CN102559648B - 一种以改性的环氧基树脂为载体的固定化酶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以改性的环氧基树脂为载体的固定化酶，它包括酶和固定所述酶的改性载体，所述的酶为γ-谷氨酰转肽酶，所述的改性载体为经过pH8～10.5的载体两性电解质改性后的环氧基树脂Eupergit C250L。本发明还公开了上述固定化酶的制备方法和应用。本发明所得到的固定化酶具有性状均一、酶稳定性强、重复使用性能好、对反应环境pH值适应性强等特点，进一步提高了γ-谷氨酰转肽酶的稳定性，并实现了新型固定化酶在茶氨酸合成中的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种固定化酶及其制备方法和应用。
背景技术
生物催化反应具有条件温和、选择性高、反应效率高等特点，因而越来越多地应用于化学合成领域。但由于生物酶在体外工业环境下的稳定性差以及酶制剂的成本过高，极大地限制了生物催化在工业领域的实际应用。固定化酶技术通过将酶分子束缚(或结合)于特殊的相，不仅有效解决了催化剂的重复使用问题，同时还可显著改善生物酶的稳定性及催化特性(底物亲和力、立体选择性等)。
目前，作为固定化酶技术的一个重要分支，高性能酶固定化载体的开发和应用十分活跃。研究内容广泛涉及载体的合成、表征，以及载体的几何参数、表面性质、表面活性及理化性质等对于酶的固载量、酶活回收率和稳定性等方面的影响。但有关载体表面电荷性质对酶催化活性及稳定性的影响却鲜有系统的研究。
研究表明，不同基质的酶固定化载体的表面电荷性质(pzc值)不同，导致其表面环境的pH值产生差异，而过高或过低的pH值不仅会降低酶的催化效率，同时也将影响酶分子结构的稳定性。因此，在选择酶固定化载体时，不仅仅要考虑酶负载量的大小和连接的牢固性，同时也需兼顾载体表面电荷性质，使其与酶的最适作用条件相匹配。但由于目前缺乏各类载体表面电荷性质的相关数据，使得人们在选择载体时盲目性较大。
环氧基载体Eupergit C250L是一种常用的酶固定化载体，由单体聚合而成的多孔小球状树脂，参与聚合的单体有：N，N’-亚甲基-双丙烯酰胺、烯丙基缩水甘油醚、甲基丙烯酸酯。商品化的Eupergit C250L粒径分布在100～250μm的小球状颗粒，树脂上的微孔直径90～130nm，担载量200μmol环氧基团/g干树脂。Eupergit C250L具有良好的化学稳定性，机械强度高，其pzc值为6.54。目前以Eupergit C250L为载体的酶固定化研究很多，但对各种酶的固定化效果差异巨大(酶活回收率从8％～92％不等)。尽管不排除固定化过程对酶构象的机械性拉伸和扭曲以及对传质的影响，但载体自身电荷环境对酶分子构象以及表观催化性能的影响也是巨大的。目前，通过在Eupergit C250L表面接枝特定pH缓冲范围的载体两性电解质，制备具有缓冲性能的功能性载体，并将其用于酶固定化的研究尚未见报道。
γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase，GGT，最适作用pH 8.5～9.5)可特异性地将γ-谷氨酰基转移至受体分子，得到新的含γ-谷氨酰基的化合物，该反应成为谷氨酰基化反应。通过改变受体种类可获得不同的谷氨酰化合物。由于该反应具有位点特异性和光学选择性强、无需对反应物进行保护和脱保护、反应过程中也不消耗ATP等特点，因此利用该反应制备系列γ-谷氨酰基类化合物的研究正在成为工业生物催化领域的研究热点。目前该反应已成功地应用于一些重要谷氨酰化合物的合成，如γ-L-谷氨酰-L-多巴、谷胱甘肽、γ-D-谷氨酰-L-色氨酸、γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸以及茶氨酸等。但由于GGT在体外环境下易发生亚基解聚，引起酶活的不可逆下降，限制了其应用范围的进一步拓展。
