CN1149284C - 以多元共聚多孔微珠为载体的固定化青霉素酰化酶及制法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种以多元共聚多孔微珠为载体的固定化青霉素酰化酶及制法。本发明用悬浮聚合法制出多元共聚多孔微珠，经过表面改性和活化，将青霉素酰化酶结合上去而制成。本发明制备的固定化青霉素酰化酶颗粒直径为80-400μm，湿密度为1.02-1.10g/cm3；强度高，不易染菌，适合于反应器操作；其活性比用琼脂糖6B微珠制备的固定化酶活性高5-10倍，比用Eupergit C制备的固定化酶活性高2-3倍，综合性能优于已有的产品；成本低，制备方法简单，适于工业生产。
Description
本发明涉及一种固定化酶生物技术，特别是涉及一种以多元共聚多孔微珠为载体的固定化青霉素酰化酶。
天然酶在食品、化工和医药工业中广泛应用。但由于酶是一种可溶性的蛋白质，不易回收，造成了浪费，此外还会污染产物。将酶人工固定，制成固定化酶，不仅使酶可以回收，重复使用，还提高了酶的稳定性，简化了后处理。酶的固定化方法可分为载体结合法、交联法和包埋法三大类。载体结合法是将酶结合在水不溶性载体上的一类固定化方法，又可分为物理吸附法、离子结合法和共价结合法等。其中共价结合法是将酶以共价键结合于载体上，因而酶结合牢固，稳定性好，是载体结合法中应用最多的一种，也是工业上应用最广泛的方法。
青霉素类抗生素是目前临床使用最广泛的抗生素，它具有抗菌力强，疗效高，毒性低等优点，是重要的抗感染药物。它的抗菌作用机制是抑制细菌细胞壁的合成。其分子内的β-内酰胺环的完整性是其抗菌作用的前提。天然青霉素有青霉素G(PenG)和青霉素V(PenV)两种，天然青霉素的长期使用，产生了抗性细菌。抗性菌可产生青霉素酶，水解青霉素分子内的β-内酰胺环，使之失活。若人工改变天然青霉素分子内β-内酰胺环上所联的侧链基团，即得到半合成青霉素，侧链基团的改变可增加β-内酰胺环的稳定性；各种半合成青霉素具有杀菌谱广，稳定性好，可口服等优点，因而在临床上迅速取代了天然青霉素，目前，世界范围内80％以上的天然青霉素都是用于半合成青霉素的生产。
6-氨基青霉烷酸(6-Aminopenicillani Acid，简称6-APA)是生产半合成青霉素的关键性中间物，目前，临床上使用的半合成青霉素全部来自6-APA。
6-APA是通过切割PenG或PenV的侧链获得的。以天然PenG或PenV为起始物，用化学法或酶法水解掉其侧链，其中酶法采用的是青霉素酰化酶。化学法和酶法是同时起步发展的，都已用于工业生产。二者各有优点。但是，随着固定化酶技术的迅速发展应用及石化产品和能源价格的不断上涨，酶法显现出较好的经济性；另外，酶法不污染环境，操作也较方便。因此，现在6-APA的工业生产主要是通过采用青霉素酰化酶水解PenG或PenV实现的。
工业上用酶法水解青霉素生产6-APA是在1960年左右开始起步的。最初采用的是活性菌种的细胞悬液，仅能使用一次，生产力非常低，大约为0.5-1kg 6-APA/kg E.coli悬液，后来，通过固定化E.coli细胞，可将生产率提高至50kg 6-APA/kg固定化催化剂。目前，主要用固定化酶，生产率一般为100-1000kg 6-APA/kg固定化催化剂。已报道的青霉素酰化酶的载体有琼脂糖、明胶、几丁质和丝素膜等天然聚合物和大孔吸附树脂、苯乙烯-二乙烯基苯离子交换树脂(在文献1：JP5959191中进行了介绍)以及在文献2：微生物学报，38(3)，204-207，1998中介绍的聚丙烯腈纤维等合成聚合物。
国内的6-APA生产厂家多使用纤维状固定化青霉素酰化酶，由于反应器中液相混合不好，不利于反应过程中酸度的调控，而且需要人工将载体装填入反应器，劳动强度大，反应过程不稳定，已逐渐被颗粒状固定化酶取代。而上述颗粒状载体往往不是专用于固定化酶的，影响酶活性的发挥，如离子交换树脂原用于水处理和其它分离过程，几丁质则是经过化学处理的天然聚合物，批次质量难以稳定，在文献3：中国医药工业杂志，24(3)，100-103，1993中有介绍。另外国内虽然已有颗粒状固定化青霉素酰化酶生产，但所用的载体为进口载体(Eupergit C)，使固定化酶的成本很高。
