CN111454934A

CN111454934A - 一种edds裂合酶固定化酶的制备方法和应用

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Publication number: CN111454934A
Application number: CN202010279909.0A
Authority: CN
Inventors: 杨仲毅; 陶宇翔; 陈良明; 汪怡璐
Original assignee: Taizhou Bona Chemical Co ltd; Taizhou University
Current assignee: Taizhou Bona Chemical Co ltd; Taizhou University
Priority date: 2020-04-10
Filing date: 2020-04-10
Publication date: 2020-07-28
Anticipated expiration: 2040-04-10
Also published as: CN111454934B

Abstract

本发明涉及一种EDDS裂合酶固定化酶的制备方法和应用，属于生物技术领域。为了解决现有的纯度差和转化率不高的问题，提供一种EDDS裂合酶固定化酶的制备方法，该方法包括将带有His‑tag的EDDS裂合酶的基因工程菌经发酵及粗提后得到EDDS裂合酶粗酶液；粗酶液与金属亲和载体接触，使EDDS裂合酶吸附到金属亲和载体上进行纯化；将金属亲和载体上的EDDS裂合酶进行洗脱，得到纯化后的酶液；将酶液和固定化载体进行固定，得到带有His‑tag的EDDS裂合酶固定化酶，用于以富马酸和乙二胺为底物合成(S,S)‑EDDS。本发明能有效除去酶液中富马酸酶，起到高效纯化效果；且有高效酶活能力和高重复利用率。

Description

一种EDDS裂合酶固定化酶的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种EDDS裂合酶固定化酶的制备方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术

乙二胺二琥珀酸(Ethylenediamine N,N'-disuccinic acid,EDDS,CAS：2084691-7)是一个天然的生物源氨基多羧酸类螯合剂，广泛用于洗涤剂、化妆品及重金属污染土壤修复。EDDS分子结构中含有2个手性中心，具有(S,S)-EDDS、(R,S)-EDDS和(R,R)-EDDS三种异构体，其中仅(S,S)-EDDS可以完全生物降解。

目前，(S,S)-EDDS主要采用化学法进行生产，生物法合成(S,S)-EDDS的报道也较多，比如1984年，nishikiori等从fungus culture中分离到(S,S)-EDDS，ENDO等利用天冬氨酸氨裂合酶合成R,S-EDDS。更多的报道是利用微生物EDDS lyase催化富马酸和乙二胺合成(S,S)-EDDS。

该酶是一种精氨琥珀酸裂合酶，属于典型的aspartase/fumarase超家族成员，可以催化EDDS的降解反应，也可以催化EDDS及其类似物的合成反应。

已有的文献报道多数是利用微生物菌体酶来合成(S,S)-EDDS，比如Takahashi R及Kaneko Makoto等分别利用微生物Acidovorax TNT149、Pseugomonas sp.TN-131菌体酶合成了90mmol/L和93mmol/L的EDDS。也有些报道利用重组EDDS lyase的基因工程菌来进行(S,S)-EDDS的生物合成，分别得到了50mM、450mM的EDDS。

一些研究着力于提高酶的稳定性和催化效率。如来自Brevundimonas diminutaMR-E001的EDDS lyase热稳定性差，50℃30分钟即可使其失活，Akiyama T等报道了热稳定性提高的EDDS裂合酶序列，该酶在50℃30分钟条件下可保持72％的活性。2004年，Shigeho等报道了利用固定化基因工程菌进行EDDS的合成，反应可以重复100批。微生物菌体中除了EDDS裂合酶，还会含有较高的富马酸酶活性，可以将反应的底物之一富马酸转化为苹果酸，这会大大降低EDDS的合成效率，转化能力差。

发明内容

本发明针对以上现有技术中存在的缺陷，提供一种EDDS裂合酶固定化酶的制备方法和应用，为了解决的问题是如何使具有高纯的EDDS裂合酶，且能够提高EDDS裂合酶催化转化能力和重复利用性。

本发明的目的之一通过以下技术方案得以实现的，一种EDDS裂合酶固定化酶的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

