CN107604034A - 一种葡萄籽蛋白酶解物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种葡萄籽蛋白酶解物及其制备方法，属于天然物质提取的技术领域。一种新的葡萄籽蛋白酶解物的制备方法，包括以下步骤：(1)葡萄籽的预处理：将葡萄籽粉碎，得葡萄籽粉；(2)制备葡萄籽蛋白：通过碱溶酸沉法制备葡萄籽蛋白；(3)酶解葡萄籽蛋白：将葡萄籽蛋白和生物酶完全溶解于水中，进行酶解反应后，离心，回收沉淀物，再干燥沉淀物，得葡萄籽蛋白酶解物。本发明所述的一种葡萄籽蛋白酶解物及其制备方法，采用葡萄籽为原料，可以提高葡萄的综合利用率；在生物酶酶解葡萄籽蛋白的反应中，设置合适的pH值、酶添加量、酶解温度和酶解时间，从而可以缩短工艺时间，提高葡萄籽多肽的抗氧化活性和生物活性等。
Description
技术领域
本发明属于天然物质提取的技术领域，具体涉及一种葡萄籽蛋白酶解物及其制备方法。
背景技术
我国具有悠久的葡萄种植历史，是葡萄生产和消费大国，其中约80％的葡萄用于酿酒业，其他部分用于直接食用和果汁加工等，具有很高的营养价值和经济价值。在葡萄的使用及加工过程中还会产生葡萄籽、葡萄皮等许多富含蛋白质、脂肪和碳水化合物等营养物质的副产物，其中仅葡萄籽的年产量就可达5万吨。而将这些葡萄籽和葡萄皮直接舍弃或者廉价出售给农民作饲料，毋庸置疑地造成了环境污染和资源浪费。
葡萄籽作为一种资源性副产物，具有产量大、易收集的特点。由于其含有丰富的营养成分，具有较高的研究利用价值，其中关于葡萄籽油、葡萄籽原花青素、葡萄籽超微粉的利用研究最为常见，而关于葡萄籽多肽的较少。
人体内存在各种各样的多肽，它们参与调控各种生理功能，具有很多对人体有益的功能，目前主要应用于医药、功能性食品、科学研究等方面。但多肽半衰期短，不稳定，易氧化降解，因此有时需要补充多肽物质。在人体内，蛋白质经胃蛋白酶分解后产生多肽，后经多种方式形成氨基酸，最终被人体吸收。葡萄籽中含有大量的葡萄籽蛋白，因此，可利用酶解葡萄籽蛋白的方法制备葡萄籽活性多肽。但是，现有的用酶解法酶解葡萄籽蛋白后，得到的酶解物为葡萄籽粗多肽，其抗氧化活性和生物活性等较差，制备时间较长。
有鉴于此，有必要提出一种新的葡萄籽蛋白酶解物及其制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种葡萄籽蛋白酶解物的制备方法，该方法操作简单，制备时间短，可以明显提高葡萄籽多肽的抗氧化活性和生物活性。
为了实现上述目的，所采用的技术方案为：
一种葡萄籽蛋白酶解物的制备方法，包括以下步骤：
(1)葡萄籽的预处理：将干燥的葡萄籽粉碎，得葡萄籽粉；
(2)制备葡萄籽蛋白：
将葡萄籽粉和石油醚按照1g：1.5～2.5ml的料液比混合均匀，在室温下静置4～6h后，待料液出现分层，回收下层沉淀物并清洗，得脱脂葡萄籽粉；
向脱脂葡萄籽粉中加入0.05～0.15mol/L的氢氧化钠溶液，在40～50℃下浸提1.5～2.5h后，再在4℃下离心，取上清液，得碱性溶液；所述脱脂葡萄籽粉的质量与氢氧化钠溶液的体积比为1g：10～20ml；
向碱性溶液中加入盐酸溶液至pH值为3.8，静置至蛋白质完全沉淀，得蛋白质混合液；
将蛋白质混合液在4℃下离心，回收沉淀物，再冷冻干燥，得葡萄籽蛋白；
(3)酶解葡萄籽蛋白：
将葡萄籽蛋白和生物酶按照1:0.005～0.025的质量比，完全溶解于水中，在40～60℃下进行酶解反应，得多肽混合液；所述生物酶为碱性蛋白酶或复合蛋白酶，所述复合蛋白酶由碱性蛋白酶和中性蛋白酶组成；
将多肽混合液在4℃下离心，回收沉淀物，再干燥沉淀物，得葡萄籽蛋白酶解物。
进一步，所述步骤(1)中，葡萄籽粉过80～120目筛；
