JPH10337185A

JPH10337185A - アスパルターゼ活性を有する新規なタンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子ｄｎａ

Info

Publication number: JPH10337185A
Application number: JP9163538A
Authority: JP
Inventors: Fumiaki Watanabe; 文昭渡辺; Fujio To; 不二夫湯
Original assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Priority date: 1997-06-06
Filing date: 1997-06-06
Publication date: 1998-12-22
Also published as: CN1211619A; FR2764303A1; FR2764303B1; CN1202244C

Abstract

(57)【要約】【解決手段】アスパルターゼ活性を有する新規なタンパ
ク質、該タンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ、該遺伝
子ＤＮＡを含む組換え体プラスミド、該組換え体プラス
ミドを導入した形質転換体および該形質転換体によるＬ
−アスパラギン酸の製造法。【効果】アスパルターゼ活性を有する新規なタンパク質
をコードする遺伝子が提供され、該遺伝子が菌体内に多
数存在する形質転換微生物の使用によりフマル酸とアン
モニアから効率的にＬ−アスパラギン酸を製造できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アスパルターゼ活
性を有する新規なタンパク質、該タンパク質をコードす
る遺伝子ＤＮＡ、該遺伝子ＤＮＡを含む組換え体プラス
ミド、該組換え体プラスミドを導入した形質転換体およ
び該形質転換体によるＬ−アスパラギン酸の製造法等に
関する。Ｌ−アスパラギン酸はこれまで医薬や食品添加
物として用いられてきたが、近年、界面活性剤や生分解
性キレート剤の原料としても注目されている。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ−アスパラギン酸は、主に酵素法によ
りアスパルターゼを用いてフマル酸とアンモニアから製
造されており、アスパルターゼをコードする遺伝子とし
ては、エシェリヒアコリ（Escherichia coli）由来の
遺伝子〔Journal of General Microbiology, 130, 1271
-1278 (1984)〕およびブレビバクテリウムフラバム
（Brevibacterium flavum) ＭＪ−２３３由来の遺伝子
（特開平5-30977 号公報）が知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、さらに、上
記以外のアスパルターゼをコードする遺伝子を探索し、
より効率的にＬ−アスパラギン酸を製造することを課題
とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を行った結果、ロドコッカス属細
菌よりアスパルターゼ活性を有する新規なタンパク質な
らびに該タンパク質をコードする遺伝子を単離し、本発
明を完成するに至った。

【０００５】すなわち、本発明は、(1) アスパルターゼ
活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列または該ア
ミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、置換若しくは付加
されたアミノ酸配列からなることを特徴とするタンパク
質、(2) 該タンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ、(3)
該遺伝子ＤＮＡをベクタープラスミドに連結した組換え
体プラスミド、(4) 該組換え体プラスミドを宿主微生物
に導入した形質転換体、(5) 該形質転換体を培養して上
記(1) のタンパク質を産生させる方法、ならびに(6) 該
形質転換体または上記(1) のタンパク質の存在下にフマ
ル酸またはその塩とアンモニアまたはアンモニウム塩を
反応させてＬ−アスパラギン酸を得ることを特徴とする
Ｌ−アスパラギン酸の製造法、を要旨とする。

【０００６】本発明のアスパルターゼ活性を有するタン
パク質ならびに該タンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ
を与える微生物としては、具体的には、ロドコッカス(R
hodococcus) sp. ＥＡ４〔微工研菌寄第12136 号(FERM
P-12136)が挙げられる。

【０００７】宿主となる微生物は特に限定されるもので
はないが、上記ＥＡ４株、ならびにロドコッカスロド
クロウス ATCC 12674、同 ATCC 17041 、同 ATCC 1789
5 、同 ATCC 19140 および同 ATCC 33258 株等が挙げら
れる。これらのうち、ＥＡ４株は上記番号にて工業技術
院生命工学工業技術研究所に寄託されており、その菌学
的性質は特開平4-304892号公報に記載されている。ま
た、ATCC 12674、同 ATCC 17041 、同 ATCC 17895 、同
ATCC 19140 および同ATCC 33258 菌株はアメリカンタ
イプカルチャーコレクション(ATCC)から容易に入手する
ことができる。

