硝酸盐最高30mg/kg，判断时应注意限量标准；
5、实验用水最好采用蒸馏水，若没有，则用去离子水或矿泉水替代；
6、使用后的玻璃比色管要及时用水冲洗多遍，再用蒸馏水洗净，晾干备用；
7、若亚硝酸盐含量超过最大色标，可用蒸馏水冲稀一定倍数，再按上述方法测试，最后进行结果换算。
大孔树脂活化的方法是：将已使用过的树脂取出，用水洗至流出清水后，用5%盐酸浸泡4-8小时后，用水洗至pH 6，再用2-4% NaOH浸泡4-8小时，用水洗至pH 7-9，待用。
本发明提供的试剂盒及检测亚硝酸盐的方法也适用于火腿、罐头、腌制品等食品中亚硝酸盐的检测。
该试剂盒基于国标GB/T5009.33-2003《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定方法》等标准开发的一种快速检测试剂盒，其开发原理是采用大孔树脂富集亚硝酸盐后，再应用改进型格里斯（Griess）比色法对燕窝中的亚硝酸盐含量进行快速准确的测定。即在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与N－1－萘基乙二胺偶合形成紫红色染料，与比色卡比较定量，并尽简化前处理，提高检测精度。而比色法原理是在相同条件下，预先配置标准溶液，按照溶液浓度与色阶的对应程度，制成比色卡。取待测样品溶液的有色溶液，将其颜色与比色卡上的色阶进行比较，用目测法即可判断出待测样品溶液的浓度。
改进型格里斯（Griess）比色法中，反应原理如下式：
本发明所述试剂盒及其用于燕窝检测时具有如下优点：（1）取样少，每次取样仅需0.1克，而其它亚硝酸盐检测方法如专利200610016130.X需取样3.125克，专利200410092884.4需取样100克，专利200810100102.5需取样3毫升，专利00112875.2需取样0.5克，本试剂盒在取样上具有优势；（2）检测限低，本试剂盒最低检测浓度为0.1 mg/kg，而其它亚硝酸检测方法如专利200810100102.5最低检测浓度为0.2 mg/kg，专利200410092884.4最低检测浓度为2 mg/kg；专利00112875.2检测限为10 mg/kg；（3）检测范围宽：本发明所述试剂盒有效检测范围为0.1 mg/kg-380 mg/kg，而类似的亚硝酸检测方法如专利200610016130.X检测范围为0.1 mg/kg-0.7 mg/kg，专利00112875.2检测范围为10 mg/kg-50 mg/kg，明显比本试剂盒检测范围窄不少；（4）大孔树脂经活化后可循环利用，有效降低试剂盒成本，目前尚无大孔树脂活化使用并循环检测亚硝酸盐含量的其它专利；（5）样品前处理简单，仅需将燕窝样品用检测液C进行处理，静置后取样即可。因此，本发明的技术方案具有灵敏度高、快速、准确、结构简单、使用方便、价格便宜、携带方便等特点。
附图说明
图1是本发明的试剂盒的直观示意图；
图2是本发明的试剂盒所用的透明玻璃亚硝酸盐富集柱直观示意图；
图3是本发明的试剂盒中提供的比色卡。
具体实施方式
实施例1：试剂盒
具体见图1。盒体：ABS材质；检测液A：10 ml；检测液B：10 ml；检测液C：50 ml；滴管：玻璃材质，2 ml；玻璃样品杯: 25 ml；透明玻璃比色管：透明玻璃材质，10.2 ml（刻度容量），尺寸为1.2 cm×1.0 cm× 8.5 cm(长×宽×高)，方柱型，上开口；透明玻璃亚硝酸盐富集柱：透明玻璃材质，16 ml，尺寸为1.6 cm× 8 cm(直径×高)，圆柱型，下端有砂芯滤层（见图2）；大孔树脂选用国产D201大孔树脂；海绵托架为聚氨酯海绵材料；比色卡（见图3）色标的范围在0.1-380 mg/kg之间。
实施例2 三种检测液的配制
一、检测液A（Griess溶液A）制备
对氨基苯磺酸溶液: 称取4 g 对氨基苯磺酸溶于700 mL水和300 mL冰乙酸中, 置棕色试剂瓶中混匀, 室温贮存。
二、检测液B（Griess溶液B）制备
N-1-萘基乙二胺溶液(1 g/L): 称取0.1 g N-1-萘基乙二胺，加100 mL 60%乙酸溶解混匀后, 置棕色试剂瓶中。
三、检测液C制备
硫酸钠饱和溶液32 ml和硼砂饱和溶液68 ml混合, 置棕色试剂瓶中。
实施例3 比色卡的制备
（一）试剂制备
1、硼砂-氢氧化钠溶液（pH=10）：取14.768克硼砂，溶解于250毫升水中，配置成浓度为0.05摩尔每升的硼砂溶液；取2.0克氢氧化钠，溶解于250毫升水中，配置成浓度为0.2摩尔每升的氢氧化钠溶液；将50毫升0.05摩尔每升的硼砂溶液与43毫升0.2摩尔每升的氢氧化钠溶液混合，即可得pH值为10的硼砂-氢氧化钠溶液；
2、亚硝酸钠标准溶液：准确称取25.0 mg于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠，加水溶解移入500 mL容量瓶中，加100mL硼砂-氢氧化钠溶液缓冲液，加水稀释至刻度，混匀，在4℃避光保存。此溶液相当于50μg／ml的亚硝酸钠。