所述步骤(2)中，所述将脱脂葡萄籽粉在氢氧化钠溶液中浸提后，在3500～4500r/min下，离心15min；
所述蛋白质混合液在3500～4500r/min下，离心15min；
所述步骤(3)中，所述生物酶为碱性蛋白酶时，反应时间为0.5～4h，反应pH值为7.0～8.6；所述生物酶为复合蛋白酶时，反应时间为1～5h，反应pH值为6.2～7.8。
再进一步，所述步骤(2)中，所述盐酸溶液的浓度为3～5mol/L；
所述步骤(3)中，采用氢氧化钠溶液和盐酸溶液调整溶液pH值。
再进一步，所述步骤(2)中，所述冷冻干燥的温度为-45～-55℃；
所述步骤(3)中，所述多肽混合液在3500～4500r/min下，离心15min。
再进一步，所述步骤(2)中，所述将葡萄籽粉和石油醚按照1g：2ml的料液比混合，静置5h；
所述氢氧化钠溶液的浓度为0.1mol/L；
所述盐酸溶液的浓度为4mol/L；
所述步骤(3)中，所述干燥温度为35～45℃。
再进一步，所述步骤(2)中，所述脱脂葡萄籽粉的质量与氢氧化钠溶液的体积比为1g：15ml；
所述步骤(3)中，所述葡萄籽蛋白和生物酶的质量比为1:0.02。
再进一步，所述步骤(2)中，所述浸提温度为45℃，时间为2h。
再进一步，所述步骤(2)中，所述将脱脂葡萄籽粉在氢氧化钠溶液中浸提后，在4000r/min下离心；
所述将蛋白质混合液在4000r/min下离心；
所述步骤(3)中，多肽混合液在4000r/min下离心。
再进一步，所述步骤(2)中，所述冷冻干燥的温度为-50℃；
所述步骤(3)中，所述干燥温度为40℃。
本发明的另一个目的在于提供一种葡萄籽蛋白酶解物，该葡萄籽蛋白酶解物由上述任一项制备方法制备得到，该葡萄籽蛋白酶解物主要为葡萄籽多肽，多肽具有较好的抗氧化活性和生物活性。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明所述的一种葡萄籽蛋白酶解物及其制备方法，采用的生物酶为蛋白酶，易得且催化效果好；采用葡萄籽为原料，可以提高葡萄的综合利用率，减少资源浪费。
2、本发明所述的一种葡萄籽蛋白酶解物及其制备方法，在生物酶酶解葡萄籽蛋白的反应中，设置合适的pH值、酶添加量、酶解温度和酶解时间，从而可以缩短工艺时间，提高葡萄籽多肽的抗氧化活性和生物活性等。
3、本发明所述的一种葡萄籽蛋白酶解物及其制备方法，制备出的葡萄籽粗多肽具有较好的抗氧化活性和生物活性，并且易被人体吸收。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明一种葡萄籽蛋白酶解物及其制备方法，达到预期发明目的，以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种葡萄籽蛋白酶解物及其制备方法，其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一个实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构或特点可由任何合适形式组合。
在详细阐述本发明一种葡萄籽蛋白酶解物及其制备方法之前，有必要对本发明中提及的相关材料和方法做进一步说明，以达到更好的效果。
实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件进行。实施例中所用原料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明中葡萄籽蛋白的提取采用碱溶酸沉法，其原理是利用混合物中各组分酸碱性差异而进行分离，该法操作简便，且葡萄籽蛋白的提取率可达60％之上。
本发明中采用的原料为：
