CN107641623B - 伯胺基固定化酶载体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种伯胺基固定化酶载体及其制备方法，正向悬浮聚合，得到大孔型聚甲基丙烯酸酯‑二烯丙基胺载体的粗品；对载体粗品进行洗涤、分级；进行胺基化反应得到含伯胺基的固定化酶载体。本发明技术方案用于多种生物酶的固定化，载体对于青霉素G酰化酶、D‑氨基酸氧化酶、GL‑7‑ACA酰化酶等具有较好的固定化效果，载酶活力高，机械强度及储存稳定性较好。本发明工艺简单、成本较低，且载体储存稳定性明显提高，有望应用于工业化大生产。

Description

伯胺基固定化酶载体及其制备方法

技术领域

本发明属于生物化工领域，涉及用于酶固定化的载体制备，具体来说是一种带有伯胺基团的固定化酶载体的制备方法。

背景技术

生物酶具有高效、专一、反应条件温和、环保等性能特点，目前已发现的酶约有5000种左右，能够工业生产的酶约有60多种，主要工业用酶有20多种。发展方向上，一方面，工业界和科学界仍在不断寻找新菌种，开发菌种改造、繁殖工艺，研发新酶制剂应用工艺，另一方面，如何更为有效、合理地利用酶，既保持生物酶的高效专一性，又增加酶的使用稳定性，简化分离纯化及生产操作流程，降低生产成本，成为一项重要课题。这其中，固定化酶法以其独特的优点脱颖而出，正逐步在酶法工业生产上占有日益重要的地位。

固定化酶(Immobilized Enzyme)又称固相酶，是20世纪60年代伴随着酶工程研究发展起来的一种酶应用新技术，是将可溶性的酶用物理或化学方法束缚或限制于固体材料上，使之成为不可溶但仍具有其专属酶活性的状态。与游离酶相比，固定化酶具有可重复使用、分离简便、稳定性高、污染小、更适于多酶体系等突出优点。时至今日，固定化酶技术已规模应用于食品、农业、医药、环保、新能源、精细化工、检测分析等领域，极大拓展了酶的工业化应用，潜力巨大，发展前景十分广阔。

固定化酶的性能主要取决于固定化方法和所使用的载体材料。酶的固定化方法不下百种，其中共价结合法，又称共价偶联法，是将酶蛋白的非活性侧链基团与载体中的活性官能团进行共价键合，形成牢固而不可逆的连接。固定化后的酶表现出良好的稳定性和机械强度，可以连续使用而且具有较高的活性，成为目前应用和研究中最为常见、最为活跃的一类酶固定化方法。载体材料的结构和性质也直接决定着固定化酶性能的发挥，酶的固定化对载体材料有很高的要求，人工合成的有机高分子材料与天然高分子材料和传统的无机材料相比，具有机械强度强、热稳定性和化学稳定性高，且结构和性能更容易调节控制等优点，有利于固定化酶技术的广泛应用。当前人工合成高分子材料主要有聚苯乙烯、聚(甲基)丙烯酸酯或丙烯酰胺两大类，均有不足之处。一般来说，前者亲和性、选择性较差，且骨架刚性强，重复使用易于磨损；后者则在孔隙率高的情况下，难于保持很好的机械强度。

发明内容

针对上述现有固定化酶载体的问题，本发明提供一种化学稳定性高、且同时保有较高的载酶活力和机械强度的新型载体及其制备方法，该载体为带有伯胺基的大孔型聚甲基丙烯酸酯-二烯丙基胺聚合物，储存稳定性好、机械强度高且对于青霉素G酰化酶、D-氨基酸氧化酶、GL-7-ACA酰化酶等在内的多种工业酶具有较好的固定化效果。

本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现：

伯胺基固定化酶载体及其制备方法，按照下述步骤进行：

步骤1，将油相投入水相中，搅拌以调节在水相中分散的油滴的粒径并形成稳定的聚合反应体系，升温至70-85℃进行反应，以得到载体粗品；

将0.5-1.5质量份的偶氮二异丁腈(AIBN)、30-40质量份的丙烯酸甲酯(MA)、10-20质量份的甲基丙烯酸甲酯(MMA)、35-55质量份的双甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、5-25质量份的二烯丙基胺(DAA)、40-150质量份的甲苯、40-90质量份的液蜡，搅拌混合均匀，配成油相；

