CN114606221B

CN114606221B - 固定化酶、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN114606221B
Application number: CN202210511794.2A
Authority: CN
Inventors: 洪浩; 詹姆斯·盖吉; 张娜; 罗杰斯卡·维亚撒·威廉姆斯; 崔瑜霞; 赵佳东; 张春月
Original assignee: Asymchem Laboratories Tianjin Co Ltd
Current assignee: Asymchem Laboratories Tianjin Co Ltd
Priority date: 2022-05-12
Filing date: 2022-05-12
Publication date: 2022-09-02
Anticipated expiration: 2042-05-12
Also published as: CN114606221A

Abstract

本发明提供了一种固定化酶、其制备方法及应用。该固定化酶包括环氧树脂载体和酶，酶与环氧树脂载体通过共价键连接，环氧树脂载体为LX‑109S环氧树脂。本申请采用LX‑109S环氧树脂作为环氧树脂载体，基于该载体本身的特性，使得其对酶的固定化效果更为稳定，且与酶的共价键结合牢固，不会影响酶自身活性。

Description

固定化酶、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及酶的固定化技术领域，具体而言，涉及一种固定化酶、其制备方法及应用。

背景技术

生物催化已成为绿色合成药物的重要部分，也是催化药物结构单元和中间体最有前途的技术之一，尤其是为手性合成提供了独特的替代方法。越来越多的生物酶在工业过程中被用作催化剂，但是由于酶使用条件的温和性和其本身的易变性使酶对环境要求非常的苛刻，且难回收利用，从而大大限制了酶在工业中的应用，导致固定化酶的需求增加，因此经常被称为“生物催化剂”的固定化酶被广泛用于工业有机合成和生物转化。

固定化酶的制作方法一般有吸附、共价偶联、交联法和包埋。共价偶联法是将酶的非活性侧链基团与载体中的活性官能团进行共价键和，如羧酸类、氨基类、环氧基类。其中环氧基类具有很高的反应活性和可塑性，载体上的环氧基团可以直接同酶分子上的-NH₂、-HS等非活性基团反应进行共价固定。由于环氧基的反应活性极高，对于含有多种非活性基团的酶，可进行多点固定来提高酶同在载体间的结合强度，因此环氧基类载体对酶的固定具有极高的优越性。

近年来合成化学家对连续流合成的兴趣日益浓厚，现在连续流合成也引起了生物转化的注意。新型固定化平台的出现使固定化酶在连续流生物催化中实现无缝整合。新型高效酶的发现和进化，以生物催化为重点的新型逆向合成方法，重组蛋白的成本降低和酶固定化策略都为连续流式生物催化做好了充分的准备。

环氧基树脂在酶的固定化中已被广泛应用，但是该树脂在固定化过程中对已纯化的纯酶的固定化效果较好，对粗酶液固定化效果不太理想，因此增加了固定化酶的成本。而且共价键合过程所发生的剧烈化学反应往往对生物分子的活性是极其不利的，所以对于活性中心较活泼的酶在固定化过程中会影响酶的活性，造成活性回收率极低。另外，环氧载体和酶的共价结合需要在高离子强度下进行，若离子强度不适合或环境中干扰因素较多，往往导致酶和载体之间仅以离子吸附的形式结合，并不能形成稳定的化学键结合可重复使用性差。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种固定化酶、其制备方法及应用，以解决现有技术中的环氧树脂固定化酶的固定化效果不稳定的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种固定化酶，该固定化酶包括环氧树脂载体和酶，酶与环氧树脂载体通过共价键连接，环氧树脂载体为LX-109S环氧树脂，酶来自于粗酶。

进一步地，上述酶选自转氨酶、D-乳酸脱氢酶、环己酮单加氧酶、酮还原酶、烯还原酶、腈水解酶、氨裂解酶、氨基酸脱氢酶、亚胺还原酶、脂肪酶及它们的突变体中的任意一种，优选氨裂解酶选自苯丙氨酸氨裂解酶中的任意一种，优选氨基酸脱氢酶选自亮氨酸脱氢酶、苯丙氨酸脱氢酶中的任意一种。

进一步地，上述固定化酶中，每克环氧树脂载体上酶的负载量为30 mg ~70 mg。

进一步地，上述固定化酶还包括辅因子。

根据本发明的另一方面，提供了一种上述任一种固定化酶的制备方法，该制备方法包括：步骤S1，将第一磷酸盐缓冲液与酶混合形成缓冲酶液；酶来为粗酶；步骤S2，将缓冲酶液与环氧基树脂混合进行固定化反应后用第二磷酸盐缓冲液洗涤，得到固定化酶，环氧树脂为LX-109S环氧树脂。

进一步地，上述缓冲酶液与环氧基树脂的体积比为3:1~5:1。

进一步地，上述第一磷酸盐缓冲液的pH值为7.0~8.0，第一磷酸盐缓冲液中含有氯化钠，优选第一磷酸盐缓冲液中所述氯化钠的浓度为1±0.2 mol/L；第二磷酸盐缓冲液的pH值为7.0~8.0，第二磷酸盐缓冲液中不含氯化钠。

进一步地，上述步骤S2包括：将缓冲酶液与环氧基树脂混合在10~20 ℃下混合并进行摇床培养16~24h后在3~5℃静置孵育40~48 h，得到固定化体系；采用第二磷酸盐缓冲液对固定化体系进行洗涤，得到固定化酶。

根据本发明的另一方面，提供了一种上述任一种的固定化酶的应用，应用包括将固定化酶作为催化剂应用于连续催化反应中。

应用本发明的技术方案，本申请采用LX-109S环氧树脂作为环氧树脂载体，基于该载体本身的特性，使得其对酶的固定化效果更为稳定，且与酶的共价键结合牢固，不会影响酶自身活性，因此能够直接以粗酶作为酶来源，极大地简化了酶固定工艺，降低了固定化酶的生产成本，缩短了流程。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

如本申请背景技术所分析的，现有技术的环氧树脂固定化酶的固定化效果不稳定，为了解决该问题，本申请提供了一种固定化酶、其制备方法和应用。

在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种固定化酶，该固定化酶包括环氧树脂载体和酶，酶与环氧树脂载体通过共价键连接，环氧树脂载体为LX-109S环氧树脂。