A、将带有His-tag的EDDS裂合酶的基因工程菌经发酵及粗提后得到EDDS裂合酶的粗酶液；

B、将得到的含带有His-tag的EDDS裂合酶的粗酶液与金属亲和载体接触，使带有His-tag的EDDS裂合酶吸附到金属亲和载体上进行纯化处理；再将金属亲和载体上的带上His-tag的EDDS裂合酶进行洗脱，得到纯化后的带有His-tag的EDDS裂合酶的酶液；

C、将带有His-tag的EDDS裂合酶的酶液和固定化载体进行固定使酶结合到固定化载体上，得到带有His-tag的EDDS裂合酶固定化酶。

本发明通过将发酵后的粗酶液与金属亲和载体接触，能够使带有His-tag的EDDS裂合酶吸附到金属亲和载体上，从而能够有效的将粗酶液中的富马酸酶活性分离出来，再经过洗脱后，得到不含富酸酶活性的纯化的EDDS裂合酶，且具有操作更便捷的优点，而由于粗酶液中富马酸酶活性的存在，直接用于EDDS合成反应中，会消耗EDDS合成反应体系中45％左右的富马酸，导致反应转化率和收率的降低，而通过本发明进行纯化并将纯化后的EDDS裂合酶与固定化载体进行固定，有效的去除富马酸酶活，能够使EDDS裂合酶具有更优异的催化性能，更高效的催化(S,S)-EDDS的合成，具有高转化率和生产效率的效果，也能够使EDDS裂合酶的酶活保持在高水平的能力，且通过固定化处理后，能够更好的提升操作性，固定化酶能够使具有重复和利用的效果，无需每批制备，且也有利于在(S,S)-EDDS催化反应后的产物提取和分离的效果。另外，通过本方法纯化后并进行固定化后具有更优异的酶活性能；进一步的讲，采用酶液的最适pH范围较窄，一般仅在pH为8.0-8.5之间，超过此范围酶活急剧下降，pH为7.0时酶活仅为pH为8.0时的1/4左右；而通过采用本发明的方法进行固定化后，制成固定化酶的最适pH范围稍宽，最适pH范围向碱性偏移，最适pH值在8.5-9.0的较宽范围具有酶活好的效果，且pH＝8.0时的酶活仍有最高值的3/4左右的酶活能力，本发明的固定化酶在pH值在6.0-10.0范围内的稳定性都有显著提高。同时，一般液体酶的最佳温度为50-60℃，温度超过60℃，酶活迅速降低到10％以下，30℃时的酶活则为50℃时的55％左右；而通过本发明制成的固定化酶能够在40-60℃范围内基本保持在高酶活的水平。且本发明的固定化EDDS裂合酶在耐受200rpm的转速500h以上，填充床柱式反应可以连续使用45天以上，仍能保持高催化的酶活性的效果，这也为(S,S)-EDDS生产工艺的简化提供了便利。

对于EDDS裂合酶是一种精氨琥珀酸裂合酶，属于典型的aspartase/fumarase超家族成员，可以催化EDDS的降解反应，也可以催化EDDS及其类似物的合成反应，所用EDDS裂合酶基因可以采用本领域熟知的技术得到，如PCR扩增、基因合成等手段。

而对于带有His-tag的EDDS裂合酶基因工程菌，该基因同样可通过本领域熟知的技术克隆到表达载体后转化宿主细胞得到基因工程菌，表达体系优化原核表达体系和酵母表达体系。进一步表达载体优选pET表达系统；而表达宿主优选采用大肠杆菌BL21(DE3)宿主进行克隆，当然，对于上述带有His-tag的EDDS裂合酶的基因工程菌也可直接通过委托其它具体克隆能力的公司进行克隆得到。

在上述EDDS裂合酶固定化酶的制备方法中，作为优选，所述带有His-tag的EDDS裂合酶的基因工程菌的核酸序列号如SEQ ID NO.1所示。最好以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，相当于采用一般的克隆技术的方式将相应的质粒导入大肠杆菌而得到的大肠杆菌BL21(DE3)/pTZU-27(带有His-tag的EDDS裂合酶的基因工程菌),通过克隆技术得到的人工序列。通过采用上述带有His-tag的EDDS裂合酶的基因工程菌，能够使得到的酶液中的带有His-tag的EDDS裂合酶更有效的吸附在金属亲和载体上和更好的分离除去粗酶液中的富马酸酶活，有效的实现纯化酶液的效果，且带有His-tag的EDDS裂合酶的具有酶活高的特性。