在600-900质量份的水中加入4.5-14质量份的羟乙基纤维素，搅拌均匀，配成水相；

将油相与水相混合后，升温至70-85℃进行反应12-18h后滤出液体，用热水、丙酮洗涤固体后筛分至所需粒度规格，得到载体粗品。

在步骤1中，油相组成优选由32-38质量份的丙烯酸甲酯、12-17质量份的甲基丙烯酸甲酯、35-50质量份的双甲基丙烯酸乙二醇酯、6-20质量份的二烯丙基胺、0.5-1.5质量份的偶氮二异丁腈、50-120质量份的甲苯和45-85质量份的液蜡组成。

步骤2，将载体粗品与胺基化试剂混合，以使载体粗品进行胺基化反应，并水洗至中性，即制得成品伯胺基固定化酶载体。

在步骤2中，在50-80℃搅拌下反应12-48h。

在步骤2中，胺基化试剂为乙二胺(EDA)、1,4-丁二胺(TDA)、1,6-己二胺(HDA)、二乙烯三胺(DETA)、三乙烯四胺(TETA)或者四乙烯五胺(TEPA)。

在步骤2中，相对于载体粗品，胺基化试剂为过量，以使载体粗品充分反应。

本发明依照上述制备步骤所得载体，外观为乳白色至黄色不透明珠体，载体含水量60-75％，功能基含量0.9-2.6mmol/g，搅拌浊度50-200NTU，最可几孔径20-60nm，比表面积100-400m²/g。粒度根据应用的不同分为60-120mesh和30-60mesh两个档次。

将本发明的载体应用于载酶领域，初步结果如下：

1、粒度为60-120mesh的载体，固定化青霉素G酰化酶制备6-氨基青霉烷酸(6-APA)，载酶活力150-270U/g，单批催化时间40-60min，底物转化率>97％。

2、粒度为60-120mesh的载体，固定化D-氨基酸氧化酶制备戊二酰-7-氨基头孢烷酸(GL-7-ACA)，载酶活力55-85U/g，单批催化时间60-80min，底物转化率>99％。

3、粒度为60-120mesh的载体，固定化GL-7-ACA酰化酶制备7-氨基头孢烷酸(7-ACA)，载酶活力70-110U/g，单批催化时间50-60min，产物收率>95％，纯度>98％。

4、粒度为30-60mesh的载体，固定化青霉素G酰化酶合成阿莫西林，载酶活力120-160U/g，单批催化时间120-140min，底物转化率>98％，固定化酶破碎率<1％。

与现有技术相比，本发明采用的技术工艺所产生的有益效果，可以通过下述方面进行阐述：(1)本发明所提供的固定化酶载体对骨架的刚性、表面亲疏水性和孔结构进行调节，使得载体同时保有较大的孔径和较高的机械强度，以得到载酶活力、反应时间和重复使用性均较好的固定化酶载体。(2)本发明所提供的固定化酶载体为带有伯胺基载体，载体储存稳定性好，工艺操作简单、原料易得，且单体价格低，可有效降低成本，适合于工业化生产。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步的描述，但本发明并不仅仅限制于以下实施例。载体含水量的检测：以日本岛津MOC-120H型电子水分计进行测定；载体功能基含量的检测：按照《GB/T 19861-2005》中弱碱交换量的方法进行测定；载体强度的检测：在固定的容器内，100g载体加纯水1000mL，使用固定的搅拌桨转速1000rpm搅拌5h，取液体以WGZ-3型浊度仪进行浊度测定；载体最可几孔径、比表面积的检测：以美国康塔PoreMaster 33/GT-17型压汞仪进行测定。

实施例1

(1)聚合反应：

i.将1质量份的AIBN、40质量份的MA、20质量份的MMA、35质量份的EGDMA、5质量份的DAA、75质量份的甲苯、75质量份的液蜡，搅拌混合均匀，配制成油相。

ii.在750质量份的水中加入7.5质量份的羟乙基纤维素，搅拌配制成水相。

iii.将油相与水相混合，搅拌至合适粒径范围后，升温至80℃，反应15h后滤出液体，用热水、丙酮洗涤固体后筛取60-120mesh载体，得到载体粗品。

(2)胺基化反应：

将载体粗品与EDA混合，75℃搅拌下反应18h，反应完成后滤出液体，水洗载体至中性，制得成品。

(3)实施例1得到的固定化酶载体外观为微黄色不透明珠体，载体含水量72％，功能基含量2.30mmol/g，搅拌浊度120NTU，最可几孔径40nm，比表面积200m²/g。