本申请采用LX-109S环氧树脂作为环氧树脂载体，基于该载体本身的特性，使得其对酶的固定化效果更为稳定，且与酶的共价键结合牢固，不会影响酶自身活性，因此能够直接以粗酶作为酶来源，极大地简化了酶固定工艺，降低了固定化酶的生产成本，缩短了流程

基于环氧树脂与酶的共价键结合，因此现有技术中可以实现共价键结合固定的酶均可考虑应用于本申请中，尤其是当酶选自转氨酶、D-乳酸脱氢酶、环己酮单加氧酶、酮还原酶、烯还原酶、腈水解酶、氨裂解酶、氨基酸脱氢酶、亚胺还原酶、脂肪酶及它们的突变体中的任意一种时，固定化效果尤为突出。优选氨裂解酶选自苯丙氨酸氨裂解酶中的任意一种，优选氨基酸脱氢酶选自亮氨酸脱氢酶、苯丙氨酸脱氢酶中的任意一种。以下表1中举例示出了一些酶的来源。

由于上述LX-109S环氧树脂的特点，其不仅可以用于纯化酶的固定，特别是酶来自于粗酶（即为未经纯化的酶）时，仍然可以取得良好的固定化效果。比如酶来自由大肠杆菌工程菌表达的粗酶酶液，该粗酶酶液是将细胞沉淀后用磷酸盐缓冲液重悬，经溶菌酶、超声或匀浆破碎，再经离心除去破碎的细胞残渣而得到的混合蛋白溶液。

需解释的是，生产酶的工艺通常包括外源基因导入宿主细胞构建工程菌、菌株复苏和扩大培养、高密度发酵、细胞破碎、除细胞碎片收集酶蛋白溶液、柱纯化提纯目标酶蛋白，纯化后的酶液冻干得到纯酶酶粉。而本发明中的粗酶指的是柱纯化前得到的粗酶液，其未经纯化处理，直接冻干形成的粗酶酶粉。通常，粗酶中含有宿主细胞本底表达的内源性蛋白，包括蛋白酶、氧化酶、还原酶等，还有水溶性的内源性蛋白翻译所用因子、氨基酸、核酸等。目标酶在粗酶溶液中的占比很小，通常＜30%，且酶液粘度大，直接使用粗酶液进行酶蛋白的树脂载体固定化，虽然成本低，但由于杂蛋白和其它物质的影响，使得固定化结合率低、固定化酶表现出的活性也往往较低。

经过试验研究发现，LX-109S环氧树脂对未经纯化过的粗酶进行固定化，与ECR8285和LX120等环氧基树脂对粗酶固定化效果相比，酶活性和可重复使用性提高了20％~60％；LX-109S环氧树脂固定的脂肪酶在水相和有机相的反应，与其他类型树脂固定化相比，酶活性和可重复使用性提高了20％~100％；LX-109S环氧树脂固定转氨酶，应用于酶促合成西他列汀，与其他类型树脂固定作用相比，酶活性和可重复使用性提高了20％~60％。

基于酶与环氧树脂的共价键结合，在保证尽可能提高酶的负载量基础上，保证酶的催化活性充分发挥，优选固定化酶中，每克环氧树脂载体上上述酶的负载量为30 mg ~70mg。比如为30 mg 、35 mgg、40 mg、45 mg、50 mg、55 mg、60 mg、65 mg、70 mg。

在本申请一些实施例中，为了提高固定化酶的催化活性和催化稳定性，优选上述固定化酶还包括可选的辅因子，辅因子的具体选择可以根据酶的具体种类来进行，比如从PLP，FAD，NAD⁺, NADP⁺等中进行选择，具体的选择本文不再一一列举。

在本申请另一种典型的实施方式中，提供了一种上述任一种的固定化酶的制备方法，该制备方法包括：步骤S1，将第一磷酸盐缓冲液与酶混合形成缓冲酶液，酶为粗酶；步骤S2，将缓冲酶液与环氧基树脂混合进行固定化反应后用第二磷酸盐缓冲液洗涤，得到固定化酶，环氧树脂为LX-109S环氧树脂。

本申请通过上述制备方法实现酶与LX-109S环氧树脂共价键结合，上述制备方法步骤简单，容易操作，易于推广应用。

在本申请一些实施例中，为了提高酶液中酶的固定化率，优选上述缓冲酶液与环氧基树脂的体积比为3:1~5:1，比如3:1~4:1、3:1~3.5:1、3.5:1~5:1、3.5:1~4:1或4:1~5:1。

在本申请一些实施例中，上述第一磷酸盐缓冲液和第二磷酸盐缓冲液可以相同也可以不同，优选二者组成不同，以发挥各阶段的作用，优选地，上述第一磷酸盐缓冲液的pH值为7.0~8.0；第二磷酸盐缓冲液的pH值为7.0~8.0。上述第一磷酸盐缓冲液和第二磷酸盐缓冲液与本领域常用的磷酸盐缓冲的基本组成相似，第一磷酸盐缓冲液中含有氯化钠，优选第一磷酸盐缓冲液中氯化钠的浓度为1±0.2 mol/L，即以磷酸盐作为缓冲对，采用氯化钠调整离子强度。第二磷酸盐缓冲液中不含氯化钠。

为了提高固定化效率，并尽可能提高固定化的稳定性，优选上述步骤S2包括：将缓冲酶液与环氧基树脂混合10~20 ℃下混合并进行摇床培养16~24 h后在3~5℃静置孵育40~48 h，得到固定化体系；采用第二磷酸盐缓冲液对固定化体系进行洗涤，得到固定化酶。上述摇床培养可以采用轨道式摇床等现有技术常用摇床设备。

在一些实施例中，上述混合温度为10℃、20℃、15℃、12℃、18℃、16℃或14℃；上述摇床培养时间为16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h或24h，上述静置时间为40h、41h、42h、43h、44h或45h。

