CN1928110A - 浊点系统两相分配生物反应器在酶法水解青霉素制备6－apa中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了浊点系统在酶法水解青霉素制备6－氨基头孢烷酸(6－APA)中的应用。具体是采用浊点系统两相分配生物反应器技术，用青霉素酰化酶酶法水解青霉素G制备半合成β－内酰胺抗生素的关键中间体6－APA。所述方法直接萃取发酵液中的青霉素而删除了青霉素的结晶过程，同时在水解过程中实现了苯乙酸(PAA)的直接萃取，不需添加酸碱来控制过程的pH，减少了废物的产生。本发明还公开了一种采用浊点系统两相分配生物反应器技术，用酶法水解青霉素制备6－APA的方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及工业生物催化领域中应用浊点系统在酶法水解青霉素制备6-APA中的应用。
背景技术
青霉素酶法水解如式1所示，酶法水解青霉素(PG)制备6-氨基青霉烷酸(6-APA)并产生副产物苯乙酸(PAA)是抗生素工业的重要基础。
式1
青霉素水解工艺国内外普遍采用酶转化技术，其基本的工艺过程如图1所示(Abian et al，Improving the industrial production of 6-APA：enzymatichydrolysis of penicillin G in the presence of organic solvents.Biotechnol Prog，2003，19：1639-1642)。现行工艺采用反复调节溶液pH的萃取、结晶后再实现酶法青霉素钾盐的水解。这一工艺不但因为反复调节溶液的pH而产生大量工业废物，同时繁杂的青霉素结晶工艺增加了操作费用和设备投资(van de Sandt et al，Innovations in cephalosporin and penicillinproduction：painting the antibiotics industry green.Chim.Oggi.2000，18：72-75)。
国外已经开始探索非水相催化以删除分离纯化青霉素发酵液的结晶过程，即采用水—有机溶剂两相系统的酶法水解技术。一种方法是发酵液萃取后调节至高pH(7-8)后，不进行青霉素结晶工艺而直接进行水解过程。虽不能实现萃取水解，但删除了结晶工艺，保证了青霉素酰化酶在高活性条件下操作仍具有很大的优势。其不能工业化的主要原因是青霉素酰化酶在水—有机溶剂两相系统中的稳定性显著降低，提高青霉素酰化酶在水—有机溶剂两相系统中的稳定性成为国内外催化剂工程研究的热点问题(Abian et al，Improving theindustrial production of 6-APA：enzymatic hydrolysis of penicillin G inthe presence of organic solvents.Biotechnol Prog，2003，19：1639-164)。另一种方法是在低pH(3-5)条件下实现萃取水解反应，其主要优点是：不需反复调节pH，环境友好，减少了酸碱消耗；实现了对反应副产物PAA的萃取，使反应向水解方向进行；产物6-APA可同时结晶，减少了下游分离费用。但青霉素酰化酶在低pH时活性降低是限制了其工业化过程的重要因素之一(denHollander et al，Discrete countercurrent contacting：an experimentalmethod for developing continuous countercurrent reactors.Ind.Eng.Chem.Res.2005，44，231-235)；在低pH条件下，酶在有机溶剂中的稳定性也是一个需要考察的重要因素。
为了提高非水相催化的效率，除采用催化剂工程技术外，介质工程已成为国内外研究的又一热点。除水-有机溶剂两相系统外，双水相系统、超临界系统、离子液体等新技术也相继出现。非离子表面活性剂水溶液在温度高于某一温度时形成互不相溶的两相，这一温度称为浊点。这一表面活性剂水溶液系统称为浊点系统。浊点系统中的溶质将不均匀地分配于浊点系统的两相，利用这一系性质而而分离或浓缩溶质的技术称为浊点萃取(Wang et al，Determinationof solubilization of phenol at coacervate phase of cloud point extraction.Colloids Surf.A.2003，216：207-214)。
