CN101579036A - 一种植物冰结构蛋白的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
一种植物冰结构蛋白的分离纯化方法，属于食品添加剂分离领域。本发明以冷胁迫植物为原料，经浸取并采用浊点萃取法分离纯化冰结构蛋白，首先采用含非离子表面活性剂的缓冲溶液将冰结构蛋白从植物原料中浸取出来；然后采用非离子表面活性剂形成的胶束溶液进行浊点萃取，加热到浊点温度后分成水相和胶束相两相，疏水性杂质富集于胶束相，而亲水性的冰结构蛋白保留在水相；最后经透析浓缩、冷冻干燥得到白色的冰结构蛋白混合物。采用差示扫描量热法对分离纯化的样品进行了热滞活性检测，证明产品存在较高热滞活性。本发明分离工艺简单，生产成本低，萃取过程无挥发性有机溶剂，纯化效率高，有利于工业生产冰结构蛋白和充分利用植物资源。
Description
技术领域
一种植物冰结构蛋白的分离纯化方法，涉及一种从冷胁迫植物中分离纯化冰结构蛋白的方法，属于食品添加剂分离领域。
背景技术
抗冻或冰结构蛋白是一类能够抑制冰晶生长和重结晶的蛋白质。它在在冷带植物、海洋鱼类、昆虫和微生物中均有分布，极低的浓度下就可以使有机体提高御寒能力，避免冰晶生长对机体的损伤。这无疑对减少冷冻食品的冰晶损伤、保持冷冻食品的质地与性能，以及延长产品贮藏期，具有积极意义。它非依数性地降低水溶液的冰点，使冰点低于熔点(熔点总是接近0℃)。这种熔点与冰点的差异称为热滞活性。冰结构蛋白的活性主要通过其热滞活性来反映。目前，植物来源的冰结构蛋白比较广泛易得，并容易为食品生产企业和一般消费者所接受。因此，关于冰结构蛋白的商业利用和研究就集中到植物来源的分离上。
传统蛋白质纯化一般通过硫酸铵沉淀、离子交换和亲和层析等步骤。这些方法存在分离周期长、过程繁琐和得率低等缺点，并且在大规模生产中，由于耗资昂贵不能使产品维持合理的价格。中国专利(CN1117497A和CN1995062A)报道了利用硫酸铵沉淀法来纯化冰结构蛋白，而硫酸铵可能会改变活性潜伏的蛋白质二级结构，造成抗冻活性的损失。
浊点萃取法是近年来在分离科学领域备受关注的一种新颖分离方法，它利用非离子表面活性剂水溶液在加热到浊点温度时形成界面清晰的胶束/水两相，而组分可在两相中进行分配来实现分离。冰结构蛋白具有很强的亲水性将保留在水相，而疏水性杂质选择性地萃取到胶束相。这是浊点萃取纯化冰结构蛋白的基础。本发明首次将浊点萃取法用于植物冰结构蛋白的分离纯化，具有表面活性剂用量少、成本低、体系组成简单，并且分离条件温和，不会对冰结构蛋白活性产生影响等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种工艺简单、成本低、得率高的分离纯化植物冰结构蛋白方法。
本发明的技术方案：一种植物冰结构蛋白的分离纯化方法，以冷胁迫植物为原料，经浸取并采用浊点萃取法分离纯化冰结构蛋白，步骤为：
(1)制备冰结构蛋白的浸取液：称取经粉碎的冷胁迫植物原料，加入含非离子表面活性剂的缓冲溶液中进行搅拌浸取，浸取1～2小时后过滤，得到固体滤渣和冰结构蛋白的浸取液；
(2)浊点分相萃取：继续向步骤(1)得到的冰结构蛋白浸取液中补充非离子表面活性剂，充分混合形成非离子表面活性剂胶束溶液，然后加热到浊点温度进行分相萃取形成胶束相和水相，疏水杂质富集于胶束相，冰结构蛋白保留在水相，离心分出水相，用于透析浓缩；
(3)透析浓缩、冷冻干燥：将步骤(2)得到的水相溶液放置于截留分子量为6000～8000Da的透析袋中，进行充分透析，透析后使用聚乙二醇粉末对透析袋覆盖浓缩，浓缩至原水相体积的1/15～1/20时，再进行冷冻干燥，得到经分离纯化的冰结构蛋白样品。
步骤(1)所述的冷胁迫植物原料与加入含非离子表面活性剂的缓冲溶液的固液比g/mL控制为1∶10。
步骤(1)所述的非离子表面活性剂缓冲溶液质量浓度为0.5％～1％，浸取温度为25～50℃。
步骤(2)所述的补充后的非离子表面活性剂溶液质量浓度为2％～5％，加热方式采用水浴恒温加热。
所述的非离子表面活性剂为脂肪醇聚氧乙烯醚类，或烷基酚聚氧乙烯醚类。
所述的脂肪醇聚氧乙烯醚类非离子表面活性剂选用月桂醇聚氧乙烯醚X-080(Genapol X-080)、月桂醇聚氧乙烯醚30(Brij 30)、五聚乙二醇单癸醚、或四聚乙二醇单癸醚；烷基酚聚氧乙烯醚类非离子表面活性剂选用对叔辛基苯基聚己二醇醚X-114(Triton X-114)或对叔辛基苯基聚己二醇醚X-100(TritonX-100)。