葡萄籽，本发明实施例中的葡萄籽指从葡萄皮和残渣中剥离的，及未经任何处理的新鲜葡萄籽。
本发明中采用的试剂为：
(石油醚、氢氧化钠溶液、盐酸溶液均为国产分析纯)
石油醚是无色透明液体，有煤油气味。主要为戊烷和己烷的混合物。不溶于水，溶于无水乙醇、苯、氯仿、油类等多数有机溶剂。易燃易爆，与氧化剂可强烈反应。主要用作溶剂和油脂处理。一般有30～60℃、60～90℃、90～120℃等沸程规格。本发明采用的为30～60℃沸程的石油醚。
氢氧化钠，化学式为NaOH，俗称烧碱、火碱、苛性钠，为一种具有强腐蚀性的强碱，一般为片状或颗粒形态，易溶于水(溶于水时放热)并形成碱性溶液，另有潮解性，易吸取空气中的水蒸气(潮解)和二氧化碳(变质)。
盐酸是氢氯酸的俗称，是氯化氢(HCl)气体的水溶液，为无色透明的一元强酸。盐酸为不同浓度的氯化氢水溶液，呈透明无色或黄色，有刺激性气味和强腐蚀性。易溶于水、乙醇、乙醚和油等。
生物酶为蛋白酶，它广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中，是一种重要的工业酶制剂，能催化蛋白质和多肽肽键水解，具有高效性和专一性，且反应条件温和。
碱性蛋白酶，指在碱性条件下能够水解蛋白质肽键的酶。碱性蛋白酶是经细菌原生质体诱变方法造育的2709枯草杆微生物通过深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，属于一种丝氨酸脆外高碱性蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力。
中性蛋白酶是由枯草芽孢杆菌经发酵提取而得的，属于一种内切酶，可用于各种蛋白质水解处理。在一定温度、pH值下，能将大分子蛋白质水解为氨基酸等产物。可广泛应用于动植物蛋白的水解，制取生产高级调味品和食品营养强化剂的HAP和HVP，此外还可用于皮革脱毛、软化、羊毛丝绸脱胶等加工。
下面将结合具体的实施例，对本发明一种葡萄籽蛋白酶解物及其制备方法做进一步的详细介绍：
实施例1.
(1)葡萄籽的预处理：将葡萄籽从葡萄皮和残渣中分离出来，并将其在太阳下自然风干，取200g的干燥葡萄籽过筛去除杂质，粉碎，过80目筛，得葡萄籽粉；
(2)制备葡萄籽蛋白：
①将100g葡萄籽粉和200ml石油醚混合均匀，在室温下静置5h后，料液出现分层，回收上层溶剂，将下层沉淀物用蒸馏水清洗干净，得脱脂葡萄籽粉；所述葡萄籽粉的质量与石油醚的体积比为1g：2ml；
②向50g脱脂葡萄籽粉中加入500ml的0.15mol/L的氢氧化钠溶液，在40℃下浸提2.5h后，在4℃、4000r/min下，离心15min，取上清液，得碱性溶液；所述脱脂葡萄籽粉的质量与氢氧化钠溶液的体积比为1g：10ml；
③向碱性溶液中加入4mol/L盐酸溶液至pH值为3.8，静置至蛋白质完全沉淀，得蛋白质混合液；
④将蛋白质混合液在4℃、4000r/min下，离心15min，回收沉淀物，再在-45℃下冷冻干燥，得葡萄籽蛋白；
(3)酶解葡萄籽蛋白：
①称取10g葡萄籽蛋白和0.2g复合蛋白酶(其中碱性蛋白酶和中性蛋白酶质量比为3:1)，并将其完全溶解于水中，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调整溶液pH值至7.4，在50℃下进行酶解反应，反应3h，此时溶液中出现多肽沉淀物，得多肽混合液；所述葡萄籽蛋白和复合蛋白酶的质量比为1：0.02；
②将多肽混合液在4℃、4000r/min下，离心15min后，回收沉淀物，再在45℃下烘干沉淀物，得葡萄籽蛋白酶解物。
本实施例所述的一种葡萄籽蛋白酶解物及其制备方法的参数，通过单因素实验及响应面分析其酶水解能力，得到的响应值为23.33％，是理论值的95.34％，十分接近预测响应值，符合要求。