底物、产物和生物催化剂在两相系统将不均匀地分配于系统的两相，其中一相充当着底物的贮存库和产物的萃取剂，从而实现底物的原位添加和产物的原位萃取，这一技术称为两相分配生物反应器。浊点系统应用于酶催化反应或生物转化过程常称为浊点系统两相分配生物反应器。其优势有：非离子表面活性剂在操作温度下基本不挥发，环境友好；系统具有特殊的微水环境结构，使酶、微生物保持了高度活性和稳定性；溶质在系统中分配的可调节因素多，操作弹性大；操作工艺和常规水-有机溶剂两相系统基本一致，工业化基础好(Wang et al，Microbial transformation of hydrophobic compounds in cloudpoint system.J.Mol.Cata.B-Enzym.2004，27：147-153；Wang et al，Cloudpoint system as a tool to improve the efficiency of biotransformation.Enzyme Microb.Technol.2005，36(4)：589-594；)。本领域迫切需要开发浊点系统两相分配生物反应器的新用途，尤其是在酶法水解青霉素制备6-氨基头孢烷酸(6-APA)中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供了浊点系统在酶法水解青霉素制备6-氨基头孢烷酸(6-APA)中的应用。
本发明的另一目的是提供了一种采用浊点系统两相分配生物反应器技术，用酶法水解青霉素制备6-APA的方法。
本发明的第一方面提供了浊点系统两相分配反应器技术在用酶法水解青霉素制备6-APA中的应用。
较佳的，所述浊点系统是指非离子表面活性剂溶液形成的两相系统；所述的非离子表面活性剂是选自聚氧乙烯型非离子表面活性剂，多元醇系非离子表面活性剂，聚醚型非离子表面活性剂或烷醇酰胺系非离子表面活性剂中的一种或二种非离子表面活性剂。优选的，所述非离子表面活性剂是聚氧乙烯醇类非离子表面活性剂。更佳的，所述的非离子表面活性剂是Tergrtiol TMN-3和/或Brij30。
优选的，所述非离子表面活性剂与青霉素溶液体积比为1∶5。
在一优选例中，所述浊点系统包含二种非离子表面活性剂。优选的，所述二种非离子表面活性剂的体积比为1∶0.5~1∶2。
本发明的第二方面提供了一种采用浊点系统两相分配生物反应器技术，用酶法水解青霉素制备6-APA的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)调节pH为2-3，采用浊点萃取技术萃取青霉素发酵液中的青霉素；
(b)调节pH为5-6，实现青霉素的酶法水解；
(c)调节pH为3.9，实现6-APA的结晶分离
所述步骤(a)中萃取青霉素时不经过结晶过程。
所述浊点系统中青霉素水解技术采取常规的批式操作模式、半连续对流操作模式或者连续对流操作模式。
所述的浊点系统是指非离子表面活性剂溶液形成的两相系统。
所述的非离子表面活性剂选自聚氧乙烯型非离子表面活性剂，多元醇系非离子表面活性剂，聚醚型非离子表面活性剂或烷醇酰胺系非离子表面活性剂中的一种或二种非离子表面活性剂。
优选的，所述非离子表面活性剂是聚氧乙烯醇类非离子表面活性剂。更佳的，所述的非离子表面活性剂是Tergrtiol TMN-3和/或Brij30。
优选的，所述非离子表面活性剂与青霉素溶液体积比为1∶5。
在一优选例中，所述浊点系统包含二种非离子表面活性剂。优选的，所述二种非离子表面活性剂的体积比为1∶0.5~1∶2。
发明人在研究浊点系统的基本性质的基础上，首次成功地将其开发为一种新的生物催化介质而应用于酶法水解青霉素制备6-氨基头孢烷酸。
本发明优选使用Tergitol TMN-3。非离子表面活性剂Tergitol TMN-3(厂家Fulka，分子式如式2所示)的水溶液在室温下会形成表面活性剂浓度很高的凝聚层相和表面活性剂浓度很低的稀相。
式2
在37℃条件下，表面活性剂与水溶液的体积比为2∶10，水溶液中青霉素原始浓度为2g/100ml时，不同pH下凝聚层相的萃取效率如图2所示。这表明在较低pH条件下可以实现青霉素的萃取。同时调节适当的pH，可以改变青霉素在两相系统中的分配。
本发明中通过添加酸碱来调节PH，如HCl，NaOH等。
苯乙酸在浊点系统中分配是决定两相分配生物反应器应用于青霉素水解的关键。在37℃，表面活性剂与水溶液的体积比为2∶10，水溶液中青霉素原始浓度为0.5g/100ml条件下PAA的分配系数如图3所示。在pH低于6时，PAA的分配系数大于1，表明浊点系统对PAA有萃取作用，而在pH大于7时，PAA基本上分配于稀相。因此，调节浊点系统在较低的pH可实现两相分配生物反应器对PAA的萃取反应，解除PAA对水解反应的抑制，同时使反应平衡向水解方向移动。而调节浊点系统在较高的pH，可以实现对PAA的反萃，实现PAA和表面活性剂的分离，以便回收副产物和实现表面活性剂的循环利用。
6-APA是青霉素水解的目标产物。在37℃条件下，6-APA在水溶液中的饱和溶解度和在非离子表面活性剂与6-APA饱和水溶液的体积比为2∶10时浊点萃取后的稀相6-APA浓度如图4所示。6-APA的溶解度随pH变化显著，在低pH时的溶解度很小。在不同pH条件下，6-APA基本上主要分配于稀相。这表明在低pH条件下，如果青霉素水解反应的产物浓度较高时会出现6-APA的反应结晶，从而解除6-APA对水解反应的抑制，同时使反应平衡向水解方向移动。
综合青霉素水解物系在浊点系统中的分配规律，调节适当的pH(4-6)，在浊点系统中实现青霉素水解有可能实现如图5的分配过程。同时6-APA还可能在浊点系统中的稀相结晶。青霉素在两相中分配，可以实现高底物浓度水解，解除了底物对酶活性的抑制，同时抑制了青霉素本身的降解。浊点系统对苯乙酸的萃取反应和6-APA的反应结晶，解除了产物对酶活性的抑制，同时移动了反应平衡，有利于反应向水解方向进行。