在本申请另一种典型的实施方式中，还提供了一种上述任一种的固定化酶的应用，该应用包括将固定化酶作为催化剂应用于连续催化反应中。由于本申请的固定化酶的稳定性较高，因此在连续催化反应中的催化活性得到较好的维持，使用寿命得到延长，进而保证了连续催化反应的反应效率。

以下将结合实施例和对比例，进一步说明本申请的有益效果。

下列实施例中的PB代表磷酸缓冲液的意思，考虑到固定化过程中酶存在一定的损失，因此在制作固定化酶时，所用的酶量高于游离酶。

实施例1：转氨酶（TA IV-Ss）环氧基树脂上的固定过程

取出1 g环氧基树脂，并用0.2 M PB 8.0和0.8 M NaCl缓冲液洗涤，除去缓冲液，并保持树脂使用。然后加入4 mL酶溶液（粗酶酶粉用0.2 M PB 8.0和0.8 M NaCl缓冲液配制酶溶液使蛋白质含量25 mg / mL，相应具有辅因子PLP），并在20 ℃下与环氧基树脂在轨道式摇床上培养20 h，取出在4 ℃下静置孵育48 h。用含有20 mM PB 8.0洗涤3次，得到负载30-80 mg蛋白的固定化转氨酶（蛋白负载量由酶标仪考马斯亮蓝法或者BCA(bicinchoninic acid)测蛋白法得到，由于环氧树脂不同，蛋白负载量不同）。

固定化转氨酶(TA IV-Ss-1, TA IV-Ss-2)活性及重复使用性测试：

主原料1

在20 mL的反应瓶中，加入0.5 mL MeOH，溶解0.1 g主原料1，并加入15 eq异丙胺盐酸盐和15.0 mg PLP（5’-磷酸吡哆醛），补加0.1 M PB 8.0至反应液终体积为5 mL，再加入0.1 g TA IV-Ss-1, 0.1 g TA IV-Ss-2粗酶酶粉或由0.2 g TA IV-Ss-1, 0.2 g TAIV-Ss-2粗酶酶粉制备的上述固定化转氨酶，在47 ℃搅拌20 h。体系经HPLC检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离，投入下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。转氨酶反应数据如表2下：

实施例2：脂肪酶(CALB)环氧基树脂上的固定过程

固定化方式同实施例1

固定化脂肪酶(CALB)活性及重复使用性测试：

在10 mL的反应瓶中，加入1.8 mL MTBE，溶解0.1 g主原料2，并加入0.8 eq HMDS（六甲基二硅氮烷），再加入0.1 g CALB粗酶酶粉或由0.1 g CALB粗酶酶粉制备的固定化酶，在40℃搅拌20 h。体系经HPLC检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数，记录在表3中。

固定化脂肪酶(CALB-1, CALB-2)活性及重复使用性测试：

在10 mL的反应瓶中，加入2 mL MTBE，溶解0.1 g主原料3，补加0.1 M KPB 7.5至反应液终体积为4 mL，再加入0.1 g CALB-1, CALB-2粗酶酶粉或由0.1 g CALB-1, 0.1 gCALB-2粗酶酶粉制备的固定化酶，在47 ℃搅拌16-20 h。体系经HPLC检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离，投入下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数，原料3记录在表3中。

固定化脂肪酶(CALB-1, CALB-2)活性及重复使用性测试：

在10 mL的反应瓶中，加入2 mL MTBE，溶解0.1 g主原料4, 并加入0.275g 乙酸乙烯酯，再加入0.1 g CALB-1, CALB-2粗酶酶粉或由0.1 g CALB-1, 0.1 g CALB-2粗酶酶粉制备的固定化酶，在30 ℃搅拌16-20 h。体系经HPLC检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离，投入下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数，记录在表3中。

实施例 3：固定化的酮还原酶（CR-Ac）的转化率及再利用性测试

固定化方式同实施例1

固定化酶活(CR-Ac)性及重复使用性检测：

在10 mL的反应瓶中，加入0.2 mL异丙醇（IPA），溶解0.1 g主原料5，并加入1 mL0.1 M PB 7.0和10 mg NAD⁺，再加入0.1 g CR-Ac粗酶酶粉或由0.2 g CR-Ac粗酶酶粉制备的固定化酶，在30 ℃搅拌20 h。体系经HPLC检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离，投入下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。反应数据如表4：

实施例 4：固定化的单加氧酶（CHMO-Rr）的转化率及再利用性测试

固定化方式同实施例1

CHMO-Rr环氧基载体固定化酶的活性通过利用以下主原料6进行反应来检测

0.3 mL的异丙醇装入10 mL的反应瓶中，随后加入50 mg的主原料6和3 mL含有5mg NADP ⁺的0.1 M PB（pH 8.0），然后加入5 mg醇脱氢酶(ABY93890.1)干粉作为辅酶，并加入0.1 g CHMO-Rr粗酶酶粉或由0.2 g CHMO-Rr粗酶酶粉制备的固定化酶。在 30 ℃下反应20 h，测试转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离，投入下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。结果见下表。

实施例 5：固定化烯还原酶（ERED-Sc）的转化率及再利用性测试

固定化方式同实施例1

ERED-Sc环氧基载体固定化酶的活性通过利用以下主原料7进行反应来检测

3 mL的0.1 M PB（pH 7.0- 8.0）装入10 mL的反应瓶中，随后通过加入0.1 g的主原料7，接着加入 10 mg NAD (P)⁺，80 mg甲酸铵，20 mg 葡萄糖脱氢酶(ACR78513.1)作为辅酶，并加入0.1 g EREC-Sc粗酶酶粉或由0.2 g ERED-Sc粗酶酶粉制备的固定化酶。在 30℃下反应20 h，测试转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离，投入下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。测试结果见下表。

实施例6：固定化的亚胺还原酶 (IRED)的转化率及再利用性测试

固定化方式同实施例1

IRED-1, IRED-2环氧基载体固定化酶的活性通过利用以下主原料8进行反应来检测

将2 mL 0.1 M PB 缓冲液（pH 7.0-8.0 ）加入10 mL反应器中，然后加入100 mg上述主原料8、 10 mg NAD⁺、60 mg甲酸铵、5 mg 甲酸氨脱氢酶(AIY34662.1)干粉作为辅酶。再加入0.1 g IRED-1, 0.1 g IRED-2粗酶酶粉或由0.2g IRED-1, 0.2 g IRED-2粗酶酶粉制备的固定化酶。在30 ℃ 下反应20 h后，检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离，投入下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。测试结果如下。