在上述EDDS裂合酶固定化酶的制备方法中，作为优选，所述带有His-tag的EDDS裂合酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。采用上述的人工序列的裂合酶，带有His-tag的EDDS裂合酶能够在催化反应过程中具有更好的转化效率和产物收率高的优点。

在上述EDDS裂合酶固定化酶的制备方法中，作为优选，步骤B中所述金属亲和载体选自Ni离子或钴离子活化的LX-1000IDA、Seplite LX-1000IDA或FP-IDA405/EB或Ni-IDA-Sefinose Resin。能够更有效的吸附带上His-tag的EDDS裂合酶的能力，又能够使富马酸酶有效的被洗脱，达到纯化的效果。

在上述EDDS裂合酶固定化酶的制备方法中，作为优选，步骤C中所述固定化载体为经过戊二醛活化的氨基载体。该载体可以与酶蛋白共价结合，具有结合强度高的特点，同时可以避免多于的活化试剂对酶蛋白活性的影响。

在上述EDDS裂合酶固定化酶的制备方法中，这里对于步骤B中的纯化处理可以直接将上述得到的粗酶液通过预装有金属亲和载体的柱子进行吸附，分离出EDDS裂合酶进行纯化，当然最好是先将粗酶液中加一定量的咪唑进行混合，提高操作的酶活稳定性，作为优选，步骤B所述纯化处理具体为：

将得到的含有His-tag的EDDS裂合酶的粗酶液作为上柱液流过预装有金属亲和载体的柱子，使含有His-tag的EDDS裂合酶吸附在金属新和载体上。所述上柱液中最好含有0-30mM的咪唑，更好的范围为使上柱液中含有10-20mM的咪唑，也就相当于在粗酶液中加入相应量的咪唑。能够在过柱过程中降低富马酸酶结合到金属亲和载体上的概率，提高EDDS裂合酶的吸附效果。

在上述EDDS裂合酶固定化酶的制备方法中，对于步骤B中的洗脱过程中可将咪唑浓度提高到能够洗脱吸附的EDDS裂合酶即可将吸附的裂合酶洗脱出来得到相应的纯化酶液。步骤B中在洗脱时采用的洗脱液中含有咪唑200-1000mM。最好使洗脱液中含有咪唑300-700mM。

本发明的目的之二是通过以下技术方案来实现的，一种EDDS裂合酶固定化酶的应用，其特征在于，所述EDDS裂合酶固定化酶用于以富马酸和乙二胺为底物合成(S,S)-EDDS。

在上述EDDS裂合酶固定化酶的应用中，作为优选，所述底物配制成反应底物混合液，所述反应底物混合液包括以下成分的浓度：

富马酸：400-2000mmol/L；乙二胺盐酸盐：200-1000mmol/L；所述EDDS裂合酶固定化酶采用批次搅拌反应，或者填充在柱子里，使反应底物混合液经过填充EDDS裂合酶固定化酶的柱子进行反应。

综上所述，本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1.通过将带有His-tag的EDDS裂合酶的粗酶液与金属亲和载体进行接触使能够有效的吸附带有His-tag的EDDS裂合酶，且能够有效的除去酶液中富马酸酶，起到高效的纯化效果；同时，再通过固定化载体进行固定化，实现带His-tag的EDDS裂合酶固定化酶的高效酶活能力和提高重复利用率的效果。

2.本发明通过纯化结合固定化处理制成相应的固定化酶能够在pH为6.0-10.0的更宽的范围内的稳定性都有显著的提高，均具有较高的酶活性。且本处理方法得到的固定化酶在40-60℃范围内基本保持在最高的酶活水平，总体上更好的提高催化酶活的能力。