所述的缓冲溶液是磷酸盐缓冲溶液或三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲溶液。
所述的冷胁迫植物选用冬小麦、或冬女真叶。
冰结构蛋白的热滞活性分析：用蒸馏水配制浓度为1mg/mL的冰结构蛋白溶液，将10μL溶液密封于铝制坩埚中，放置在差示扫描量热仪的样品池中央，以空池为参比。当设备稳定后，首先以1℃/min的速率，从室温降至-25℃，然后升温至25℃，可分别得到结晶放热峰和熔化吸热峰的热流扫描曲线，结晶温度(Tf)可由结晶放热峰起始点温度确定，而样品熔点(Tm)则相应于熔化吸热峰值温度，完全熔化热(Qm)可由放热峰与基线所围面积得到。接着再以1℃/min的速率降温至-25℃，使之固化，并稳定5min，然后以1℃/min的升温速率加热复温，当温度升至略低于Tm时停止，并保持稳定5min。此时样品呈部分熔化状态，这一温度称之为“保持温度”(Th)。从Th再以1℃/min降温至-25℃。由于冰晶生长，降温曲线上出现结晶放热峰，其初始温度为T0。若样品中包含具有热滞活性的冰结构蛋白，结晶放热峰的出现将被延迟，To与Th存在差异。反之，对于无热滞活性的样品，To与Th几乎相等。因此可定义冰结构蛋白的热滞活性(THA)为：THA＝Th-To，其中，在To时，部分熔化的样品中的初始冰晶含量(φ)可由延迟的结晶放热量Qr与完全熔化热Qm之比得到，即φ＝(1-Qr/Qm)×100％。典型的差示扫描量热仪的热流图如图1所示。
本发明的有益效果：采用的非离子表面活性剂均可生物降解，绿色环保；浊点萃取条件温和，不会对冰结构蛋白的活性产生影响；浊点萃取后，冰结构蛋白中的疏水杂质成分已有效去除，使后续精制更简单。本发明工艺简单、生产成本低、冰结构蛋白得率高，有利于工业生产，充分利用冷胁迫植物资源。
附图说明
图1样品溶液的差示扫描热流曲线。图中，Th为保持温度，To为初始温度。
具体实施方式
实施例1
称取粉碎的冬小麦100g，加入1000mL含0.5％的Genapol X-080(脂肪醇聚氧乙烯醚类，购于Sigma-Aldrich公司)的磷酸盐缓冲溶液(100mM，pH 7.3)，浸取1小时后过滤，得到固体滤渣和冰结构蛋白的浸取液；继续向冰结构蛋白浸取液中补充Genapol X-080至5％，然后加热到50℃进行分相萃取，2h后以5000rpm离心10min，分出水相；取水相溶液放置于截留分子量为6000Da的透析袋中，4℃下充分透析，透析后使用聚乙二醇10000对透析袋覆盖浓缩，浓缩至原体积的1/20时，再进行冷冻干燥，得到经分离纯化的冰结构蛋白样品2.8g。精确称取以上冰结构蛋白样品0.5g，用500mL蒸馏水溶解，配制成浓度为1mg/mL的溶液。采用差示扫描量热法对样品溶液进行热滞活性检测，结果如表1所示，最大热滞活性为0.20℃。
表1样品的保持温度Th，初始温度To，初始冰晶含量φ及热滞活性THA
实施例2
称取粉碎的冬小麦100g，加入1000mL含1％的Triton X-114(烷基酚聚氧乙烯醚类，购于上海晶纯试剂有限公司)的磷酸盐缓冲溶液(100mM，pH 7.3)，浸取1小时后过滤，得到固体滤渣和冰结构蛋白的浸取液，继续向冰结构蛋白浸取液中补充Triton X-114至3％，然后加热到35℃进行分相萃取，2h后以5000rpm离心10min，分出水相，取水相溶液放置于截留分子量为6000Da的透析袋中，4℃下充分透析，透析后使用聚乙二醇10000对透析袋覆盖浓缩，浓缩至原体积的1/20时，再进行冷冻干燥，得到经分离纯化的冰结构蛋白样品3.5g。精确称取以上冰结构蛋白样品0.5g，用500mL蒸馏水溶解，配制成浓度为1mg/mL的溶液。采用差示扫描量热法对样品溶液进行热滞活性检测，结果如表2所示，最大热滞活性为0.21℃。
表2样品的保持温度Th，初始温度To，初始冰晶含量φ及热滞活性THA
实施例3