对葡萄籽蛋白酶解物(主要为葡萄籽多肽)清除自由基的能力进行测定，将1ml不同浓度葡萄籽蛋白酶解物与3ml的1.43mmoL/L的DPPH自由基反应，反应平衡时于517nm处测定吸光度，研究其对DPPH自由基的清除率。当葡萄籽蛋白酶解物浓度在120μg/mL-600μg/mL的质量浓度范围内，其清除自由基DPPH的能力为19.25-41.03％，并且葡萄籽蛋白酶解物对清除自由基的能力随着其浓度的增加而增强；而常规方法当葡萄籽蛋白酶解物浓度在120-600μg/mL的质量浓度范围内，其清除自由基DPPH的能力为14.21-32.14％。
本发明实施例所述的一种葡萄籽蛋白酶解物及其制备方法，采用的生物酶为蛋白酶，易得且催化效果好；采用葡萄籽为原料，可以提高葡萄的综合利用率；在生物酶酶解葡萄籽蛋白的反应中，设置合适的pH值、酶添加量、酶解温度和酶解时间，从而可以缩短工艺时间，提高葡萄籽蛋白酶解物的抗氧化活性和生物活性等，使得制备出的葡萄籽蛋白酶解物易具有较好的抗氧化活性和生物活性，并且易被人体吸收。
实施例2.
(1)葡萄籽的预处理：将葡萄籽从葡萄皮和残渣中分离出来，并将其在太阳下自然风干，取200g的干燥葡萄籽过筛去除杂质，粉碎，过100目筛，得葡萄籽粉；
(2)制备葡萄籽蛋白：
①将100g葡萄籽粉和150ml石油醚混合均匀，在室温下静置4h后，料液出现分层，回收上层溶剂，将下层沉淀物用蒸馏水清洗干净，得脱脂葡萄籽粉；所述葡萄籽粉的质量与石油醚的体积比为1g：1.5ml；
②向50g脱脂葡萄籽粉中加入750ml的0.1mol/L的氢氧化钠溶液，在45℃下浸提5h后，在4℃、3500r/min下，离心15min，取上清液，得碱性溶液；所述脱脂葡萄籽粉的质量与氢氧化钠溶液的体积比为1g：15ml；
③向碱性溶液中加入3mol/L盐酸溶液至pH值为3.8，静置至蛋白质完全沉淀，得蛋白质混合液；
④将蛋白质混合液在4℃、3500r/min下，离心15min，回收沉淀物，再在-50℃下冷冻干燥，得葡萄籽蛋白；
(3)酶解葡萄籽蛋白：
①将10g葡萄籽蛋白和0.05g复合蛋白酶(其中碱性蛋白酶和中性蛋白酶质量比为2：1)，并将其完全溶解于水中，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调整溶液pH值至7.8，在40℃下进行酶解反应，反应5h，此时溶液中出现多肽沉淀物，得多肽混合液；所述葡萄籽蛋白和复合蛋白酶的质量比为1：0.005；
②将多肽混合液在4℃、3500r/min下，离心15min，回收沉淀物，再在35℃下烘干沉淀物，得葡萄籽蛋白酶解物。
对葡萄籽蛋白酶解物(主要为葡萄籽多肽)清除自由基的能力进行测定，将1ml不同浓度葡萄籽蛋白酶解物与3ml的1.43mmoL/L的DPPH自由基反应，反应平衡时于517nm处测定吸光度，研究其对DPPH自由基的清除率。当葡萄籽蛋白酶解物浓度在120μg/mL-600μg/mL的质量浓度范围内，其清除自由基DPPH的能力为20.68-42.56％，并且葡萄籽蛋白酶解物对清除自由基的能力随着其浓度的增加而增强；而常规方法当葡萄籽蛋白酶解物浓度在120μg/mL-600μg/mL的质量浓度范围内，其清除自由基DPPH的能力为14.21-32.14％。
本发明实施例所述的一种葡萄籽蛋白酶解物及其制备方法，采用的生物酶为蛋白酶，易得且催化效果好；采用葡萄籽为原料，可以提高葡萄的综合利用率；在生物酶酶解葡萄籽蛋白的反应中，设置合适的pH值、酶添加量、酶解温度和酶解时间，从而可以缩短工艺时间，提高葡萄籽多肽的抗氧化活性和生物活性等，使得制备出的葡萄籽多肽易具有较好的抗氧化活性和生物活性，并且易被人体吸收。
实施例3.
