CN104531654B - 改良型腈水合酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种改良型腈水合酶。具体地，本发明提供一种催化活性提高了的改良型腈水合酶，并且提供编码该改良型腈水合酶的DNA、包含该DNA的重组载体、包含该重组载体的转化体、从该转化体的培养物中提取的腈水合酶及其制造方法。还提供使用了该培养物或该培养物的处理物的酰胺化合物的制造方法。一种改良型腈水合酶，其特征在于，其为β亚基中包含序列号50(GX1X2X3X4DX5X6R)所示的氨基酸序列的腈水合酶；X4为选自由半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸所组成的组的氨基酸。

Description

改良型腈水合酶
本申请是申请号为201280028338.7(国际申请号为PCT/JP2012/003745)的原申请的分案申请，该原申请的申请日为2012年6月7日，发明名称为“改良型腈水合酶”。
技术领域
本发明涉及改良型(变异型)腈水合酶及其制造方法。进而涉及编码该酶的基因DNA、包含该基因DNA的重组载体、和具有该重组载体的转化体以及酰胺化合物的制造方法。
背景技术
近年发现了酶腈水合酶、即具有将腈基水合并转换为酰胺基的腈水合活性的酶，公开了使用该酶或含有该酶的微生物菌体等通过腈化合物而制造对应的酰胺化合物的方法。已知该制造方法与现有的化学合成法相比较，由腈化合物向对应的酰胺化合物的转化率和选择率高。
作为生产腈水合酶的微生物，可列举出例如：属于棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、根瘤菌属(Rhizobium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)等的微生物。其中，玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)J1株用于丙烯酰胺的工业生产中，其有用性已被证实。另外，编码该菌株所产生的腈水合酶的基因也已明确(参照专利文献1)。
另一方面,不仅利用由自然界中存在的微生物分离的腈水合酶、其基因，还出于改变腈水合酶的活性、底物特异性、Vmax、Km、热稳定性、对底物的稳定性、对生成物的稳定性等目的，尝试了向腈水合酶中导入变异；嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶中，由立体结构信息预测与底物特异性、热稳定性相关的区域，从中取得底物特异性变化了的变异酶(参照专利文献2～4)。另外，本发明人等得到耐热性或酰胺化合物耐性均提高了的腈水合酶基因(参照专利文献5～9)。
在利用酶法工业生产丙烯酰胺方面，从催化剂成本等生产成本的观点等出发，开发催化活性提高的腈水合酶是非常有用的；从反应时的酶量的削减和成本削减等观点出发，尤其期望开发而获得活性提高了的酶。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第3162091号公报
专利文献2：国际公开第2004/056990号小册子
专利文献3：日本特开2004-194588号公报
专利文献4：日本特开2005-16403号公报
专利文献5：国际公开第2005/116206号小册子
专利文献6：日本特开2007-143409号公报
专利文献7：日本特开2007-43910号公报
专利文献8：日本特开2008-253182号公报
专利文献9：日本特开2010-172295号公报
发明内容
发明要解决的问题
因此，本发明的目的在于，通过腈水合酶的改良提供催化活性提高了的改良型腈水合酶。另外，本发明的目的在于提供编码该改良型腈水合酶的DNA、包含该DNA的重组载体、包含该重组载体的转化体、从该转化体的培养物中提取的腈水合酶及其制造方法。进一步，本发明的目的在于提供使用了该培养物或该培养物的处理物的酰胺化合物的制造方法。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述问题进行了深入的研究。结果发现，在野生型腈水合酶的氨基酸序列中将特定的氨基酸残基置换为其他的氨基酸残基而成的蛋白质不仅具有腈水合酶活性，催化活性也提高了；至此完成本发明。
即，本发明如下。
(1)一种改良型腈水合酶，其具有选自下述(a)～(e)中的至少一种特征。
(a)一种改良型腈水合酶，其特征在于，其为β亚基中包含序列号50所示的氨基酸序列的腈水合酶；
GX1X2X3X4DX5X6R(序列号50)
G表示甘氨酸，D表示天冬氨酸，R表示精氨酸，X1、X2、X3、X5、X6分别独立地表示任意的氨基酸残基；
X4为选自由半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸所组成的组的氨基酸。
(b)一种改良型腈水合酶，其特征在于，其为β亚基中包含序列号81所示的氨基酸序列的腈水合酶；
WEX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18D(序列号81)
W表示色氨酸，E表示谷氨酸，D表示天冬氨酸，X1～X6和X8～X18表示分别独立的任意的氨基酸残基；
X7为选自由丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸所组成的组的氨基酸。
(c)一种改良型腈水合酶，其特征在于，其为α亚基中包含序列号119所示的氨基酸序列的腈水合酶；
AX1X2X3X4GX5X6GX7X8(序列号119)
A表示丙氨酸，G表示甘氨酸，X1～X7表示分别独立的任意的氨基酸残基；
X8为选自由丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸所组成的组的氨基酸。
(d)一种改良型腈水合酶，其特征在于，其为α亚基中包含序列号132所示的氨基酸序列的腈水合酶；X7被置换为不同于野生型的氨基酸；
AX1X2X3X4GX5X6GX7Q(序列号132)
A表示丙氨酸，G表示甘氨酸，Q表示谷氨酰胺，X1～X6表示分别独立的任意的氨基酸残基；
(e)一种改良型腈水合酶，其特征在于，其为α亚基中包含序列号136所示的氨基酸序列的腈水合酶；X9被置换为不同于野生型的氨基酸；
AX1X2X3X4GX5X6GX7QX8X9(序列号136)
A表示丙氨酸，G表示甘氨酸，Q表示谷氨酰胺，X1～X8表示分别独立的任意的氨基酸残基。
(2)根据(1)所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列号50的X2为S(丝氨酸)。
(3)根据(1)所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列号50的X1为I(异亮氨酸)，X2为S(丝氨酸)，X3为W(色氨酸)，X5为(K赖氨酸)，X6为S(丝氨酸)。
(4)根据(1)～(3)的任一项所述的改良型腈水合酶，包含前述序列号50所示的氨基酸序列的腈水合酶具有序列号51所示的氨基酸序列。
(5)根据(1)所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列号81的X14为G(甘氨酸)。
(6)根据(1)所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列号81的X1为G(甘氨酸)，X2为R(精氨酸)，X3为T(苏氨酸)，X4为L(亮氨酸)，X5为S(丝氨酸)，X6为I(异亮氨酸)，X8为T(苏氨酸)，X9为W(色氨酸)，X10为M(甲硫氨酸)，X11为H(组氨酸)，X12为L(亮氨酸)，X13为K(赖氨酸)，X14为G(甘氨酸)。
(7)根据(1)、(5)和(6)的任一项所述的改良型腈水合酶，包含前述序列号81所示的氨基酸序列的腈水合酶具有序列号82所示的氨基酸序列。
(8)根据(1)所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列号119的X1为M(甲硫氨酸)，X2为A(丙氨酸)，X3为S(丝氨酸)，X4为L(亮氨酸)，X5为Y(酪氨酸)，X6为A(丙氨酸)，X7为E(谷氨酸)。
(9)根据(1)或(8)所述的改良型腈水合酶，包含前述序列号119所示的氨基酸序列的腈水合酶具有序列号120所示的氨基酸序列。
(10)根据(1)所述的改良型腈水合酶，其特征在于，其为α亚基中包含序列号132所示的氨基酸序列的腈水合酶；X7为选自由半胱氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸所组成的组的氨基酸。
(11)根据(1)或(10)所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列号132的X1为M(甲硫氨酸)，X2为A(丙氨酸)，X3为S(丝氨酸)，X4为L(亮氨酸)，X5为Y(酪氨酸)，X6为A(丙氨酸)。
(12)根据(1)、(10)和(11)的任一项所述的改良型腈水合酶，包含前述序列号132所示的氨基酸序列的腈水合酶具有序列号131所示的氨基酸序列。
(13)根据(1)所述的改良型腈水合酶，其特征在于，其为α亚基中包含序列号136所示的氨基酸序列的腈水合酶，X9为选自由半胱氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、酪氨酸所组成的组的氨基酸。
(14)根据(1)或(13)所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列号136的X1为M(甲硫氨酸)，X2为A(丙氨酸)，X3为S(丝氨酸)，X4为L(亮氨酸)，X5为Y(酪氨酸)，X6为A(丙氨酸)，X7为E(谷氨酸)，X8为A(丙氨酸)。
(15)根据(1)、(13)和(14)的任一项所述的改良型腈水合酶，包含前述序列号136所示的氨基酸序列的腈水合酶具有序列号135所示的氨基酸序列。
(16)根据(1)～(15)的任一项所述的改良型腈水合酶，前述腈水合酶来源于红球菌属细菌或诺卡氏菌属细菌。
(17)一种DNA，其编码(1)～(16)的任一项所述的改良型腈水合酶。
(18)一种DNA，其与(17)所述的DNA在严格的条件下杂交。
(19)一种重组载体，其包含(17)或(18)所述的DNA。
(20)一种转化体，其包含(19)所述的重组载体。
(21)一种腈水合酶，为从培养(20)所述的转化体而得到的培养物中提取的。
(22)一种腈水合酶的制造方法，其特征在于，培养(20)所述的转化体，由得到的培养物提取腈水合酶。
(23)一种酰胺化合物的制造方法，其特征在于，使(1)～(16)的任一项所述的改良型腈水合酶或培养(20)所述的转化体而得到的培养物或者该培养物的处理物与腈化合物接触。
发明的效果
本发明能够提供催化活性提高了的、新型的改良型(变异型)腈水合酶。催化活性提高的改良型腈水合酶在酰胺化合物的制造上是非常有用的。
本发明进一步能够提供编码上述改良型腈水合酶的基因DNA、包含该基因DNA的重组载体、包含该重组载体的转化体、从该转化体的培养物中提取的腈水合酶及其制造、以及使用了前述蛋白质(改良型腈水合酶)或者使用了该培养物或该培养物的处理物的酰胺化合物的制造方法。
附图说明
图1为质粒pSJ034的结构图。
图2-1为表示已知的腈水合酶的β亚基的比对结果的图。
图2-2为表示已知的腈水合酶的β亚基的比对结果的图。
图3为序列号51所示的、本发明的β亚基的氨基酸序列。
图4为表示SDS-PAGE的结果的照片。
图5为质粒pER855A的结构图。
图6-1为表示来源于各种微生物的野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列(N末端侧的一部分)的图。
图6-2为表示与图6-1相同的氨基酸序列的图，表示接着图6-1的氨基酸序列的序列(C末端侧的一部分)。
图7为序列号82所示的、本发明的β亚基的氨基酸序列。
图8-1为表示来源于各种微生物的腈水合酶的α亚基的氨基酸序列(N末端侧的一部分)的图。
图8-2为表示与图8-1相同的氨基酸序列的图，表示接着图8-1的氨基酸序列的序列。
图9为序列号121所示的、本发明的α亚基的氨基酸序列。
图10-1为表示来源于各种微生物的腈水合酶的α亚基的氨基酸序列(N末端侧的一部分)的图。
图10-2为表示与图2-1相同的氨基酸序列的图，表示接着图10-1的氨基酸序列的序列。
图11为序列号131所示的、本发明的α亚基的氨基酸序列。
图12-1为表示来源于各种微生物的腈水合酶的α亚基的氨基酸序列(N末端侧的一部分)的图。
图12-2为表示与图12-1相同的氨基酸序列的图，表示接着图12-1的氨基酸序列的序列。
图13为序列号135所示的、本发明的α亚基的氨基酸序列。
具体实施方式
以下，详细地说明本发明。
1.腈水合酶
(a)已知的腈水合酶
本发明的改良型腈水合酶为已知的腈水合酶的改良型，对于其来源没有特别地限定。只要是例如：美国国立生物技术信息中心(NCBI；National Center for BiotechnologyInformation)所提供的Gen Bank数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？CMD＝search&DB＝protein)中登录的腈水合酶或公知文献中记载的腈水合酶，就可以参考。可以例示例如专利文献5～9(通过进行参照而引入本说明书中)所述的腈水合酶。专利文献5～9的腈水合酶具有耐热性、丙烯酰胺耐性，可以通过施加本发明的氨基酸置换而附加催化活性提高的性质。具体而言，可列举出具有序列号53～57的氨基酸序列的腈水合酶。
另外，对于编码上述氨基酸序列的基因，使用公知的方法导入变异，通过对具有所希望的性能的变异酶进行评价/选拔，能够得到性能进一步提高的改良酶。具体而言，可列举出具有序列号58～61的氨基酸序列的腈水合酶。
“腈水合酶”采取由α亚基和β亚基的结构域缔合而成的高级结构，具有非血红素铁原子或非咕啉核钴原子作为辅基。这些腈水合酶分别以铁型腈水合酶和钴型腈水合酶的称呼加以区分。
作为铁型腈水合酶，可列举出来源于红球菌属N-771株的腈水合酶作为其代表例。通过进行X射线结晶结构解析，该铁型腈水合酶的立体结构变得明确。结果，该酶介由形成活性中心的α亚基的半胱氨酸簇(Cys-Ser-Leu-Cys-Ser-Cys)(序列号48)中的4个氨基酸残基而与非血红素铁结合。