【０００８】

【実施例】以下、実施例により詳細に説明する。ただ
し、本発明はこれらの実施例により限定されるものでは
ない。

【０００９】実施例１ (1) ＥＡ４株染色体ＤＮＡの調製ＥＡ４株を１００ｍｌのＭＹ培地（０．５％ポリペプト
ン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％バクトモ
ルトエキス、１％グルコース）中、３０℃にて７２時間
振盪培養した後、集菌し、この菌体をＳａｌｉｎｅ−Ｅ
ＤＴＡ溶液（０．１ＭＥＤＴＡ、０．１５ＭＮａＣ
ｌ（ｐＨ８．０））４ｍｌに懸濁し、リゾチーム８ｍｇ
を加えて３７℃で１〜２時間振盪した後、凍結した。次
に、１０ｍｌのＴｒｉｓ−ＳＤＳ液（１％ＳＤＳ、０．
１ＭＮａＣｌ、０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
９．０））を穏やかに振盪しながら加え、さらにプロテ
イナーゼＫ（メルク社）（終濃度０．１ｍｇ）を加え３
７℃で１時間振盪した。次に、等量のＴＥ飽和フェノー
ルを加え撹拌後（ＴＥ：１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、
１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））遠心し、上層をとり
２倍量のエタノールを加えたのちガラス棒でＤＮＡを巻
きとり、９０％、８０％、７０％のエタノールで順次フ
ェノールを取り除いた。次に、ＤＮＡを３ｍｌのＴＥ緩
衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼＡ溶液（１００℃、
１５分間の加熱処理済）を１０μｇ／ｍｌになるよう加
え３７℃で３０分間振盪した。さらに、プロテイナーゼ
Ｋを加え３７℃で３０分間振盪した後、等量のＴＥ飽和
フェノールを加え遠心し上層と下層に分離させた。上層
についてこの操作を２回繰り返した後、同量のクロロホ
ルム（４％イソアミルアルコール含有）を加え同様の抽
出操作を繰り返した（以後この操作をフェノール処理と
呼ぶ）。その後、上層に２倍量のエタノールを加えガラ
ス棒でＤＮＡを巻きとり回収し、染色体ＤＮＡ標品を得
た。

【００１０】(2) プローブの調製工程(1) で得られた染色体ＤＮＡ１０μｌ（1/20希
釈）、１０倍濃度の反応緩衝液１０μｌ、５０ｍＭＭ
ｇＣｌ₂ 3μｌ、１０ｍＭｄＮＴＰ２μｌ、プライマ
ー＃１として配列番号４に示すオリゴヌクレオチド、プ
ライマー＃２として、配列番号５に示すオリゴヌクレオ
チド各１μｌ（１００ｐｍｏｌ濃度相当）、Taq ＤＮＡ
ポリメラーゼ（GIBCO BRL 社）１μｌを加えて１００μ
ｌとした。プライマーはいずれもすでに公知の各種アス
パルターゼのホモロジーの高い領域のアミノ酸配列を参
考にして作成した。この溶液について、９３℃、３０秒
間（変性ステップ）、５５℃、３０秒間（アニーリング
ステップ）、７２℃、２分間（伸長ステップ）のインキ
ュベーションを３０サイクル行った。反応終了後、クロ
ロホルム抽出を３回行い、エタノール沈殿により増幅さ
れたＤＮＡを回収した。これを０．７％アガロースゲル
電気泳動で分離後、ＥＡ４株アスパルターゼ遺伝子の一
部をコードすると考えられる約６００ｂｐのＤＮＡ断片
を得た。こうして得られたＤＮＡ断片を DIG DNA Label
ing Kit （ベーリンガー・マンハイム株式会社）を用い
て標識し、プローブとした。

