CN110423263B - 一种从葡萄籽中提取蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白质提取领域，公开了一种从葡萄籽中提取蛋白质的方法，本发明采用布勒试验磨将葡萄籽粉碎，并将高压脉冲电场萃取方法与浊点萃取技术结合，从葡萄籽中提取蛋白质。采用非离子表面活性剂，相较于带电荷的离子型表面活性剂，对蛋白质变性影响小。将聚氧乙烯辛烷基苯酚醚与十二烷基聚乙二醇醚两种非离子型表面活性剂混合，使混合体系的浊点下降，促进相分离提高提取率。KCl的加入因盐析效应会使胶束体系的浊点下降，无机盐可导致胶束间斥力减少，吸引力增大，胶束沉淀，同时KCl的加入会使溶剂极性增加，使萃取剂在满足浊点萃取的条件下也适用于高压脉冲技术。

Description

一种从葡萄籽中提取蛋白质的方法
技术领域
本发明涉及蛋白质提取领域，尤其涉及一种从葡萄籽中提取蛋白质的方法。
背景技术
全世界年产葡萄约为6500万吨，其中80％用于酿酒，在酿酒的同时产生大量废弃的葡萄籽。目前，对葡萄籽的研究主要集中在葡萄籽油加工利用方面，很少对葡萄籽的蛋白质进行研究，葡萄籽中的蛋白质是一种很好的蛋白质资源，葡萄籽蛋白中含有优质的粗蛋白，水解后形成的多肽极易被人体消化吸收，此外，还含有人体必需的8种氨基酸，部分氨基酸的含量堪比大豆，将其添加到食物中，可以有效提高产品的营养价值，葡萄籽蛋白在诱导白细胞凋亡方面具有一定的作用。
浊点萃取技术是近年来出现的一种新兴的液-液萃取技术，它不使用挥发性有机溶剂，不影响环境。它以中性表面活性剂胶束水溶液的溶解性和浊点现象为基础，改变实验参数引发相分离，将疏水性物质与亲水性物质分离。
高压脉冲电场技术是一种新型、高效的非热处理技术，它是利用外部电场可诱导细胞膜穿孔原理，对两极间的物料反复施加高压的脉冲数进行处理的方法。高压脉冲电场处理具有快速、均匀，可在室温下进行等优点，目前，已经被广泛应用于天然产物提取、食品非热加工等领域。
目前提取葡萄籽蛋白主要采取的方式是浊点萃取方法，反胶束萃取法，酸溶碱沉法，沉淀法，电泳法，采用高压脉冲电场技术与浊点萃取技术相结合的手段提取葡萄籽的方法还未见报道。
发明内容
本发明用一种省时高效，绿色环保的方法提取葡萄籽中蛋白质，采用布勒试验磨将葡萄籽粉碎，葡萄籽质地较硬，采取该方法有利于将其均匀地磨碎，将高压脉冲电场萃取方法与浊点萃取技术结合起来，从葡萄籽中提取蛋白质，实现废物重利用，可用于动物饲料。本发明采用非离子表面活性剂，相较于带电荷的离子型表面活性剂，对蛋白质变性影响小。将聚氧乙烯辛烷基苯酚醚与十二烷基聚乙二醇醚两种非离子型表面活性剂混合，使混合体系的浊点下降，促进相分离提高提取率。KCl这一无机盐的加入，因盐析效应会使胶束体系的浊点下降，无机盐可导致胶束间斥力减少，吸引力增大，胶束沉淀，同时KCl的加入会使溶剂极性增加，使萃取剂在满足浊点萃取的条件下也适用于高压脉冲技术，此外，KCl的加入可促进所用表面活性剂聚氧乙烯辛烷基苯酚醚中聚氧化乙烯链间的脱水，胶束与溶液中其他组分密度差越大越有利于离心分离，相分离的时间缩短有利于生物分子活性的保持。
本发明的具体技术方案为：一种从葡萄籽中提取蛋白质的方法，包括以下步骤：
1)原料预处理：将葡萄籽浸泡后，用布勒试验磨磨粉，过90目-120目筛加入石油醚，室温下搅拌2-6h，抽滤，将所得沉淀置于通风处，待石油醚挥发完后，将葡萄籽粉末收集备用；
本发明采用布勒试验磨将葡萄籽粉碎，葡萄籽质地较硬，采取该方法有利于将其均匀地磨碎，采用石油醚对葡萄籽进行预处理以达到初步脱脂的目的，本发明以葡萄籽为原料，原料简单易得，葡萄籽为酿酒过程中产生的废物，本发明符合绿色环保，可持续发展理念。