作为钴型腈水合酶，可列举出来源于玫瑰色红球菌J1株(以下有时称为“J1菌”)的钴型腈水合酶，或来源于嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardiathermophila)的钴型腈水合酶作为代表例。
来源于J1菌的钴型腈水合酶介由形成活性中心的α亚基的半胱氨酸簇(Cys-Thr-Leu-Cys-Ser-Cys)(序列号49)所示的区域而与钴原子结合。需要说明的是，来源于嗜热假诺卡氏菌的钴型腈水合酶的半胱氨酸簇中，上述来源于J1菌的半胱氨酸簇中的上游侧(N末端侧)起第4位的半胱氨酸(Cys)为半胱亚磺酸(Csi)，最下游侧(C末端侧)的第6位的半胱氨酸(Cys)为半胱次磺酸(Cse)。
如上所述，辅基与α亚基中的半胱氨酸簇“C(S/T)LCSC”(序列号48、49)所示的区域结合。作为包含这样的辅基结合区域的腈水合酶，可列举出例如：具有来源于玫瑰色红球菌J1(FERM BP-1478)、玫瑰色红球菌M8(SU1731814)、玫瑰色红球菌M33(VKM Ac-1515D)、玫瑰色红球菌ATCC39484(日本特开2001-292772)、史密斯芽孢杆菌(Bacillus smithii)(日本特开平9-248188)、嗜热假诺卡氏菌(日本特开平9-275978)或热葡糖苷地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)的氨基酸序列的腈水合酶以及来源于上述菌的基因序列所编码的腈水合酶。
另一方面，认为β亚基的功能涉及结构的稳定性。
例如：来源于玫瑰色红球菌J1(FERM BP-1478)的α亚基的氨基酸序列如序列号4所示、碱基序列如序列号3所示。另外，β亚基的氨基酸序列如序列号2所示、碱基序列如序列号1所示、登录号为“P21220”。另外，来源于玫瑰色红球菌M8(SU1731814)的α亚基的登录号为“ATT79340”，β亚基的登录号为“AAT79339”。来源于嗜吡啶红球菌(Rhodococcuspyridinovorans)MW3的腈水合酶基因的登录号为AJ582605、来源于嗜吡啶红球菌S85-2的腈水合酶基因的登录号为AJ582605、赤红球菌RH(Rhodococcus ruber RH)(CGMCCNo.2380)的腈水合酶基因记载于CN101463358。进而，来源于诺卡氏菌·YS-2002的腈水合酶基因的登录号为“X86737”，来源于诺卡氏菌属JBRs的腈水合酶基因的登录号为“AY141130”。
(b-1)改良型腈水合酶(β48)
将来源于各种微生物的已知的腈水合酶的β亚基的氨基酸(单字符号)序列的比对示于图2-1和图2-2中。需要说明的是，在图2-1、2-2中，各氨基酸序列从上方起依次表示序列号2、5～12和42～47。
进而，本发明的改良型腈水合酶中还包括在除了序列号50所示的氨基酸序列以外的已知的腈水合酶的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加有1个或数个(例如1个～10个左右，优选为1个～5个左右)的氨基酸残基的改良型腈水合酶。
作为本发明的改良型腈水合酶的一例，可列举出：如图3所示，β亚基具有序列号51所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶。此处，从N末端开始数第44位～第52位存在有序列号50所示的氨基酸序列。
实施方式之一中，在具有序列号51所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶中，X1、X2、X3、X5、X6分别独立地表示任意的氨基酸残基，X4为选自由半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸所组成的组的氨基酸。
另外，在其他的实施方式中，在具有序列号51所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶中，X1、X3、X5、X6分别独立地表示任意的氨基酸残基，X2为S(丝氨酸)，X4为选自由半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸所组成的组的氨基酸。
进一步，其他的实施方式中，具有序列号51所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶中，X1为I(异亮氨酸)，X2为S(丝氨酸)，X3为W(色氨酸)，X5为K(赖氨酸)，X6为S(丝氨酸)，X4为选自由半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸所组成的组的氨基酸。
作为本发明的改良型腈水合酶的其他例，可列举出：在序列号2所示的已知的腈水合酶的氨基酸序列中，β亚基的第48位的氨基酸残基(色氨酸)置换为半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸或苏氨酸而成的腈水合酶。
作为这样的氨基酸置换形式的标记例，可列举出Wβ48C、Wβ48D、Wβ48E、Wβ48H、Wβ48I、Wβ48K、Wβ48M、Wβ48N、Wβ48P、Wβ48Q、Wβ48S、Wβ48T。需要说明的是，氨基酸的字母标记可以用通常的单字表示，在表示置换位置为止的氨基酸残基数的数字(例如“48”)的左侧所表示的字母表示置换前的氨基酸的单字符号；右侧所表示的字母表示置换后的氨基酸的单字符号。
具体而言，关于序列号2所表示的β亚基的氨基酸序列，标记为“Wβ48C”的情况下，意味着β亚基的氨基酸序列(序列号2)中由N末端的氨基酸残基开始数(包含该N末端的氨基酸残基数起)第48位的色氨酸(W)置换为半胱氨酸(C)而成的改良型腈水合酶的氨基酸置换形式。
本发明的更优选的改良型腈水合酶中的氨基酸置换形式可以分别用以下的1～12的标记表示。
1.Wβ48C
2.Wβ48D
3.Wβ48E
4.Wβ48H
5.Wβ48I
6.Wβ48K
7.Wβ48M
8.Wβ48N
9.Wβ48P
10.Wβ48Q
11.Wβ48S
12.Wβ48T
作为用于产生上述氨基酸置换的碱基置换，优选可列举出以下的方式。
Wβ48C：优选将碱基序列TGG(位于序列号1中的第142～144位)置换为TGC(TGG→TGC)。
Wβ48D：优选将碱基序列TGG(位于序列号1中的第142～144位)置换为GAC(TGG→GAC)。
Wβ48E：优选将碱基序列TGG(位于序列号1中的第142～144位)置换为GAG(TGG→GAG)。
Wβ48F：优选将碱基序列TGG(位于序列号1中的第142～144位)置换为TTC(TGG→TTC)。
Wβ48H：优选将碱基序列TGG(位于序列号1中的第142～144位)置换为CAC(TGG→CAC)。
Wβ48I：优选将碱基序列TGG(位于序列号1中的第142～144位)置换为ATC(TGG→ATC)。
Wβ48K：优选将碱基序列TGG(位于序列号1中的第142～144位)置换为AAG(TGG→AAG)。
Wβ48M：优选将碱基序列TGG(位于序列号1中的第142～144位)置换为ATG(TGG→ATG)。
Wβ48N：优选将碱基序列TGG(位于序列号1中的第142～144位)置换为AAC(TGG→AAC)。
Wβ48P：优选将碱基序列TGG(位于序列号1中的第142～144位)置换为CCG(TGG→CCG)。
Wβ48Q：优选将碱基序列TGG(位于序列号1中的第142～144位)置换为CAG(TGG→CAG)。
Wβ48S：优选将碱基序列TGG(位于序列号1中的第142～144位)置换为TCC(TGG→TCC)。
Wβ48T：优选将碱基序列TGG(位于序列号1中的第142～144位)置换为ACC(TGG→ACC)。
(b-2)改良型腈水合酶(β37)
将来源于各种微生物的已知的腈水合酶的β亚基的氨基酸(单字符号)序列的比对示于图6-1和图6-2中。需要说明的是，在图6-1、6-2中，各氨基酸序列从上方起依次表示序列号2、5～12和42～49。
进而，本发明的改良型腈水合酶中还包括在除了序列号81所示的氨基酸序列以外的已知的腈水合酶的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加有1个或数个(例如1个～10个左右，优选为1个～5个左右)的氨基酸残基的改良型腈水合酶。
作为本发明的改良型腈水合酶的一例，可列举出：如图7所示，β亚基具有序列号82所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶。此处，从N末端开始数第29位～第49位存在有序列号81所示的氨基酸序列。
实施方式之一中，在具有序列号82所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶中，X1～X6和X8～X18表示分别独立的任意的氨基酸残基，X7为选自由丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸所组成的组的氨基酸。
另外，其他的实施方式中，在具有序列号82所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶中，X1～X6、X8～X13和X15～X18表示分别独立的任意的氨基酸残基，X14为G(甘氨酸)，X7为选自由丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸所组成的组的氨基酸。
进一步，其他的实施方式中，在具有序列号82所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶中，X15～X18表示分别独立的任意的氨基酸残基，X1为G(甘氨酸)，X2为R(精氨酸)，X3为T(苏氨酸)，X4为L(亮氨酸)，X5为S(丝氨酸)，X6为I(异亮氨酸)，X8为T(苏氨酸)，X9为W(色氨酸)，X10为M(甲硫氨酸)，X11为H(组氨酸)，X12为L(亮氨酸)，X13为K(赖氨酸)，X14为G(甘氨酸)，X7为选自由丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸所组成的组的氨基酸。
作为本发明的改良型腈水合酶的其他例，可列举出：在序列号2所示的已知的腈水合酶的氨基酸序列中，β亚基的第37位的氨基酸残基(亮氨酸)置换为丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸而成的腈水合酶。
作为这样的氨基酸置换形式的标记例，可列举出：Lβ37A、Lβ37D、Lβ37F、Lβ37I、Lβ37M、Lβ37T、Lβ37V。需要说明的是，氨基酸的字母标记可以用通常的单字表示，在表示置换位置为止的氨基酸残基数的数字(例如“37”)的左侧所表示的字母表示置换前的氨基酸的单字符号；右侧所表示的字母表示置换后的氨基酸的单字符号。
具体而言，关于序列号2所表示的β亚基的氨基酸序列，标记为“Lβ37A”的情况下，意味着β亚基的氨基酸序列(序列号2)中由N末端的氨基酸残基开始数(包含该N末端的氨基酸残基数起)第37位的亮氨酸(L)被置换为丙氨酸(A)而成的改良型腈水合酶的氨基酸置换形式。
本发明的更优选的改良型腈水合酶中的氨基酸置换的形式可以分别用以下的1～7的标记表示。
1.Lβ37A
2.Lβ37D
3.Lβ37F
4.Lβ37I
5.Lβ37M
6.Lβ37T
7.Lβ37V
作为用于产生上述氨基酸置换的碱基置换，优选可列举出以下的表1所示的方式。
[表1]
(b-3)改良型腈水合酶(α83)
将来源于各种微生物的已知的腈水合酶的α亚基的氨基酸(单字符号)序列的比对示于图8-1和图8-2中。需要说明的是，在图8-1、8-2中，各氨基酸序列从上方起依次表示序列号4、105～108、121、109、110、112、111、122～124、113、114、125。
进而，本发明的改良型腈水合酶中还包括在除了序列号119所示的氨基酸序列以外的已知的腈水合酶的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加有1个或数个(例如1个～10个左右，优选为1个～5个左右)的氨基酸残基的改良型腈水合酶。作为一例，可以示出专利文献5～9(通过参照而引入本说明书中)所述的腈水合酶。专利文献5～9的腈水合酶具有耐热性、丙烯酰胺耐性，可以通过施加本发明的氨基酸置换而附加催化活性提高的性质。
作为本发明的改良型腈水合酶的一例，可列举出：如图9所示，α亚基具有序列号120所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶。此处，从N末端开始数第73位～第83位存在有序列号119所示的氨基酸序列。
实施方式之一中，在具有序列号120所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶中，X1～X7表示独立的任意的氨基酸残基，X8为选自由丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸所组成的组的氨基酸。
另外，其他的实施方式中，在具有序列号120所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶中，X1为M(甲硫氨酸)，X2为A(丙氨酸)，X3为S(丝氨酸)，X4为L(亮氨酸)，X5为Y(酪氨酸)，X6为A(丙氨酸)，X7为E(谷氨酸)，X8为选自由丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸所组成的组的氨基酸。
作为本发明的改良型腈水合酶的其他例，可列举出：在序列号4所示的已知的腈水合酶的氨基酸序列中，α亚基的第83位的氨基酸残基(谷氨酰胺)置换为丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或色氨酸而成的腈水合酶。
作为这样的氨基酸置换形式的标记例，可列举出Qα83A、Qα83C、Qα83D、Qα83E、Qα83F、Qα83G、Qα83H、Qα83K、Qα83L、Qα83M、Qα83N、Qα83P、Qα83R、Qα83S、Qα83T、Qα83AY、Qα83W。需要说明的是，氨基酸的字母标记可以用通常的1文字表示，在表示置换位置为止的氨基酸残基数的数字(例如“83”)的左侧所表示的字母表示置换前的氨基酸的单字符号；右侧所表示的字母表示置换后的氨基酸的单字符号。