实施例 7：固定化的氨基酸脱氢酶（AADH-Ti）的转化率及再利用性测试

固定化方式同实施例1

AADH-Ti环氧基载体固定化酶的活性通过利用以下主原料9进行反应检测

在10 mL的反应瓶中，加入5 mL 0.1 M Tris-Cl（pH 8.0-9.0），随后加入0.1 g 主原料9 ，加入108 mg 氯化铵（ammonium chloride），调节 pH 值至7.5-8.0，接着加10 mgNAD⁺、50 mg GDH作为辅酶，并加入 0.1 g AADH-Ti的粗酶酶粉或者由0.2 g AADH-Ti粗酶酶粉制备的固定化酶。在30℃下反应20 h后用于转化率测试。测试结果见下表。

实施例8 转氨酶环氧基载体固定化酶在填充床连续反应中的应用

实施例1中转氨酶TA IV-Ss-2固定化至载体LX-109S，所得固定化酶填充至120 mL柱体积的柱状反应器中，固定化酶用量70 g。

100g主原料1，用0.5 L的甲醇溶解，并加入15 eq的异丙胺盐酸盐（0.6 L的6 M 异丙胺盐酸盐水溶液）和 5 g PLP，加PB缓冲液（0.1 M, pH 8.0）定容至5 L。

设置流速0.4 mL/min，即保留时间300 min，进行连续化反应，出口端流出液检测转化率，转化率＞98%，持续运行280 h，转化率降低至86%。具体见下表。

实施例9 转氨酶环氧基载体固定化酶在连续搅拌罐反应中的应用

使用同实施例1的固定化酶TA IV-Ss-2，载体为LX-109S，1 L反应器中加入60 g转氨酶TA IV-Ss的固定化酶，加入300 mL磷酸缓冲液。

100 g主原料1，加入4 L PB (0.1 M, pH 8.0)，0.6 L异丙胺盐酸盐水溶液（6 M）和5 g PLP，打浆制成混悬液。

以0.4 mL/min的速度向反应瓶中连续添加底物混悬液（即保留时间500 min），同时以同样的流速在出口抽出反应体系（管道末端加过滤头，防止将固定化酶抽出）。在该条件下，转化率可达90%以上，且连续运行350 h，转化率基本无降低。结果如下表所示。

实施例10：转氨酶（TA IV-Ss）环氧基树脂上的固定过程

取出1 g环氧基树脂，并用0.2 M PB 8.0和0.8 M NaCl缓冲液洗涤，除去缓冲液，并保持树脂使用。然后加入4 mL粗酶酶溶液（用0.2 M PB 8.0和0.8 M NaCl缓冲液溶解粗酶酶粉配制酶溶液使蛋白质含量20 mg / mL，相应具有辅因子PLP），并在20 ℃下与环氧基树脂在轨道式摇床中培养20 h，取出在4 ℃下静置孵育48 h。用含有20 mM PB 8.0洗涤3次，得到含有44 mg/g蛋白的固定化转氨酶（蛋白负载量由酶标仪考马斯亮蓝法或者BCA(bicinchoninic acid)。

实施例11：转氨酶（TA IV-Ss）环氧基树脂上的固定过程

取出1 g环氧基树脂，并用0.2 M PB 8.0和0.8 M NaCl缓冲液洗涤，除去缓冲液，并保持树脂使用。然后加入4 mL粗酶酶溶液（用0.2 M PB 8.0和0.8 M NaCl缓冲液溶解粗酶酶粉配制酶溶液使蛋白质含量30 mg / mL，相应具有辅因子PLP），并在20 ℃下与环氧基树脂在轨道式摇床中培养20 h，取出在4 ℃下静置孵育48 h。用含有20 mM PB 8.0洗涤3次，得到含有51 mg/g蛋白的固定化转氨酶（蛋白负载量由酶标仪考马斯亮蓝法或者BCA(bicinchoninic acid)。

实施例12：转氨酶（TA IV-Ss）环氧基树脂上的固定过程

取出1 g环氧基树脂，并用0.2 M PB 8.0和0.8 M NaCl缓冲液洗涤，除去缓冲液，并保持树脂使用。然后加入4 mL粗酶酶溶液（用0.2 M PB 8.0和0.8 M NaCl缓冲液溶解粗酶酶粉配制酶溶液使蛋白质含量25mg / mL，相应具有辅因子PLP），并在10 ℃下与环氧基树脂在轨道式摇床中培养24 h，取出在4 ℃下静置孵育48 h。用含有20 mM PB 8.0洗涤3次，得到含有55 mg/g蛋白的固定化转氨酶（蛋白负载量由酶标仪考马斯亮蓝法或者BCA(bicinchoninic acid)。

实施例13：转氨酶（TA IV-Ss）环氧基树脂上的固定过程

取出1 g环氧基树脂，并用0.2 M PB 8.0和0.8 M NaCl缓冲液洗涤，除去缓冲液，并保持树脂使用。然后加入4 mL粗酶酶溶液（用0.2 M PB 8.0和0.8 M NaCl缓冲液溶解粗酶酶粉配制酶溶液使蛋白质含量25 mg / mL，相应具有辅因子PLP），并在20 ℃下与环氧基树脂在轨道式摇床中培养16 h，取出在4 ℃下静置孵育48 h。用含有20 mM PB 8.0洗涤3次，得到含有48 mg/g蛋白的固定化转氨酶（蛋白负载量由酶标仪考马斯亮蓝法或者BCA(bicinchoninic acid)。

实施例14：转氨酶（TA IV-Ss）环氧基树脂上的固定过程

取出1 g环氧基树脂，并用0.2 M PB 8.0和0.8 M NaCl缓冲液洗涤，除去缓冲液，并保持树脂使用。然后加入4 mL粗酶酶溶液（用0.2 M PB 8.0和0.8 M NaCl缓冲液溶解粗酶酶粉配制酶溶液使蛋白质含量25 mg / mL，相应具有辅因子PLP），并在25 ℃下与环氧基树脂在轨道式摇床中培养20 h，取出在4 ℃下静置孵育48 h。用含有20 mM PB 8.0洗涤3次，得到含有61 mg/g蛋白的固定化转氨酶。