2)萃取剂制备：将聚氧乙烯辛烷基苯酚醚与十二烷基聚乙二醇醚混合后添加至去离子水中搅拌2-4h混合均匀，再加入KCl溶液，超声分散10-15min，得到萃取剂；
本发明采用非离子表面活性剂，相较于带电荷的离子型表面活性剂，对蛋白质变性影响小。将聚氧乙烯辛烷基苯酚醚与十二烷基聚乙二醇醚两种非离子型表面活性剂混合，使混合体系的浊点下降，促进相分离提高提取率。KCl这一无机盐的加入，因盐析效应会使胶束体系的浊点下降，无机盐可导致胶束间斥力减少，吸引力增大，胶束沉淀，同时KCl的加入会使溶剂极性增加，使萃取剂在满足浊点萃取的条件下也适用于高压脉冲技术，此外，KCl的加入可促进所用表面活性剂聚氧乙烯辛烷基苯酚醚中聚氧化乙烯链间的脱水，胶束与溶液中其他组分密度差越大越有利于离心分离，相分离的时间缩短有利于生物分子活性的保持。
3)葡萄籽粉末与萃取剂混合：称取葡萄籽粉末，加入萃取剂，30-40℃下搅拌15-20min；
4)将步骤3)中所得混合液体以8-12mL/min的流速通过高压脉冲电场装置进行电场处理，将所得提取液离心2-3min，取胶束相；
5)将胶束相于30-40℃恒温水浴中静置10-20min，使其分层，取分层后的上层液体加入少量钾钠缓冲溶液，离心8-10min，取水相；
本发明加入钾钠缓冲溶液有利于所提取蛋白质活性的保持。
6)将水相倒入透析袋，透析袋置于蒸馏水中，每隔2-3h将蒸馏水更换一次，24h后停止，脱盐处理完毕，冷却干燥，采取凯氏定氮法测定提取蛋白质率。
作为优选，步骤1)中采用布勒试验磨的条件为葡萄籽用去离子水浸泡30-35h，喂料速度控制在90-100g/min。
作为优选，步骤1)中粉碎后葡萄籽与石油醚的固液比为1∶8-1∶12；
作为优选，步骤2)中，聚氧乙烯辛烷基苯酚醚与十二烷基聚乙二醇醚质量比为2∶1-3∶1，加入去离子水和KCl溶液后，萃取剂中KCl含量维持在1.3％-1.6％；
作为优选，步骤3)中，萃取剂与葡萄籽粉末的液固比为18-20mL/g；
作为优选，步骤4)中，高压脉冲电场装置的脉冲数为7-9个，电场强度17-20kV/cm；
作为优选，步骤5)钾钠缓冲溶液配制步骤为称取27.2g三水乙酸钠，19.6g醋酸钾，一边搅拌一边加入30mL去离子水，再加入20mL乙酸，超声溶解，用去离子水定容至100mL；
作为优选，步骤4)和步骤5)中，离心转速为3600-3900rpm。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：用一种省时高效，绿色环保的方法提取葡萄籽中蛋白质，采用布勒试验磨将葡萄籽粉碎，葡萄籽质地较硬，采取该方法有利于将其均匀地磨碎，将高压脉冲电场萃取方法与浊点萃取技术结合起来，从葡萄籽中提取蛋白质，实现废物重利用，可用于动物饲料。本发明采用非离子表面活性剂，相较于带电荷的离子型表面活性剂，对蛋白质变性影响小。将聚氧乙烯辛烷基苯酚醚与十二烷基聚乙二醇醚两种非离子型表面活性剂混合，使混合体系的浊点下降，促进相分离提高提取率。KCl这一无机盐的加入，因盐析效应会使胶束体系的浊点下降，无机盐可导致胶束间斥力减少，吸引力增大，胶束沉淀，同时KCl的加入会使溶剂极性增加，使萃取剂在满足浊点萃取的条件下也适用于高压脉冲技术，此外，KCl的加入可促进所用表面活性剂聚氧乙烯辛烷基苯酚醚中聚氧化乙烯链间的脱水，胶束与溶液中其他组分密度差越大越有利于离心分离，相分离的时间缩短有利于生物分子活性的保持。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
1)原料预处理：葡萄籽用蒸馏水浸泡30h后，以90g/min的喂料速度进行布勒试验磨磨粉，过100目筛后，按照固液比1∶8加入石油醚，室温下搅拌3h，抽滤，将所得沉淀置于通风处，待石油醚挥发干净后，将葡萄籽粉收集备用；