具体而言，关于序列号4所表示的α亚基的氨基酸序列，标记为“Qα83A”的情况下，意味着α亚基的氨基酸序列(序列号4)中由N末端的氨基酸残基开始数(包含该N末端的氨基酸残基数起)第83位的谷氨酰胺(Q)被置换为丙氨酸(A)而成的改良型腈水合酶的氨基酸置换形式。
本发明的更优选的改良型腈水合酶中的氨基酸置换形式可以分别用以下的1～17的标记表示。
1.Qα83A
2.Qα83C
3.Qα83D
4.Qα83E
5.Qα83F
6.Qα83G
7.Qα83H
8.Qα83K
9.Qα83L
10.Qα83M
11.Qα83N
12.Qα83P
13.Qα83R
14.Qα83S
15.Qα83T
16.Qα83Y
17.Qα83W
作为用于产生上述氨基酸置换的碱基置换，优选可列举出以下的方式。
[表2]
(b-4)改良型腈水合酶(α82)
将来源于各种微生物的已知的腈水合酶的α亚基的氨基酸(单字符号)序列的比对示于图10-1和图10-2中。需要说明的是，在图10-1、10-2中，各氨基酸序列从上方起依次表示序列号4、105～108、121、109、110、112、111、122～124、113、114、125。
进而，本发明的改良型腈水合酶中还包括在除了序列号31所示的氨基酸序列以外的已知的腈水合酶的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加有1个或数个(例如1个～10个左右，优选为1个～5个左右)的氨基酸残基的改良型腈水合酶。作为一例，可以示出专利文献5～9(通过参照而引入本说明书中)所述的腈水合酶。专利文献5～9的腈水合酶具有耐热性、丙烯酰胺耐性，可以通过施加本发明的氨基酸置换而附加催化活性提高的性质。
作为本发明的改良型腈水合酶的一例，可列举出：如图11所示，α亚基具有序列号131所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶。此处，从N末端开始数第73位～第82位存在有序列号132所示的氨基酸序列。
本发明中的实施方式之一中，在具有序列号131所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶中，X1～X6表示独立的任意的氨基酸残基，X7为选自由半胱氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸所组成的组的氨基酸。
其他的实施方式中，在具有序列号131所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶中，X1为M(甲硫氨酸)，X2为A(丙氨酸)，X3为S(丝氨酸)，X4为L(亮氨酸)，X5为Y(酪氨酸)，X6为A(丙氨酸)，X7为选自由半胱氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸所组成的组的氨基酸。
作为本发明的改良型腈水合酶的其他例，可列举出：在序列号4所示的已知的腈水合酶的氨基酸序列中，α亚基的第82位的氨基酸残基(谷氨酸)置换为半胱氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸、或酪氨酸而成的腈水合酶。
作为这样的氨基酸置换形式的标记例，可列举出Eα82C、Eα82F、Eα82H、Eα82I、Eα82K、Eα82M、Eα82Q、Eα82R、Eα82T、Eα82Y。需要说明的是，氨基酸的字母标记可以用通常的单字表示，在表示置换位置为止的氨基酸残基数的数字(例如“82”)的左侧所表示的字母表示置换前的氨基酸的单字符号；右侧所表示的字母表示置换后的氨基酸的单字符号。
具体而言，关于序列号4所表示的α亚基的氨基酸序列，标记为“Eα82C”的情况下，意味着α亚基的氨基酸序列(序列号4)中由N末端的氨基酸残基开始数(包含该N末端的氨基酸残基数起)第82位的谷氨酸(E)被置换为半胱氨酸(C)而成的改良型腈水合酶的氨基酸置换形式。
本发明的更优选的改良型腈水合酶中的氨基酸置换形式可以分别用以下的1～10的标记表示。
1.Eα82C
2.Eα82F
3.Eα82H
4.Eα82I
5.Eα82K
6.Eα82M
7.Eα82Q
8.Eα82R
9.Eα82T
10.Eα82Y
作为用于产生上述氨基酸置换的碱基置换，优选可列举出以下的方式。
[表3]
(b-5)改良型腈水合酶(α85)
将来源于各种微生物的已知的腈水合酶的α亚基的氨基酸(单字符号)序列的比对示于图12-1和图12-2中。需要说明的是，在图12-1、12-2中，各氨基酸序列从上方起依次表示序列号4、105～108、121、109、110、112、111、122～124、113、114、125。
进而，本发明的改良型腈水合酶中还包括在除了序列号135所示的氨基酸序列以外的已知的腈水合酶的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加有1个或数个(例如1个～10个左右，优选为1个～5个左右)的氨基酸残基的改良型腈水合酶。作为一例，可以示出专利文献5～9(通过参照而引入本说明书中)所述的腈水合酶。专利文献5～9的腈水合酶具有耐热性、丙烯酰胺耐性，可以通过施加本发明的氨基酸置换而附加催化活性提高的性质。
作为本发明的改良型腈水合酶的一例，可列举出：如图13所示，α亚基具有序列号135所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶。此处，从N末端开始数第73位～第85位存在有序列号136所示的氨基酸序列。
本发明的实施方式之一中，在具有序列号135所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶中，X1～X8表示独立的任意的氨基酸残基，X9为选自由半胱氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、酪氨酸所组成的组的氨基酸。
其他的实施方式中，在具有序列号135所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶中，X1为M(甲硫氨酸)，X2为A(丙氨酸)，X3为S(丝氨酸)，X4为L(亮氨酸)，X5为Y(酪氨酸)，X6为A(丙氨酸)，X7为E(谷氨酸)，X8为A(丙氨酸)，X9为选自由半胱氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、酪氨酸所组成的组的氨基酸。
作为本发明的改良型腈水合酶的其他例，可列举出：在序列号4所示的已知的腈水合酶的氨基酸序列中，α亚基的第85位的氨基酸残基(组氨酸)的X9置换为半胱氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、或酪氨酸而成的腈水合酶。
作为这样的氨基酸置换形式的标记例，可列举出Hα85C、Hα85E、Hα85F、Hα85I、Hα85N、Hα85Q、Hα85S、Hα85Y。需要说明的是，氨基酸的字母标记可以用通常的单字表示，在表示置换位置为止的氨基酸残基数的数字(例如“85”)的左侧所表示的字母表示置换前的氨基酸的单字符号；右侧所表示的字母表示置换后的氨基酸的单字符号。
具体而言，关于序列号4所表示的α亚基的氨基酸序列，标记为“Hα85C”的情况下，意味着α亚基的氨基酸序列(序列号4)中由N末端的氨基酸残基开始数(包含该N末端的氨基酸残基数起)第85位的组氨酸(H)置换为半胱氨酸(C)而成的改良型腈水合酶的氨基酸置换形式。
本发明的更优选的改良型腈水合酶中的氨基酸置换形式可以分别用以下的1～8的标记表示。
1.Hα85C
2.Hα85E
3.Hα85F
4.Hα85I
5.Hα85N
6.Hα85Q
7.Hα85S
8.Hα85Y
作为用于产生上述氨基酸置换的碱基置换，优选可列举出以下的方式。
[表4]
(b-6)腈水合酶活性
相对于导入了变异前的腈水合酶的活性，本发明的改良型腈水合酶的活性中的催化活性提高。
此处，“腈水合酶活性”是指催化将腈化合物转换为对应的酰胺化合物的水合反应(RCN+H2O→RCONH2)的酶。关于活性测定，可以通过使作为底物的腈化合物与腈水合酶接触，转换为对应的酰胺化合物之后，将该酰胺化合物定量而算出。作为底物，只要腈水合酶反应，不论怎样的腈化合物都可以使用，优选丙烯腈。
作为反应条件，在底物浓度为2.5％、反应温度为10℃～30℃、反应时间为10分钟～30分钟的范围下进行。酶反应通过添加磷酸而停止。之后，可以通过HPLC(高效液相色谱)、气象色谱分析生成的丙烯酰胺而进行酰胺化合物的定量。
“催化活性提高”是指通过对具有改良型腈水合酶的转化体的培养物或从该转化体中分离的改良型腈水合酶进行活性测定，改良型腈水合酶的催化活性相比于同条件下测定的亲株的活性值高1成以上。本发明的亲株是指被导入了导入变异的模板质粒的转化体。
作为酰胺化合物，可列举出例如下述通式(1)所示的酰胺化合物：
R-CONH2(1)
(此处，R表示可以被取代的碳原子数1～10的直链状或者支链状的烷基或烯基、可以被取代的碳原子数3～18的环烷基或芳基、或者可以被取代的饱和或不饱和杂环基。)。
特别优选式中的R为“CH2＝CH-”的丙烯酰胺。
上述的改良型腈水合酶为将腈水合酶通过氨基酸置换而得到的，例如，通过改变来源于玫瑰色红球菌J1株的腈水合酶的氨基酸序列(序列号2)并选择催化活性提高的腈水合酶而得到的。
需要说明的是，玫瑰色红球菌J1株以FERM BP-1478于昭和62(1987)年9月18日于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)进行了国际保藏。
可以认为在除了J1菌以外的腈水合酶中，由于上述的变异的位置、变异的氨基酸种类、DNA序列不同而催化活性提高。作为这样的细菌，优选可列举出：玫瑰色红球菌M8(SU1731814)(序列号5)、赤红球菌TH(序列号6)、玫瑰色红球菌M33(VKM Ac-1515D)、嗜吡啶红球菌MW3(序列号7)、嗜吡啶红球菌S85-2(序列号8)、嗜吡啶红球菌MS-38(序列号9)、赤红球菌RH(Rhodococcus ruber RH)(CN101463358)(序列号52)、诺卡氏菌属JBRs(序列号10)、诺卡氏菌·YS-2002(序列号11)、玫瑰色红球菌ATCC39384(序列号12)、不可培养细菌(uncultured bacterium)SP1(序列号42)、不可培养细菌BD2(序列号43)、睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)(序列号44)、热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)Q6(序列号45)、嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)JCM3095(序列号46)、玫瑰色红球菌Cr4(序列号47)等。需要说明的是，玫瑰色红球菌M33(VKM Ac-1515D)是筛选出的上述M8菌(SU1731814)由于自发突变从而结构上表达腈水合酶的菌株。该腈水合酶自身的氨基酸序列和基因序列中没有变异(美国专利第5，827，699号)。可列举出：这些菌的β亚基中N末端的第48位的氨基酸残基置换为半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸或苏氨酸而成的菌。
作为对腈水合酶进行氨基酸置换的方法，可以采用：使具有腈水合酶活性的微生物与羟基胺、亚硝酸等成为变异源的药剂接触、发生作用的方法；通过紫外射线照射诱导变异的方法；向编码腈水合酶的基因中使用PCR随机地导入变异的易错聚合酶链反应(Errorprone PCR)方法等。
(b-7)易错聚合酶链反应
作为使用变异体研究蛋白质的功能、性质的方法之一，有随机变异导入法。随机变异导入法是指对于编码限定的蛋白质的基因，导入随机的变异，制作变异体的方法。利用PCR进行的随机变异导入法中，可以在DNA扩增时设定严格度(Stringency)低的条件而导入碱基的变异(Error prone PCR)。
在该易错聚合酶链反应中，对于被扩增的DNA的全部区域，在任意的位点导入变异。这样，通过对于得到的在任意的位点导入有变异的变异体的功能进行研究，能够得到对蛋白质固有的功能重要的氨基酸、结构域的信息。
成为易错聚合酶链反应的模板的腈水合酶可以使用来源于野生株的腈水合酶基因、利用易错聚合酶链反应获得的扩增产物DNA。
作为易错聚合酶链反应的反应条件，可列举出例如：将反应液中的dNTP(dGTP、dCTP、dATP或dTTP)的任1种、2种或3种的配合比例设为与其他的dNTP相比减少了的组成的条件。由此，DNA合成时，在需要配合比例已经减少的dNTP的位置，错误地使用其他的dNTP的可能性变高，从而导入变异。另外，作为其他的反应条件，也优选列举出设为增加了反应液中的MgCl2和/或MnCl2量的组成的条件。
(b-8)改良型腈水合酶
编码改良型腈水合酶的DNA可以以已知的腈水合酶DNA为基础根据MolecularCloning，A Laboratory Manual 2nded.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons(1987-1997)等所述的位点特异性变异诱导法而制备。为了向DNA中导入变异，可以通过Kunkel法、缺口双链体(Gappedduplex)法等公知手法，使用利用了位点特异性突变诱导法的变异导入用试剂盒，例如Quick Change TM XL Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司造)、Gene TailorTM Site-Directed Mutagenesis System(Invitrogen公司制造)、TaKaRa Site-DirectedMutagenesis System(Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：TAKARA BIO INC.制造)而进行。