酶在浊点系统中的稳定性是实现青霉素在浊点系统两相分配生物反应器中水解的关键因素之一。在37℃条件下，固定化青霉素酰化酶在缓冲溶液、表面活性剂与缓冲溶液的体积比为2∶10的浊点系统中振荡8小时后酶的残留活性如图6所示。固定化酶在低pH下稳定性较差，而在高pH下具有较好的稳定性。酶在浊点系统中的稳定性也有相似的规律。这表明酶的不稳定性主要是由溶液的pH影响的，浊点系统对酶的稳定性影响较小。换句话说，固定化酶在浊点系统中具有较好的稳定性。
通过不同pH下青霉素的水解反应，发明人发现：在浊点系统中，产物浓度(包括结晶部分)明显高于对照系统，表明反应物系在浊点系统中两相的不平均分配有利于解除对酶的抑制和移动反应平衡向水解方向进行。而在缓冲溶液的对照系统中，产物浓度随pH的降低而降低。具体实验条件为：
固定化酶量为0.2±0.01g，表面活性剂与缓冲液体积比2∶10，青霉素浓度为2g/100ml的磷酸盐缓冲液10ml反应两小时(图7)。在缓冲溶液的对照系统中，产物浓度随pH的降低而降低。
发明人进一步研究了低pH下酶的水解(图8)：
pH为5.2，固定化酶量为0.2±0.01g，青霉素浓度为2g/100ml的磷酸盐缓冲液10ml反应两小时，不同表面活性剂与缓冲液体积比时青霉素的水解率(包括6-APA结晶部分)的结果如图8所示。这表明改变表面活性剂加量，在不添加酸碱调节pH的条件下有可能使青霉素彻底水解。
最后，发明人采用如图1所示的浊点系统两相分配生物反应器新工艺，克服了酶在非水溶剂中的不稳定性，以实现青霉素的分离与水解的过程集成，同时实现水解反应中不添加酸碱来控制pH。删除了青霉素发酵液萃取中的结晶工艺，减少了工业废物产生。在青霉素水解过程中直接萃取水解副产物苯乙酸，实现了PAA的反萃和表面活性剂的回收和循环利用，有利于降低成本，简化工艺。
本发明所述的非离子表面活性剂选自聚氧乙烯型非离子表面活性剂，多元醇系非离子表面活性剂，聚醚型非离子表面活性剂或烷醇酰胺系非离子表面活性剂。
其中所述的聚氧乙烯型非离子表面活性剂，包括脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO)、脂肪酸聚氧乙烯酯、烷基酚聚氧乙烯醚(APEO)、聚氧乙烯酰胺、聚氧乙烯脂肪胺、聚氧乙烯醇、吐温等。其中烷基酚聚氧乙烯醚类包括Triton X-100或Triton X-114(辛基酚聚氧乙烯醚类)；其中聚氧乙烯醇类包括Brij30，Brij35，Brij56，Tergitol TMN-3或C12E7；聚氧乙烯醚类包括包括Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、Span20、Span40、Span60或Span80；
所述的多元醇系非离子表面活性剂，包括脂肪酸乙二醇酯、单脂肪酸甘油酯(单甘酯)、季戊四醇脂肪酸酯、失水山梨醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯等。
所述的聚醚型非离子表面活性剂，包括环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物。
所述的烷醇酰胺系非离子表面活性剂包括脂肪酸二乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、氧化胺和烷基多苷(APG)等。
本发明所述的浊点系统两相分配生物反应器的优势有：非离子表面活性剂在操作温度下基本不挥发，环境友好；系统具有特殊的微水环境结构，使酶、微生物保持了高度活性和稳定性；溶质在系统中分配的可调节因素多，操作弹性大；操作工艺和常规水-有机溶剂两相系统基本一致，工业化基础好。本发明所述方法可实现PAA反萃和表面活性剂的循环利用，降低成本。
本发明的方法通过调节初始PH来控制青霉素萃取、水解和结晶的顺序进行，在每一步具体反应过程中不需要调节PH，操作简便。
附图说明
图1青霉素酶法水解新老工艺的比较
浊点系统两相分配生物反应器技术可直接从发酵液中萃取青霉素，而且水解过程不需添加酸碱控制过程的pH，同时实现6-APA的直接结晶
图2浊点系统萃取青霉素的效果
青霉素原始浓度为2g/100ml时不同pH时浊点萃取的效率
图3苯乙酸在浊点系统中的分配
37℃条件下表面活性剂与水溶液的体积比为2∶10，苯乙酸原始浓度为0.5g/100m时PAA的分配系数
图4 6-APA的饱和溶解度和在浊点系统中的分配
37℃条件下，6-APA的饱和溶解度和表面活性剂与6-APA饱和水溶液的体积比为2∶10时浊点萃取后稀相的6-APA浓度
图5青霉素在浊点系统中反应的原理示意图
图6固定化酶在浊点系统中的稳定性
37℃条件下，固定化青霉素酰化酶在缓冲溶液(上方曲线)和浊点系统(表面活性剂与缓冲液的体积比为2∶10，下方曲线)的酶残留活性的水解曲线。
图7不同pH下浊点系统中的青霉素水解