目前，对γ-谷氨酰转肽酶的固定化及稳定化研究较少，且以载体两性电解质改性材料为载体的GGT固定化及应用均未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种以改性后的环氧基树脂为载体的固定化酶，以进一步提高γ-谷氨酰转肽酶对环境pH值的适应性，以及酶的稳定性和催化活性，降低制备茶氨酸的工艺成本。
本发明还要解决的技术问题是提供上述固定化酶的制备方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述固定化酶在催化合成茶氨酸中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种以改性的环氧基树脂为载体的固定化酶，它包括酶和固定所述酶的改性载体，所述的酶为γ-谷氨酰转肽酶，所述的改性载体为经过pH8～10.5的载体两性电解质改性后的环氧基树脂Eupergit C250L。
其中，所述的改性载体按如下方法制备得到：将干燥后的环氧基树脂Eupergit C250L加入pH8～10.5的载体两性电解质中，常温下搅拌反应16～20h后，将液体滤出，固体颗粒分别经纯水反复淋洗、0.5mol/L的NaCl溶液反复淋洗、纯水反复淋洗三道淋洗后烘干即制得改性载体。
其中，所述的pH8～10.5的载体两性电解质为pharmalyte TM 8-10.5，液态，CAS号为17-0455-01，缓冲范围为pH 8～10.5，生产厂商为GE healthcare，原溶液浓度为0.36meq/mL。
其中，所述的环氧基树脂Eupergit C250L为
C250L，CAS号为149531-08-8，生产厂商为FLUKA，EupergitTM C250L为N，N’-亚甲基-双丙烯酰胺、烯丙基缩水甘油醚、甲基丙烯酸酯共聚物，粒径分布在100～250μm的小球状颗粒，树脂上的微孔直径90～130nm，环氧基团浓度大于等于200μmol/g干树脂。
其中，对于每g干重环氧基树脂Eupergit C250L，载体两性电解质的用量为10～20mL。
其中，将pH8～10.5的载体两性电解质用浓度为50％(v/v)以上的pH8～10.5的载体两性电解质水溶液替换。
其中，所述的烘干条件为真空干燥箱内干燥48～72h，干燥温度不高于40℃。
上述以改性的环氧基树脂为载体的固定化酶的制备方法，将改性载体加入γ-谷氨酰转肽酶溶液中，于常温下振荡反应1～5h(优选2.5h)，将液体滤出，固体颗粒纯水淋洗3～4次，烘干后即得。
其中，所述的γ-谷氨酰转肽酶溶液的浓度为0.25～0.30mg/mL。
其中，对于每g干重改性载体，γ-谷氨酰转肽酶溶液的用量为10～20mL。
其中，所述的烘干条件为真空干燥箱内干燥48～72h，干燥温度不高于40℃。
上述制备得到的以改性的环氧基树脂为载体的固定化酶最终水淋洗吹干后置于冰箱4℃保存，制得的固定化酶具有很好的化学稳定性、结构稳定、有很好的机械操作强度、表面富含-NH2和-COOH，极易与酶分子间形成氢键或离子键。
上述以改性的环氧基树脂为载体的固定化酶在催化合成茶氨酸中的应用。
载体两性电解质：Pharmalyte，以下简称CA。
经过pH8～10.5的载体两性电解质改性后的环氧基树脂Eupergit C250L，即改性载体，以下简称ECCA。
以上述改性的环氧基树脂为载体的固定化γ-谷氨酰转肽酶，以下简称ECCA-GGT。
有益效果：本发明充分利用环氧基树脂Eupergit C250L的良好特性，通过在其表面共价键合缓冲范围在pH8～10.5的载体两性电解质制备新载体ECCA，制备得到的ECCA电荷零点值为9.1，接近GGT的最适作用pH值，且ECCA载体形状均一、稳定性高、表面富含-COOH和-NH2，为固定化γ-谷氨酰转肽酶提供了良好的操作条件。