另外，本发明的DNA也与如下DNA在严格条件下杂交且编码具有腈水合酶活性的蛋白质的DNA：由与本发明的DNA的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA。
这样的改良型腈水合酶DNA可以如上所述通过向野生型基因中导入变异而得到；也可以将该DNA序列或其互补序列、或者它们的片段作为探针，通过菌落杂交、噬菌斑杂交(plaque hybridization)、DNA印迹杂交(Southern blotting)等公知的杂交法，由cDNA文库和基因组文库而得到。文库能够利用采用公知的方法制作的文库，也可以利用市售的cDNA文库和基因组文库。
“严格条件(Stringent conditions)”意味着杂交后洗涤时的条件为盐浓度300～2000mM、温度40～75℃；优选为盐浓度600～900mM、温度65℃的条件。可列举出例如：2×SSC下50℃等的条件。本领域技术人员可以在这样的缓冲液的盐浓度、温度等条件的基础上，加上其他的如探针浓度、探针的长度、反应时间等各种条件，可以适宜地设定用于得到编码本发明的腈水合酶的DNA的条件。
对于杂交法的详细的步骤，可以参照Molecular Cloning，A Laboratory Manual2nded.(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))等。作为杂交的DNA，可列举出：包含与本发明的DNA具有至少40％以上、优选为60％、进一步优选为90％以上的同源性的碱基序列的DNA或其部分片段。
(c)重组载体、转化体
腈水合酶基因需要按照在被转化的宿主生物中能够表达的方式重组入载体中。作为载体可列举出例如：质粒DNA、噬菌体DNA、反转录转座子DNA、人工染色体DNA等。
另外，本发明中能够使用的宿主，只要是导入了上述重组载体后能够表达目标腈水合酶，就没有特别的限定。可以使用例如：大肠杆菌和枯草杆菌等细菌、酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等。将大肠杆菌作为宿主的情况下，优选使用表达效率高的表达载体，例如：具有trc启动子的表达载体pkk233-2(Amersham Biosciences公司制造)或pTrc99A(Amersham Biosciences公司制造)等。
除了腈水合酶基因之外，载体中还可以连接有启动子、终止子、增强子、剪接信号(Splicing signal)、poly-A附加信号(poly-A additional signal)、选择标记、核糖体结合序列(SD序列)等。需要说明的是，作为选择标记，可列举出例如：卡那霉素抗性基因、二氢叶酸还原酶基因、氨苄青霉素抗性基因、新霉素抗性基因等。
将细菌作为宿主的情况下，可列举出例如：大肠杆菌(Escherichia coli)，作为红球菌，可列举出例如：玫瑰色红球菌ATCC12674、玫瑰色红球菌ATCC17895、玫瑰色红球菌ATCC19140等。这些ATCC株能够从美国菌种保藏中心(American Type CultureCollection.)购得。
制作表达腈水合酶的转化体时，使用大肠杆菌作为宿主的情况下，表达的大部分腈水合酶成为包涵体(inclusion body)而不溶化，因此得到的是催化活性低的转化体。另一方面，将红球菌作为宿主使用的情况下，腈水合酶存在于可溶性级分中，因此能够得到高活性的转化体。这些转化体根据目的进行选择即可，严格条件下选拔改良型酶的情况优选使用高活性的红球菌的转化体。
作为向细菌导入重组载体的方法，只要是向细菌中导入DNA的方法，就没有特别的限定。可列举出例如：使用钙离子的方法、电穿孔法等。
将酵母作为宿主的情况下，可以使用例如：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、毕赤酵母(Pichia pastoris)等。作为向酵母导入重组载体的方法，只要是向酵母中导入DNA的方法，就没有特别的限定，可列举出例如：电穿孔法、原生质体法、醋酸锂法等。
将动物细胞作为宿主的情况下，可以使用猴细胞COS-7、Vero、CHO细胞、小鼠L细胞、大鼠GH3、人FL细胞等。作为向动物细胞中导入重组载体的方法，可列举出例如：电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法等。
将昆虫细胞作为宿主的情况下，可以使用Sf9细胞、Sf21细胞等。作为向昆虫细胞导入重组载体的方法，可以使用例如磷酸钙法、脂质体法、电穿孔法等。
将植物细胞作为宿主的情况下，可列举出烟草BY-2细胞等，对其没有限定。作为向植物细胞导入重组载体的方法，可以使用例如：土壤杆菌法、基因枪法、PEG法、电穿孔法等。
(d)培养物和改良型腈水合酶的制造方法
本发明中，改良型腈水合酶可以通过培养上述转化体，从得到的培养物中提取而进行制造。
本发明还包含特征在于从该培养物中提取改良型腈水合酶的、改良型腈水合酶的制造方法。
本发明中，“培养物”是指培养上清、培养细胞、培养菌体、或者细胞或菌体的破碎物的任意者。培养本发明的转化体的方法根据宿主的培养中所使用的通常的方法而进行。目标的改良型腈水合酶累积于上述培养物中。
培养本发明的转化体的培养基只要是含有宿主菌所能够同化(assimilation)的碳源、氮源、无机盐类等，能够有效地进行转化体的培养的培养基，就可以使用天然培养基、合成培养基的任意者。作为碳源，可列举出：葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、棉子糖和淀粉等碳水化合物、醋酸和丙酸等有机酸、乙醇和丙醇等醇类。作为氮源，可列举出：氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵和磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐、或者其他的含氮化合物。
其他的，也可以使用蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、玉米浆、各种氨基酸等。作为无机物，可列举出：磷酸二氢钾、磷酸氢钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸銅、碳酸钙等。另外，也可以根据需要，为了防止培养中的发泡而添加消泡剂。进而，也可以向培养基中添加作为腈水合酶的辅基的钴离子、铁离子，成为酶的诱导剂的腈类、酰胺类。
培养中，为了防止载体和目标基因的脱落，也可以在施加了选择压力(selectionpressure)的状态下进行培养。即，选择标记为药剂抗性基因的情况下，可以向培养基中添加相应的药剂；或者选择标记为营养缺陷型(auxotrophic)互补基因的情况下，也可以将相应的营养因子从培养基中去除。
另外，选择标记为赋予同化性的基因的情况下，可以根据需要添加相应的同化因子作为唯一因子。例如，培养用包含氨苄青霉素抗性基因的载体进行了转化的大肠杆菌的情况下，培养中也可以根据需要添加氨苄青霉素。
用将诱导型的启动子用作启动子的表达载体进行了转化而制成转化体，将该转化体进行培养的情况下，也可以根据需要向培养基中添加诱导物。例如：用具有能够用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的启动子的表达载体进行了转化而制成转化体，将该转化体进行培养时，可以向培养基中添加IPTG等。另外，使用了能够用吲哚乙酸(IAA)诱导的trp启动子的表达载体进行了转化而制成转化体，将该转化体进行培养时，可以向培养基中添加IAA等。
对于转化体的培养条件，只要在不妨碍目标改良型腈水合酶的生产率和宿主的生育的条件下，就没有特别的限定，通常为10℃～40℃、优选为20℃～37℃下进行5～100小时。pH的调节使用无机或有机酸、碱溶液等进行，例如为大肠杆菌时调节为6～9。
作为培养方法，可列举出：固体培养、静置培养、振荡培养、通气搅拌培养等；特别是培养大肠杆菌转化体的情况下，优选通过振荡培养或通气搅拌培养(小型发酵罐)在需氧条件下进行培养。
如果在上述培养条件下进行培养，则能够以高收率将本发明的改良型腈水合酶累积于上述培养物中，即培养上清、培养细胞、培养菌体或者细胞或菌体的破碎物的至少一者中。
培养后，在菌体内或细胞内生产改良型腈水合酶的情况下，通过将菌体或细胞进行破碎，能够提取目标的改良型腈水合酶。作为菌体或细胞的破碎方法，可以利用通过弗氏压碎器或均化器的高压处理、超声波处理、通过玻璃珠等的磨碎处理、使用溶菌酶、纤维素酶或果胶酶等的酶处理、冻融处理、低渗液处理、通过噬菌体的溶菌诱导处理等。
破碎后，可以根据需要去除菌体或细胞的破碎残渣(包含细胞提取液不溶性级分)。作为将残渣去除的方法，可以列举出例如：离心分离、过滤等，也可以根据需要使用絮凝剂、过滤助剂等提高残渣除去效率。去除残渣后得到的上清为细胞提取液可溶性级分，可以作为经粗纯化的改良型腈水合酶溶液。
另外，在菌体内或细胞内生产改良型腈水合酶的情况下，也可以将菌体、细胞自身用离心分离、膜分离等进行回收，以未破碎的状态使用。
在菌体内或细胞内生产改良型腈水合酶的情况下，将培养液直接使用、或者通过离心分离、过滤等将菌体或细胞去除。之后，也可以根据需要通过利用硫酸铵沉淀的提取等，从前述培养物中提取出改良型腈水合酶，进而，根据需要使用透析、各种色谱(凝胶过滤、离子交换色谱、亲和色谱等)进行分离纯化。
培养转化体而得到的腈水合酶的产率可以以例如单位培养液、单位菌体湿重量或干燥重量、单位粗酶液蛋白质等单位，通过SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)或腈水合酶活性测定等进行确认，没有特别的限定。SDS-PAGE可以使用本领域技术人员公知的方法进行。另外，腈水合酶活性可以适用上述的活性值。
另外，本发明中，不必全部使用活细胞(living cell)，采用无细胞蛋白质合成系而能够生产改良型腈水合酶。
无细胞蛋白质合成体系是指使用细胞提取液在试管等人工容器内合成蛋白质的体系。需要说明的是，本发明中使用的无细胞蛋白质合成体系中也包含将DNA作为模板合成RNA的无细胞转录体系。
此时，对应于上述的宿主的生物与下述的细胞提取液的来源生物相对应。此处，上述细胞提取液可以使用来源于真核细胞的提取液或来源于原核细胞的提取液，例如：小麦胚芽、大肠杆菌等的提取液。需要说明的是，这些细胞提取液既可以被浓缩，也可以不被浓缩。
细胞提取液可以通过例如超滤、透析、聚乙二醇(PEG)沉淀等而得到。进而，本发明中，无细胞蛋白质合成也可以使用市售的试剂盒而进行。作为这样的试剂盒，可列举出例如:试剂盒PROTEIOSTM(TOYOBO CO.,LTD.)、TNTTM System(Promega KK.)、合成装置的PG-MateTM(TOYOBO CO.,LTD.)、RTS(Roche Diagnostics K.K.)等。
如上所述，通过无细胞蛋白质合成得到的改良型腈水合酶可以如前所述选择适宜色谱而进行纯化。
2.酰胺化合物的制造方法
如上所述制造的改良型腈水合酶可以作为酶催化剂利用于物质生产。例如，通过使腈化合物与上述改良型腈水合酶接触而生成酰胺化合物。接着，提取通过接触而生成的酰胺化合物。由此，能够制造酰胺化合物。
作为酶催化剂，可以使用如前述那样分离纯化的腈水合酶。另外，如前所述，按照在适当的宿主内改良型腈水合酶基因能够表达的方式进行基因导入，利用培养宿主后的培养物或者该培养物的处理物。作为处理物，可列举出例如：将培养后的细胞用丙烯酰胺等凝胶包埋而成的处理物、用戊二醛进行了处理的处理物、负载于氧化铝、二氧化硅、沸石和硅藻土等无机载体而成的处理物等。
此处，“接触”是指使改良型腈水合酶和腈化合物存在于相同的反应体系或培养体系中，包含例如：将经分离纯化的改良型腈水合酶与腈化合物进行混合；向表达改良型腈水合酶基因的细胞的培养容器中添加腈化合物；在腈化合物的存在下培养该细胞；将该细胞的提取液与腈化合物混合等。
作为底物而使用的腈化合物，考虑酶的底物特异性、酶相对于底物的稳定性等而进行选择。作为腈化合物优选丙烯腈。反应方法、和反应结束后的酰胺化合物的提取方法根据底物和酶催化剂的特性而进行适宜选择。
酶催化剂只要其活性不失活，就优选循环使用。鉴于防止失活、容易地进行循环的观点，酶催化剂优选以处理物的形式而使用。
实施例
以下，列举实施例进一步具体说明本发明，但本发明并不受这些实施例的任何限定。需要说明的是，玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)J-1株以FERM BP-1478于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)(原保藏日：1987年9月18日)进行了国际保藏。
[制备例1]
质粒pSJ034的制作
将成为本发明的用于导入氨基酸置换的模板的具有J1菌的腈水合酶基因的质粒pSJ034(图1)按照以下的方法进行制作。
pSJ034为在红球菌中表达腈水合酶的质粒，由pSJ023使用日本特开平10-337185号公报所示的方法制作。即，将质粒pSJ023通过XbaI部分切断，用Sse8387I连接(ligation)，制成1个XbaI位点被置换为Sse8387I的质粒pSJ033。接着，将pSJ033用Sse8387I进行部分切断，使用Klenow片段进行末端平滑化，进行自身连接(self-ligation)，由此制作质粒pSJ034。需要说明的是，pSJ023为转化体“R.rhodochrousATCC12674/pSJ023”，以保藏号FERM BP-6232于平成9(1997)年3月4日于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)进行了国际保藏。
[制备例2]
质粒pFR005的制作
(1)变异基因文库的构建
作为模板的质粒，使用由β亚基的氨基酸序列(序列号2)的N末端的氨基酸残基开始数167残基下游的氨基酸残基由天冬酰胺(N)变异为丝氨酸(S)；并且，由上述N末端的氨基酸残基开始数219残基下游的氨基酸残基由缬氨酸(V)变异为丙氨酸(A)；并且，由上述N末端的氨基酸残基开始数57残基下游的氨基酸残基由丝氨酸(S)变异为甲硫氨酸(M)；并且，由上述N末端的氨基酸残基开始数114残基下游的氨基酸残基由赖氨酸(K)变异为酪氨酸(Y)；并且，由上述N末端的氨基酸残基开始数107残基下游的氨基酸残基由苏氨酸(T)变异为赖氨酸(K)而成的质粒pER855(参照日本特开2010-172295)的改变物pER855A(图5)。