3.本方法能够彻底有效的去除富马酸酶活，使采用固定化酶进行催化合成，能够使富马酸和乙二胺在转化合成中达到更高的转化率和生产效率。

4.本方法得到的固定化酶能够重复使用，能够得到较高的转化率和较高的产物浓度。

附图说明

图1是本发明的EDDS裂合酶的纯化酶液与固定化酶在不同pH和温度下的酶活能力分析图。

图2是本发明的比较例1中采用粗酶液和纯化酶液分别进行反应进行的产物情况分析图。

具体实施方式

下面通过具体实施例和附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明，但是本发明并不限于这些实施例。

实施例1

将大肠杆菌BL21(DE3)/pTZU-27(带有His-tag的EDDS裂合酶的基因工程菌)单菌落接种于15mL试管中，质粒pTZU-27含有核酸序列SEQ ID NO.1，加入30μg/mL氨苄西林5ml-LB，在37℃的恒温条件下进行培养，隔夜培养后，将1mL细胞接种于40mL TB培养基(2.4％酵母抽提物、1.2％胰蛋白酶、0.4％甘油、17mmol/L KH₂PO₄、72mmol/L KH₂PO₄)中，并在500mL烧瓶中加入50mg/mL氨苄青霉素，4小时后，在3L发酵罐中将培养物转入2.0L TB培养基中,发酵温度37℃，转速200rpm，发酵时间2.5h，OD 600达到1左右后，将温度降低到25℃，再加入150mL20％(w/v)乳糖溶液进行诱导培养，空气流量保持在1.0vvm，调整搅拌转速使溶解氧(DO)保持在20％以上，发酵20h结束，将发酵液在10000×g离心，细胞在-20℃保存，将30克细胞悬浮在270mL水中，并在1000巴下将菌悬液均质三次，以12000×g离心20分钟得到粗酶液。

实施例2

取上述实施例1培养得到的粗酶液1mL与1mL Binding/wash buffer(50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，20mM咪唑，pH8.0)，进行混匀，流过预先用2mL Binding/wash buffer平衡的预装1mL Ni-IDA树脂的柱子；

再用2mL Binding/wash buffer清洗柱子后；然后，以2mL Elution Buffer(50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，500mM咪唑，pH＝8.0)进行洗脱，收集洗脱液即得到相应的纯化酶液。

对于上述纯化酶液的标准的EDDS lyase活性检测方法可采用如下：取500uL酶液，加入1.0mL反应底物溶液(50mmol/L tris，50mmol/L磷酸二氢钠；600mmol/L富马酸；300mmol/L乙二胺盐酸盐；pH8.0)，温度控制在30℃，转速控制在200rpm，进行反应30min，取样以稀释液(1g/L乙酸铜，盐酸调节pH3.0)稀释20-50倍，离心后进行HPLC测定。1个酶活单位定义为每分钟催化产生1mmol EDDS所需的酶量。

从以下表1中可看出，经上述方法纯化后，粗酶液中的富马酸酶活性彻底去除。

表1：

实施例3

取20g LX-1000HA树脂，分别以100mL去离子水和100mL pH为8.0的100mmol/L的磷酸钠缓冲液洗涤，滤干后再加入100mL含有2.0wt％戊二醛的pH为8.0的100mmol/L磷酸钠缓冲液，控制温度在30℃，转速在200rpm下进行处理2小时，回收树脂，用去离子水洗涤3次，得到活化的LX-1000HA树脂载体。

取20ml采用上述实施例2的方法得到的纯化酶液，加1.0g戊二醛活化的氨基载体，控制温度在30℃，转速在200rpm进行固定化处理1h，固定过程中取清液20uL加入80uL考马斯亮蓝溶液(25mg G250,12.5mL乙醇，25mL 85％磷酸，溶解后加去离子水至250mL)检测蛋白残留量，并通过向固定化体系中逐渐增加戊二醛活化的氨基载体量控制残留蛋白少于0.02g/L，固定化结束后，回收固定好的载体，以pH为8.0的100mmol/L的磷酸钠缓冲液洗涤，过滤，得到相应的固定化酶，20mL纯化酶液固定到经过戊二醛活化的氨基载体LX-1000HA上，得到3.18g固定化酶，活性的收率为69.49％，固定化酶的酶活达到13.33U/g。