【００１１】(3) ＤＮＡライブラリーの作製ＥＡ４株染色体ＤＮＡ２００μｌに10倍濃度制限酵素
緩衝液４０μｌ、滅菌水１４５μｌ、制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ１５μｌを加え３７℃にて６時間反応させた後、エ
タノール沈殿によりＤＮＡを回収した。アガロース電気
泳動を行い、8ｋｂ付近のＤＮＡ断片をゲルから切り出
し DNA PREP （株式会社ダイアヤトロン）を用いて回収
した。このＤＮＡ断片をライゲーションキット（宝酒造
株式会社）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１１８のＢａ
ｍＨＩ部位に挿入し、組換え体ＤＮＡライブラリーを作
製した。ライゲーションに用いたｐＵＣ１１８断片は次
のように作製した。ｐＵＣ１１８１０μｌに対し１０
倍濃度制限酵素緩衝液１０μｌ、滅菌水７７μｌ、制限
酵素ＢａｍＨ１２μｌを加え３７℃で２時間反応後、
フェノール処理、エタノール沈澱させた後乾燥して５０
μｌの滅菌水に溶解した。さらにアルカリフォスタファ
ーゼ（宝酒造株式会社）１μｌ、１０倍濃度緩衝液１０
μｌ、滅菌水３９μｌを加え６５℃で反応後フェノール
処理、エタノール沈澱を行い乾燥して滅菌水に溶解し
た。

【００１２】(4) 形質転換体の作製および組換え体ＤＮ
Ａの選別大腸菌ＪＭ１０９株をＬＢ培地（１％バクトトリプト
ン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％ＮａＣ
ｌ）１ｍｌに接種し３７℃、５時間前培養し、この培養
物１００μｌをＳＯＢ培地５０ｍｌ（２％バクトトリプ
トン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭＮａ
Ｃｌ、２．５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｇＳＯ₄、１ｍ
ＭＭｇＣｌ₂）に加え、１８℃で２０時間培養した。
遠心により集菌した後、冷１３ｍｌＴＦ溶液（２０ｍＭ
ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．０）、２００ｍＭＫ
Ｃｌ、１０ｍＭＣａＣｌ₂、４０ｍＭＭｎＣｌ₂）
を１３ｍｌ加え、０℃で１０分放置後、再度遠心した。
上澄を除いた後、沈澱した大腸菌に冷ＴＦ溶液３．２ｍ
ｌに懸濁し０．２２ｍｌのジメチルスルホキシドを加え
０℃で１０分間放置した。こうして作製したコンピテン
トセル２００μｌに工程(3) で作製した組換え体プラス
ミドを含有する溶液（ＤＮＡライブラリー）を１０μｌ
加え、０℃で３０分放置後、４２℃で３０秒間ヒートシ
ョックを与え０℃で２分間冷却後、ＳＯＣ培地（２％バ
クトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、２０
ｍＭグルコース、１０ｍＭＮａＣｌ、２．５ｍＭＫ
Ｃｌ、１ｍＭＭｇＳＯ₄、１ｍＭＭｇＣｌ₂）を
０．８ｍｌ加え３７℃にて６０分間振盪培養した。これ
を２００μｌずつアンピシリン１００μｇ／ｍｌ含有の
ＬＢ寒天培地にまき、３７℃で培養した。寒天培地上に
生育した形質転換体コロニーについてコロニーハイブリ
ダイゼーション法にてアスパルターゼ遺伝子を持つ形質
転換体を選別した。すなわち、寒天培地上に生育した形
質転換体をナイロンメンブレン（バイオダインＡ：日本
ポール株式会社）上に移し、菌体を溶かしてＤＮＡを固
定した後、これを工程(2) で作製したプローブ（約６０
０ｋｂ断片）で処理し、DIG Luminescent Detection Ki
t （ベーリンガー・マンハイム株式会社）を用い、目的
の組換え体ＤＮＡを含むコロニーを選択した。