首先，按照以下的方法向腈水合酶基因导入变异。
＜PCR反应液组成＞
＜PCR反应条件＞
(98℃10秒、55℃5秒、72℃下90秒)×30循环
＜引物＞β17的饱和变异引物
β17RM-F ggatacggaccggtcNNStatcagaaggacgag(序列号63)
β17RM-R ctcgtccttctgataSNNgaccggtccgtatcc(序列号64)
＜反应条件＞
(94℃下30秒、65℃下30秒、72℃下3分钟)×30循环
PCR结束后，将反应液5μl供于0.7％琼脂糖凝胶电泳，确认11kb的扩增片段，将1μl的Dpn I(试剂盒附带的)添加至PCR反应液中使之在37℃下反应1小时，进行模板质粒的去除。将反应结束液用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega KK.)进行纯化，使用经纯化的PCR反应物对JM109进行转化。将得到的数千个菌落由平板进行回收，使用QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN公司)提取质粒DNA，作为变异基因文库。
(2)红球菌转化体的制作
将玫瑰色红球菌ATCC12674株的对数增殖期的细胞通过离心分离器进行集菌，在冰冷却过的无菌水中洗涤3次，悬浮于无菌水中。将上述(2)制备的质粒1μl和菌体悬浮液10μl混合，用冰冷却，向比色皿中加入质粒DNA和菌体的悬浮液，通过基因导入装置GenePulser II(BIO RAD)在2.0KV、200OHMS下进行电脉冲处理。
将加入了电脉冲处理液的比色皿在冰冷却下静置10分钟，37℃下进行10分钟热休克。之后，向比色皿中加入MYK培养基(0.5％聚蛋白胨、0.3％Bacto酵母提取物、0.3％Bacto麦芽浸膏提取物、0.2％K2HPO4、0.2％KH2PO4)500μl，30℃下静置5小时后，涂布至加入了50μg/ml卡那霉素的MYK琼脂培养基。将30℃下培养3天后的菌落作为转化体。同样地制作pER855A的转化体作为比较株。
(3)红球菌转化体的酰胺处理
为了进行筛选，使用上述(3)中得到的包含腈水合酶基因的红球菌转化体、和作为比较株的ATCC12674/pER855A。在各加入了GGPK培养基(1.5％葡萄糖、1％谷氨酸钠、0.1％酵母提取物、0.05％K2HPO4、0.05％KH2PO4、0.05％MgSO4·7H2O、1％CoCl2、0.1％尿素、50μg/ml卡那霉素、pH7.2)1ml的96孔深孔平板中分别接种上述菌株，30℃下进行3天液体培养。
接着，将得到的培养液30μl分注至96孔平板，通过离心分离去除培养基，最后，添加50％丙烯酰胺溶液40μl，将菌悬浮。将悬浮于高浓度丙烯酰胺溶液的转化体置于恒温箱中，50℃的温度下、进行30分钟加热处理，使作为比较的比较株完全地失活。残余腈水合酶活性按照下述的方法进行测定。
首先，将经过丙烯酰胺处理的转化体用50mM磷酸缓冲液(pH7.0)进行洗涤，按照以下的方法进行了活性测定。向试管中添加经洗涤的转化体和50mM磷酸缓冲液(pH7.0)，30℃下进行10分钟预孵育，添加等量的5％丙烯腈溶液(pH7.0)使之反应10分钟，添加1/10量的1M磷酸，从而使反应停止。接着，由停止的反应液通过离心分离去除转化体，稀释至适当的浓度，通过HPLC进行分析(WAKOSIL5C8(和光纯药公司)250mm、包含5mM磷酸的10％乙腈、流动相的流速1ml/min和紫外吸收检测器波长260nm)。需要说明的是，使用没有进行丙烯酰胺处理的各种无处理菌进行活性测定作为比较对照，将得到的活性值作为基准，求出丙烯酰胺处理后的残余活性。
从具有按照上述的方法导入了变异的腈水合酶基因的数百个转化体中，选拔出具有高浓度丙烯酰胺耐性的变异酶pFR005。
(4)碱基序列的确认
为了进行腈水合酶基因的碱基序列的确认，从得到的选拔株回收质粒。将红球菌转化体接种至10ml的MYK培养基(聚蛋白胨0.5％、Bacto酵母提取物0.3％、麦芽浸膏提取物0.3％、葡萄糖1％、卡那霉素50μg/ml)中。24小时培养后添加20％灭菌的甘氨酸溶液使其终浓度为2％，进一步进行24小时培养。之后，通过离心分离回收菌体，将菌体用TES(10mMTris-HCl(pH8)-10mM NaCl-1mM EDTA)缓冲液进行洗涤后，悬浮于2ml的50mM Tris-HCl(pH8)-12.5％蔗糖-100mM NaCl-1mg/ml溶菌酶，37℃下进行3小时振荡。向其中加入0.4ml的10％SDS，在室温下平稳地进行1小时振荡，进而，添加2.1ml的5M醋酸钠缓冲液(pH5.2)，在冰中静置1小时。之后，4℃下进行10，000×g、1小时离心，得到上清。向其中加入5倍量的乙醇，-20℃下静置30分钟后，进行10,000×g、20分钟离心。将沉淀物用10ml的70％乙醇进行洗涤后，溶解于100μl的TE缓冲液中，得到DNA溶液。
接着，将包含腈水合酶的序列用PCR法进行扩增。
＜PCR反应液组成＞
＜引物＞
NH-19GCCTCTAGATATCGCCATTCCGTTGCCGG(序列号65)
NH-20ACCCTGCAGGCTCGGCGCACCGGATGCCCAC(序列号66)
＜反应条件＞
(94℃下30秒、65℃下30秒、72℃下3分钟)×30循环
PCR结束后，将反应液5μl供于0.7％琼脂糖凝胶电泳，进行2.5kb的PCR扩增产物的检测。PCR反应液经过Exo-SAP处理(Amersham Pharmacia)后，通过循环测序法制备序列解析用样品，用Beckman CEQ-2000XL进行解析。其结果是，pFR005的变异位点确认为Nβ167S、Vβ219A、Sβ57M、Kβ114Y、Tβ107K、Pβ17G。即，pFR005为β亚基第17位的脯氨酸变异为甘氨酸，β亚基第57位的丝氨酸变异为赖氨酸，β亚基第107位的酪氨酸变异为赖氨酸，β亚基第114位的赖氨酸变异为酪氨酸，β亚基第167位的天冬酰胺变异为丝氨酸，β亚基第219位的缬氨酸变异为丙氨酸而成的。
实施例1
改良型腈水合酶的制作
使用制备例1中制作的pSJ034，进行氨基酸置换。PCR使用下述反应液组成、反应条件、引物而进行。
＜PCR反应液组成＞
＜PCR反应条件＞
(98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下90秒)×30循环
＜引物＞
[表5]
(表5)使用的引物
PCR结束后，将反应液5μl供于0.7％琼脂糖凝胶电泳，确认有11kb的扩增片段，将1μl的Dpn I(试剂盒附带的)添加至PCR反应液中使之在37℃下反应1小时，进行模板质粒的去除。将反应结束液用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega KK.)进行纯化，使用经纯化的PCR反应物对JM109进行转化。由得到的培养物，使用QIAprep SpinMiniprep Kit(QIAGEN公司)提取质粒DNA，使用自动测序仪CEQ8000(Beckman Coulter,Inc.)，确认腈水合酶的碱基序列。将得到的质粒如下进行命名。
[表6]
(表6)质粒的命名
质粒名 氨基酸置换
pSJ102 Wβ48C
pSJ103 Wβ48D
pSJ104 Wβ48E
pSJ107 Wβ48H
pSJ108 Wβ48I
pSJ109 Wβ48K
pSJ111 Wβ48M
pSJ112 Wβ48N
pSJ113 Wβ48P
pSJ114 Wβ48Q
pSJ116 Wβ48S
pSJ117 Wβ48T
实施例2
红球菌转化体的制作
将玫瑰色红球菌ATCC12674株的对数增殖期的细胞通过离心分离器进行集菌，在冰冷却过的无菌水中洗涤3次，悬浮于无菌水中。将实施例1中制备的质粒1μl和菌体悬浮液10μl进行混合，用冰冷却。向比色皿中加入DNA和菌体的悬浮液，通过基因导入装置GenePulser(BIORAD)在2.0kV、200OHMS下进行电脉冲处理。将电脉冲处理液在冰冷却下静置10分钟，37℃下进行10分钟热休克，加入MYK培养基(0.5％聚蛋白胨、0.3％Bacto酵母提取物、0.3％Bacto麦芽浸膏、0.2％K2HPO4、0.2％KH2PO4)500μl，在30℃静置5小时。之后，涂布至加入了50μg/ml卡那霉素的MYK琼脂培养基，30℃下培养3天。将30℃下培养3天后的菌落作为转化体。
将上述的工序中得到的各转化体分别接种于MYK培养基(50μg/ml卡那霉素)中，在30℃下进行2天振荡培养，在GGPK培养基(1.5％葡萄糖、1％谷氨酸钠、0.1％酵母提取物、0.05％K2HPO4、0.05％KH2PO4、0.05％Mg2O4·7H2O、1％CoCl2、0.1％尿素、50μg/ml卡那霉素、pH7.2)中接种1％。30℃下进行3天振荡培养，通过离心分离进行集菌。之后，用100mM磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤菌体，制备菌体悬浮液。
实施例3
改良型腈水合酶的活性
菌体悬浮液的腈水合酶活性的测定按照下述的方法进行。将菌体液0.2ml和50mM磷酸缓冲液(pH7.0)4.8ml进行混合，进一步，将包含5.0％(w/v)丙烯腈的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)5ml加入至混合液，10℃下边进行振荡边使之反应10分钟。接着，将菌体过滤，使用气相色谱将生成的丙烯酰胺的量进行定量。
＜分析条件＞
分析仪器：气相色谱仪GC-14B(岛津制作所制作)
检测器：FID(检测200℃)
柱：填充有Porapak PS(Nihon Waters K.K.制造柱填充剂)而成的1m玻璃柱
柱温度：190℃
由丙烯酰胺的量换算腈水合酶活性。此处，腈水合酶活性将1分钟内生成1μmol的丙烯酰胺的酶量定义为1U。酶活性以将导入了氨基酸置换的亲株设为1.0的相对活性形式示于表7中。
[表7]
(表7)催化活性测定结果
由以上的结果可知，将β亚基第48位的氨基酸置换为天冬氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸的改良型腈水合酶的催化活性提高。
实施例4
改良型腈水合酶的制作和评价
使用制备例2中制作的pFR005作为模板质粒，进行β亚基第48位的氨基酸置换。
即，使用实施例1所述的方法制作进行了氨基酸置换的改良型腈水合酶，用实施例2的方法得到转化体。进而，用与实施例3相同的方法检测催化活性。将结果示于表8中。
[表8]
(表8)催化活性测定结果
由以上的结果可知，序列号50所示的氨基酸序列中，将X4(相当于β亚基第48位的氨基酸)设为选自由半胱氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸所组成的组的氨基酸，由此对于导入变异的腈水合酶也具有同样的效果。
实施例5
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
将实施例2中制备的菌体悬浮液使用超声波破碎装置VP-300(TIETECHCo.,Ltd.日本)边冰冷却边进行10分钟破碎。接着，将菌体的粉碎溶液施加13500rpm、30分钟的离心分离，由上清得到无细胞提取液。对于得到的细胞提取液使用Bio-Rad蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度，与聚丙烯酰胺凝胶电泳用样品缓冲液(0.1M Tris-HCl(pH6.8)、4％w/v SDS、12％v/vβ巯基乙醇、20％v/v甘油、微量溴酚蓝)进行混合，煮沸5分钟而进行变性处理。制作10％聚丙烯酰胺凝胶，将变性处理过的样品以每1通道蛋白质量成为等量的方式进样，从而进行电泳分析(图4)。
结果，全部的样品中腈水合酶的条带强度没有差别，因此可知腈水合酶的表达量相同。由以上的结果可知，催化活性的提高是因为酶的比活提高。
实施例6
具有来源于玫瑰色红球菌M8株(以下，称为M8株)的腈水合酶的转化体的制作
(1)由M8株制备染色体DNA
M8株(SU1731814)可以由俄罗斯菌株中心IBFM(VKPM S-926)得到。将M8株在100ml的MYK(0.5％聚蛋白胨、0.3％Bacto酵母提取物、0.3％Bacto麦芽浸膏、0.2％K2HPO4、0.2％KH2PO4)培养基(pH7.0)中，30℃下进行72小时振荡培养。将培养液进行离心分离，将收集的菌体悬浮于Saline-EDTA溶液(0.1M EDTA、0.15M NaCl(pH8.0))4ml中。向悬浮液中加入溶菌酶8mg，37℃下进行1～2小时振荡后，-20℃下进行冻结。
接着，边平稳地振荡该悬浮液边向其中加入10ml的Tris-SDS液(1％SDS、0.1MNaCl、0.1M Tris-HCl(pH9.0))。进一步，向该悬浮液中加入蛋白酶K(Merck Japan公司)(终浓度0.1mg)，37℃下振荡1小时。接着，加入等量的TE饱和苯酚，搅拌后(TE：10mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH8.0))进行离心。提取上层，加入2倍量的乙醇，用玻璃棒卷取DNA。之后，将其依次用90％、80％、70％的乙醇进行离心分离而去除苯酚。
接着，将DNA溶解于3ml的TE缓冲液中，加入核糖核酸酶A溶液(100℃进行了15分钟的加热处理)以成为10μg/ml，37℃下振荡30分钟。进一步，加入蛋白酶K(Merck Japan公司)在37℃下振荡30分钟。向其中加入等量的TE饱和苯酚，离心分离后，分离成为上层和下层。
将上层进一步加入等量的TE饱和苯酚，离心分离后，分离成为上层和下层。再次重复该操作。之后，向上层中加入等量的氯仿(含有4％异戊醇)，进行离心分离，将上层回收。接着，向上层中加入2倍量的乙醇，用玻璃棒卷取DNA进行回收，得到染色体DNA。
(2)使用PCR由M8株染色体DNA制备改良型腈水合酶
来源于M8株的腈水合酶记载于非专利文献(Veiko，V.P.etal，Cloning，nucleotide sequence of nitrilehydratase gene from Rhodococcus rhodochrous M8，Biotekhnologiia(Mosc.)5，3-5(1995))中，将β亚基、α亚基、激活因子的序列分别示于序列号37，序列号38，序列号39。基于序列信息，合成序列表的序列号40和41记载的引物，将根据(1)制备的染色体DNA作为模板进行PCR。