实施例4

本实施例主要为了说明比较纯化酶液及固定化酶最佳条件

称取约30mg的固定化酶，加入相应缓冲液约3mL，调节至所需pH，离心后去上清，并重新加入相应缓冲液0.5mL作为酶液进行酶活测定。调节酶液pH至5-11，并用相应pH的缓冲液(50mmol/L tris，50mmol/L磷酸二氢钠)稀释到3倍，并取500uL加入1.0mL pH＝5-11的反应底物溶液进行酶活测定确定最佳pH。在pH稳定性实验中，稀释后的酶液在不同pH条件下于30℃放置所需时间，并取0.5mL直接加入1.0mL pH为8.0的反应底物溶液进行酶活测定；经验证，pH为5-11的酶液其pH能够被底物溶液缓冲到pH为8.0。

在最佳温度实验中，pH为8.0的酶液和底物溶液分别在不同温度预热2分钟，再混匀后进行酶活测定。在温度稳定性中，pH为8.0的酶液先在不同温度保温所需时间，再冷却或预热到30℃，再加入pH8.0的底物溶液进行酶活测定。

结合图1中A-D分析结果表明，结合图1-A所示，纯化酶液(未固定化酶)的最适pH范围较窄，仅在pH在8.0-8.5之间，超过此范围酶活急剧下降，pH在7.0时酶活仅为pH在8.0时的1/4左右；且结合图1-B所示，未固定化的酶稳定性较差，尤其在pH值为6.0-7.0的溶液中保存24h后活性只有初始的30-70％左右。如图1-A所示，本发明的固定化酶的最适pH范围稍宽，最适pH值向碱性偏移，pH为8.5-9.0，且pH在8.0时酶活仍有最高值的3/4左右；固定化酶在pH在6.0-10.0范围内的稳定性都有显著提高，且如图1-B所示，固定化酶在pH6.0-8.0保存24h，其酶活基本不变，pH9.0之后酶稳定性才有明显下降，但残留酶活都要高于未固定的酶。结合图1-C所示，液体酶的最佳温度为50-60℃，温度超过60℃，酶活迅速降低到10％以下，30℃时的酶活则为50℃时的55％左右；而本发明的固定化酶虽然在不同温度下保存24h的稳定性方面与未固定的酶相似(图1-D)，但在40-60℃范围内酶活基本保持最高水平，其适用的温度范围更广。

实施例5

取1.0g固定化酶，加入20-10mL的反应底物混合液,在温度为30℃转速为200rpm的条件下进行反应；每批的反应情况结果如下表2的结果分析所示，固定化酶从第1批到第10批重复使用，其中第10批反应得到(S,S)-EDDS 175.8g/L。

表2：

实施例6

取100克LX-1000EA树脂，分别以500mL去离子水和500mLpH为8.0的100mmol/L磷酸钠缓冲液洗涤，滤干后再加入500mL含有2％戊二醛的pH8.0的100mmol/L磷酸钠缓冲液，30℃200rpm 2小时，回收树脂，去离子水洗涤3次，得到活化的LX-1000EA树脂载体。

将100mL酶液与100mL Binding/wash buffer(50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，20mM咪唑，pH为8.0)混匀，以1mL/min流过预先用100mL Binding/wash buffer平衡的装有50mL上述得到的活化的LX-1000EA树脂的层析柱，再用100mL Binding/wash buffer清洗柱子后；再以200mL Elution Buffer(50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，500mM咪唑，pH＝8.0)的洗脱液进行洗脱，洗脱液直接上到装有50mL活化LX-1000EA载体的层析柱，上柱速度为1mL/min，流出液取20uL加入80uL考马斯亮蓝溶液检测蛋白残留量，当流出液蛋白浓度大于0.05g/L后停止上柱，并以pH8.0的100mmol/L磷酸钠缓冲液洗涤去除残留未固定蛋白。