【００１３】(5) 組換え体プラスミドの調製工程(4) で選択した形質転換体を１００ｍｌのＬＢ培地
にて３７℃で一晩培養し、集菌後、滅菌水により洗浄
し、溶液Ｉ（２ｍＭグルコース、１０ｍＭＥＤＴＡ、
２５ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を５ｍ
ｌ、リゾチームを２５ｍｇ加え、０℃で３０分間放置し
た。溶液ＩＩ（１ＮＮａＯＨ、５％ＳＤＳ）を１０ｍ
ｌ加え０℃で５分間放置し、溶液ＩＩＩ（３Ｍ酢酸ナト
リウム（ｐＨ４．８））を７．５ｍｌ加え０℃で３０分
間放置した。これを遠心し、その上澄みに５０ｍｌのエ
タノールを加えさらに遠心し上清を取り除き５ｍｌの溶
液ＩＶ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））とリボヌクレアーゼＡ溶液
（１０ｍｇ／ｍｌ）を２．５μｌ加え室温で２０分間放
置した。これに１２ｍｌのエタノールを加え、遠心によ
りプラスミドを回収、７０％エタノールでリンスし、乾
燥後０．４ｍｌの滅菌水に溶解した。さらにフェノール
処理後、エタノール沈殿によりプラスミドを回収し、乾
燥後０．４ｍｌの滅菌水に溶解した。こうして得られた
組換え体プラスミドをｐＡＲ００２と名付けた。なお、
組換え体プラスミドｐＡＲ００２は、形質転換体 E. co
li JMI09/pAR002 (FERM P-16257)として工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託されている。

【００１４】(6) 制限酵素地図の作製およびプローブが
ハイブリダイズする領域の決定工程(5) で得られたプラスミドｐＡＲ００２を数種の制
限酵素を用いて切断し制限酵素地図を作製した（図
１）。さらに、ｐＡＲ００２を制限酵素ＫｐｎＩ、Ｂｇ
ｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ等で切断後、アガロースゲ
ル電気泳動を行い、サザーンハイブリダイゼーション法
によりプローブがハイブリダイズする断片を特定した。

【００１５】(7) 塩基配列の決定工程(6) で特定された領域周辺の塩基配列をファルマシ
ア社蛍光シーケンサーALF IIを用いて決定した。その結
果、配列番号３に示される塩基配列が得られ、配列番号
１に示されるアミノ酸配列を持つオープンリーディング
フレームが見いだされた。アミノ酸配列データーベース
NBRF （National Biomedical ResearchFoundation)と
の比較より本遺伝子は既知のアスパルターゼとアミノ酸
配列レベルで５０〜６０％のホモロジーを有しているこ
と、既知のアスパルターゼ間でホモロジーの高い領域は
本ポリペプチドでも高いホモロジーを有していることか
ら、本ポリペプチドは新規なアスパルターゼであること
が考えられた。また、このオープンリーディングフレー
ムの塩基配列を配列番号２に示した。