目前，我国生产半合成青霉素所用的6-APA大部分依靠进口，也有厂家进口固定化青霉素酰化酶和配套技术生产6-APA，不仅花费大量外汇，也严重影响和制约着我国医药工业的发展。
本发明的目的：为了克服上述某些固定化酶载体使用会影响酶活性的发挥，为了克服使用纤维状固定化青霉素酰化酶时，反应器中液相混合不好而影响反应过程中酸度的调控，而且生产过程中需要人工将载体装填入反应器，劳动强度大，反应过程不稳定等缺点；为了制备一种性能优良、成本较低的、质量稳定的产品；和为了促进固定化酶技术的发展，以及实现我国半合成抗生素原料的国产化，从而提供一种用于6-APA的工业生产，以多元共聚多孔微珠为载体的固定化青霉素酰化酶及制法。
本发明的目的是这样实现的：本发明提供了一种利用悬浮聚合技术制备出多元共聚多孔微珠载体，经过表面改性和活化，将青霉素酰化酶结合上去，制备成固定化青霉素酰化酶，颗粒直径为80-400μm，湿密度为1.02-1.10g/cm3的以多元共聚多孔微珠为载体的固定化青霉素酰化酶。
由于该固定化青霉素酰化酶使用了一种利用悬浮聚合技术制备出的多元共聚多孔微珠载体，载体表面的可活化基团(-OH)多，可以结合更多的酶，因而所得的固定化青霉素酰化酶成本低，比活力更高。
本发明提供了一种制备以多元共聚多孔微珠为载体的固定化青霉素酰化酶的方法，利用与本发明相关的专利申请(申请号为：99109836.0)的悬浮聚合技术制备出多元共聚多孔微珠载体，经过表面改性和活化，将青霉素酰化酶结合上去，制备成固定化青霉素酰化酶。基本原理(以对苯醌活化为例)为：
以多元共聚多孔微珠为载体的固定化青霉素酰化酶的制法依下列步骤进行：
(1)多元共聚多孔微珠的制备：共聚单体有四类(A、B、C、D)，其配料比例如下：
单体A 5-30重量份；
单体B 5-30重量份；
单体C 50-90重量份；
单体D 0-10重量份；
其中单体A包括苯乙烯、对乙烯基甲苯和间乙烯基甲苯中的一种或多种，单体B包括二乙烯基苯和异氰尿酸三烯丙酯中的一种或两种，单体C为乙酸乙烯酯，单体D包括甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸甲酯、丙烯酸和甲基丙烯酸中的一种或多种；
将A、B、C、D四类单体按上述比例充分混合。按照每100g上述混合好的单体计，加入引发剂0.8-1.3g，致孔剂6-30ml和200#汽油0-20ml。其中引发剂采用如偶氮二异丁腈(AIBN)，或过氧化苯甲酰(BPO)等本行业通用的引发剂，制孔剂采用如乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、丁酸乙酯或丁酸丁酯等本行业通用的制孔剂；
在单体总体积3-4倍的含有1-4％wt的明胶及1％wtMg(OH)2的悬浮体系中进行聚合反应。40℃开始缓慢升温，升温速率为0.45-0.65℃/min，65-70℃聚合5小时，70℃以上固化6-10小时，过筛，用大量的水洗涤，然后用丙酮浸泡，洗去致孔剂，得到多孔微珠。
(2)表面改性：采用醇解工艺进行表面改性，将上述步骤得到多孔微珠风干，加入过量的含3-5％wtNaOH的甲醇溶液，18-25℃反应24-48小时后，抽滤，用丙酮洗涤三次，即制得固定化酶用的载体。
(3)载体活化：活化试剂包括对苯醌、环氧氯丙烷、三氯三嗪、SESA、SESA+戊二醛、对甲苯磺酰氯、溴化氰和双缩水甘油醚，采用常规活化工艺进行载体活化，其具体活化条件由每种活化剂决定。