＜PCR反应溶液组成＞
＜引物＞
M8-1：GGTCTAGAATGGATGGTATCCACGACACAGGC(序列号40)
M8-2：cccctgcaggtcagtcgatgatggccatcgattc(序列号41)
＜反应条件＞
(98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下30秒)×30循环
PCR结束后，将反应液5μl供于0.7％琼脂糖凝胶(使用同仁化学公司制造琼脂糖I；琼脂糖浓度0.7重量％)电泳，进行1.6kb的扩增片段的检测。将反应结束液使用Wizard SVGel and PCR Clean-Up System(Promega KK.)进行纯化。
将回收的PCR产物使用Ligation Kit(宝酒造)连接至载体(pUC118/HincII位点)，通过反应液转化大肠杆菌JM109的感受态细胞。由得到的转化体菌落将多个克隆接种至LB-Amp培养基1.5ml，37℃下进行12小时振荡培养。培养后，将该培养物通过离心分离进行集菌。通过使用QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN公司)，从收集的菌体提取质粒DNA。对于得到的质粒DNA，使用测序试剂盒和自动测序仪CEQ8000(Beckman Coulter,Inc.)，确认腈水合酶的碱基序列(序列号62)。
接着，将得到的质粒DNA用限制性内切酶XbaI和Sse8387I切断后，通过0.7％琼脂糖凝胶进行电泳，回收腈水合酶基因片段(1.6kb)，导入至质粒pSJ042的XbaI-Sse8387I位点。将得到的质粒命名为pSJ-N01A。需要说明的是，pSJ042为在红球菌中表达J1株腈水合酶的质粒，由日本特开2008-154552号公报(通过参照引入本说明书中)所示的方法而制作；pSJ042的制作中使用的pSJ023作为转化体ATCC12674/pSJ023(FERM BP-6232)于平成9(1997)年3月4日于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)进行了国际保藏。
实施例7
改良型腈水合酶的制作和评价
使用实施例6中得到的质粒pSJ-N01A，进行β亚基第48位的氨基酸置换。采用与实施例1相同的手法进行氨基酸置换，制作改良型腈水合酶。进一步，采用与实施例3相同的手法得到玫瑰色红球菌ATCC12674株的转化体及其菌体悬浮液，之后，采用与实施例4相同的方法测定催化活性。将结果示于表9中。
[表9]
(表9)催化活性测定结果
质粒名 氨基酸置换 催化活性(相对值)
pSJ-N01A 无(亲株) 1.0(比较例)
pSJR13 Wβ48M 2.4
pSJR21 Wβ48N 2.3
由表9的结果可知，将β亚基的第48位的氨基酸置换过的改良型腈水合酶，与实施例3同样地催化活性提高。
实施例8
改良型腈水合酶的制作
使用制备例1中制作的质粒pSJ034，进行氨基酸置换。PCR使用下述反应液组成、反应条件、表2所示的引物而进行。
＜PCR反应液组成＞
＜PCR反应条件＞
(98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下90秒)×30循环
＜引物＞
[表10]
PCR结束后，将反应液5μl供于0.7％琼脂糖凝胶电泳，确认11kb的扩增片段，将1μl的Dpn I(试剂盒附带的)添加至PCR反应液中使之在37℃下反应1小时，进行模板质粒的去除。将反应结束液用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega KK.)进行纯化，使用经纯化的PCR反应物对JM109进行转化。由得到的培养物，使用QIAprep Spin MiniprepKit(QIAGEN公司)提取质粒DNA，使用自动测序仪CEQ8000(Beckman Coulter，Inc.)，确认腈水合酶的碱基序列。将得到的质粒如表11进行命名。
[表11]
质粒名 氨基酸置换
pSJ120 Lβ37A
pSJ122 Lβ37D
pSJ124 Lβ37F
pSJ127 Lβ37I
pSJ129 Lβ37L
pSJ130 Lβ37M
pSJ136 Lβ37T
pSJ137 Lβ37V
实施例9
红球菌转化体的制作
将玫瑰色红球菌ATCC12674株的对数增殖期的细胞通过离心分离器进行集菌，在冰冷却过的无菌水中洗涤3次，悬浮于无菌水中。将实施例1中制备的质粒1μl和菌体悬浮液10μl进行混合，用冰冷却。向比色皿中加入DNA和菌体的悬浮液，通过基因导入装置GenePulser(BIORAD)在2.0kV、200OHMS下进行电脉冲处理。将电脉冲处理液在冰冷却下静置10分钟，37℃下进行10分钟热休克，加入MYK培养基(0.5％聚蛋白胨、0.3％Bacto酵母提取物、0.3％Bacto麦芽浸膏、0.2％K2HPO4、0.2％KH2PO4)500μl，在30℃下静置5小时。之后，涂布至加入了50μg/ml卡那霉素的MYK琼脂培养基，30℃下培养3天。将30℃下培养3天后的菌落作为转化体。
将上述的工序中得到的各转化体分别接种于MYK培养基(50μg/ml卡那霉素)中，在30℃下进行2天振荡培养，在GGPK培养基(1.5％葡萄糖、1％谷氨酸钠、0.1％酵母提取物、0.05％K2HPO4、0.05％KH2PO4、0.05％Mg2O4·7H2O、1％CoCl2、0.1％尿素、50μg/ml卡那霉素、pH7.2)中接种1％。30℃下进行3天振荡培养，通过离心分离进行集菌。之后，用100mM磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤菌体，制备菌体悬浮液。
实施例10
改良型腈水合酶的活性
菌体悬浮液的腈水合酶活性的测定按照下述的方法进行。
将菌体液0.2ml和50mM磷酸缓冲液(pH7.0)4.8ml进行混合，进一步，将包含5.0％(w/v)丙烯腈的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)5ml加入至混合液，10℃下边进行振荡边使之反应10分钟。接着，将菌体过滤，使用气相色谱将生成的丙烯酰胺的量进行定量。
＜分析条件＞
分析仪器：气相色谱仪GC-14B(岛津制作所制作)
检测器：FID(检测200℃)
柱：填充有Porapak PS(Nihon Waters K.K.制造柱填充剂)而成的1m玻璃柱
柱温度：190℃
由丙烯酰胺的量换算腈水合酶活性。此处，腈水合酶活性将1分钟内生成1μmol的丙烯酰胺的酶量定义为1U。酶活性以将没有导入氨基酸置换的亲株设为1.0的相对活性形式示于表12中。
[表12]
由以上的结果可知，将β亚基第37位的氨基酸置换为选自由丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸所组成的组的氨基酸而成的酶，催化活性提高。
实施例11
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
将实施例2中制备的菌体悬浮液使用超声波破碎装置VP-300(TIETECH Co.,Ltd.日本)边冰冷却边进行10分钟破碎。接着，将菌体的粉碎溶液施加13500rpm、30分钟的离心分离，由上清得到无细胞提取液。对于得到的细胞提取液使用Bio-Rad蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度，与聚丙烯酰胺凝胶电泳用样品缓冲液(0.1M Tris-HCl(pH6.8)、4％w/v SDS、12％v/vβ巯基乙醇、20％v/v甘油、微量溴酚蓝)进行混合，煮沸5分钟而进行变性处理。制作10％聚丙烯酰胺凝胶，将变性处理过的样品以每1通道蛋白质量成为等量的方式进样，从而进行电泳分析。
结果，全部的样品中腈水合酶的条带强度没有差别，因此可知腈水合酶的表达量相同。由以上的结果可知，催化活性的提高在于酶的比活提高。
实施例12
改良型腈水合酶的制作和评价
使用下述的pFR005作为模板质粒，进行β亚基第37位的氨基酸置换。
即，采用实施例1所述的方法制作氨基酸置换过的改良型腈水合酶，采用实施例2的方法得到玫瑰色红球菌ATCC12674株的转化体及其菌体悬浮液。进而，用与实施例3相同的方法进行活性测定。将结果示于表13中。
[表13]
由以上的结果可知，本发明的氨基酸置换不仅对于野生型腈水合酶，对于导入了变异的腈水合酶也具有同样的效果。
实施例13
改良型腈水合酶的制作
使用制备例1中制作的质粒pSJ034，进行氨基酸置换。PCR使用下述反应液组成、反应条件、表2所示的引物而进行。
＜PCR反应液组成＞
＜PCR反应条件＞
(98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下90秒)×30循环
＜引物＞
[表14]
PCR结束后，将反应液5ul供于0.7％琼脂糖凝胶电泳，确认11kb的扩增片段，将1μl的Dpn I(试剂盒附带的)添加至PCR反应液中使之在37℃下反应1小时，进行模板质粒的去除。将反应结束液用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega KK.)进行纯化，使用经纯化的PCR反应物对JM109进行转化。从得到的培养物中，使用QIAprep SpinMiniprep Kit(QIAGEN公司)提取质粒DNA，使用自动测序仪CEQ8000(Beckman Coulter，Inc.)，确认腈水合酶的碱基序列。将得到的质粒如表15进行命名。
[表15]
质粒名 氨基酸置换
pSJ127 Qα83A
pSJ152 Qα83C
pSJ153 Qα83D
pSJ154 Qα83E
pSJ155 Qα83F
pSJ156 Qα83G
pSJ157 Qα83H
pSJ130 Qα83M
pSJ132 Qα83N
pSJ159 Qα83P
pSJ161 Qα83S
pSJ162 Qα83T
实施例14
红球菌转化体的制作
将玫瑰色红球菌ATCC12674株的对数增殖期的细胞通过离心分离器进行集菌，在冰冷却过的无菌水中洗涤3次，悬浮于无菌水中。将实施例1中制备的质粒1ul和菌体悬浮液10μl进行混合，用冰冷却。向比色皿中加入DNA和菌体的悬浮液，通过基因导入装置GenePulser(BIO RAD)在2.0kV、200OHMS下进行电脉冲处理。将电脉冲处理液在冰冷却下静置10分钟，37℃下进行10分钟热休克，加入MYK培养基(0.5％聚蛋白胨、0.3％Bacto酵母提取物、0.3％Bacto麦芽浸膏、0.2％K2HPO4、0.2％KH2PO4)500μl，在30℃静置5小时。之后，涂布至加入了50μg/ml卡那霉素的MYK琼脂培养基，30℃下培养3天。将30℃下培养3天后的菌落作为转化体。
将上述的工序中得到的各转化体分别接种于MYK培养基(50μg/ml卡那霉素)中，在30℃下进行2天振荡培养，在GGPK培养基(1.5％葡萄糖、1％谷氨酸钠、0.1％酵母提取物、0.05％K2HPO4、0.05％KH2PO4、0.05％Mg2O4·7H2O、1％CoCl2、0.1％尿素、50μg/ml卡那霉素、pH7.2)中接种1％。30℃下进行3天振荡培养，通过离心分离进行集菌。之后，用100mM磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤菌体，制备菌体悬浮液。
实施例15
改良型腈水合酶的活性
菌体悬浮液的腈水合酶活性的测定按照下述的方法进行。
将菌体液0.2ml和50mM磷酸缓冲液(pH7.0)4.8ml进行混合，进一步，将包含5.0％(w/v)丙烯腈的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)5ml加入至混合液，10℃下边进行振荡边使之反应10分钟。接着，将菌体过滤，使用气相色谱将生成的丙烯酰胺的量进行定量。
＜分析条件＞
分析仪器：气相色谱仪GC-14B(岛津制作所制作)
检测器：FID(检测200℃)
柱：填充有Porapak PS(Nihon Waters K.K.制造柱填充剂)而成的1m玻璃柱
柱温度：190℃
由丙烯酰胺的量换算腈水合酶活性。此处，腈水合酶活性将1分钟内生成1μmol的丙烯酰胺的酶量定义为1U。酶活性以将没有导入氨基酸置换的亲株设为1.0的相对活性形式示于表16中。
[表16]
质粒名 氨基酸置换 催化活性(相对值)
pSJ034 无(亲株) 1.0(比较例)
pSJ127 Qα83A 5.3
pSJ152 Qα83C 3.7
pSJ153 Qα83D 1.9
pSJ154 Qα83E 1.2
pSJ155 Qα83F 1.8
pSJ156 Qα83G 4.4
pSJ157 Qα83H 1.9
pSJ130 Qα83M 2.3
pSJ132 Qα83N 5.7
pSJ159 Qα83P 1.5
pSJ161 Qα83S 5.8
pSJ162 Qα83T 3.8
由以上的结果可知，将α亚基第83位的氨基酸置换为选自由丙氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺组成的组的氨基酸而成的酶，催化活性提高。
实施例16
改良型腈水合酶的制作和评价
使用下述的pFR005作为模板质粒，进行α亚基第83位的氨基酸置换。
即，采用实施例1所述的方法制作氨基酸置换过的改良型腈水合酶，采用实施例2的方法得到玫瑰色红球菌ATCC12674株的转化体及其菌体悬浮液。进而，用与实施例3相同的方法进行活性测定。将结果示于表17中。
[表17]
由以上的结果可知，本发明的氨基酸置换不仅对于腈水合酶，对于导入了变异的腈水合酶也具有同样的效果。
实施例17
具有来源于玫瑰色红球菌M8株(以下，称为M8株)的腈水合酶的转化体的制作
(1)由M8株制备染色体DNA
M8株(SU1731814)可以由俄罗斯菌株中心IBFM(VKPM S-926)得到。将M8株在100ml的MYK(0.5％聚蛋白胨、0.3％Bacto酵母提取物、0.3％Bacto麦芽浸膏、0.2％K2HPO4、0.2％KH2PO4)培养基(pH7.0)中，30℃下进行72小时振荡培养。将培养液进行离心分离，将收集的菌体悬浮于Saline-EDTA溶液(0.1M EDTA、0.15M NaCl(pH8.0))4ml中。向悬浮液中加入溶菌酶8mg，37℃下进行1～2小时振荡后，-20℃下进行冻结。