以本发明方法制备的ECCA-GGT形状均一，酶活力回收率平均达到19.22％；在纯水中，固定化酶ECCA-GGT的最大反应速度为缓冲体系下的81％～95.8％；与游离酶相比，固定化酶的最适作用pH和温度略有改变，适用pH和温度范围均有一定程度的增大；固定化酶的热稳定性和pH稳定性均较游离酶有大幅度提高，且重复使用性能好。
附图说明
图1为ECCA对GGT的吸附-时间曲线。由于ECCA对GGT的固载是通过物理吸附，其吸附量与载体的比表面积相关，且可形成多分子层吸附。因此，载体对酶的平衡吸附量和酶活回收率可达2.7mg/g树脂和19.29％，较Eupergit C250L有较大幅度的提高。
图2为温度对ECCA-GGT固定化酶和游离酶活力的影响。该图显示，固定化酶ECCA-GGT和游离GGT的最适反应温度均在60℃左右。但ECCA-GGT对温度的敏感性有所降低，在室温(23.7℃)条件下，ECCA-GGT的相对酶活仍可达最高酶活的60％以上。
图3为pH值对固定化酶和游离酶活力的影响。该图显示，游离酶和固定化酶的最适作用pH值均在9.0左右。但固定化酶在对pH值变化的敏感性明显下降，当pH值为6.0时，固定化酶的相对酶活仍高达70％左右，而此时游离酶的相对酶活仅剩40.44％。
图4为ECCA-GGT固定化酶在纯水(A)和Tris-HCl缓冲体系(pH 8.0)(B)在的动力学常数拟合结果。该图显示，固定化酶在纯水中的最大反应速度(rmax)为0.0236mmol/L.min，为其在Tris-HCl缓冲液中的116.5％。
图5为游离酶和ECCA-GGT固定化酶的热稳定性比较。该图显示，ECCA-GGT的热稳定性较游离酶有大幅度的提高。
图6为ECCA-GGT的操作稳定性。该图显示，ECCA-GGT的操作稳定性良好。经19个批次的重复使用，固定化酶ECCA-GGT的相对酶活仍可达初始值的50％以上。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例中酶活力检测方法如下：
酶活定义：以γ-谷氨酰对硝基苯胺(GpNA)为供体，以双甘二肽为受体，每分钟催化GpNA水解生成1umol对硝基苯胺(pNA)所需的酶量
对硝基苯胺(pNA)标准曲线：配制不同浓度(1～5mmol/L)的pNA标准溶液，并在410nm下测定其吸光值，分别以pNA浓度和相应的吸光值为横、竖坐标，绘制标准曲线。
游离酶酶活测定：取酶液50μl，加入Tris-HCl，定容置10mL(酶液稀释200倍)。取稀释后酶液0.5mL，加入0.5mL GpNA(浓度5mmol/L)，0.5mL双甘二肽，1.5mLTris-HCl buffer，总反应体系3.0mL。37℃水浴反应5～15min。反应液于A410测定吸光值。固定化酶酶活测定：取固定化酶10～30mg，加入0.5mL GpNA，0.5mL双甘二肽，2.0mLTris-HCl buffer，总反应体系3.0mL。37℃水浴反应5～10min。反应液滤出后于A410测定吸光值。
以下实施例中酶活回收率计算方法如下：
回收率＝(固定化酶活力/总投入酶活)×100％
以下实施例中，Eupergit C250L购自于FLUKA公司，载体两性电解质pharmalyteTM8--10.5购自于GE Healthcare公司，γ-谷氨酰转肽酶为自制，所得GGT为电泳纯，酶活为8.12U/mL，蛋白浓度为0.5mg/mL。
实施例1：ECCA载体制备。
取0.3g烘干的Eupergit C250L置于20ml砂芯管内，按照固液比1g/20mL加入50％(v/v)的CA水溶液，常温反应16h，反应结束后将先将反应液体滤出。滤干后的固体颗粒用纯水反复淋洗6～7次；再用0.5mol/L的NaCl溶液反复淋洗3～4次；最后再用纯水淋洗6～7次后滤干，于40℃烘干即制得CA修饰的载体ECCA。按质量差减法计算CA的接枝量为0.0964g。