配制pH为8.0反应底物混合液(含1000mmol/L富马酸；500mmol/L乙二胺盐酸盐；50mmol/L tris，50mmol/L磷酸二氢钠，5N NaOH调节pH8.0)，在30℃条件下以6mL/h的速度通过固定化酶柱子。连续反应45天后收集到反应液6.0L，进行检测表明(S,S)-EDDS281.58mmol/L。说明本固定化酶具有很好的重复利用性能。

当然，对于反应底物混合液的各原料浓度含量可进行调整，还可调整使在以下用量范围内均可具有较好的效果。

富马酸：400-2000mmol/L；乙二胺盐酸盐：200-1000mmol/L；MgCl₂：800-1200mmol/L。

实施例7

取上述实施例1方法得到的粗酶液1mL与1mL Binding/wash buffer(50mM磷酸二氢钠，200mM氯化钠，30mM咪唑，pH为8.0)，进行混匀，流过预先用2mL Binding/wash buffer平衡的预装1mL FP-IDA405/EB树脂的柱子，用2mL Binding/wash buffer清洗柱子后；然后，以2mL Elution Buffer(50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，600mM咪唑，pH＝8.0)的洗脱液进行洗脱，收集洗脱液即得到相应的纯化酶液。

本实施例中的金属亲和载体可采用Ni离子或钴离子活化的LX-1000IDA、SepliteLX-1000IDA或Ni-IDA-Sefinose Resin进行代替后一一进行具体实施，同样能够得到相应的纯化后的酶液，可用于下一步的固定化处理。

实施例8

取上述实施例1方法得到的粗酶液1mL与1mL Binding/wash buffer(50mM磷酸二氢钠，250mM氯化钠，15mM咪唑，pH为8.0)，进行混匀，流过预先用2mL Binding/wash buffer平衡的预装1mL钴离子活化的LX-1000IDA的柱子，用2mL Binding/wash buffer清洗柱子后；然后，以2mL Elution Buffer(55mM磷酸二氢钠，200mM氯化钠，700mM咪唑，pH＝8.0)的洗脱液进行洗脱，收集洗脱液即得到相应的纯化酶液。

比较例1

分别取2.0mL粗酶液和纯化酶液，加入18mL反应底物混合液(含400mmol/L富马酸；300mmol/L乙二胺盐酸盐；50mmol/L tris，50mmol/L磷酸二氢钠，5N NaOH调节pH8.0)，在30℃200rpm条件下反应，反应过程中以2N NaOH调节pH8.0，纯化酶液和粗酶液反应分别产生81.69mmol/L和67.88mmol/L的(S,S)-EDDS，转化率分别为如图2所示。

本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。

序列表

<110> 台州学院

台州市博纳化工有限公司

<120> 一种EDDS裂合酶固定化酶的制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1548

<212> DNA

<213> 大肠杆菌BL21（DE3）/pTZU-27(大肠杆菌BL21（DE3）/pTZU-27)

<400> 1

catatgaaca tcaacgttcc ggatgcgacc cgcatcggtc gcgcgaccgg cgcgaaagcg 60

ccggaattcc aggaactgta tgatttcgat gcggcggcgc tgaccctgac ctccgctgtg 120

ttcccgtatg attctcagat tcaccgcgcg cacgtggtta tgctgaccga acagggtatc 180

ctgaccgttg aagaatccgc taccatcctg tccggcctgg cgcaggttga tgaactggcg 240

gcaactgatg gtagcctgcg tacctacctg ccgtacgaag cggccctgaa acgtaccatc 300

ggtagcgtag cgggtaaaat gcacatcggc cgtagccgta acgtactggc gaacgcgggt 360

aaacgcatgt tcctgcgtga tcagctgctg cgcaccattg aagcggttat cggttaccgt 420

gaagctgttg ttcacaaagc ggctgatcat ctggataccg ttatggttgt ttacacccag 480

cgtaaagaag cgcagccgat tactctgggt cactacctga tggcgattag cgaaaacctg 540

gcaaaaaacc tggatcgtta ccgtgaactg tacgcgcgta tcaacctgtg cccgctgggt 600

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ggtttcgacg gcctggttgt taactctatt gaaggcgttg cgggctggga ccacgttgcg 720