(4)挂酶：按每0.2-0.4g载体(湿重)加入800单位的青霉素酰化酶酶液的比例，于19-22℃反应36小时后再加入等量的青霉素酰化酶，继续反应12-24小时后停止。产物依次以24％wt的(NH4)2SO4或0.5M的NaCl溶液和pH8.0的磷酸缓冲液洗涤，得到以多元共聚多孔微珠为载体的固定化青霉素酰化酶。
本发明的效果：
1、本发明制备的以多元共聚多孔微珠为载体的固定化青霉素酰化酶，其颗粒直径为80-400μm，湿密度为1.02-1.10g/cm3，适合于反应器操作；不易染菌，强度优于国外通常采用的琼脂糖6B微珠。
2、本发明制备的固定化青霉素酰化酶比用琼脂糖6B微珠和Eupergit C制备的固定化酶活性要高(比用琼脂糖6B微珠制备的固定化酶活性高5-10倍，比用EupergitC制备的固定化酶活性高2-3倍)。本发明制备的固定化青霉素酰化酶与用其它方法制备的固定化青霉素酰化酶活性的比较见表1。
3、本发明的产品价格便宜，稳定性好。本发明制备的固定化青霉素酰化酶的稳定性如图1所示。
4、解决我国半合成青霉素的原料国产化。
5、本发明提供的制备方法简单，反应过程稳定，适于工业批量生产。
表1：固定化青霉素酰化酶活性的比较
载体 活化方法 固定化酶的相对活性(％)
琼脂糖6B NalO4 100
(未交联) 双缩水甘油醚 17.6
三氯三嗪 71.5
对苯醌 77.4
琼脂糖6B NalO4 77.9
(交联) 双缩水甘油醚 42.0
Eupergit C 环氧氯丙烷 264
本发明 660～700
下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明。
图1是本发明制备的以多元共聚多孔微珠为载体的固定化青霉素酰化酶的稳定性图。
实施例1：
1将苯乙烯5g、二乙烯基苯5g、乙酸乙烯酯90g充分混合，加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)1.1g，致孔剂乙酸丁酯10ml和200#汽油10ml，在400ml含有2.5％明胶及1％Mg(OH)2的悬浮体系中进行聚合反应。40℃开始缓慢升温，升温速率为0.56℃/min，65℃聚合5小时，70℃固化2小时，75℃固化3.5小时，80℃继续固化1小时后，停止反应，过筛，用大量的水洗涤，然后用丙酮浸泡，洗去致孔剂，制成微珠。
2将上述微珠风干，加入过量的含3％NaOH的甲醇溶液，18℃反应24小时后，抽滤，用丙酮洗涤三次，即制得固定化酶用的多元共聚多孔微珠载体。
3按活化1g湿载体加入10ml活化液的比例添加活化液。活化液的配比为：0.6g对苯醌溶解于pH7.5、含20％乙醇的0.1M的磷酸缓冲溶液100ml中。28℃反应5小时，依次用20％的乙醇、1M的NaCl、去离子水洗涤载体至洗涤液无色。
4按每0.2g载体(湿重)加入800单位的青霉素酰化酶酶液的比例，于19℃反应36小时后再加入等量的青霉素酰化酶，继续反应12小时后停止。产物依次以24％的(NH4)2SO4和pH8.0的磷酸缓冲液洗涤，得到以多元共聚多孔微珠为载体的固定化青霉素酰化酶。
实施例2：
步骤1和2同实施例1，苯乙烯40g，二乙烯基苯40g，乙酸乙烯酯20g，乙酸丁酯20ml，200#汽油20ml，明胶溶液410ml，其它不变。
3按活化1g湿载体加入10ml活化液的比例添加活化液。活化液的配比为：0.8g对苯醌溶解于pH7.5、含20％乙醇的0.1M的磷酸缓冲溶液100ml中。27℃反应5小时，依次用20％的乙醇、1M的NaCl、去离子水洗涤载体至洗涤液无色。
4按每0.3g载体(湿重)加入800单位的青霉素酰化酶酶液的比例，于20℃反应36小时后再加入等量的青霉素酰化酶，继续反应18小时后停止。产物依次以0.5M的NaCl溶液和pH8.0的磷酸缓冲液洗涤，得到以多元共聚多孔微珠为载体的固定化青霉素酰化酶。
实施例3：
步骤1和2同实施例1，苯乙烯25g，二乙烯基苯15g，乙酸乙烯酯60g，致孔剂乙酸甲酯30ml，不加200#汽油，明胶溶液400ml，其它不变。