实施例2：ECCA载体制备。
称取0.3g烘干的Eupergit C250L置于20ml砂芯管内，按照固液比1g/10mL加入100％(v/v)CA，24℃室温反应20h，反应结束后将先将反应液体滤出。滤干后的固体颗粒用纯水反复淋洗6～7次；再用0.5mol/L的NaCl溶液反复淋洗3～4次；最后再用纯水淋洗6～7次后滤干，于40℃烘干即制得CA修饰的载体ECCA。按质量差减法计算CA的接枝量为0.124g。
实施例3：ECCA-GGT的制备方法。
称取以实施例2中最优选方法制备好的干成品载体ECCA 0.3g至于安瓿瓶中，按固液比1g∶13.3mL加入纯化后的GGT酶液(酶浓度为0.3mg/mL)，于常温下水浴摇床振荡反应1h，反应结束后先将反应液体滤出，滤干后的固体颗粒用纯水反复淋洗3～4次，于30℃烘干即制得ECCA-GGT。GGT吸附量为1.26mg/g树脂，酶活回收率为9.72％。
实施例4：ECCA-GGT的制备方法。
称取以实施例2中最优选方法制备好的干成品载体ECCA 3.0g至于安瓿瓶中，按固液比1g∶20mL加入纯化后的GGT酶液(酶浓度为0.25mg/mL)，于常温下水浴摇床振荡反应2.5h，反应结束后先将反应液体滤出，滤干后的固体颗粒用纯水反复淋洗3～4次，于30℃烘干即制得ECCA-GGT。GGT吸附量为2.7mg/g树脂，酶活回收率为19.29％。
实施例5：ECCA-GGT的制备方法。
称取以实施例2中最优选方法制备好的干成品载体ECCA 3.0g至于安瓿瓶中，按固液比1g∶10mL加入纯化后的GGT酶液(酶浓度为0.3mg/mL)，于常温下水浴摇床振荡反应5h，反应结束后先将反应液体滤出，滤干后的固体颗粒用纯水反复淋洗3～4次，于30℃烘干即制得ECCA-GGT。GGT吸附量为2.68mg/g树脂，酶活回收率为19.21％。
实施例6：ECCA-GGT催化制备茶氨酸。
茶氨酸(Theanine)属酰胺类化合物，系统命名为N-乙基-γ-L-谷氨酰胺(N-ethyl-γ-L-glutamine)。以γ-谷氨酰转肽酶为催化剂，L-谷氨酰胺(Gln)和乙胺为底物，可实现酶法合成茶氨酸。配制Gln和乙胺浓度皆为5mmol/L，加入游离酶GGT，以及按实施例4方法制备的固定化酶ECCA-GGT，于40℃水浴反应，定时取样测定产物茶氨酸的浓度。实验结果表明，以本发明的固定化酶为催化剂，在相同的酶浓度下，经反应24h，供体转化率为62.3％；以游离酶为催化剂时，供体转化率仅为34.1％。该反应体系简单，条件温和，可实现连续操作。
实施例7：缓冲性能比较试验：ECCA-GGT固定化酶在纯水和Tris-HCl缓冲体系下的动力学常数测定。
按照上述的最优固定化条件制备得到ECCA-GGT，分别在纯水和Tris-HCl缓冲(pH8.0)中测定固定化酶的动力学常数。实验中固定受体双甘二肽的浓度为100mmol/L，供体GpNA浓度为0.5～5mmol/L，测定不同GpNA浓度下的GGT反应速率。通过单底物米氏方程拟合，得到固定化酶ECCA-GGT在纯水和Tris-HCl缓冲体系下的最大反应速率分别为0.0275mmol/L.min和0.0236mmol/L.min(如图4所示)。纯水中ECCA-GGT在纯水中的最大反应速率为缓冲体系下的116.5％。
实施例8：游离酶和ECCA-GGT固定化酶的最适温度比较。
按照上述的最优固定化条件制备得到ECCA-GGT，在不同温度(23.7～70℃)下分别测定游离酶及固定化酶活力，结果如图2所示：固定化酶ECCA-GGT和游离GGT的最适反应温度均在60℃左右。但ECCA-GGT对温度的敏感性有所降低，在室温(23.7℃)条件下，ECCA-GGT的相对酶活仍可达最高酶活的60％以上。
实施例9：游离酶、Eupergit C250L-GGT和ECCA-GGT的最适pH值比较。