(4)实施例1得到的固定化酶载体用于固定化青霉素G酰化酶

首先进行载体的活化，在反应瓶中投入5g伯胺基载体，加入含有5％戊二醛的K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液(0.2M，pH＝8)20mL，密封后在25℃反应2h，滤出载体，以缓冲溶液洗5遍载体待用。

其次进行酶的固定化，取活化后的载体1g，加入K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液(0.2M，pH＝7.8)5mL，再加入青霉素G酰化酶液，混合均匀，密封后在20℃反应20h，滤出固定化酶的载体，用纯水和1M NaCl溶液洗涤，滤净载体，检测酶活，4℃下放置待用。

(5)固定化青霉素G酰化酶后进行催化裂解青霉素G钾盐，制备抗生素中间体6-APA，载酶活力270U/g，单批催化时间40min，底物转化率98.1％。青霉素G酰化酶载酶活力的检测——在反应器中加入10％的青霉素G钾盐溶液50mL，控温37℃下加入0.25g固定化酶，用0.1mol/L的NaOH标准溶液滴加，控制反应体系pH＝7.8，记录反应10min时消耗的NaOH体积，按下式计算固定化酶活力：

实施例2

(1)聚合反应：

i.将0.5质量份的AIBN、30质量份的MA、10质量份的MMA、55质量份的EGDMA、5质量份的DAA、40质量份的甲苯、60质量份的液蜡，搅拌混合均匀，配制成油相。

ii.在600质量份的水中加入9质量份的羟乙基纤维素，搅拌配制成水相。

iii.将油相与水相混合，搅拌至合适粒径范围后，升温至70℃，反应18h后滤出液体，用热水、丙酮洗涤固体后筛取30-60mesh载体，得到载体粗品。

(2)胺基化反应：

将载体粗品与TETA混合，75℃搅拌下反应24h，反应完成后滤出液体，水洗载体至中性，制得成品。

(3)实施例2得到的固定化酶载体外观为黄色不透明珠体，载体含水量67％，功能基含量1.27mmol/g，搅拌浊度70NTU，最可几孔径28nm，比表面积260m²/g。

(4)将实施例2得到的固定化酶载体用于固定化青霉素G酰化酶

首先进行载体的活化，在反应瓶中投入5g伯胺基载体，加入含有5％戊二醛的K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液(0.2M，pH＝8)20mL，密封后在25℃反应2h，滤出载体，以缓冲溶液洗5遍载体待用。

其次进行酶的固定化，取活化后的载体1g，加入K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液(0.2M，pH＝7.8)5mL，再加入青霉素G酰化酶液，混合均匀，密封后在20℃反应20h，滤出固载了酶的载体，用纯水和1M NaCl溶液洗涤，滤净载体，检测酶活，4℃下放置待用。

(5)固定化青霉素G酰化酶后催化合成D-对羟基苯甘氨酸甲酯和6-APA，制备半合成抗生素药物阿莫西林，载酶活力150U/g，单批催化时间130min，底物转化率98.5％，固定化酶破碎率0.7％。青霉素G酰化酶载酶活力的检测——在反应器中加入10％的青霉素G钾盐溶液50mL，控温37℃下加入0.25g固定化酶，用0.1mol/L的NaOH标准溶液滴加，控制反应体系pH＝7.8，记录反应10min时消耗的NaOH体积，按下式计算固定化酶活力：

实施例3

(1)聚合反应：

i.将1.2质量份的AIBN、30质量份的MA、10质量份的MMA、35质量份的EGDMA、25质量份的DAA、133质量份的甲苯、67质量份的液蜡，搅拌混合均匀，配制成油相。

ii.在900质量份的水中加入7.5质量份的羟乙基纤维素，搅拌配制成水相。

iii.将油相与水相混合，搅拌至合适粒径范围后，升温至85℃，反应12h后滤出液体，用热水、丙酮洗涤固体后筛取60-120mesh载体，得到载体粗品。

(2)胺基化反应：

将载体粗品与TDA混合，75℃搅拌下反应14h，反应完成后滤出液体，水洗载体至中性，制得成品。

(3)实施例3得到的固定化酶载体外观为黄色不透明珠体，载体含水量75％，功能基含量1.83mmol/g，搅拌浊度130NTU，最可几孔径55nm，比表面积290m2/g。