采用与实施例1相同的测试手段进行测试，测试结果见表11。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：

本申请采用LX-109S环氧树脂作为环氧树脂载体，基于该载体本身的特性，使得其对酶的固定化效果更为稳定，且与酶的共价键结合牢固，不会影响酶自身活性。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司

<120> 固定化酶、其制备方法及应用

<130> PN148731KLY

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 338

<212> PRT

<213> Sciscionella sp. SE31

<400> 1

Met Thr Thr Thr Glu Phe Ala Asn Ser Asn Leu Val Ala Val Glu Pro

1 5 10 15

Gly Ala Ile Arg Glu Pro Thr Pro Pro Gly Ser Val Ile Gln Tyr Ser

20 25 30

Glu Tyr Glu Leu Asp Arg Ser Gln Pro Leu Ala Gly Gly Val Ala Trp

35 40 45

Ile Glu Gly Glu Tyr Val Pro Ala Asp Glu Ala Arg Ile Ser Ile Phe

50 55 60

Asp Thr Gly Phe Gly His Ser Asp Leu Thr Tyr Thr Val Ala His Val

65 70 75 80

Trp His Gly Asn Ile Phe Arg Leu Glu Asp His Leu Asp Arg Leu Leu

85 90 95

His Gly Ala Ala Arg Leu Lys Leu Glu Thr Gly Met Ser Arg Glu Glu

100 105 110

Leu Ala Gly Ile Ala Lys Arg Cys Val Ser Leu Ser Gln Leu Arg Glu

115 120 125

Ala Tyr Val Asn Ile Thr Ile Thr Arg Gly Tyr Gly Lys Lys Arg Gly

130 135 140

Glu Lys Asp Leu Thr Lys Leu Thr His Gln Val Tyr Val Tyr Ala Ile

145 150 155 160

Pro Tyr Leu Trp Ala Phe Pro Pro Glu Glu Gln Ile Phe Gly Thr Ser

165 170 175

Val Ile Val Pro Arg His Val Arg Arg Ala Gly Arg Asn Thr Ile Asp

180 185 190

Pro Thr Ile Lys Asn Tyr Gln Trp Gly Asp Leu Thr Ala Ala Ser Phe

195 200 205

Glu Ala Lys Asp Arg Gly Ala Arg Ser Ala Val Leu Leu Asp Ala Asp

210 215 220

Asn Cys Val Ala Glu Gly Pro Gly Phe Asn Val Val Leu Val Lys Asp

225 230 235 240

Gly Ala Leu Val Ser Pro Ser Arg Asn Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg

245 250 255

Lys Thr Val Tyr Glu Ile Ala Ala Ala Lys Gly Ile Glu Thr Met Leu

260 265 270

Arg Asp Val Thr Ser Ser Glu Leu Tyr Glu Ala Asp Glu Leu Met Ala

275 280 285

Val Thr Thr Ala Gly Gly Val Thr Pro Ile Thr Ser Leu Asp Gly Glu

290 295 300

Gln Val Gly Asn Gly Glu Pro Gly Pro Ile Thr Val Ala Ile Arg Asp

305 310 315 320

Arg Phe Trp Ala Leu Met Asp Glu Pro Ser Ser Leu Ile Glu Ala Ile

325 330 335

Asp Tyr

<210> 2

<211> 253

<212> PRT

<213> Acetobacter sp. CCTCC M209061

<400> 2

Met Thr Arg Val Ala Gly Lys Val Ala Ile Val Ser Gly Ala Ala Asn

1 5 10 15

Gly Ile Gly Lys Ala Thr Ala Gln Leu Leu Ala Lys Glu Gly Ala Lys

20 25 30

Val Val Ile Gly Asp Leu Lys Glu Glu Asp Gly Gln Lys Ala Val Ala

35 40 45

Glu Ile Lys Ala Ala Gly Gly Glu Ala Ala Phe Val Lys Leu Asn Val

50 55 60

Thr Asp Glu Ala Ala Trp Lys Ala Ala Ile Glu Gln Thr Leu Lys Leu

65 70 75 80

Tyr Gly Arg Leu Asp Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Tyr Ser

85 90 95

Gly Ser Val Glu Ser Thr Ser Leu Glu Asp Trp Arg Arg Val Gln Ser

100 105 110

Ile Asn Leu Asp Gly Val Phe Leu Gly Thr Gln Val Ala Ile Glu Ala

115 120 125

Met Lys Lys Ser Gly Gly Gly Ser Ile Val Asn Leu Ser Ser Ile Glu

130 135 140

Gly Leu Ile Gly Asp Pro Met Gly Ala Ala Tyr Asn Ala Ser Lys Gly

145 150 155 160

Gly Val Arg Leu Phe Thr Lys Ser Ala Ala Leu His Cys Ala Lys Ser

165 170 175

Gly Tyr Lys Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro Gly Tyr Ile Trp Thr

180 185 190

Pro Met Val Ala Gly Leu Thr Lys Glu Asp Ala Ala Ala Arg Gln Lys

195 200 205

Leu Val Asp Leu His Pro Ile Gly His Leu Gly Glu Pro Asn Asp Ile

210 215 220

Ala Tyr Gly Ile Leu Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Val Thr

225 230 235 240

Gly Ser Glu Leu Val Ile Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln

245 250

<210> 3

<211> 603

<212> PRT

<213> Rhodococcus ruber-SD1

<400> 3

Met Thr Thr Ser Ile Asp Arg Glu Ala Leu Arg Arg Lys Tyr Ala Glu

1 5 10 15

Glu Arg Asp Lys Arg Ile Arg Pro Asp Gly Asn Asp Gln Tyr Ile Arg

20 25 30

Leu Asp His Val Asp Gly Trp Ser His Asp Pro Tyr Met Pro Ile Thr

35 40 45

Pro Arg Glu Pro Lys Leu Asp His Val Thr Phe Ala Phe Ile Gly Gly

50 55 60

Gly Phe Ser Gly Leu Val Thr Ala Ala Arg Leu Arg Glu Ser Gly Val

65 70 75 80

Glu Ser Val Arg Ile Ile Asp Lys Ala Gly Asp Phe Gly Gly Val Trp

85 90 95

Tyr Trp Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Met Cys Asp Thr Ala Ala Met Val