(1)葡萄籽的预处理：将葡萄籽从葡萄皮和残渣中分离出来，并将其在太阳下自然风干，取200g的干燥葡萄籽过筛去除杂质，粉碎，过100目筛，得葡萄籽粉；
(2)制备葡萄籽蛋白：
①将100g葡萄籽粉和250ml石油醚混合均匀，在室温下静置6h后，料液出现分层现象，回收上层溶剂，将下层沉淀物用蒸馏水清洗干净，得脱脂葡萄籽粉；所述葡萄籽粉的质量与石油醚的体积比为1g：2.5ml；
②向50g脱脂葡萄籽粉中加入700ml的0.8mol/L的氢氧化钠溶液，在43℃下浸提140min后，在4℃、4500r/min下，离心15min，取上清液，得碱性溶液；所述脱脂葡萄籽粉的质量与氢氧化钠溶液的体积比为1g：140ml；
③向碱性溶液中加入5mol/L盐酸溶液至pH值为3.8，静置至蛋白质完全沉淀，得蛋白质混合液；
④将蛋白质混合液在4℃、3500r/min下，离心15min，回收沉淀物，再在-48℃下冷冻干燥，得葡萄籽蛋白；
(3)酶解葡萄籽蛋白：
①将10g葡萄籽蛋白和0.25g复合蛋白酶(其中碱性蛋白酶和中性蛋白酶质量比为1：1)，并将其完全溶解于水中，用1moi/L的盐酸溶液调整溶液pH值至6.2，在60℃下进行酶解反应，反应1h，此时溶液中出现多肽沉淀物，得多肽混合液；所述葡萄籽蛋白和复合蛋白酶的质量比为1：0.25；
②将多肽混合液在4℃、4500r/min下，离心15min，回收沉淀物，再在43℃下烘干沉淀物，得葡萄籽蛋白酶解物。
对葡萄籽蛋白酶解物(主要为葡萄籽多肽)清除自由基的能力进行测定，将1ml不同浓度葡萄籽蛋白酶解物与3ml的1.43mmoL/L的DPPH自由基反应，反应平衡时于517nm处测定吸光度，研究其对DPPH自由基的清除率。当葡萄籽蛋白酶解物浓度在120μg/mL-600μg/mL的质量浓度范围内，其清除自由基DPPH的能力为18.42-38.47％，并且葡萄籽蛋白酶解物对清除自由基的能力随着其浓度的增加而增强；而常规方法当葡萄籽蛋白酶解物浓度在120μg/mL-600μg/mL的质量浓度范围内，其清除自由基DPPH的能力为14.21-32.14％。
本发明实施例所述的一种葡萄籽蛋白酶解物及其制备方法，采用的生物酶为蛋白酶，易得且催化效果好；采用葡萄籽为原料，可以提高葡萄的综合利用率；在生物酶酶解葡萄籽蛋白的反应中，设置合适的pH值、酶添加量、酶解温度和酶解时间，从而可以缩短工艺时间，提高葡萄籽多肽的抗氧化活性和生物活性等，使得制备出的葡萄籽粗多肽易具有较好的抗氧化活性和生物活性，并且易被人体吸收。
实施例4.