gaacacgcgt tcgtgaacgc agttttcctg tccggcctga gccgtctggc gtctgaaatc 780

cagctgtgga gcaccgatga ataccaggtg gcggaactgg atgcttcctt cgcgggcacc 840

agcagcatta tgccgcagaa aaagaacccg gatagcctgg aacgtagccg caaagcggct 900

ttcgcagcga tgggtccgct ggttggcatt ctgacctccc tgaacgcgat tgaataccag 960

tactctgcgg cgcgtgttga actggaaccg cgttctattg acgccctgat cgcggccacc 1020

cacgctatga ctggcgtggt tcgtaccctg catccgaaca aagaacgtat gcgtcagtac 1080

gctgctgaaa actacagcac catgactgat ctgaccgaca tgctggtgcg ccgtgtgggc 1140

attgattacc gtgaagctca tgaaatcgtt gcgcacgttg tgatcaccgc gattgaaaaa 1200

ggcatcaaag cgaacaaaat cggtctggac ctggttcagg aagccgctgt ggcgcagacc 1260

ggcgctggta tcaacgttag cgcggatgat attaaagatg cgctggaccc gtggcagaac 1320

gtactgcgtc gtgaaggtaa aggtatgccg gctccgatga gcgtgaaagc gagcatcgac 1380

gatgcgatgg cagaactgca caaagatcgt gcgtggctgg caaacgcgac ccaggcactg 1440

gcgaacgcga aacagaccct ggcggactcc gttcagcaga tcatccagac cgaccgtaaa 1500

tatctgcgta agcttgcggc cgcactcgag caccaccacc accaccac 1548

<210> 2

<211> 514

<212> PRT

<213> EDDS裂合酶(裂合酶)

<400> 2

Met Asn Ile Asn Val Pro Asp Ala Thr Arg Ile Gly Arg Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala Lys Ala Pro Glu Phe Gln Glu Leu Tyr Asp Phe Asp Ala Ala Ala