2)萃取剂制备：将聚氧乙烯辛烷基苯酚醚与十二烷基聚乙二醇醚按2∶1的比例加到去离子水中配置成0.05g/mL的溶液，用磁力搅拌器搅拌2h，使其混合均匀，再加入KCl溶液，使KCl溶液的含量维持在1.5％(w/v)搅拌15min；
3)葡萄籽粉末与萃取剂混合：称取葡萄籽粉末40g，加入720mL的步骤2)中制备的萃取剂，维持固液比为1∶18，35℃下磁力搅拌15-20min；
4)将步骤3)中制备的混合液体以10mL/min的流速通过高压脉冲电场装置进行电场处理，提取完毕后，将提取液转移至离心管中，以3800r/min的速率离心2min，取胶束相；
5)称取27.2g三水乙酸钠，19.6g醋酸钾，一边搅拌一边加入30mL去离子水，再加入20mL乙酸，超声溶解，用去离子水定容至100mL，配制成钾钠缓冲溶液，将步骤4)中胶束相于35℃恒温水浴中静置10min，使其分层，取分层后的上层液体加入少量钾钠缓冲溶液，以3800r/min的速率离8min，取水相；
6)将水相倒入透析袋，透析袋置于蒸馏水中，每隔2h将蒸馏水更换一次，24h后停止，脱盐处理完毕，冷却干燥，采取凯氏定氮法测定提取蛋白质率。
依据GB/T-5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》，蛋白质提取率为82％。纯度为87％。
实施例2
1)原料预处理：葡萄籽用蒸馏水浸泡32h后，以100g/min的喂料速度进行布勒试验磨磨粉，过90目筛后，按照固液比1∶10加入石油醚，室温下搅拌4h，抽滤，将所得沉淀置于通风处，待石油醚挥发干净后，将葡萄籽粉收集备用；
2)萃取剂制备：将聚氧乙烯辛烷基苯酚醚与十二烷基聚乙二醇醚按2.5∶1的比例加到去离子水中配置成0.05g/mL的溶液，用磁力搅拌器搅拌2h，使其混合均匀，再加入KCl溶液，使KCl溶液的含量维持在1.4％(w/v)搅拌20min；
3)葡萄籽粉末与萃取剂混合：称取葡萄籽粉末60g，加入1200mL的步骤2)中制备的萃取剂，维持固液比为1∶20，35℃下磁力搅拌15-20min；
4)将步骤3)中制备的混合液体以10mL/min的流速通过高压脉冲电场装置进行电场处理，提取完毕后，将提取液转移至离心管中，以3700r/min的速率离心2min，取胶束相；
5)称取27.2g三水乙酸钠，19.6g醋酸钾，一边搅拌一边加入30mL去离子水，再加入20mL乙酸，超声溶解，用去离子水定容至100mL，配制成钾钠缓冲溶液，将步骤4)中的胶束相于35℃恒温水浴锅中10min，使其分层，取分层后的上层液体加入少量钾钠缓冲溶液，以3700r/min的速率离心9min，取水相；
6)将水相倒入透析袋，透析袋置于蒸馏水中，每隔3h将蒸馏水更换一次，24h后停止，脱盐处理完毕，冷却干燥，采取凯氏定氮法测定提取蛋白质率。
依据GB/T-5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》，蛋白质提取率为81％。纯度为88％。
实施例3
1)原料预处理：葡萄籽用蒸馏水浸泡31h后，以110g/min的喂料速度进行布勒试验磨磨粉，过120目筛后，按照固液比1∶9加入石油醚，室温下搅拌3.5h，抽滤，将所得沉淀置于通风处，待石油醚挥发干净后，将葡萄籽粉收集备用；
2)萃取剂制备：将聚氧乙烯辛烷基苯酚醚与十二烷基聚乙二醇醚按2.6∶1的比例加到去离子水中配置成0.05g/mL的溶液，用磁力搅拌器搅拌2.5h，使其混合均匀，再加入KCl溶液，使KCl溶液的含量维持在1.5％(w/v)搅拌20min；