固定化酶为0.2g±0.01g，表面活性剂与缓冲液的体积比为2∶10，青霉素原始浓度为2g/100ml的缓冲液10ml反应两小时的结果。
图8低pH时不同表面活性剂加量的青霉素水解效果
pH为5.2，固定化酶为0.2g±0.01g，青霉素原始浓度为2g/100ml的缓冲液10ml反应两小时，不同表面活性剂与缓冲液体积比时青霉素的水解结果。(包括6-APA结晶部分)
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
1.萃取水解例子：
将青霉素浓度为8g/100ml的溶液按表面活性剂Tergitol TMN-3与青霉素溶液体积比为1∶5混合，调节pH至2.5以下，在室温下静置1小时以上后取出凝聚层相。在固定化酶为0.8±0.01g，初始pH7.8的磷酸盐缓冲液15ml，凝聚层相与缓冲液的体积比为1∶4，在反应3小时后，溶液的pH稳定于平衡值6.3，溶液相产物6-APA浓度(不包括结晶部分)达到114.1mM，而包括结晶部分的6-APA总浓度达到138.2mM。(这表明在高产物浓度和较高pH条件下6-APA也存在反应结晶过程)
2.萃取水解例子：
将青霉素浓度为2g/100ml的溶液按表面活性剂Brij 30与青霉素溶液体积比为1∶5混合，调节pH至3以下，在室温下静置2小时以上后取出凝聚层相。在固定化酶为0.29±0.01g，初始pH5.2的磷酸盐缓冲液10ml，凝聚层相与缓冲液的体积比为1∶5，在反应4小时后，溶液的pH稳定于平衡值5.1，产物6-APA浓度(包括结晶部分)达到37mM。(表明Brij 30，在低pH下的结晶过程)
3.萃取水解例子：
将青霉素浓度为8g/100ml的溶液按表面活性剂(Tergitol TMN-3：Brij30＝1∶0.5~1∶2)与青霉素溶液体积比为1∶5混合，调节pH至2以下，在室温下静置1.5小时以上后取出凝聚层相。在固定化酶为0.8±0.01g，初始pH6.2的磷酸盐缓冲液15ml，凝聚层相与缓冲液的体积比为1∶4，在反应3小时后，溶液的pH稳定于平衡值5.7，溶液相产物6-APA浓度(不包括结晶部分)达到43.4mM，而包括结晶部分的6-APA总浓度达到65.2mM。(表明混合表面活性剂也有浊点系统的效果)取出浊点系统的凝聚层相，加入等体积的水并调节pH到8以上，如图3所示，PAA基本分配于稀相，可实现PAA反萃和表面活性剂的循环利用。
4.萃取水解例子：
将青霉素浓度为8g/100ml的溶液按表面活性剂与青霉素溶液体积比为1∶5混合，调节pH至2.5左右，在室温下静置1小时以上后取出凝聚层相。在固定化酶为0.8±0.01g，初始pH7的磷酸盐缓冲液15ml，凝聚层相与缓冲液的体积比为1∶4，在反应3小时后，溶液的pH稳定于平衡值6.1，溶液相产物6-APA浓度(包括结晶部分)达到113.6mM。取出反应液的凝聚层相，按凝聚层相与水体积比为1∶4混合后调节至pH8。在室温下静置1小时以上后取出凝聚层相作为回收的表面活性剂重复青霉素萃取、浊点系统中水解过程，反应3小时后，产物浓度(包括结晶部分)为115mM。(表明表面活性剂可以重复利用)
5.离散式半连续萃取水解例子
在固定化酶为0.8±0.01g，初始pH7.8，底物浓度为8g/100ml的缓冲液15ml，表面活性剂与缓冲液的体积比为1∶4，在反应3小时过程中三次更换浊点系统的凝聚层相，每次产物6-APA的浓度分别为140mM、160mM和170mM。将凝聚层相更换为新鲜的表面活性剂溶液强化了浊点系统的萃取功能，使产物浓度进一步提高。这一离散式半连续操作模式表明采用半连续、连续对流等操作模式可进一步提高浊点系统中青霉素的水解效率。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.浊点系统两相分配反应器技术在用酶法水解青霉素制备6-APA中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述浊点系统是指非离子表面活性剂溶液形成的两相系统；所述的非离子表面活性剂选自聚氧乙烯型非离子表面活性剂，多元醇系非离子表面活性剂，聚醚型非离子表面活性剂或烷醇酰胺系非离子表面活性剂中的一种或二种非离子表面活性剂。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的非离子表面活性剂是聚氧乙烯醇类非离子表面活性剂。
4.一种采用浊点系统两相分配生物反应器技术，用酶法水解青霉素制备6-APA的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)调节pH为2-3，采用浊点萃取技术萃取青霉素发酵液中的青霉素；
(b)调节pH为5-6，实现青霉素的酶法水解；
(c)调节pH为3.9，实现6-APA的结晶分离。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(a)中萃取青霉素时不经过结晶过程。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述的浊点系统中青霉素水解技术采取常规的批式操作模式、半连续对流操作模式或者连续对流操作模式。