20 25 30

Leu Thr Leu Thr Ser Ala Val Phe Pro Tyr Asp Ser Gln Ile His Arg

35 40 45

Ala His Val Val Met Leu Thr Glu Gln Gly Ile Leu Thr Val Glu Glu

50 55 60

Ser Ala Thr Ile Leu Ser Gly Leu Ala Gln Val Asp Glu Leu Ala Ala

65 70 75 80

Thr Asp Gly Ser Leu Arg Thr Tyr Leu Pro Tyr Glu Ala Ala Leu Lys

85 90 95

Arg Thr Ile Gly Ser Val Ala Gly Lys Met His Ile Gly Arg Ser Arg

100 105 110

Asn Asp Leu Ala Asn Ala Gly Lys Arg Met Phe Leu Arg Asp Gln Leu

115 120 125

Leu Arg Thr Ile Glu Ala Val Ile Gly Tyr Arg Glu Ala Val Val His

130 135 140

Lys Ala Ala Asp His Leu Asp Thr Val Met Val Val Tyr Thr Gln Arg

145 150 155 160

Lys Glu Ala Gln Pro Ile Thr Leu Gly His Tyr Leu Met Ala Ile Ser

165 170 175

Glu Asn Leu Ala Lys Asn Leu Asp Arg Tyr Arg Glu Leu Tyr Ala Arg

180 185 190

Ile Asn Leu Cys Pro Leu Gly Ala Ala Ala Thr Ala Gly Thr Gly Trp

195 200 205

Pro Leu Asn Arg Asp Arg Thr Ser Ala Leu Leu Gly Phe Asp Gly Leu

210 215 220

Val Val Asn Ser Ile Glu Gly Val Ala Gly Trp Asp His Val Ala Glu

225 230 235 240

His Ala Phe Val Asn Ala Val Phe Leu Ser Gly Leu Ser Arg Leu Ala

245 250 255

Ser Glu Ile Gln Leu Trp Ser Thr Asp Glu Tyr Gln Val Ala Glu Leu

260 265 270

Asp Ala Ser Phe Ala Gly Thr Ser Ser Ile Met Pro Gln Lys Lys Asn

275 280 285

Pro Asp Ser Leu Glu Arg Ser Arg Lys Ala Ala Phe Ala Ala Met Gly

290 295 300

Pro Leu Val Gly Ile Leu Thr Ser Leu Asn Ala Ile Glu Tyr Gln Tyr

305 310 315 320

Ser Ala Ala Arg Val Glu Leu Glu Pro Arg Ser Ile Asp Ala Leu Ile

325 330 335

Ala Ala Thr His Ala Met Thr Gly Val Val Arg Thr Leu His Pro Asn

340 345 350

Lys Glu Arg Met Arg Gln Tyr Ala Ala Glu Asn Tyr Ser Thr Met Thr

355 360 365

Asp Leu Thr Asp Met Leu Val Arg Arg Val Gly Ile Asp Tyr Arg Glu

370 375 380

Ala His Glu Ile Val Ala His Val Val Ile Thr Ala Ile Glu Lys Gly

385 390 395 400

Ile Lys Ala Asn Lys Ile Gly Leu Asp Leu Val Gln Glu Ala Ala Val

405 410 415

Ala Gln Thr Gly Ala Gly Ile Asn Val Ser Ala Asp Asp Ile Lys Asp

420 425 430

Ala Leu Asp Pro Trp Gln Asn Val Leu Arg Arg Glu Gly Lys Gly Met

435 440 445

Pro Ala Pro Met Ser Val Lys Ala Ser Ile Asp Asp Ala Met Ala Glu

450 455 460

Leu His Lys Asp Arg Ala Trp Leu Ala Asn Ala Thr Gln Ala Leu Ala

465 470 475 480

Asn Ala Lys Gln Thr Leu Ala Asp Ser Val Gln Gln Ile Ile Gln Thr

485 490 495

Asp Arg Lys Tyr Leu Arg Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His

500 505 510

His His

Claims

1.一种EDDS裂合酶固定化酶的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤

B、将得到的EDDS裂合酶的粗酶液与金属亲和载体接触，使含有His-tag的EDDS裂合酶吸附到金属亲和载体上进行纯化处理；再将金属亲和载体上的带上His-tag的EDDS裂合酶进行洗脱，得到纯化后的带有His-tag的EDDS裂合酶的酶液；

2.根据权利要求1所述EDDS裂合酶固定化酶的制备方法，其特征在于，所述带有His-tag的EDDS裂合酶的基因工程菌的基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述EDDS裂合酶固定化酶的制备方法，其特征在于，所述带上His-tag的EDDS裂合酶蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1或2或3所述EDDS裂合酶固定化酶的制备方法，其特征在于，步骤B中所述金属亲和载体选自Ni离子或钴离子活化的LX-1000IDA、Seplite LX-1000IDA、FP-IDA405/EB或Ni-IDA-Sefinose Resin。

5.根据权利要求1或2或3所述EDDS裂合酶固定化酶的制备方法，其特征在于，步骤C中所述固定化载体为经过戊二醛活化的氨基载体。

6.根据权利要求1或2或3所述EDDS裂合酶固定化酶的制备方法，其特征在于，步骤B所述纯化处理具体为：

将得到的含有His-tag的EDDS裂合酶的粗酶液作为上柱液流过预装有金属亲和载体的柱子，使含有His-tag的EDDS裂合酶吸附在金属新和载体上。

7.根据权利要求6所述EDDS裂合酶固定化酶的制备方法，其特征在于，所述上柱液中含有0-30mM的咪唑。

8.根据权利要求6所述EDDS裂合酶固定化酶的制备方法，其特征在于，步骤B中所述洗脱采用的洗脱液中含有咪唑200-1000mM。

9.一种EDDS裂合酶固定化酶的应用，其特征在于，所述EDDS裂合酶固定化酶用于以富马酸和乙二胺为底物合成(S,S)-EDDS。

10.根据权利要求9所述EDDS裂合酶固定化酶的应用，其特征在于，所述底物配制成反应底物混合液，所述反应底物混合液包括以下成分的浓度：

富马酸：400-2000mmol/L；乙二胺盐酸盐：200-1000mmol/L；Mg²⁺：800-1200mmol/L。