100 105 110

Tyr Met Pro Leu Leu Glu Glu Thr Gly Tyr Met Pro Thr Glu Lys Tyr

115 120 125

Ala His Gly Pro Glu Ile Leu Glu His Cys Gln Arg Ile Gly Lys His

130 135 140

Tyr Asp Leu Tyr Asp Asp Ala Leu Phe His Thr Glu Val Thr Asp Leu

145 150 155 160

Val Trp Gln Glu His Asp Gln Arg Trp Arg Ile Ser Thr Asn Arg Gly

165 170 175

Asp His Phe Thr Ala Gln Phe Val Gly Met Gly Thr Gly Pro Leu His

180 185 190

Val Ala Gln Leu Pro Gly Ile Pro Gly Ile Glu Ser Phe Arg Gly Lys

195 200 205

Ser Phe His Thr Ser Arg Trp Asp Tyr Asp Tyr Thr Gly Gly Asp Ala

210 215 220

Leu Gly Ala Pro Met Asp Lys Leu Ala Asp Lys Arg Val Ala Val Ile

225 230 235 240

Gly Thr Gly Ala Thr Ala Val Gln Cys Val Pro Glu Leu Ala Lys Tyr

245 250 255

Cys Arg Glu Leu Tyr Val Val Gln Arg Thr Pro Ser Ala Val Asp Glu

260 265 270

Arg Gly Asn His Pro Ile Asp Glu Lys Trp Phe Ala Gln Ile Ala Thr

275 280 285

Pro Gly Trp Gln Lys Arg Trp Leu Asp Ser Phe Thr Ala Ile Trp Asp

290 295 300

Gly Val Leu Thr Asp Pro Ser Glu Leu Ala Ile Glu His Glu Asp Leu

305 310 315 320

Val Gln Asp Gly Trp Thr Ala Leu Gly Gln Arg Met Arg Ala Ala Val

325 330 335

Gly Ser Val Pro Ile Glu Gln Tyr Ser Pro Glu Asn Val Gln Arg Ala

340 345 350

Leu Glu Glu Ala Asp Asp Glu Gln Met Glu Arg Ile Arg Ala Arg Val

355 360 365

Asp Glu Ile Val Thr Asp Pro Ala Thr Ala Ala Gln Leu Lys Ala Trp

370 375 380

Phe Arg Gln Met Cys Lys Arg Pro Cys Phe His Asp Asp Tyr Leu Pro

385 390 395 400

Ala Phe Asn Arg Pro Asn Thr His Leu Val Asp Thr Gly Gly Lys Gly

405 410 415

Val Glu Arg Ile Thr Glu Asn Gly Val Val Val Ala Gly Val Glu Tyr

420 425 430

Glu Val Asp Cys Ile Val Tyr Ala Ser Gly Phe Glu Phe Leu Gly Thr

435 440 445

Gly Tyr Thr Asp Arg Ala Gly Phe Asp Pro Thr Gly Arg Asp Gly Val

450 455 460

Lys Leu Ser Glu His Trp Ala Gln Gly Thr Arg Thr Leu His Gly Met

465 470 475 480

His Thr Tyr Gly Phe Pro Asn Leu Phe Val Leu Gln Leu Met Gln Gly

485 490 495

Ala Ala Leu Gly Ser Asn Ile Pro His Asn Phe Val Glu Ala Ala Arg

500 505 510

Val Val Ala Ala Ile Val Asp His Val Leu Ser Thr Gly Thr Ser Ser

515 520 525

Val Glu Thr Thr Lys Glu Ala Glu Gln Ala Trp Val Gln Leu Leu Leu

530 535 540

Asp His Gly Arg Pro Leu Gly Asn Pro Glu Cys Thr Pro Gly Tyr Tyr

545 550 555 560

Asn Asn Glu Gly Lys Pro Ala Glu Leu Lys Asp Arg Leu Asn Val Gly

565 570 575

Tyr Pro Ala Gly Ser Ala Ala Phe Phe Arg Met Met Asp His Trp Leu

580 585 590

Ala Ala Gly Ser Phe Asp Gly Leu Thr Phe Arg

595 600

<210> 4

<211> 353

<212> PRT

<213> Chryseobacterium sp. CA49

<400> 4

Met Ser Thr Glu Ser Leu Phe Thr Pro Phe Lys Tyr Lys Asn Leu Glu

1 5 10 15

Leu Lys Asn Arg Ile Val Met Ala Pro Met Thr Arg Ala Gln Ser Asp

20 25 30

Asn Gly Val Pro Thr Gln Gln Ile Ala Asp Tyr Tyr Ala Arg Arg Ala

35 40 45

Ala Ala Glu Val Gly Leu Ile Leu Ser Glu Gly Thr Val Ile Asn Arg

50 55 60

Pro Ala Ser Lys Asn Met Gln Asn Ile Pro Asp Phe Tyr Gly Thr Glu

65 70 75 80

Ala Leu Asn Gly Trp Lys Asn Val Ile Asp Ala Val His His Asn Gly

85 90 95

Gly Lys Met Gly Pro Gln Ile Trp His Val Gly Asp Thr Arg Ser Thr

100 105 110

Pro Asp Tyr Pro Leu Glu Asp Met Glu Lys Ala Ser Thr Met Thr Leu

115 120 125

Glu Asp Ile Gln Asp Thr Ile Ala Gln Phe Ala Ala Ser Ala Lys Ser

130 135 140

Ala Lys Asp Leu Gly Phe Asp Val Leu Glu Ile His Gly Ala His Gly

145 150 155 160

Tyr Leu Ile Asp Gln Phe Phe Trp Glu Gly Thr Asn Thr Arg Thr Asp

165 170 175

Glu Tyr Gly Gly Lys Thr Ile Lys Glu Arg Ser Arg Phe Ala Val Asp

180 185 190

Val Val Lys Ala Ile Arg Ala Ala Val Gly Glu Asp Phe Thr Ile Ile

195 200 205

Ile Arg Leu Ser Gln Trp Lys Gln Gln Asp Tyr Ser Val Lys Leu Ala

210 215 220

His Thr Pro Glu Glu Met Glu Glu Trp Leu Leu Pro Leu Lys Asp Ala

225 230 235 240

Gly Val Asp Ile Phe His Cys Ser Gln Arg Arg Phe Trp Glu Pro Glu

245 250 255