3按活化1g湿载体加入10ml活化液的比例添加活化液。活化液的配比为：1.0g对苯醌溶解于pH7.5、含20％乙醇的0.1M的磷酸缓冲溶液100ml中。25℃反应5小时，依次用20％的乙醇、1M的NaCl、去离子水洗涤载体至洗涤液无色。
4按每0.4g载体(湿重)加入800单位的青霉素酰化酶酶液的比例，于22℃反应36小时后再加入等量的青霉素酰化酶，继续反应24小时后停止。产物依次以24％的(NH4)2SO4和pH8.0的磷酸缓冲液洗涤，得到以多元共聚多孔微珠为载体的固定化青霉素酰化酶。
实施例4：
1将苯乙烯15g、二乙烯基苯25g、乙酸乙烯酯50g、甲基丙烯酸甲酯10g充分混合，加入引发剂过氧化苯甲酰(BPO)0.9g，致孔剂乙酸乙酯6ml和200#汽油6ml，在375ml含有2.5％明胶及1％Mg(OH)2的悬浮体系中进行聚合反应。40℃开始缓慢升温，升温速率为0.45℃/min，65℃聚合5小时，72℃固化2小时，75℃固化3.0小时，80℃继续固化1小时后，停止反应，过筛，用大量的水洗涤，然后用丙酮浸泡，洗去致孔剂。
2将上述微珠风干，加入过量的含5％NaOH的甲醇溶液，22℃反应36小时后，抽滤，用丙酮洗涤三次，即制得固定化酶用的载体。
3按活化1g湿载体加入10ml活化液的比例添加活化液。活化液的配比为：5g环氧氯丙烷溶解于pH8.5的0.1M的磷酸缓冲溶液100ml中。30℃反应10小时，依次用20％的乙醇、1M的NaCl、去离子水洗涤载体至洗涤液无色。
4同实施例1。
实施例5：
1将苯乙烯20g、二乙烯基苯15g、乙酸乙烯酯60g、甲基丙烯酸5g充分混合，加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)1.0g，致孔剂丁酸乙酯15ml和200#汽油15ml，在400ml含有2.5％明胶及1％Mg(OH)2的悬浮体系中进行聚合反应。40℃开始缓慢升温，升温速率为0.45℃/min，67℃聚合5小时，72℃固化2小时，75℃固化3.0小时，80℃继续固化1小时后，停止反应，过筛，用大量的水洗涤，然后用丙酮浸泡，洗去致孔剂。
2将上述微珠风干，加入过量的含4％NaOH的甲醇溶液，256反应24小时后，抽滤，用丙酮洗涤三次，即制得固定化酶用的载体。
3活化液的配比为：将0.01g三氯三嗪以少量丙酮溶解后，以蒸馏水稀释1倍。将载体颗粒与等体积的丙酮混合，搅动0.5小时，加入活化液，搅动5分钟，加入0.1体积的2M Na2CO3，再搅动5分钟，依次用50％的丙酮、去离子水洗涤载体。
4同实施例2。
实施例6：
1将对乙烯基甲苯25g、异氰尿酸三烯丙酯15g、乙酸乙烯酯60g充分混合，加入引发剂过氧化苯甲酰(BPO)1.1g，致孔剂乙酸丁酯30ml和200#汽油5ml，在400ml含有2.5％明胶及1％Mg(OH)2的悬浮体系中进行聚合反应。40℃开始缓慢升温，升温速率为0.50℃/min，67℃聚合5小时，70℃固化2.5小时，75℃固化3.0小时，80℃继续固化1小时后，停止反应，过筛，用大量的水洗涤，然后用丙酮浸泡，洗去致孔剂。
2将上述微珠风干，加入过量的含3％NaOH的甲醇溶液，18℃反应48小时后，抽滤，用丙酮洗涤三次，即制得固定化酶用的载体。
3活化液的配比为：向1.25g SESA中加入3.8ml水和11.2ml 2％的Na2CO3(溶于0.1M的NaOH中)溶液，pH为6.4-6.7，过滤弃去滤渣。将1克载体(湿重)加入到上述活化液中，搅匀，78℃反应10分钟，加入0.75gNaCl，13分钟后加入0.6克Na2CO3，升温至83℃，搅拌30分钟，冷却抽干，用蒸馏水洗5次(每次约60ml)，抽干。