7.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述的浊点系统是指非离子表面活性剂溶液形成的两相系统；所述的非离子表面活性剂选自聚氧乙烯型非离子表面活性剂，多元醇系非离子表面活性剂，聚醚型非离子表面活性剂或烷醇酰胺系非离子表面活性剂中的一种或二种非离子表面活性剂。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述的非离子表面活性剂是聚氧乙烯醇类非离子表面活性剂。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述的浊点系统中青霉素水解技术采取常规的批式操作模式、半连续对流操作模式或者连续对流操作模式。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述的非离子表面活性剂是Tergrtiol TMN-3和/或Brij30。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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Owner name: SHANGHAOI BAIPUDA BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: SHANGHAI HAPPY BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Effective date: 20100326 |
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| COR | Change of bibliographic data |
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Effective date of registration: 20100326 Address after: 200233, No. 3, building 2, building 500, Caobao Road, Shanghai Patentee after: Shanghai Puda Biotechnology Co. Ltd. Address before: 201505, room 16, No. 717, Ping Nan Road, ting Lin Town, Shanghai, Jinshan District Patentee before: Shanghai Haibai Biotechnology Co., Ltd. |
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| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: YICHENG GOTO PHARMACEUTICALS CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: SHANGHAI BAIPUDA BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Effective date: 20110530 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 200233 2/F, BUILDING 3, NO. 500, CAOBAO ROAD, SHANGHAI TO: 441401 GAOKENG GROUP 1, XIAOHE TOWN, YICHENG CITY, HUBEI PROVINCE |
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20110530 Address after: 441401 a group of Gao Keng, Xiaohe Town, Hubei, Yicheng Patentee after: Yicheng Goto Pharmaceuticals Co., Ltd. Address before: 200233, No. 3, building 2, building 500, Caobao Road, Shanghai Patentee before: Shanghai Puda Biotechnology Co. Ltd. |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20080723 Termination date: 20150907 |
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| EXPY | Termination of patent right or utility model |