接着，边平稳地振荡该悬浮液边向其中加入10ml的Tris-SDS液(1％SDS、0.1MNaCl、0.1M Tris-HCl(pH9.0))。进一步，向该悬浮液中加入蛋白酶K(Merck Japan公司)(终浓度0.1mg)，37℃下振荡1小时。接着，加入等量的TE饱和苯酚，搅拌后(TE：10mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH8.0))进行离心。提取上层，加入2倍量的乙醇，用玻璃棒卷取DNA。之后，将其依次用90％、80％、70％的乙醇进行离心分离而去除苯酚。
接着，将DNA溶解于3ml的TE缓冲液中，加入核糖核酸酶A溶液(100℃进行了15分钟的加热处理)以成为10μg/ml，37℃下振荡30分钟。进一步，加入蛋白酶K(Merck Japan公司)在37℃下振荡30分钟。向其中加入等量的TE饱和苯酚，离心分离后，分离成为上层和下层。
将上层进一步加入等量的TE饱和苯酚，离心分离后，分离成为上层和下层。再次重复该操作。之后，向上层中加入等量的氯仿(含有4％异戊醇)，进行离心分离，将上层回收。接着，向上层中加入2倍量的乙醇，用玻璃棒卷取DNA进行回收，得到染色体DNA。
(2)使用PCR由M8株染色体DNA制备腈水合酶基因
来源于M8株的腈水合酶记载于非专利文献(Veiko，V.P.etal，Cloning，nucleotide sequence of nitrile hydratase gene from Rhodococcus rhodochrousM8，Biotekhnologiia(Mosc.)5，3-5(1995))，将β亚基、α亚基的序列分别示于序列号17、序列号18。基于序列信息，合成序列表的序列号115和116记载的引物，将根据(1)制备的染色体DNA作为模板进行PCR。
＜PCR反应溶液组成＞
＜引物＞
M8-1：GGTCTAGAATGGATGGTATCCACGACACAGGC(序列号115)
M8-2：CCCCTGCAGGTCAGTCGATGATGGCCATCGATTC(序列号116)
＜反应条件＞
(98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下30秒)×30循环
PCR结束后，将反应液5μl供于0.7％琼脂糖凝胶(使用同仁化学公司制造琼脂糖I；琼脂糖浓度0.7重量％)电泳，进行1.6kb的扩增片段的检测。将反应结束液使用Wizard SVGel and PCR Clean-Up System(Promega KK.)进行纯化。
将回收的PCR产物使用Ligation Kit(宝酒造)连接至载体(pUC118/HincII位点)，通过反应液转化大肠杆菌JM109的感受态细胞。由得到的转化体菌落将多个克隆接种至LB-Amp培养基1.5ml，37℃下进行12小时振荡培养。培养后，将该培养物通过离心分离进行集菌。通过使用QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN公司)，从收集的菌体中提取质粒DNA。对于得到的质粒DNA，使用测序试剂盒和自动测序仪CEQ8000(Beckman Coulter,Inc.)，确认腈水合酶的碱基序列。
接着，将得到的质粒DNA用限制性内切酶XbaI和Sse8387I切断后，通过0.7％琼脂糖凝胶进行电泳，回收腈水合酶基因片段(1.6kb)，导入至质粒pSJ042的XbaI-Sse8387I位点。将得到的质粒命名为pSJ-N01A。需要说明的是，pSJ042为在红球菌中表达J1株腈水合酶的质粒，由日本特开2008-154552号公报所示的方法制作，pSJ042的制作中使用的pSJ023作为转化体ATCC12674/pSJ023(FERM BP-6232)于平成9(1997)年3月4日于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)进行了国际保藏。
实施例18
改良型腈水合酶的制作和评价
使用实施例5中得到的质粒pSJ-N01A，进行α亚基第83位的氨基酸置换。采用与实施例1相同的手法进行氨基酸置换，制作改良型腈水合酶。进一步，采用与实施例2相同的手法得到玫瑰色红球菌ATCC12674株的转化体及其菌体悬浮液，之后，采用与实施例4相同的方法进行活性测定。将结果示于表18中。
[表18]
质粒名 氨基酸置换 催化活性(相对值)
pSJ-N01A 无(亲株) 1.0(比较例)
pSJR17 Qα83M 6.9
由以上的结果可知，将α亚基的第83位进行氨基酸置换成为甲硫氨酸的pSJR17，与实施例4同样地催化活性提高。
实施例19
改良型腈水合酶的制作
使用制备例1中制作的质粒pSJ034，进行氨基酸置换。PCR使用下述反应液组成、反应条件、表2所示的引物而进行。
＜PCR反应液组成＞
＜PCR反应条件＞
(98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下90秒)×30循环
＜引物＞
α82的饱和变异引物
α82RM-F ATGCCGGTNNSCAGGCACACCAAATTT(序列号129)
α82RM-R TGTGCCTGSNNACCGGCATAGCCCAAT(序列号130)
PCR结束后，将反应液5μl供于0.7％琼脂糖凝胶电泳，确认11kb的扩增片段，将1μl的Dpn I(试剂盒附带的)添加至PCR反应液中使之在37℃下反应1小时，进行模板质粒的去除。将反应结束液用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega KK.)进行纯化，使用经纯化的PCR反应物对JM109进行转化。从得到的培养物中，使用QIAprep SpinMiniprep Kit(QIAGEN公司)提取质粒DNA，使用自动测序仪CEQ8000(Beckman Coulter，Inc.)，确认腈水合酶的碱基序列。将得到的质粒如表19进行命名。
[表19]
质粒名 氨基酸置换
pSJ173 Eα82C
pSJ174 Eα82F
pSJ175 Eα82H
pSJ176 Eα82I
pSJ177 Eα82K
pSJ178 Eα82M
pSJ179 Eα82Q
pSJ180 Eα82R
pSJ181 Eα82T
pSJ182 Eα82Y
实施例20
红球菌转化体的制作
将玫瑰色红球菌ATCC12674株的对数增殖期的细胞通过离心分离器进行集菌，在冰冷却过的无菌水中洗涤3次，悬浮于无菌水中。将实施例2中制备的质粒1μl和菌体悬浮液10μl进行混合，用冰冷却。向比色皿中加入DNA和菌体的悬浮液，通过基因导入装置GenePulser(BIORAD)在2.0kV、200OHMS下进行电脉冲处理。将电脉冲处理液在冰冷却下静置10分钟，37℃下进行10分钟热休克，加入MYK培养基(0.5％聚蛋白胨、0.3％Bacto酵母提取物、0.3％Bacto麦芽浸膏、0.2％K2HPO4、0.2％KH2PO4)500μl，在30℃静置5小时。之后，涂布至加入了50μg/ml卡那霉素的MYK琼脂培养基，30℃下培养3天。将30℃下培养3天后的菌落作为转化体。
将上述的工序中得到的各转化体分别接种于MYK培养基(50μg/ml卡那霉素)中，在30℃下进行2天振荡培养，在GGPK培养基(1.5％葡萄糖、1％谷氨酸钠、0.1％酵母提取物、0.05％K2HPO4、0.05％KH2PO4、0.05％Mg2O4·7H2O、1％CoCl2、0.1％尿素、50μg/ml卡那霉素、pH7.2)中接种1％。30℃下进行3天振荡培养，通过离心分离进行集菌。之后，用100mM磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤菌体，制备菌体悬浮液。
实施例21
改良型腈水合酶的活性
菌体悬浮液的腈水合酶活性的测定按照下述的方法进行。
将菌体液0.2ml和50mM磷酸缓冲液(pH7.0)4.8ml进行混合，进一步，将包含5.0％(w/v)丙烯腈的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)5ml加入至混合液，10℃下边进行振荡边使之反应10分钟。接着，将菌体过滤，使用气相色谱将生成的丙烯酰胺的量进行定量。
＜分析条件＞
分析仪器：气相色谱仪GC2014(岛津制作所制作)
检测器：FID(检测200℃)
柱：填充有Porapak PS(Nihon Waters K.K.制造柱填充剂)而成的1m玻璃柱
柱温度：190℃
由丙烯酰胺的量换算腈水合酶活性。此处，腈水合酶活性将1分钟内生成1μmol的丙烯酰胺的酶量定义为1U。酶活性以将没有导入氨基酸置换的亲株设为1.0的相对活性形式示于表20中。
[表20]
质粒名 氨基酸置换 催化活性(相对值)
pSJ042 无(亲株) 1.0(比较例)
pSJ173 Eα82C 2.6
pSJ174 Eα82F 4.3
pSJ175 Eα82H 1.3
pSJ176 Eα82I 3.6
pSJ177 Eα82K 4.2
pSJ178 Eα82M 3.6
pSJ179 Eα82Q 2.3
pSJ180 Eα82R 4.2
pSJ181 Eα82T 1.2
pSJ182 Eα82Y 2.1
由以上的结果可知，将α亚基第82位的氨基酸置换为选自由半胱氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸组成的组的氨基酸而成的酶，催化活性提高。
实施例22
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
将实施例3中制备的菌体悬浮液使用超声波破碎装置VP-300(TIETECH Co.，Ltd.日本)边冰冷却边进行10分钟破碎。接着，将菌体的粉碎溶液施加13500rpm、30分钟的离心分离，由上清得到无细胞提取液。对于得到的细胞提取液使用Bio-Rad蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度，与聚丙烯酰胺凝胶电泳用样品缓冲液(0.1M Tris-HC1(pH6.8)、4％w/v SDS、12％v/vβ巯基乙醇、20％v/v甘油、微量溴酚蓝)进行混合，煮沸5分钟而进行变性处理。制作10％聚丙烯酰胺凝胶，将变性处理过的样品以每1通道蛋白质量成为等量的方式进样，从而进行电泳分析。
结果，全部的样品中腈水合酶的条带强度没有差别，因此可知腈水合酶的表达量相同。由以上的结果可知，催化活性的提高在于酶的比活提高。
实施例23
改良型腈水合酶的制作
使用制备例1中制作的质粒pSJ034，进行氨基酸置换。PCR使用下述反应液组成、反应条件、表2所示的引物而进行。
＜PCR反应液组成＞
＜PCR反应条件＞
(98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下90秒)×30循环
＜引物＞
α85的饱和变异引物
α85RM-F：CAGGCANNSCAAATTTCGGCGGTCTTC(序列号133)
α85RM-R：AATTTGSNNTGCCTGCTCACCGGCATA(序列号134)
PCR结束后，将反应液5μl供于0.7％琼脂糖凝胶电泳，确认11kb的扩增片段，将1μl的Dpn I(试剂盒附带的)添加至PCR反应液中使之在37℃下反应1小时，进行模板质粒的去除。将反应结束液用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega KK.)进行纯化，使用经纯化的PCR反应物对JM109进行转化。由得到的培养物，使用QIAprep Spin MiniprepKit(QIAGEN公司)提取质粒DNA，使用自动测序仪CEQ8000(Beckman Coulter,Inc.)，确认腈水合酶的碱基序列。将得到的质粒如表21进行命名。
[表21]
质粒名 氨基酸置换
pSJ165 Hα85C
pSJ166 Hα85E
pSJ167 Hα85F
pSJ168 Hα85I
pSJ169 Hα85N
pSJ170 Hα85Q
pSJ171 Hα85S
pSJ172 Hα85Y
实施例24
红球菌转化体的制作
将玫瑰色红球菌ATCC12674株的对数增殖期的细胞通过离心分离器进行集菌，在冰冷却过的无菌水中洗涤3次，悬浮于无菌水中。将实施例2中制备的质粒1μl和菌体悬浮液10μl进行混合，用冰冷却。向比色皿中加入DNA和菌体的悬浮液，通过基因导入装置GenePulser(BIORAD)在2.0kV、200OHMS下进行电脉冲处理。将电脉冲处理液在冰冷却下静置10分钟，37℃下进行10分钟热休克，加入MYK培养基(0.5％聚蛋白胨、0.3％Bacto酵母提取物、0.3％Bacto麦芽浸膏、0.2％K2HPO4、0.2％KH2PO4)500μl，在30℃下静置5小时。之后，涂布至加入了50μg/ml卡那霉素的MYK琼脂培养基，30℃下培养3天。将30℃下培养3天后的菌落作为转化体。
将上述的工序中得到的各转化体分别接种于MYK培养基(50μg/ml卡那霉素)中，在30℃下进行2天振荡培养，在GGPK培养基(1.5％葡萄糖、1％谷氨酸钠、0.1％酵母提取物、0.05％K2HPO4、0.05％KH2PO4、0.05％Mg2O4·7H2O、1％CoCl2、0.1％尿素、50μg/ml卡那霉素、pH7.2)中接种1％。30℃下进行3天振荡培养，通过离心分离进行集菌。之后，用100mM磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤菌体，制备菌体悬浮液。
实施例25
改良型腈水合酶的活性
菌体悬浮液的腈水合酶活性的测定按照下述的方法进行。
将菌体液0.2ml和50mM磷酸缓冲液(pH7.0)4.8ml进行混合，进一步，将包含5.0％(w/v)丙烯腈的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)5ml加入至混合液，10℃下边进行振荡边使之反应10分钟。接着，将菌体过滤，使用气相色谱将生成的丙烯酰胺的量进行定量。
＜分析条件＞
分析仪器：气相色谱仪GC2014(岛沣制作所制作)
检测器：FID(检测200℃)