(4)将实施例3得到的固定化酶载体用于固定化D-氨基酸氧化酶

首先进行载体的活化，在反应瓶中投入5g伯胺基载体，加入含有5％戊二醛的K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液(0.2M，pH＝8)20mL，密封后在25℃反应2h，滤出载体，以缓冲溶液洗5遍载体待用。

其次进行酶的固定化，取活化后的载体1g，加入K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液(0.55M，pH＝8.0)5mL，再加入脱盐后的D-氨基酸氧化酶液，混合均匀，密封后在20℃反应20h，滤出固载了酶的载体，用纯水和1M NaCl溶液洗涤，滤净载体，检测酶活，4℃下放置待用。

(5)固定化D-氨基酸氧化酶后催化氧化头孢菌素C钠盐，制备抗生素中间体GL-7-ACA，载酶活力79U/g，单批催化时间64min，底物转化率99.3％。D-氨基酸氧化酶载酶活力的检测——在恒温反应器中加入5％的头孢菌素C钠盐溶液15mL，控温20℃下加入精确称量的0.5g固定化酶，通入氧气，用3mol/L的NH₃·H₂O标准溶液滴加，控制反应体系pH＝7.2，反应10min取样，用高效液相色谱仪检测反应前后体系中头孢菌素C含量的变化，按下式计算固定化酶活力：

实施例4

(1)聚合反应：

i.将1质量份的AIBN、35质量份的MA、15质量份的MMA、40质量份的EGDMA、10质量份的DAA、80质量份的甲苯、40质量份的液蜡，搅拌混合均匀，配制成油相。

ii.在850质量份的水中加入8.5质量份的羟乙基纤维素，搅拌配制成水相。

iii.将油相与水相混合，搅拌至合适粒径范围后，升温至85℃，反应12h后滤出液体，用热水、丙酮洗涤固体后筛取60-120mesh载体，得到载体粗品。

(2)胺基化反应：

将载体粗品与HDA混合，75℃搅拌下反应40h，反应完成后滤出液体，水洗载体至中性，制得成品。

(3)实施例4得到的固定化酶载体外观为黄色不透明珠体，载体含水量75％，功能基含量1.65mmol/g，搅拌浊度95NTU，最可几孔径34nm，比表面积240m²/g。

(4)将实施例4得到的固定化酶载体用于固定化GL-7-ACA酰化酶

首先进行载体的活化，在反应瓶中投入5g伯胺基载体，加入含有5％戊二醛的K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液(0.2M，pH＝8)20mL，密封后在25℃反应2h，滤出载体，以缓冲溶液洗5遍载体待用。

其次进行酶的固定化，取活化后的载体1g，加入K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液(0.75M，pH＝7.8)5mL，再加入250U脱盐后的GL-7-ACA酰化酶液，混合均匀，密封后在25℃反应40h，滤出固载了酶的载体，用纯水和1M NaCl溶液洗涤，滤净载体，检测酶活，4℃下放置待用。

(5)将实施例4得到的固定化酶载体用于固定化GL-7-ACA酰化酶催化裂解GL-7-ACA，制备抗生素中间体7-ACA，载酶活力110U/g，单批催化时间50min，产物收率95.5％，纯度>98.7％。GL-7-ACA酰化酶载酶活力的检测——在反应器中加入2％的GL-7-ACA溶液20mL，控温25℃下加入精确称量的0.25g固定化酶，用0.1mol/L的NaOH标准溶液滴加，控制反应体系pH＝8.0，记录反应10min时消耗的NaOH体积，按下式计算固定化酶活力：

以实施例1得到的固定化酶载体固定化青霉素G酰化酶制备6-APA为例，与市售载体(日本三菱公司的伯胺基载体产品Sepabeads EC-EA)相比，在载酶活力、催化速率等方面略有提高，机械强度则明显改善，对比数据见表1。

表1

其中，单批催化时间越短，表明固定化酶的活力越高，且反应动力学越好；摩擦后介质浊度越小，表明载体的机械强度越高。

以实施例4得到的固定化酶载体固定化GL-7-ACA酰化酶制备7-ACA为例，储存稳定性数据见表2。

表2

可以看出，所得载体功能基团较为稳定，载体的储存稳定性高，存放两年，载体功能基含量及载酶活力下降率均<5％。

根据本发明内容调整制备载体的工艺参数并进行测试，均表现出机械强度的提高和储存稳定性的提高。以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (9)