(1)葡萄籽的预处理：将葡萄籽从葡萄皮和残渣中分离出来，并将其在太阳下自然风干，取200g的干燥葡萄籽过筛去除杂质，粉碎后，过120目筛，得葡萄籽粉；
(2)制备葡萄籽蛋白：
①将100g葡萄籽粉和200ml石油醚混合均匀，在室温下静置5h后，料液出现分层，回收上层溶剂，将下层沉淀物用蒸馏水清洗干净，得脱脂葡萄籽粉；所述葡萄籽粉的质量与石油醚的体积比为1g：2ml；
②向50g脱脂葡萄籽粉中加入1000ml的0.05mol/L的氢氧化钠溶液，在50℃下浸提1.5h后，在4℃、4000r/min下，离心15min，取上清液，得碱性溶液；所述脱脂葡萄籽粉的质量与氢氧化钠溶液的体积比为1g：20ml；
③向碱性溶液中加入4mol/L盐酸溶液至pH值为3.8，静置至蛋白质完全沉淀，得蛋白质混合液；
④将蛋白质混合液在4℃、4000r/min下，离心15min，回收沉淀物，再在-55℃下冷冻干燥，得葡萄籽蛋白；
(3)酶解葡萄籽蛋白：
①将10g葡萄籽蛋白和0.2g碱性蛋白酶完全溶解于水中，用0.05mol/L的氢氧化钠溶液调整溶液pH值至8.6，在50℃下进行酶解反应，反应3h，此时溶液中出现多肽沉淀物，得多肽混合液；所述葡萄籽蛋白和碱性蛋白酶的质量比为1：0.02；
②将多肽混合液在4℃、4000r/min下，离心15min，回收沉淀物，再在40℃下烘干沉淀物，得葡萄籽蛋白酶解物。
对葡萄籽蛋白酶解物(主要为葡萄籽多肽)抑制油脂氧化活性进行测定，把浓度为0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％的葡萄籽蛋白酶解物分别溶于葵花籽油中，在65℃条件下，每隔两天观察葡萄籽蛋白酶解物对葵花籽油氧化的抑制作用。当葡萄籽蛋白酶解物浓度为0.15％时，油脂抗氧化效果较好；把浓度为0.15％的不同抗氧化剂(VE、VC和葡萄籽蛋白酶解物)分别溶于葵花籽油中，在65℃条件下，每隔两天观察葡萄籽蛋白酶解物对葵花籽油氧化的抑制作用，在2-8d期间，0.15％葡萄籽蛋白酶解物的油脂抗氧化效果与同浓度的VE和VC相当。
本发明实施例所述的一种葡萄籽蛋白酶解物及其制备方法，采用的生物酶为蛋白酶，易得且催化效果好；采用葡萄籽为原料，可以提高葡萄的综合利用率；在生物酶酶解葡萄籽蛋白的反应中，设置合适的pH值、酶添加量、酶解温度和酶解时间，从而可以缩短工艺时间，提高葡萄籽多肽的抗氧化活性和生物活性等，使得制备出的葡萄籽多肽易具有较好的抗氧化活性和生物活性，并且易被人体吸收。
实施例5.
(1)葡萄籽的预处理：将葡萄籽从葡萄皮和残渣中分离出来，并将其在太阳下自然风干，取200g的干燥葡萄籽过筛去除杂质，粉碎，过100目筛，得葡萄籽粉；
(2)制备葡萄籽蛋白：
①将100g的葡萄籽粉和165ml的石油醚混合均匀，在室温下静置5.5h后，料液出现分层，回收上层溶剂，将下层沉淀物用蒸馏水清洗干净，得脱脂葡萄籽粉；所述葡萄籽粉的质量与石油醚的体积比为1g：1.65ml；
②向50g脱脂葡萄籽粉中加入600ml的0.1mol/L的氢氧化钠溶液，在48℃下浸提130min后，在4℃、3500r/min下，离心15min，取上清液，得碱性溶液；所述脱脂葡萄籽粉的质量与氢氧化钠溶液的体积比为1g：12ml；
③向碱性溶液中加入4mol/L盐酸溶液至pH值为3.8，静置至蛋白质完全沉淀，得蛋白质混合液；
④将蛋白质混合液在4℃、4000r/min下，离心15min，回收沉淀物，再在-48℃下冷冻干燥，得葡萄籽蛋白；
(3)酶解葡萄籽蛋白：
①将10g葡萄籽蛋白和0.05g碱性蛋白酶完全溶解于水中，水的pH值为7，在40℃下进行酶解反应，反应4h，此时溶液中出现多肽沉淀物，得多肽混合液；所述葡萄籽蛋白和碱性蛋白酶的质量比为1：0.005；
②将多肽混合液在4℃、4000r/min下，离心15min，回收沉淀物，再在42℃下烘干沉淀物，得葡萄籽蛋白酶解物。