柱：填充有Porapak PS(Nihon Waters K.K.制造柱填充剂)而成的1m玻璃柱
柱温度：190℃
由丙烯酰胺的量换算腈水合酶活性。此处，腈水合酶活性将1分钟内生成1μmol的丙烯酰胺的酶量定义为1U。酶活性以将没有导入氨基酸置换的亲株设为1.0的相对活性形式示于表22中。
[表22]
质粒名 氨基酸置换 催化活性(相对值)
pSJ042 无(亲株) 1.0(比较例)
pSJ165 Hα85C 1.5
pSJ166 Hα85E 1.9
pSJ167 Hα85F 1.8
pSJ168 Hα85I 2.1
pSJ169 Hα85N 2.3
pSJ170 Hα85Q 2.1
pSJ171 Hα85S 2.5
pSJ172 Hα85Y 1.5
由以上的结果可知，将α亚基第85位的氨基酸置换为选自由半胱氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、酪氨酸所组成的组的氨基酸而成的酶，催化活性提高。
实施例26
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
将实施例3中制备的菌体悬浮液使用超声波破碎装置VP-300(TIETECH Co.,Ltd.日本)边冰冷却边进行10分钟破碎。接着，将菌体的粉碎溶液施加13500rpm、30分钟的离心分离，由上清得到无细胞提取液。对于得到的细胞提取液使用Bio-Rad蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度，与聚丙烯酰胺凝胶电泳用样品缓冲液(0.1M Tris-HCl(pH6.8)、4％w/v SDS、12％v/vβ巯基乙醇、20％v/v甘油、微量溴酚蓝)进行混合，煮沸5分钟而进行变性处理。制作10％聚丙烯酰胺凝胶，将变性处理过的样品以每1通道蛋白质量成为等量的方式进样，从而进行电泳分析。
结果，全部的样品中腈水合酶的条带强度没有差别，因此可知腈水合酶的表达量相同。由以上的结果可知，催化活性的提高在于酶的比活提高。
产业上的可利用性
本发明能够提供催化活性提高了的新型的改良型(变异型)腈水合酶。催化活性提高的改良型腈水合酶在酰胺化合物的制造上是非常有用的。
本发明进一步能够提供编码上述改良型腈水合酶的DNA、包含该DNA的重组载体、包含该重组载体的转化体、从该转化体的培养物中提取的腈水合酶及其制造、以及使用了前述蛋白质(改良型腈水合酶)或者使用了该培养物或该培养物的处理物的酰胺化合物的制造方法。
本发明能够提供催化活性提高了的新型的改良型(变异型)腈水合酶。催化活性提高的改良型腈水合酶在酰胺化合物的制造上是非常有用的。
本发明进一步能够提供编码上述改良型腈水合酶的基因DNA、包含该基因DNA的重组载体、包含该重组载体的转化体、从该转化体的培养物中提取的腈水合酶及其制造、以及使用了前述蛋白质(改良型腈水合酶)或者使用了该培养物或该培养物的处理物的酰胺化合物的制造方法。
保藏号
玫瑰色红球菌J1株以FERM BP-1478于昭和62(1987)年9月18日于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)进行了国际保藏。
pSJ023为转化体“R.rhodochrous ATCC12674/pSJ023”，以保藏号FERMBP-6232于平成9(1997)年3月4日于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)进行了国际保藏。
[序列表的说明]
序列号1：来源于玫瑰色红球菌J1(FERM BP-1478)的β亚基的碱基序列。
序列号2：来源于玫瑰色红球菌J1(FERM BP-1478)的β亚基的氨基酸序列。
序列号3：来源于玫瑰色红球菌J1(FERM BP-1478)的α亚基的碱基序列。
序列号4：来源于玫瑰色红球菌J1(FERM BP-1478)的α亚基的氨基酸序列。
序列号5：玫瑰色红球菌M8(SU1731814)的β亚基的氨基酸序列。
序列号6：赤红球菌TH的β亚基的氨基酸序列。
序列号7：嗜吡啶红球菌MW33(VKM Ac-1515D)的β亚基的氨基酸序列。
序列号8：嗜吡啶红球菌S85-2的β亚基的氨基酸序列。
序列号9：嗜吡啶红球菌MS-38的β亚基的氨基酸序列。
序列号10：诺卡氏菌属JBRs的β亚基的氨基酸序列。
序列号11：诺卡氏菌属YS-2002的β亚基的氨基酸序列。
序列号12：玫瑰色红球菌ATCC39384的β亚基的氨基酸序列。
序列号13：β48C-F引物。
序列号14：β48C-R引物。
序列号15：β48D-F引物。
序列号16：β48D-R引物。
序列号17：β48E-F引物。
序列号18：β48E-R引物。
序列号19：β48H-F引物。
序列号20：β48H-R引物。
序列号21：β48I-F引物。
序列号22：β48I-R引物。
序列号23：β48K-F引物。
序列号24：β48K-R引物。
序列号25：β48M-F引物。
序列号26：β48M-R引物。
序列号27：β48N-F引物。
序列号28：β48N-R引物。
序列号29：β48P-F引物。
序列号30：β48P-R引物。
序列号31：β48Q-F引物。
序列号32：β48Q-R引物。
序列号33：β48S-F引物。
序列号34：β48S-R引物。
序列号35：β48T-F引物。
序列号36：β48T-R引物。
序列号37：来源于M8株的腈水合酶β亚基的氨基酸序列。
序列号38：来源于M8株的腈水合酶α亚基的氨基酸序列。
序列号39：来源于M8株的腈水合酶的激活因子的氨基酸序列。
序列号40：M8-1的引物。
序列号41：M8-2的引物。
序列号42：不可培养细菌SP1的β亚基的氨基酸序列。
序列号43：不可培养细菌BD2的β亚基的氨基酸序列。
序列号44：睾丸酮丛毛单胞菌的β亚基的氨基酸序列。
序列号45：热葡糖苷地芽孢杆菌Q6的β亚基的氨基酸序列。
序列号46：嗜热假诺卡氏菌JCM3095的β亚基的氨基酸序列。
序列号47：玫瑰色红球菌Cr4的β亚基的氨基酸序列。
序列号48：铁型腈水合酶的α亚基的半胱氨酸簇的氨基酸序列。
序列号49：钴型腈水合酶的α亚基的半胱氨酸簇的氨基酸序列。
序列号50：本发明中使用的特定的氨基酸序列。
序列号51：本发明的β亚基的氨基酸序列。
序列号52：赤红球菌RH(CN101463358)的β亚基的氨基酸序列。
序列号53：腈水合酶J1D的碱基序列。
序列号54：腈水合酶203的碱基序列。
序列号55：腈水合酶414的碱基序列。
序列号56：腈水合酶855的碱基序列。
序列号57：腈水合酶D2的α亚基的碱基序列
序列号58：腈水合酶005的碱基序列。
序列号59：腈水合酶108A的碱基序列。
序列号60：腈水合酶211的碱基序列。
序列号61：腈水合酶306A的碱基序列。
序列号62：玫瑰色红球菌M8的两末端包含引物序列的PCR片段的碱基序列。
序列号63：β17RM-F引物。
序列号64：β17RM-R引物。
序列号65：NH-19引物。
序列号66：NH-20引物。
序列号67：β37A-F引物。
序列号68：β37A-R引物。
序列号69：β37D-F引物。
序列号70：β37D-R引物。
序列号71：β37F-F引物。
序列号72：β37F-R引物。
序列号73：β37I-F引物。
序列号74：β37I-R引物。
序列号75：β37M-F引物。
序列号76：β37M-R引物。
序列号77：β37T-F引物。
序列号78：β37T-R引物。
序列号79：β37V-F引物。
序列号80：β37V-R引物。
序列号81：本发明中使用的特定的氨基酸序列。
序列号82：本发明的β亚基的氨基酸序列。
序列号83：α83A-F引物。
序列号84：α83A-R引物。
序列号85：α83C-F引物。
序列号86：α83C-R引物。
序列号87：α83D-F引物。
序列号88：α83D-R引物。
序列号89：α83E-F引物。
序列号90：α83E-R引物。
序列号91：α83F-F引物。
序列号92：α83F-R引物。
序列号93：α83G-F引物。
序列号94：α83G-R引物。
序列号95：α83H-F引物。
序列号96：α83H-R引物。
序列号97：α83M-F引物。
序列号98：α83M-R引物。
序列号99：α83P-F引物。
序列号100：α83P-R引物。
序列号101：α83S-F引物。
序列号102：α83S-R引物。
序列号103：α83T-F引物。
序列号104：α83T-R引物。
序列号105：玫瑰色红球菌M8(SU1731814)的α亚基的氨基酸序列。
序列号106：赤红球菌TH的α亚基的氨基酸序列。
序列号107：嗜吡啶红球菌MW33(VKM Ac-1515D)的α亚基的氨基酸序列。
序列号108：嗜吡啶红球菌S85-2的α亚基的氨基酸序列。
序列号109：诺卡氏菌属JBRs的α亚基的氨基酸序列。
序列号110：诺卡氏菌属YS-2002的α亚基的氨基酸序列。
序列号111：不可培养细菌BD2的α亚基的氨基酸序列。
序列号112：不可培养细菌SP1的α亚基的氨基酸序列。
序列号113：嗜热假诺卡氏菌JCM3095的α亚基的氨基酸序列。
序列号114：玫瑰色红球菌Cr4的α亚基的氨基酸序列。
序列号115：M8-1引物。
序列号116：M8-2引物。
序列号117：铁型腈水合酶的α亚基的半胱氨酸簇的氨基酸序列。
序列号118：钴型腈水合酶的α亚基的半胱氨酸簇的氨基酸序列。
序列号119：本发明中使用的特定的氨基酸序列。
序列号120：本发明的α亚基的氨基酸序列。
序列号121：嗜吡啶红球菌MS-38的α亚基的氨基酸序列。
序列号122：玫瑰色红球菌ATCC39384的α亚基的氨基酸序列。
序列号123：中华根瘤菌WSM419的α亚基的氨基酸序列。
序列号124：热葡糖苷酶地芽孢杆菌Q6的α亚基的氨基酸序列。
序列号125：睾丸酮丛毛单胞菌的α亚基的氨基酸序列。
序列号126：赤红球菌RH(CN101463358)的α亚基的氨基酸序列。
序列号127：α83N-F引物。
序列号128：α83N-R引物。
序列号129：α82RM-F引物。
序列号130：α82RM-R引物。
序列号131：本发明的α亚基的氨基酸序列。
序列号132：本发明中使用的特定的氨基酸序列。
序列号133：α85RM-F引物。
序列号134：α85RM-R引物。
序列号135：本发明的α亚基的氨基酸序列。
序列号136：本发明中使用的特定的氨基酸序列。

Claims (8)

1.一种改良型腈水合酶，其选自下述中的至少一种：
(a1)一种改良型腈水合酶，其特征在于，其为由序列号4及序列号2的氨基酸组成的腈水合酶，α亚基由序列号4所示的氨基酸序列组成，β亚基由序列号2所示的氨基酸序列从N末端开始数第37位的氨基酸为选自由丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸所组成的组的氨基酸序列组成；
(a2)一种改良型腈水合酶，其特征在于，α亚基由序列号4所示的氨基酸序列组成，β亚基由序列号2所示的氨基酸序列的从N末端开始数第17位的脯氨酸变为甘氨酸、第57位的丝氨酸变为甲硫氨酸，第107位的酪氨酸变为赖氨酸、114位的赖氨酸变为酪氨酸、167位的天冬酰胺变为丝氨酸，第219位的缬氨酸变为丙氨酸，序列号2的从N末端开始数第37位的亮氨酸被丙氨酸或天冬氨酸置换的氨基酸序列组成；
(b1)一种改良型腈水合酶，其特征在于，其为由序列号4及序列号2的氨基酸组成的腈水合酶，α亚基由序列号4所示的氨基酸序列组成，β亚基由序列号4所示的氨基酸序列从N末端开始数第83位的氨基酸为选自由丙氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、甲硫氨酸和天冬酰胺组成的组的氨基酸序列组成；
(b2)一种改良型腈水合酶，其特征在于，α亚基由序列号4所示的氨基酸序列组成，β亚基由序列号2所示的氨基酸序列的从N末端开始数第17位的脯氨酸变为甘氨酸、第57位的丝氨酸变为甲硫氨酸，第107位的酪氨酸变为赖氨酸、114位的赖氨酸变为酪氨酸、167位的天冬酰胺变为丝氨酸，第219位的缬氨酸变为丙氨酸，序列号4的从N末端开始数第83位的谷氨酰胺被选自由丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和天冬酰胺组成的组的氨基酸置换的氨基酸序列组成；
(b3)一种改良型腈水合酶，其特征在于，其为由序列号38所示氨基酸序列及序列号37所示氨基酸序列组成，α亚基由序列号38所示氨基酸序列的从N末端开始数第83位的氨基酸被甲硫氨酸置换的氨基酸序列组成，β亚基由序列号37所示的氨基酸序列组成；
(c)一种改良型腈水合酶，其特征在于，其为由序列号4及序列号2的氨基酸组成的腈水合酶，α亚基由序列号4所示的氨基酸序列组成，β亚基由序列号4所示氨基酸序列的从N末端开始数第82位的氨基酸为选自由半胱氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸和酪氨酸组成的组的氨基酸序列组成；
(d)一种改良型腈水合酶，其特征在于，其为由序列号4及序列号2的氨基酸组成的腈水合酶，α亚基由序列号4所示的氨基酸序列组成，β亚基由序列号4所示氨基酸序列的从N末端开始数第85位的氨基酸为选自由半胱氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、酪氨酸所组成的组的氨基酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的改良型腈水合酶，其中，所述腈水合酶来源于红球菌属(Rhodococcus)细菌或诺卡氏菌属(nocardia)细菌。
3.一种DNA，其编码权利要求1或2所述的改良型腈水合酶。
4.一种重组载体，其包含权利要求3所述的DNA。
5.一种转化体，其包含权利要求4所述的重组载体。
6.一种腈水合酶，是从培养权利要求5所述的转化体而得到的培养物中提取的。
7.一种腈水合酶的制造方法，其特征在于，培养权利要求5所述的转化体，由得到的培养物提取腈水合酶。
8.一种酰胺化合物的制造方法，其特征在于，使权利要求1或2所述的改良型腈水合酶或培养权利要求5所述的转化体而得到的培养物或者该培养物的处理物与腈化合物接触。
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