CN104458712A - 一种血液和尿液中亚硝酸盐的高灵敏快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血液、尿液中亚硝酸盐的快速检测方法。利用亚硝酸盐与Griess试剂发生重氮化偶合反应，形成偶氮化合物，用非离子表面活性剂包括脂肪醇聚氧乙烯醚AEO系列进行浊点萃取，具有操作条件温和、浊点温度低、分相时间短、萃取效率高等特点。体系中亚硝酸盐检测限可达0.005μg/mL。该发明具有简单、快速、灵敏度高、可现场检测等特点。
Description
技术领域
本发明属于体内药物检测技术领域，具体涉及一种血液和尿液中亚硝酸盐的高灵敏快速检测方法。
背景技术
一氧化氮（NO）是一种带有不成对电子的气体，化学性质不稳定，半衰期很短，仅有几秒钟，易形成亚硝酸盐和硝酸盐。NO是目前所知的最强的血管舒张因子和收缩因子，它能作为介质、信使、递质或细胞功能调节因子参与集体许多生理或病理过程。 NO是调节心肌正常生理活动的重要分子，具有使血管扩张，抑制血小板聚集与黏附，抗炎症，抑制细胞凋亡、增生等作用。人类有60 万亿细胞，一氧化氮在人体内扮演着细胞间的传导因子的角色，也是重要的“信号分子”。作为相对稳定的NO代谢产物，亚硝酸盐（NO2 -）在最近10年成为世界医学界的热点，通过测定尿液、血液中的NO2 -的含量来反映体内NO含量和作为反应多项身体机能的重要指标或疾病诊断。
目前亚硝酸盐检测最通用的方法是食品安全国家标准GB 5009.33- 2010，该标准第一法中采用离子色谱法检测各类食品中的亚硝酸盐和硝酸盐，第二法为分光光度法。同时，亚硝酸盐的测定还有荧光光度法、高效液相色谱法等。食品中亚硝酸盐一是含量相对高，二是基本没有盐的干扰，离子色谱法及光度法都是较适合的检测方法，而体内血液或尿液中亚硝酸盐却含量低，有较高盐含量，基体干扰严重。目前检测通常用Griess检测试剂盒，由于受到检测灵敏度的限制及基体干扰，通常很难检测出亚硝酸盐，其灵敏度通常只能达到1μg/mg。研究小组之前已利用高效液相色谱(HPLC)对血液尿液及组织中硝酸盐与亚硝酸盐检测进行了研究，取得了不错的效果，申请了发明专利（201310129291.X），同时还将亚硝酸盐与Griess试剂反应，经浊点萃取（CPE）进行分离、富集，直接目视比色，进行血液尿液中亚硝酸盐简单快速检测，申请了发明专利（201310274145.6）。进一步更加深入研究发现，用非离子表面活性剂AEO系列作浊点萃取剂，与Triton系列及其他非离子表面活性剂相比，该表面活性剂能达到相似或更高的萃取效率，由于不含芳环，更加环保、环境中易降解，同时本发明通过研究发现几种有机醇可以使AEO系列浊点温度降低，分相时间更短，具有检测更加快速简便、灵敏的特点。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种简单快速、灵敏度、能现场检测、尿液中亚硝酸盐定性、半定量的方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。
一种血液和尿液中亚硝酸盐的检测方法，包括以下步骤：
（1）亚硝酸盐标准色阶制作：取浓度为5.0μg/mL 的NO2 - 标准溶液0.005、0.01、0.05、0.10、0.30、0.70、1.0mL于刻度离心管中，用蒸馏水稀释至5mL，加入GriessA试剂250μL，混合均匀；1min后加入GriessB试剂250μL，混合均匀，加入非离子表面活性剂0.1mL，降浊点和相分离促进剂氯化钠或硫酸铵0.1～0.5g或有机醇0.05～0.2mL，涡旋混合1min，离心分相，在溶液上层出现由浅至深的红色环色阶溶液；
（2）样品检测：
尿液的检测：取10mL尿液，加入蛋白沉淀剂硫酸锌0.4～1.0g，活性炭0.5～1.0g，混合均匀，离心脱色、脱蛋白，滤纸过滤除去脱色剂和蛋白沉淀剂；取5mL处理后的尿液，加入GriessA试剂250μL，混合均匀；1min后加入GriessB试剂250μL，混合均匀，放置5min后，加入非离子表面活性剂0.1mL，降浊点和相分离促进剂氯化钠或硫酸铵0.1～0.5g或有机醇0.05～0.2mL，涡旋混合1min，离心分相，将溶液上层表面活性剂的颜色与步骤（1）标准色阶比较，判断其含量；