Phe Glu Gly Ser Asp Leu Asn Phe Ala Gly Trp Ala Lys Lys Ile Thr

260 265 270

Gly Gln Pro Thr Ile Thr Val Gly Ser Val Gly Leu Glu Gly Asp Phe

275 280 285

Met Ala Ala Phe Gly Gly Gln Gly Thr Glu Lys Ala Asp Leu Thr Glu

290 295 300

Leu Thr Lys Arg Leu Glu Arg Gly Asp Phe Asp Leu Val Ala Val Gly

305 310 315 320

Arg Ala Leu Leu Gln Asp Pro Glu Trp Ala Lys Lys Val Lys Glu Gln

325 330 335

Asn Thr Glu Ala Leu Leu Asp Phe Ser Ala Glu Ser Leu Gly Val Leu

340 345 350

Tyr

<210> 5

<211> 285

<212> PRT

<213> Amycolatopsis decaplanina

<400> 5

Met Ser Pro Gly Gly Thr Leu Thr Leu Gly Asp Leu Thr Val Ser Arg

1 5 10 15

Met Gly Tyr Gly Ala Met Arg Leu Ser Gly Pro Gly Ile Trp Gly Pro

20 25 30

Pro Ser Asp Arg Glu Thr Ala Ile Ala Val Leu Arg Glu Ala Val Glu

35 40 45

Leu Gly Val Thr His Ile Asp Thr Ser Asp Phe Tyr Gly Pro His Thr

50 55 60

Val Asn Glu Leu Ile Arg Glu Ala Leu His Pro Tyr Pro Asp Glu Leu

65 70 75 80

His Ile Val Thr Lys Val Gly Ala Lys Arg Ser Pro Asp Lys Gly Trp

85 90 95

Pro Ser Ala Leu Ser Arg Glu Glu Leu Thr Ser Ala Val His Asp Asn

100 105 110

Leu Arg Asn Leu Gly Val Asp Val Leu Asp Val Val Asn Leu Arg Leu

115 120 125

Ala Gly Glu His Gly Val Phe Pro Ile Pro Val Ser Ile Thr Glu Pro

130 135 140

Phe Glu Val Leu Ala Glu Leu Arg Gln Gln Gly Leu Ile Arg His Leu

145 150 155 160

Gly Leu Ser His Val Ser Ala Glu Gln Val Lys Glu Ala Arg Ala Ile

165 170 175

Ala Pro Val Val Cys Val Gln Asn Glu Tyr Asn Val Ala Asn Arg Ala

180 185 190

Asn Asp Asp Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ala Ile Asn Ile Pro Phe Val

195 200 205

Pro Tyr Phe Pro Leu Gly Gly Phe Thr Pro Leu Gln Ser Gly Val Leu

210 215 220

Asp Asp Cys Ala Arg Arg Val Asp Ala Thr Pro Met Gln Val Ala Leu

225 230 235 240

Ala Trp Leu Leu Gln Arg Ser Pro Asn Ile Leu Val Ile Pro Gly Thr

245 250 255

Ser Ser Pro Ser His Leu Arg Glu Asn Val Ala Ala Ala Lys Leu Glu

260 265 270

Leu Pro Ala Asp Val Ile Ala Asp Leu Asp Ala Leu Val

275 280 285

<210> 6

<211> 299

<212> PRT

<213> Saccharothrix syringae

<400> 6

Met Thr Asp Asn Ala Leu Ala Gln Pro Gly Pro Ser Thr Pro Leu Thr

1 5 10 15

Leu Leu Gly Thr Gly Ala Met Gly Thr Ala Leu Ala Arg Ala Trp Leu

20 25 30

Ala Ala Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg Thr Pro Ala Arg Ala

35 40 45

Glu Ala Leu Ala Ala Glu Gly Ala Thr Val Ala Ala Ser Ala Ala Glu

50 55 60

Ala Val Ala Ala Asn Arg Leu Val Val Val Cys Leu Leu Asp Asp Ala

65 70 75 80

Ser Val Gly Glu Ala Leu Asp Gly Ala Asp Leu Thr Gly Arg Asp Leu

85 90 95

Val Asn Ile Thr Thr Gly Thr Pro Gly Gln Gly Arg Ser Arg Ala Ala

100 105 110

Trp Ala Lys Ala Arg Gly Ala Arg Phe Leu Asp Gly Gly Ile Met Ala

115 120 125

Val Pro Pro Met Ile Gly Ala Pro Asp Ser Gly Ala Tyr Val Phe Tyr

130 135 140

Ser Gly Ser Ala Ala Leu Phe Glu Glu His Arg Asp Thr Leu Ala Val

145 150 155 160

Pro Ala Gly Thr Thr Tyr Val Gly Ala Asp Pro Gly Phe Ala Ala Leu

165 170 175

His Asp Val Ala Leu Leu Ser Ala Met Asn Gly Met Phe Ala Gly Ile

180 185 190

Thr His Ala Phe Ala Leu Ile Arg Arg Glu Asp Ile Ala Pro Lys Asp

195 200 205

Phe Ala Pro Leu Leu Val Ser Trp Leu Thr Ala Met Ala His Ser Ala

210 215 220

His Lys Ala Ala Asp Gln Leu Glu Ser Gly Asp Tyr Gly Lys Asp Val

225 230 235 240

Val Ser Ser Leu Ala Met Gln Val Ala Gly Asn Ala Thr Leu Leu Arg

245 250 255

Thr Ala Glu Glu Gln Gly Val Ser Ala Glu Leu Leu Arg Pro Tyr Met

260 265 270

Asp Leu Met Glu Arg Arg Leu Ala Leu Gly Asn Gly Glu Glu Asp Thr

275 280 285

Thr Gly Val Val Glu Leu Leu Leu Arg Lys Pro

290 295

<210> 7

<211> 366

<212> PRT

<213> Thermoactinomyces intermedius ATCC33205

<400> 7

Met Arg Asp Val Phe Glu Met Met Asp Arg Tyr Gly His Glu Gln Val

1 5 10 15

Ile Phe Cys Arg His Pro Gln Thr Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Leu