按照上述的最优固定化条件制备得到ECCA-GGT。按宋希文等的方法(详见《现代化工》，2009，29(增刊2)：147～149)，以未经修饰的Eupergit C250L为载体，按固液比1∶10加入纯化后的GGT，混合物于4℃下振荡反应24h，滤除残液后，用10倍于树脂量(v/w)的Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH 8.0)多次洗涤后，制得固定化酶EupergitC250L-GGT。
分别在pH 7～9(Tris-HCl缓冲)及pH10～11(碳酸氢钠缓冲)的溶液中测定游离酶、Eupergit C250L-GGT和ECCA-GGT的活力，结果如图3所示：游离酶和固定化酶的最适作用pH值均在9.0左右。但ECCA-GGT对pH值变化的敏感性明显下降，当pH值为6.0时，ECCA-GG的相对酶活仍高达70％左右，而此时游离酶和Eupergit C250L-GGT的相对酶活仅剩40.44％和17.9％。表明以CA修饰的Eupergit C250L为载体对GGT进行固定化可有效地扩大酶的作用pH范围。
实施例10：ECCA-GGT固定化酶热稳定性实验。
取一定量的游离GGT和ECCA-GGT分别在不同温度下(30～50℃)保温，每隔一定时间取样测定GGT酶活，以0时刻的GGT活性为100％，计算相对酶活Ar。实验结果表明，ECCA-GGT的热稳定性较游离酶有较大幅度的上升(图5A和5B)。经拟合，ECCA-GGT的热失活反应活化能为Ed＝125.4KJ/mol，较游离酶(Ed＝49.8KJ/mol)有大幅度提高。
实施例11：ECCA-GGT使用稳定性试验。
称取18.1mg的ECCA-GGT，于4℃下贮藏，定期测定酶活，固定化酶的储存稳定性测试，结果如图6所示：ECCA-GGT的操作稳定性良好。经19个批次的重复使用，固定化酶ECCA-GGT的相对酶活仍可达初始值的50％以上。
Claims (5)
1.一种以改性的环氧基树脂为载体的固定化酶，其特征在于，它包括酶和固定所述酶的改性载体，所述的酶为γ-谷氨酰转肽酶，所述的改性载体为经过pH8～10.5的载体两性电解质改性后的环氧基树脂Eupergit C250L；
其中，所述的改性载体按如下方法制备得到：将干燥后的环氧基树脂Eupergit C250L加入pH8～10.5的载体两性电解质中，常温下搅拌反应16～20h后，将液体滤出，固体颗粒分别经纯水、0.5mol/L的NaCl溶液和纯水反复淋洗后干燥即制得改性载体；
对于每g干重环氧基树脂Eupergit C250L，载体两性电解质的用量为10～20mL；
所述的pH8～10.5的载体两性电解质为pharmalyteTM8-10.5。
2.根据权利要求1所述的以改性的环氧基树脂为载体的固定化酶，其特征在于，将pH8～10.5的载体两性电解质用体积百分浓度为50%以上的pH8～10.5的载体两性电解质水溶液替换。
3.权利要求1所述的以改性的环氧基树脂为载体的固定化酶的制备方法，其特征在于，将改性载体加入γ-谷氨酰转肽酶溶液中，于常温下振荡反应1～5h，将液体滤出，固体颗粒纯水淋洗3～4次，烘干后即得；
其中，所述的γ-谷氨酰转肽酶溶液的浓度为0.25～0.30mg/mL；
对于每g干重改性载体，γ-谷氨酰转肽酶溶液的用量为10～20mL。
4.根据权利要求3所述的以改性的环氧基树脂为载体的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述的烘干，其烘干条件为真空干燥箱内干燥48～72h，干燥温度不高于40℃。
5.权利要求1所述的以改性的环氧基树脂为载体的固定化酶在催化合成茶氨酸中的应用。
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