3)葡萄籽粉末与萃取剂混合：称取葡萄籽粉末45g，加入900mL的步骤2)中制备的萃取剂，维持固液比为1∶20，35℃下磁力搅拌20min；
4)将步骤3)中制备的混合液体以10mL/min的流速通过高压脉冲电场装置进行电场处理，提取完毕后，将提取液转移至离心管中，以3750r/min的速率离心3min，取胶束相；
5)称取27.2g三水乙酸钠，19.6g醋酸钾，一边搅拌一边加入30mL去离子水，再加入20mL乙酸，超声溶解，用去离子水定容至100mL，配制成钾钠缓冲溶液将步骤4)中的胶束相于40℃恒温水浴锅中13min，使其分层，取分层后的上层液体加入少量钾钠缓冲溶液，以3750r/min的速率离心4min，取水相；
6)将水相倒入透析袋，透析袋置于蒸馏水中，每隔2.5h将蒸馏水更换一次，24h后停止，脱盐处理完毕，冷却干燥，采取凯氏定氮法测定提取蛋白质率；
依据GB/T-5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》，蛋白质提取率为84％。纯度为87％。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (7)

1.一种从葡萄籽中提取蛋白质的方法，以g和mL计，其特征在于包括以下步骤：
1）原料预处理：将葡萄籽浸泡后，用布勒试验磨磨粉，过90目-120目筛加入石油醚，室温下搅拌2-6 h，抽滤，将所得沉淀置于通风处，待石油醚挥发完后，将葡萄籽粉末收集备用；
2）萃取剂制备：将聚氧乙烯辛烷基苯酚醚与十二烷基聚乙二醇醚混合后添加至去离子水中搅拌2-4 h混合均匀，再加入KCl溶液，超声分散10-15 min，得到萃取剂；
3）葡萄籽粉末与萃取剂混合：称取葡萄籽粉末，加入萃取剂，30-40℃下搅拌15-20min；
4）将步骤3）中所得混合液体以8-12 mL/min的流速通过高压脉冲电场装置进行电场处理，将所得提取液离心2-3 min，取胶束相；高压脉冲电场装置的脉冲数为7-9个，电场强度17-20 kV/cm；
5）将胶束相于30-40 ℃恒温水浴中静置10-20 min，使其分层，取分层后的上层液体加入钾钠缓冲溶液，离心8-10 min，取水相；
6）将水相倒入透析袋，透析袋置于蒸馏水中，每隔 2-3 h 将蒸馏水更换一次，20-30h后停止，脱盐处理完毕，冷却干燥，采取凯氏定氮法测定提取蛋白质率。
2.如权利要求1所述的一种从葡萄籽中提取蛋白质的方法，其特征在于，步骤1）中采用布勒试验磨的条件为葡萄籽用去离子水浸泡30-35h，喂料速度控制在90-100 g/min。
3.如权利要求1所述的一种从葡萄籽中提取蛋白质的方法，其特征在于，步骤1）中粉碎后葡萄籽与石油醚的固液比为1: 8-1: 12g/mL。
4.如权利要求1所述的一种从葡萄籽中提取蛋白质的方法，其特征在于，步骤2）中，聚氧乙烯辛烷基苯酚醚与十二烷基聚乙二醇醚质量比为2:1-3:1，加入去离子水和KCl溶液后，萃取剂中KCl含量维持在1.3-1.6%。
5.如权利要求1所述的一种从葡萄籽中提取蛋白质的方法，其特征在于，步骤3）中，萃取剂与葡萄籽粉末的液固比为18-20mL/g。
6.如权利要求1所述的一种从葡萄籽中提取蛋白质的方法，其特征在于， 步骤5）钾钠缓冲溶液配制步骤为称取27.2 g三水乙酸钠，19.6 g醋酸钾，边搅拌边加入30 mL去离子水，再加入20 mL乙酸，超声溶解，用去离子水定容至100 mL。
7.如权利要求1所述的一种从葡萄籽中提取蛋白质的方法，其特征在于，步骤4）和步骤5）中，离心转速为3600-3900 rpm。
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