4将上述载体在0-5℃下加2.4ml水、5.6ml 1M的HCl，混匀，缓慢滴加4ml 5％的NaNO2，搅匀，20分钟后抽干，用0.05M的冷HCl洗3次(每次约60ml)，最后用冷水洗1-2次，使pH约4.5，抽干，立刻在0-5℃下滴加用0.5M的Na2CO3调pH至8.0的酶液1ml，搅拌均匀(此时pH降至约5.8)，再滴加0.5M的Na2CO3至pH约5.0，0.5-3小时后，用冷蒸馏水洗4次(每次约50ml)。产物依次以24％的(NH4)2SO4和pH8.0的磷酸缓冲液洗涤，得到以多元共聚多孔微珠为载体的固定化青霉素酰化酶。
实施例7：
1将对乙烯基甲苯15g、二乙烯基苯25g、乙酸乙烯酯50g、甲基丙烯酸甲酯5g、甲基丙烯酸5g充分混合，加入引发剂过氧化苯甲酰(BPO)0.8g，致孔剂乙酸丁酯6ml和200#汽油6ml，在375ml含有4％明胶及1％Mg(OH)2的悬浮体系中进行聚合反应。40℃开始缓慢升温，升温速率为0.50℃/min，70℃聚合5小时，72℃固化2小时，75℃固化3小时，80℃继续固化1小时后，停止反应，过筛，用大量的水洗涤，然后用丙酮浸泡，洗去致孔剂。
2将上述微珠风干，加入过量的含5％NaOH的甲醇溶液，22℃反应36小时后，抽滤，用丙酮洗涤三次，即制得固定化酶用的载体。
3活化液的配比为：1g对甲苯磺酰氯溶解于2ml干丙酮(含水量低于0.01％的丙酮)中。将1g湿载体依次用20倍于颗粒沉积体积的蒸馏水、蒸馏水-丙酮混合液(体积比3∶1)、蒸馏水-丙酮混合液(体积比1∶3)、丙酮、干丙酮洗涤载体，洗涤时间为1.5小时。将载体转入2ml活化液中，摇匀，振荡中缓慢加入1ml吡啶，室温反应1小时，按与上述洗涤顺序相反的顺序洗涤。
4 同实施例1。
实施例8：
1将对乙烯基甲苯20g、异氰尿酸三烯丙酯15g、乙酸乙烯酯60g、丙烯酸5g充分混合，加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)0.9g，致孔剂乙酸甲酯15ml和200#汽油10ml，在350ml含有3％明胶及1％Mg(OH)2的悬浮体系中进行聚合反应。40℃开始缓慢升温，升温速率为0.60℃/min，70℃聚合5小时，72℃固化2小时，75℃固化3小时，80℃继续固化1小时后，停止反应，过筛，用大量的水洗涤，然后用丙酮浸泡，洗去致孔剂。
2将上述微珠风干，加入过量的含4％NaOH的甲醇溶液，25℃反应24小时后，抽滤，用丙酮洗涤三次，即制得固定化酶用的载体。
3按活化1g湿载体加入10ml活化液的比例添加活化液。活化液的配比为：0.8g溴化氰溶解于pH7.5、含20％乙醇的0.1M的磷酸缓冲溶液100ml中。27℃反应5小时，依次用20％的乙醇、1M的NaCl、去离子水洗涤载体至洗涤液无色。
4同实施例2。
实施例9：
1将间乙烯基甲苯25g、异氰尿酸三烯丙酯15g、乙酸乙烯酯60g充分混合，加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)0.8g，致孔剂丁酸丁酯30ml，在400ml含有2.5％明胶及1％Mg(OH)2的悬浮体系中进行聚合反应。40℃开始缓慢升温，升温速率为0.60℃/min，70℃聚合5小时，70℃固化2.5小时，75℃固化3.5小时，80℃继续固化1小时后，停止反应，过筛，用大量的水洗涤，然后用丙酮浸泡，洗去致孔剂。
2将上述微珠风干，加入过量的含3％NaOH的甲醇溶液，18℃反应48小时后，抽滤，用丙酮洗涤三次，即制得固定化酶用的载体。
3按活化1g湿载体加入10ml活化液的比例添加活化液。活化液的配比为：5g双缩水甘油醚溶解于pH8.5的0.1M的磷酸缓冲溶液100ml中。25℃反应5小时，依次用20％的乙醇、1M的NaCl、去离子水洗涤载体至洗涤液无色。
4同实施例3。
实施例10：
1将间乙烯基甲苯15g、二乙烯基苯25g、乙酸乙烯酯50g、丙烯酸甲酯5g、丙烯酸5g充分混合，加入引发剂过氧化苯甲酰(BPO)1.0g，致孔剂乙酸丁酯6ml和200#汽油6ml，在375ml含有2.5％明胶及1％Mg(OH)2的悬浮体系中进行聚合反应。40℃开始缓慢升温，升温速率为0.65℃/min，68℃聚合5小时，72℃固化2小时，75℃固化3.5小时，80℃继续固化1小时后，停止反应，过筛，用大量的水洗涤，然后用丙酮浸泡，洗去致孔剂。