对葡萄籽蛋白酶解物(主要为葡萄籽多肽)清除自由基的能力进行测定，将1ml不同浓度葡萄籽蛋白酶解物与3ml的1.43mmoL/L的DPPH自由基反应，反应平衡时于517nm处测定吸光度，研究其对DPPH自由基的清除率。当葡萄籽蛋白酶解物浓度在120μg/mL-600μg/mL的质量浓度范围内，其清除自由基DPPH的能力为19.03-40.35％，并且葡萄籽蛋白酶解物对清除自由基的能力随着其浓度的增加而增强。
本发明实施例所述的一种葡萄籽蛋白酶解物及其制备方法，采用的生物酶为蛋白酶，易得且催化效果好；采用葡萄籽为原料，可以提高葡萄的综合利用率；在生物酶酶解葡萄籽蛋白的反应中，设置合适的pH值、酶添加量、酶解温度和酶解时间，从而可以缩短工艺时间，提高葡萄籽多肽的抗氧化活性和生物活性等，使得制备出的葡萄籽多肽易具有较好的抗氧化活性和生物活性，并且易被人体吸收。
实施例6.
(1)葡萄籽的预处理：将葡萄籽从葡萄皮和残渣中分离出来，并将其在太阳下自然风干，取200g的干燥葡萄籽过筛去除杂质，粉碎，过100目筛，得葡萄籽粉；
(2)制备葡萄籽蛋白：
①将100g的葡萄籽粉和220ml石油醚混合均匀，在室温下静置4.5h后，料液出现分层，回收上层溶剂，将下层沉淀物用蒸馏水清洗干净，得脱脂葡萄籽粉；所述葡萄籽粉的质量与石油醚的体积比为1g：2.2ml；
②向50g脱脂葡萄籽粉中加入600ml的0.1mol/L的氢氧化钠溶液，在50℃下浸提2.5h后，在4℃、4000r/min下，离心15min，取上清液，得碱性溶液；所述脱脂葡萄籽粉的质量与氢氧化钠溶液的体积比为1g：12ml；
③向碱性溶液中加入3mol/L盐酸溶液至pH值为3.8，静置至蛋白质完全沉淀，得蛋白质混合液；
④将蛋白质混合液在4℃、4000r/min下，离心15min，回收沉淀物，再在-51℃下冷冻干燥，得葡萄籽蛋白；
(3)酶解葡萄籽蛋白：
①将10g葡萄籽蛋白和0.25g碱性蛋白酶完全溶解于水中，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液整溶液pH值至8.2，在60℃下进行酶解反应，反应0.5h，此时溶液中出现多肽沉淀物，得多肽混合液；所述葡萄籽蛋白和碱性蛋白酶的质量比为1：0.025；
②将多肽混合液在4℃、4000r/min下，离心15min，回收沉淀物，再在40℃下烘干沉淀物，得葡萄籽蛋白酶解物。
对葡萄籽蛋白酶解物(主要为葡萄籽多肽)清除自由基的能力进行测定，将1ml不同浓度葡萄籽蛋白酶解物与3ml的1.43mmoL/L的DPPH自由基反应，反应平衡时于517nm处测定吸光度，研究其对DPPH自由基的清除率。当葡萄籽蛋白酶解物浓度在120μg/mL-600μg/mL的质量浓度范围内，其清除自由基DPPH的能力为18.47-40.89％，并且葡萄籽蛋白酶解物对清除自由基的能力随着其浓度的增加而增强。
本发明实施例所述的一种葡萄籽蛋白酶解物及其制备方法，采用的生物酶为蛋白酶，易得且催化效果好；采用葡萄籽为原料，可以提高葡萄的综合利用率；在生物酶酶解葡萄籽蛋白的反应中，设置合适的pH值、酶添加量、酶解温度和酶解时间，从而可以缩短工艺时间，提高葡萄籽多肽的抗氧化活性和生物活性等，使得制备出的葡萄籽多肽易具有较好的抗氧化活性和生物活性，并且易被人体吸收。
以上所述，仅是本发明实施例的较佳实施例而已，并非对本发明实施例作任何形式上的限制，依据本发明实施例的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明实施例技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种葡萄籽蛋白酶解物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)葡萄籽的预处理：将干燥的葡萄籽粉碎，得葡萄籽粉；