血液的检测：取5 mL新鲜血液，放入离心机中离心，取上清液，加入活性炭0.5～1.0g、蛋白沉淀剂0.1mol/L氢氧化钠溶液0.2mL和硫酸锌0.2g,混合均匀，加入乙腈1mL，离心分离，取上清液2mL于10mL离心管中用蒸馏水定容至5mL,加入GriessA试剂250μL，混合均匀；1min后加入GriessB试剂250μL，混合均匀，放置5min, 加入非离子表面活性剂0.1mL，降浊点和相分离促进剂氯化钠或硫酸铵0.1～0.5g或有机醇0.05～0.2mL，涡旋混合1min，离心分相，将溶液上层表面活性剂的颜色与步骤（1）标准色阶比较，判断其含量；
其中，步骤（1）（2）中所述的GriessA试剂为50mg对氨基苯磺酸溶于5mL盐酸（0.5mol/L）；GriessB试剂为4mg N-1-萘乙二胺盐酸盐溶于4mL甲醇（50%）；
所述非离子表面活性剂包括脂肪醇聚氧乙烯醚AEO-3、AEO-7、AE0-9之一种；
有机醇包括：正辛醇、正戊醇、正癸醇之一种；
所述的离心条件为离心时间5～15min，离心速率3000～10000r／min。
相对于现有技术，本发明具有以下显著优点:
1、所采用的新型非离子表面活性剂AEO系列浊点（30℃）低，与通用浊点萃取表面活性剂Triton系列浊点（40℃）或其他非离子表面活性剂相比，浊点明显降低，操作条件温和。与其他传统表面活性剂在相同条件下进行浊点萃取，萃取时间短、萃取率更高，用目视比色灵敏度达到了0.005μg/mL。
2、非离子表面活性剂AEO系列为脂肪醇聚氧乙烯醚，不含芳环，环保、易降解，其价格低廉。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1
利用本发明检测人体尿液中亚硝酸盐的含量。
1、亚硝酸盐标准色阶制作：取浓度为5.0μg/mL 的NO2 - 标准溶液0.005、0.01、0.05、0.10、0.30、0.70、1.0mL于刻度离心管中，用蒸馏水稀释至5mL，加入GriessA试剂250μL，混合均匀；1min后加入GriessB试剂250μL，混合均匀，放置5min后，加入非离子表面活性剂AE0-9 0.1mL，硫酸铵0.2g，涡旋混合1min，5000r／min离心10min后分相，在溶液上层出现由浅至深的红色环色阶溶液；
2、样品处理及测定结果
取10mL尿液于10mL离心管中，加入1.0g活性炭，0.2g硫酸铵，混合均匀，4000r/min离心10min，滤纸过滤除去活性炭和蛋白沉淀。取5.0mL脱色、脱蛋白后的尿液于10mL离心管中，加入GriessA试剂250μL，混合均匀。1min后加入GriessB试剂250μL，混合均匀，放置5min后，加入非离子表面活性剂AEO-9 0.1mL，硫酸铵0.2g，涡旋混合1min， 5000r／min 离心10min后分相，上层表面活性剂的色环与步骤（1）标准色阶环比较，亚硝酸盐含量0.005μg/mL和0.01μg/mL之间。
实施例 2
利用本发明检测人体血液中亚硝酸盐的含量。
1.按实施例1制作亚硝酸盐的标准色阶，非离子表面活性剂为AEO-7，正辛醇0.05mL替代硫酸铵。
2.样品处理及测定结果
取5 mL新鲜血液，6000r/min离心12min。取上清液于离心管中，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液0.2mL和硫酸锌0.2g,混合均匀，加入乙腈1mL，4000r/min离心10min分离，取上清液2mL于10mL离心管中用蒸馏水定容至5mL,加入GriessA试剂250μL，混合均匀，1min后加入GriesssB试剂250μL，混合均匀，加入非离子表面活性剂AEO-7 0.1mL，正辛醇0.05mL，涡旋混合1min，5000r／min离心15min后分相，上层表面活性剂的色环与步骤（1）标准色阶环比较，亚硝酸盐含量为0.30μg/mL。
实施例 3
利用本发明检测人体血液中亚硝酸盐的含量。
1. 按实施例1制作亚硝酸盐的标准色阶，非离子表面活性剂为AEO-3有机醇为正戊醇0.1mL。
2.样品处理及测定结果
取5mL新鲜血液于离心管中，6000r/min离心8min，取上清液于离心管中，0.1mol/L氢氧化钠溶液0.2mL和硫酸锌0.2g,混合均匀，加入乙腈1mL，4000r/min离心10min分离，取上清液2mL于10mL离心管中用蒸馏水定容至5mL, 加入GriessA试剂250μL，混合均匀。1min后加入GriessB试剂250μL，混合均匀，放置5min后, 加入非离子表面活性剂AEO-3 0.1mL，正戊醇0.1mL，涡旋混合1min，5000r／min离心10min后分相，上层表面活性剂的色环与步骤（1）标准色阶环比较，亚硝酸盐含量0.01μg/mL和0.05μg/mL之间。