2将上述微珠风干，加入过量的含5％NaOH的甲醇溶液，22℃反应36小时后，抽滤，用丙酮洗涤三次，即制得固定化酶用的载体。
3先按实施例6用β-硫酸酯乙砜基苯胺活化。将β-硫酸酯乙砜基苯胺活化过的载体与等体积的2.5％(V/V)的戊二醛溶液混合，室温下摇动4小时，过滤除去戊二醛，以蒸馏水洗涤，洗涤时不能将颗粒暴露于空气，以免氧化。
4同实施例1。
实施例11：
1将间乙烯基甲苯20g、异氰尿酸三烯丙酯15g、乙酸乙烯酯60g、丙烯酸甲酯5g充分混合，加入引发剂过氧化苯甲酰(BPO)1.0g，致孔剂乙酸丁酯20ml和200#汽油10ml，在450ml含有2.5％明胶及1％Mg(OH)2的悬浮体系中进行聚合反应。40℃开始缓慢升温，升温速率为0.65℃/min，68℃聚合5小时，72℃固化2小时，75℃固化3.5小时，80℃继续固化1小时后，停止反应，过筛，用大量的水洗涤，然后用丙酮浸泡，洗去致孔剂。
2将上述微珠风干，加入过量的含4％NaOH的甲醇溶液，25℃反应24小时后，抽滤，用丙酮洗涤三次，即制得固定化酶用的载体。
3同实施例10。
4同实施例2。本发明的配方中使用的是重量百分比。
利用产自巨大芽孢杆菌(中科院微生物研究所筛选)的青霉素酰化酶，制备固定化青霉素酰化酶，酶活收率平均为37％。在37℃重复使用时，酶活力批损失为0.26-0.5％，如图1所示。
Claims (4)
1.一种以多元共聚多孔微珠为载体的固定化青霉素酰化酶，该固定化青霉素酰化酶颗粒直径为80-400μm，湿密度为1.02-1.10g/cm3；它依下列制备方法获得：
(1)微珠制备：将单体A、单体B、单体C、单体D充分混合；
每100g上述混合单体，加入引发剂0.8-1.3g，致孔剂6-30ml和200#汽油0-20ml；
在单体总体积3-4倍的含有1-4％wt的明胶及1％wt Mg(OH)2的悬浮体系中进行聚合反应，40℃开始缓慢升温，升温速率为0.45-0.65℃/min，65-70℃聚合5小时，70℃以上同化6-10小时，过筛，用大量的水洗涤，然后用丙酮浸泡，洗去致孔剂，得到多孔型微珠；
(2)表面改性：将上述微珠风干，加入过量的含3-5％wt NaOH的甲醇溶液，18-25℃反应24-48小时后，抽滤，用丙酮洗涤三次，即制得固定化酶用的载体；
(3)载体活化：根据活化试剂的种类采用不同的活化工艺条件；
(4)挂酶：按每0.2-0.4g载体，以载体湿重计算，加入800单位的青霉素酰化酶酶液的比例，于19-22℃反应36小时后再加入等量的青霉素酰化酶，继续反应12-24小时后停止；产物依次以24％wt的(NH4)2SO4或0.5M的NaCl溶液和pH8.0的磷酸缓冲液洗涤，得到以多元共聚多孔微珠为载体的固定化青霉素酰化酶。
2.按照权利要求1所述的以多元共聚多孔微珠为载体的固定化青霉素酰化酶，其特征在于：所述的单体A包括苯乙烯、对乙烯基甲苯和间乙烯基甲苯中的一种或多种；单体B包括二乙烯基苯和异氰尿酸三烯丙酯中的一种或两种；单体C为乙酸乙烯酯；单体D包括甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸甲酯、丙烯酸和甲基丙烯酸中的一种或多种。
3.按照权利要求1所述的以多元共聚多孔微珠为载体的固定化青霉素酰化酶的制备方法，其特征在于：所述的单体混合配比为：
单体A 5-30重量份；
单体B 5-30重量份；
单体C 50-90重量份；
单体D 0-10重量份。
4.按照权利要求1所述的一种以多元共聚多孔微珠为载体的固定化青霉素酰化酶，其特征在于：所述的活化剂包括：对苯醌、环氧氯丙烷、三氯三嗪、β-硫酸酯乙砜基苯胺、对甲苯磺酰氯、溴化氰和双缩水甘油醚。
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