称取粉碎的冬女贞叶100g，加入1000mL含0.5％的Genapol X-080(脂肪醇聚氧乙烯醚类，购于Sigma-Aldrich公司)的磷酸盐缓冲溶液(100mM，pH 7.3)，浸取2小时后过滤，得到固体滤渣和冰结构蛋白的浸取液；继续向冰结构蛋白浸取液中补充Genapol X-080至5％，然后加热到50℃进行分相萃取，2h后以5000rpm离心10min，分出水相；取水相溶液放置于截留分子量为6000Da的透析袋中，4℃下充分透析，透析后使用聚乙二醇10000对透析袋覆盖浓缩，浓缩至原体积的1/20时，再进行冷冻干燥，得到经分离纯化的冰结构蛋白样品1.8g。精确称取以上冰结构蛋白样品0.5g，用500mL蒸馏水溶解，配制成浓度为1mg/mL的溶液。采用差示扫描量热法对样品溶液进行热滞活性检测，结果如表3所示，最大热滞活性为0.38℃。
表3样品的保持温度Th，初始温度To，初始冰晶含量φ及热滞活性THA
实施例4
称取粉碎的冬女贞叶100g，加入1000mL含1％的Triton X-114(烷基酚聚氧乙烯醚类，购于上海晶纯试剂有限公司)的磷酸盐缓冲溶液(100mM，pH 7.3)，浸取2小时后过滤，得到固体滤渣和冰结构蛋白的浸取液，继续向冰结构蛋白浸取液中补充Triton X-114至3％，然后加热到35℃进行分相萃取，2h后以5000rpm离心10min，分出水相；取水相溶液放置于截留分子量为6000Da的透析袋中，4℃下充分透析，透析后使用聚乙二醇10000对透析袋覆盖浓缩，浓缩至原体积的1/20时，再进行冷冻干燥，得到经分离纯化的冰结构蛋白样品2.0g。精确称取以上冰结构蛋白样品0.5g，用500mL蒸馏水溶解，配制成浓度为1mg/mL的溶液。采用差示扫描量热法对样品溶液进行热滞活性检测，结果如表4所示，最大热滞活性为0.38℃。
表4样品的保持温度Th，初始温度To，初始冰晶含量φ及热滞活性THA
Claims (8)
1、一种植物冰结构蛋白的分离纯化方法，其特征在于以冷胁迫植物为原料，经浸取并采用浊点萃取法分离纯化冰结构蛋白，步骤为：
(1)制备冰结构蛋白的浸取液：称取经粉碎的冷胁迫植物原料，加入含非离子表面活性剂的缓冲溶液中进行搅拌浸取，浸取1～2小时后过滤，得到固体滤渣和冰结构蛋白的浸取液；
(2)浊点分相萃取：继续向步骤(1)得到的冰结构蛋白浸取液中补充非离子表面活性剂，充分混合形成非离子表面活性剂胶束溶液，然后加热到浊点温度进行分相萃取形成胶束相和水相，疏水杂质富集于胶束相，冰结构蛋白保留在水相，离心分出水相，用于透析浓缩；
(3)透析浓缩、冷冻干燥：将步骤(2)得到的水相溶液放置于截留分子量为6000～8000Da的透析袋中，进行充分透析，透析后使用聚乙二醇粉末对透析袋覆盖浓缩，浓缩至原水相体积的1/15～1/20时，再进行冷冻干燥，得到经分离纯化的冰结构蛋白样品。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的冷胁迫植物原料与加入含非离子表面活性剂的缓冲溶液的固液比g/mL控制为1∶10。
3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的非离子表面活性剂缓冲溶液质量浓度为0.5％～1％，浸取温度为25～50℃。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的补充后的非离子表面活性剂溶液质量浓度为2％～5％，加热方式采用水浴恒温加热。
5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非离子表面活性剂为脂肪醇聚氧乙烯醚类，或烷基酚聚氧乙烯醚类。
6、根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的脂肪醇聚氧乙烯醚类非离子表面活性剂选用月桂醇聚氧乙烯醚X-080、月桂醇聚氧乙烯醚30、五聚乙二醇单癸醚、或四聚乙二醇单癸醚；烷基酚聚氧乙烯醚类非离子表面活性剂选用对叔辛基苯基聚己二醇醚X-114或对叔辛基苯基聚己二醇醚X-100。
7、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的缓冲溶液是磷酸盐缓冲溶液或三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液。
8、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的冷胁迫植物选用冬小麦、或冬女真叶。
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