(2)制备葡萄籽蛋白：
将葡萄籽粉和石油醚按照1g：1.5～2.5ml的料液比混合均匀，在室温下静置4～6h后，待料液出现分层，回收下层沉淀物并清洗，得脱脂葡萄籽粉；
向脱脂葡萄籽粉中加入0.05～0.15mol/L的氢氧化钠溶液，在40～50℃下浸提1.5～2.5h后，再在4℃下离心，取上清液，得碱性溶液；所述脱脂葡萄籽粉的质量与氢氧化钠溶液的体积比为1g：10～20ml；
向碱性溶液中加入盐酸溶液至pH值为3.8，静置至蛋白质完全沉淀，得蛋白质混合液；
将蛋白质混合液在4℃下离心，回收沉淀物，再冷冻干燥，得葡萄籽蛋白；
(3)酶解葡萄籽蛋白：
将葡萄籽蛋白和生物酶按照1:0.005～0.025的质量比，完全溶解于水中，在40～60℃下进行酶解反应，得多肽混合液；所述生物酶为碱性蛋白酶或复合蛋白酶，所述复合蛋白酶由碱性蛋白酶和中性蛋白酶组成；
将多肽混合液在4℃下离心，回收沉淀物，再干燥沉淀物，得葡萄籽蛋白酶解物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中，
所述步骤(1)中，葡萄籽粉过80～120目筛；
所述步骤(2)中，所述将脱脂葡萄籽粉在氢氧化钠溶液中浸提后，在3500～4500r/min下，离心15min；
所述蛋白质混合液在3500～4500r/min下，离心15min；
所述步骤(3)中，所述生物酶为碱性蛋白酶时，反应时间为0.5～4h，反应pH值为7.0～8.6；所述生物酶为复合蛋白酶时，反应时间为1～5h，反应pH值为6.2～7.8。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，其中，
所述步骤(2)中，所述盐酸溶液的浓度为3～5mol/L；
所述步骤(3)中，采用氢氧化钠溶液和盐酸溶液调整溶液pH值。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，其中，
所述步骤(2)中，所述冷冻干燥的温度为-45～-55℃；
所述步骤(3)中，所述多肽混合液在3500～4500r/min下，离心15min。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，其中，
所述步骤(2)中，所述将葡萄籽粉和石油醚按照1g：2ml的料液比混合，静置5h；
所述氢氧化钠溶液的浓度为0.1mol/L；
所述盐酸溶液的浓度为4mol/L；
所述步骤(3)中，所述干燥温度为35～45℃。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，其中，
所述步骤(2)中，所述脱脂葡萄籽粉的质量与氢氧化钠溶液的体积比为1g：15ml；
所述步骤(3)中，所述葡萄籽蛋白和生物酶的质量比为1:0.02。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，其中，
所述步骤(2)中，所述浸提温度为45℃，时间为2h。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，其中，
所述步骤(2)中，所述将脱脂葡萄籽粉在氢氧化钠溶液中浸提后，在4000r/min下离心；
所述将蛋白质混合液在4000r/min下离心；
所述步骤(3)中，多肽混合液在4000r/min下离心。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，其中，
所述步骤(2)中，所述冷冻干燥的温度为-50℃；
所述步骤(3)中，所述干燥温度为40℃。
10.一种葡萄籽蛋白酶解物，其特征在于，所述葡萄籽蛋白酶解物由权利要求1～9任一项制备方法制备得到。
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