（二）、制备步骤
1、准确吸取5Oμg／ml亚硝酸钠标准溶液0.1、0.25、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0、15.0、17.0、20.0、21.0、23.0、25.0、27.0、30.0ml分别置于50 ml试管中，加水稀释至刻度摇匀；
2、各吸取lml上述溶液滴加在白色卡片纸上，并使卡片均匀湿润，再先后滴加0.4％对氨基苯磺酸和0.2％N-1-萘基乙二胺溶液，使其充分反应、呈色。约5分钟，卡片呈现深浅不同色阶的紫红色；
3、将此卡片塑封，即为比色卡。依照其由浅至深的色标，比色卡所对应的亚硝酸钠含量依次为(mg/kg) 0.1、0.25、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、
13.0、15.0、17.0、20.0、21.0、23.0、25.0、27.0、30.0；
4、参照此方法，分别准确吸取50μg／ml亚硝酸钠标准溶液50.0 ml、100.0 ml、200.0 ml及380.0 ml。分别置于500 ml容量瓶中，加水稀释至刻度摇匀；吸取l ml上述溶液滴加在白色卡片纸上，并使卡片均匀湿润，再先后滴加0.4％对氨基苯磺酸和0.2％N-1-萘基乙二胺溶液，使其充分反应、呈色。约5分钟，卡片呈现深浅不同色阶的颜色。将此卡片塑封，即为比色卡。依照其由浅至深的色标，比色卡所对应的亚硝酸钠含量依次为50.0、100.0、200.0及380.0 mg/kg。
实施例4 燕窝中亚硝酸盐含量检测
（1）、将样品捣碎研磨，随后称取0.1克于样品杯中，加入6毫升蒸馏水到样品杯中，加入2 ml检测液C，搅拌均匀，静置15分钟，取上清液；
（2）、取2 ml样品上清提取液至玻璃比色管，紧接着再滴加A检测液和B检测液各3滴，得混合溶液；
（3）、往已填装2.5 g大孔树脂的透明玻璃亚硝酸盐富集柱中滴入2 ml蒸馏水，再将步骤（2）中的混合溶液倒入该玻璃富集柱中，10分钟后，将该玻璃富集柱中的液体放入到玻璃样品比色管中，对着自然光观察，并与比色卡上的颜色比较，以确定亚硝酸盐浓度。
实施例5 火腿中亚硝酸盐含量检测
（1）、将样品捣碎研磨，随后称取0.5克于样品杯中，加入12毫升蒸馏水到样品杯中，加入4 ml检测液C以沉淀蛋白质，搅拌均匀，静置15分钟，滤纸过滤得澄清滤液；
（2）、取2 ml样品澄清滤液至透明玻璃比色管，紧接着再滴加A检测液和B检测液各6滴，得混合溶液；
（3）、往已填装3.5g大孔树脂的透明玻璃亚硝酸盐富集柱中滴入3 ml蒸馏水，再将步骤（2）中的混合溶液倒入该玻璃富集柱中，10分钟后，将该玻璃富集柱中的液体放入到玻璃样品比色管中，对着自然光观察，并与比色卡上的颜色比较，以确定亚硝酸盐浓度。
Claims (3)
1.快速检测燕窝中亚硝酸盐的试剂盒，包括Griess溶液A即检测液A、Griess溶液B即检测液B和蛋白质沉淀剂即检测液C，以及玻璃样品杯、滴管、透明玻璃比色管、比色卡、透明玻璃亚硝酸盐富集柱，其特征在于：检测液A是按照4 g 对氨基苯磺酸溶于700 mL水和300 mL冰乙酸中的比例配制而成；检测液C是按照硫酸钠饱和溶液：硼砂饱和溶液=32 ml：68 ml混合而成；透明玻璃亚硝酸盐富集柱底部安置砂芯滤板，柱中的填料选自国产D201大孔树脂、美国Amberlite IRA-900树脂或德国Lewatit MP-500树脂，填料充填量为2.0-3.0克；比色卡上建立由浅至深的色标，并标注对应的亚硝酸钠含量依次为0.1、0.25、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0、15.0、17.0、20.0、21.0、23.0、25.0、27.0、30.0、 50.0、100.0、200.0、380.0 mg/kg。
2.权利要求1所述的试剂盒，在检测燕窝中亚硝酸盐含量的应用。
3.权利要求1所述的试剂盒在燕窝检测中的应用，其特征在于：步骤如下：
（1）、将燕窝样品捣碎研磨，随后称取0.1-0.2克于玻璃样品杯中，加入5-7毫升蒸馏水或纯净水，加入1.0-2 ml检测液C，搅拌均匀，静置10-15分钟，取上清液；
（2）、用滴管取2-3 ml上清液至透明玻璃比色管，再滴管滴加等体积的检测液A和检测液B各3-4滴，得混合溶液；
（3）、往透明玻璃亚硝酸盐富集柱中滴入2-3 ml蒸馏水或纯净水，再将步骤（2）中的混合溶液倒入该玻璃富集柱中，10-15分钟后，将该玻璃富集柱中的液体放入到透明玻璃比色管中，对着自然光观察，并与比色卡上的颜色比较；
（4）、如果透明玻璃比色管中的颜色与比色卡某一色标一致，则表明该燕窝样品的亚硝酸盐含量与对应该色标所标示的亚硝酸盐含量一致；如果比比色卡上某一色标深，但比邻近的某一色标浅，则该燕窝样品亚硝酸含量在这两个色标对应的亚硝酸盐含量之间。
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