1.伯胺基固定化酶载体，其特征在于，伯胺基固定化酶载体为带有伯胺基的聚甲基丙烯酸酯-二烯丙基胺聚合物，外观为乳白色至黄色不透明珠体，载体含水量60-75％，功能基含量0.9-2.6mmol/g，搅拌浊度50-200NTU，最可几孔径20-60nm，比表面积100-400m²/g，按照下述步骤进行：

步骤1，将油相与水相混合，搅拌以调节在水相中分散的油滴的粒径并形成稳定的聚合反应体系，升温至70-85℃进行反应，以得到载体粗品；

将0.5-1.5质量份的偶氮二异丁腈、30-40质量份的丙烯酸甲酯、10-20质量份的甲基丙烯酸甲酯、35-55质量份的双甲基丙烯酸乙二醇酯、5-25质量份的二烯丙基胺、40-150质量份的甲苯、40-90质量份的液蜡，搅拌混合均匀，配成油相；在600-900质量份的水中加入4.5-14质量份的羟乙基纤维素，搅拌均匀，配成水相；

步骤2，将载体粗品与胺基化试剂混合，以使载体粗品进行胺基化反应，并水洗至中性，即制得成品伯胺基固定化酶载体，胺基化试剂为乙二胺、1,4-丁二胺、1,6-己二胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺或者四乙烯五胺。

2.根据权利要求1所述的伯胺基固定化酶载体，其特征在于，在步骤1中，油相组成由32-38质量份的丙烯酸甲酯、12-17质量份的甲基丙烯酸甲酯、35-50质量份的双甲基丙烯酸乙二醇酯、6-20质量份的二烯丙基胺、0.5-1.5质量份的偶氮二异丁腈、50-120质量份的甲苯和45-85质量份的液蜡组成。

3.根据权利要求1所述的伯胺基固定化酶载体，其特征在于，在步骤1中，水相由600-900质量份的水中加入4.5-14质量份的羟乙基纤维素组成。

4.根据权利要求1所述的伯胺基固定化酶载体，其特征在于，在步骤1中，升温至70-85℃进行反应12-18h后滤出液体，用热水、丙酮洗涤固体后筛分至所需粒度规格，得到载体粗品。

5.根据权利要求1所述的伯胺基固定化酶载体，其特征在于，在步骤2中，在50-80℃搅拌下反应12-48h。

6.伯胺基固定化酶载体的制备方法，其特征在于，按照下述步骤进行：

步骤1，将油相与水相混合，搅拌以调节在水相中分散的油滴的粒径并形成稳定的聚合反应体系，升温至70-85℃进行反应，以得到载体粗品；

将0.5-1.5质量份的偶氮二异丁腈、30-40质量份的丙烯酸甲酯、10-20质量份的甲基丙烯酸甲酯、35-55质量份的双甲基丙烯酸乙二醇酯、5-25质量份的二烯丙基胺、40-150质量份的甲苯、40-90质量份的液蜡，搅拌混合均匀，配成油相；在600-900质量份的水中加入4.5-14质量份的羟乙基纤维素，搅拌均匀，配成水相；

步骤2，将载体粗品与胺基化试剂混合，以使载体粗品进行胺基化反应，并水洗至中性，即制得成品伯胺基固定化酶载体，胺基化试剂为乙二胺、1,4-丁二胺、1,6-己二胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺或者四乙烯五胺。

7.根据权利要求6所述的伯胺基固定化酶载体的制备方法，其特征在于，在步骤1中，油相组成由32-38质量份的丙烯酸甲酯、12-17质量份的甲基丙烯酸甲酯、35-50质量份的双甲基丙烯酸乙二醇酯、6-20质量份的二烯丙基胺、0.5-1.5质量份的偶氮二异丁腈、50-120质量份的甲苯和45-85质量份的液蜡组成；水相由600-900质量份的水中加入4.5-14质量份的羟乙基纤维素组成；升温至70-85℃进行反应12-18h后滤出液体，用热水、丙酮洗涤固体后筛分至所需粒度规格，得到载体粗品。

8.根据权利要求6所述的伯胺基固定化酶载体的制备方法，其特征在于，在步骤2中，在50-80℃搅拌下反应12-48h。

9.权利要求1—5任一项所述的伯胺基固定化酶载体在固定化青霉素G酰化酶制备6-氨基青霉烷酸，或者固定化D-氨基酸氧化酶制备戊二酰-7-氨基头孢烷酸，或者固定化GL-7-ACA酰化酶制备7-氨基头孢烷酸，或者固定化青霉素G酰化酶合成阿莫西林中的应用。