实施例 4
利用本发明检测人体尿液中亚硝酸盐的含量。
1.按实施例1制作亚硝酸盐的标准色阶，非离子表面活性剂为AEO-9，有机醇为正癸醇0.1mL。
2、样品处理及测定结果
取10mL尿液于10mL离心管中，加入加入活性炭0.5g，硫酸锌0.5g,混合均匀，5000r/min离心10min，用定性滤纸过滤。取5.0mL处理后的尿液于10mL离心管中，加入GriessA试剂250μL，混合均匀。1min后加入GriessB试剂250μL，混合均匀，放置5min后，加入非离子表面活性剂AEO-9 0.1mL，正癸醇0.1mL，涡旋混合1min，4000r/min离心10min分相，上层表面活性剂的色环与步骤（1）标准色阶环比较，亚硝酸盐含量0.005μg/mL和0.01μg/mL之间。在相同条件下，做了TritonX-114、TMN-6、NP-9、AEO-9浊点萃取的对比，其结果如下表：
| 表面活性剂 | 现象（含量） | 分相时间（min） | 相分离促进剂 |
| TritonX-114 | 无色（未检出） | 25 | 硫酸铵 |
| TMN-6 | 无色（未检出） | 30 | 硫酸铵 |
| NP-9 | 无色（未检出） | 50 | 氯化钠 |
| AEO-9 | 浅粉红色（＞0.005μg/mL） | 10 | 正辛醇 |
本发明在检测时间、检测灵敏度方面有优势。
Claims (5)
1.一种血液和尿液中亚硝酸盐快速检测方法，包括以下步骤：
（1）制备亚硝酸盐标准色阶溶液：取浓度为5.0μg/mL 的NO2 - 标准溶液0.005、0.01、0.05、0.10、0.30、0.70、1.0mL于刻度离心管中，用蒸馏水稀释至5mL，加入GriessA试剂250μL，混合均匀；1min后加入GriessB试剂250μL，混合均匀，加入非离子表面活性剂0.1mL，降浊点和相分离促进剂氯化钠或硫酸铵0.1～0.5g或有机醇0.05～0.2mL，涡旋混合1min，离心5～15min分相，溶液上层表面活性剂相出现由浅至深的红色环色阶；
（2）检测尿液中的亚硝酸盐：取10mL尿液，硫酸锌0.4～1.0g，加入活性炭0.5～1.0g，混合均匀，离心脱色，滤纸过滤除去活性炭；取5mL脱色后的尿液，加入GriessA试剂250μL，混合均匀；1min后加入GriessB试剂250μL，混合均匀，放置5min后，加入非离子表面活性剂0.1mL，降浊点和相分离促进剂氯化钠或硫酸铵0.1～0.5g或有机醇0.05～0.2mL，涡旋混合1min，离心5～15min分相，将溶液上层表面活性剂相的颜色与步骤（1）标准色阶比较，判断其含量；
（3）检测血液中的亚硝酸盐：取5 mL新鲜血液，放入离心机中离心，取上清液，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液0.2mL和硫酸锌0.2g,混合均匀，加入乙腈1mL，离心分离，取上清液2mL于10mL离心管中用蒸馏水定容至5mL,加入GriessA试剂250μL，混合均匀；1min后加入GriessB试剂250μL，混合均匀，放置5min, 加入非离子表面活性剂0.2mL，降浊点和相分离促进剂氯化钠或硫酸铵0.1～0.5g或有机醇0.05～0.2mL，涡旋混合1min，离心5～15min分相，将溶液上层表面活性剂相的颜色与步骤（1）标准色阶比较，判断其含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述的GriessA试剂为50mg对氨基苯磺酸溶于5mL盐酸（0.5mol/L）；GriessB试剂为4mg N-1-萘乙二胺盐酸盐溶于4mL甲醇（50%）。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述非离子表面活性剂包括脂肪醇聚氧乙烯醚AEO-3、AEO-7、AE0-9中之一种。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述的降浊点和相分离促进剂，有机醇包括正辛醇、正戊醇、正癸醇中的一种。
5.权利要求1所述的检测方法，其特征在于：样品检测中所述的离心条件为离心时间5～15min，离心速率3000～10000r／min。
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