20 25 30

His Asn Thr Thr Ala Gly Pro Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met Ile Pro

35 40 45

Tyr Ala Ser Thr Asp Glu Ala Leu Glu Asp Val Leu Arg Leu Ser Lys

50 55 60

Gly Met Thr Tyr Lys Cys Ser Leu Ala Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly

65 70 75 80

Lys Met Val Ile Ile Gly Asp Pro Lys Lys Asp Lys Ser Pro Glu Leu

85 90 95

Phe Arg Val Ile Gly Arg Phe Val Gly Gly Leu Asn Gly Arg Phe Tyr

100 105 110

Thr Gly Thr Asp Met Gly Thr Asn Pro Glu Asp Phe Val His Ala Ala

115 120 125

Arg Glu Ser Lys Ser Phe Ala Gly Leu Pro Lys Ser Tyr Gly Gly Lys

130 135 140

Gly Asp Thr Ser Ile Pro Thr Ala Leu Gly Val Phe His Gly Met Arg

145 150 155 160

Ala Thr Ala Arg Phe Leu Trp Gly Thr Asp Gln Leu Lys Gly Arg Val

165 170 175

Val Ala Ile Gln Gly Val Gly Lys Val Gly Glu Arg Leu Leu Gln Leu

180 185 190

Leu Val Glu Val Gly Ala Tyr Cys Lys Ile Ala Asp Ile Asp Ser Val

195 200 205

Arg Cys Glu Gln Leu Lys Glu Lys Tyr Gly Asp Lys Val Gln Leu Val

210 215 220

Asp Val Asn Arg Ile His Lys Glu Ser Cys Asp Ile Phe Ser Pro Cys

225 230 235 240

Ala Lys Gly Gly Val Val Asn Asp Asp Thr Ile Asp Glu Phe Arg Cys

245 250 255

Leu Ala Ile Val Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Val Glu Asp Arg His

260 265 270

Gly Ala Leu Leu Gln Lys Arg Ser Ile Cys Tyr Ala Pro Asp Tyr Leu

275 280 285

Val Asn Ala Gly Gly Leu Ile Gln Val Ala Asp Glu Leu Glu Gly Phe

290 295 300

His Glu Glu Arg Val Leu Ala Lys Thr Glu Ala Ile Tyr Asp Met Val

305 310 315 320

Leu Asp Ile Phe His Arg Ala Lys Asn Glu Asn Ile Thr Thr Cys Glu

325 330 335

Ala Ala Asp Arg Ile Val Met Glu Arg Leu Lys Lys Leu Thr Asp Ile

340 345 350

Arg Arg Ile Leu Leu Glu Asp Pro Arg Asn Ser Ala Arg Arg

355 360 365

<210> 8

<211> 318

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 8

Met Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val

1 5 10 15

Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser

20 25 30

Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser

35 40 45

Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr Gln Leu Gly Tyr Thr Pro

50 55 60

Cys Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn

65 70 75 80

Thr Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Gly Ser Gly

85 90 95

Asn Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala

100 105 110

Gln Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg

115 120 125

Leu Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro

130 135 140

Leu Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr

145 150 155 160

Gly Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln

165 170 175

Ile Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln

180 185 190

Pro Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly

195 200 205

Lys Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp

210 215 220

His Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser

225 230 235 240

Ala Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile

245 250 255

Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys

260 265 270

Val Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala

275 280 285

Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro

290 295 300

Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro

305 310 315

Claims

1.一种固定化酶，其特征在于，所述固定化酶包括环氧树脂载体和酶，所述酶与所述环氧树脂载体通过共价键连接，所述环氧树脂载体为LX-109S环氧树脂，所述酶来自于粗酶，选自转氨酶、D-乳酸脱氢酶、环己酮单加氧酶、酮还原酶、烯还原酶、腈水解酶、氨裂解酶、氨基酸脱氢酶、亚胺还原酶、脂肪酶及它们的突变体中的任意一种；所述固定化酶中，每克所述环氧树脂载体上所述酶的负载量为30 mg ~70 mg。

2.根据权利要求1所述的固定化酶，其特征在于，所述氨裂解酶选自苯丙氨酸氨裂解酶中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的固定化酶，其特征在于，所述氨基酸脱氢酶选自亮氨酸脱氢酶、苯丙氨酸脱氢酶中的任意一种。

4.根据权利要求1所述的固定化酶，其特征在于，所述固定化酶还包括辅因子。

5.一种权利要求1至4中任一项所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

步骤S1，将第一磷酸盐缓冲液与酶混合形成缓冲酶液；所述酶为粗酶；

步骤S2，将所述缓冲酶液与环氧基树脂混合进行固定化反应后用第二磷酸盐缓冲液洗涤，得到所述固定化酶，所述环氧树脂为LX-109S环氧树脂。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲酶液与所述环氧基树脂的体积比为3:1~5:1。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述第一磷酸盐缓冲液的pH值为7.0~8.0，所述第一磷酸盐缓冲液中含有氯化钠，所述第一磷酸盐缓冲液中所述氯化钠的浓度为1±0.2 mol/L；所述第二磷酸盐缓冲液的pH值为7.0~8.0，所述第二磷酸盐缓冲液中不含氯化钠。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2包括：

将所述缓冲酶液与环氧基树脂混合在10~20 ℃下混合并进行摇床培养16~24h后在3~5℃静置孵育40~48 h，得到固定化体系；

采用所述第二磷酸盐缓冲液对所述固定化体系进行洗涤，得到所述固定化酶。

9.一种权利要求1至4中任一项所述的固定化酶的应用，所述应用包括将所述固定化酶作为催化剂应用于连续催化反应中。