【００１６】実施例２ (1) プラスミドｐＡＲ０１６の作製ｐＡＲ００２１０μｌ（1/20希釈）、１０倍濃度の反
応緩衝液１０μｌ、５０ｍＭＭｇＣｌ₂ ３μｌ、１
０ｍＭｄＮＴＰ２μｌ、プライマー＃３として配列
番号６に示すオリゴヌクレオチド、プライマー＃４とし
て、配列番号７に示すオリゴヌクレオチド各１μｌ（１
００ｐｍｏｌ濃度相当）、Taq ＤＮＡポリメラーゼ（GI
BCO BRL 社）１μｌを加えて１００μｌとした。プライ
マーはＥＡ４アスパルターゼのＯＲＦを含んだ断片を増
幅するように作成した。この溶液について、９３℃、３
０秒間（変性ステップ）、５５℃、３０秒間（アニーリ
ングステップ）、７２℃、２分間（伸長ステップ）のイ
ンキュベーションを３０サイクル行った。反応終了後、
クロロホルム抽出を３回行い、エタノール沈殿により増
幅されたＤＮＡを回収した。次に、回収したＤＮＡを制
限酵素ＸｂａＩとＳｓｅ８３８７Ｉとで切断した後、こ
れを０．７％アガロースゲル電気泳動で分離した。この
ゲルから１．２ｋｂのバンドを回収し、ロドコッカス属
細菌用の強力なプロモーター活性を有するプラスミドｐ
ＳＪ０３４（図３）のＸｂａＩ−Ｓｓｅ８３８７Ｉ部位
に挿入し、組換え体プラスミドｐＡＲ０１６（図２）を
作製した。なお、ｐＳＪ０３４はプラスミドｐＳＪ０２
３（特願平9-65618 号明細書記載）より図４に示した工
程により作製した。ｐＳＪ０２３は形質転換体 R.rhodo
chrous ATCC 12674/pSJ023 (FERM P-16108) として工業
技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。

【００１７】（２）ロドコッカス属細菌の形質転換およ
び形質転換体のアスパルターゼ活性ロドコッカスロドクロウス ATCC 12674 株の対数増殖
期の細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水に
て３回洗浄し、滅菌水に懸濁した。プラスミドｐＡＲ０
１６１μｌと菌体懸濁液１０μｌを混合し、氷冷し
た。キュベットにＤＮＡと菌体の懸濁液をいれ、遺伝子
導入装置 Gene Pulser (BIO RAD)により２．０ＫＶ、２
００ＯＨＭＳで電気パルス処理を行った。電気パルス
処理液を氷冷下１０分静置し、３７℃で１０分間ヒート
ショクを行い、ＭＹＫ培地（０．５％ポリペプトン、
０．３％バクトイーストエキス、０．３％バクトモルト
エキス、０．２％Ｋ₂ＨＰＯ₄、０．２％ＫＨ₂ＰＯ
₄）５００μl を加え、３０℃、５時間静置した後、５
０μｇ／ｍｌカナマイシン入りＭＹＫ寒天培地に塗布
し、３０℃、３日間培養した。こうして作製したロドコ
ッカス属細菌組換え体をＭＹＫ培地（５０μｇ／ｍｌカ
ナマイシン含有）１０ｍｌに接種し、３０℃で７２時間
前培養した。本培養はＭＹＫ培地（５０μｇ／ｍｌカナ
マイシン含有）１０ｍｌで行い、前培養から１％接種
し、３０℃で９６時時間培養した。遠心分離により集菌
し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で菌体を洗
浄し、最後に少量の緩衝液に懸濁した。この菌体懸濁液
を氷冷下、超音波破壊し、遠心分離によって粗酵素液を
得、アスパルターゼ活性の測定に供した。なお、対象と
して、カナマイシン無添加で培養したATCC 12674株を用
いた。アスパルターゼ活性は次のように測定した。１．
０Ｍフマル酸アンモニウム（ｐＨ８．８、１ｍＭ塩
化マグネシウム含有）と粗酵素液を接触させ、３０℃で
６０分間に生成するアスパラギン酸を、ＯＤＳカラムを
使用したＨＰＬＣで定量した。その結果、プラスミドを
導入した組換え体でアスパルターゼ活性が増加している
ことが認められた。

【００１８】生成Ｌ−アスパラギン酸（ｍＭ） ATCC 12674／ｐＡＲ０１６３２２ ATCC 12674 ０．１

【００１９】実施例３実施例２の方法で、プラスミドｐＡＲ０１６を ATCC 17
895 、19140 に導入したロドコッカス属細菌組換え体を
ＭＹＫ培地（５０μｇ／ｍｌカナマイシン含有）１０ｍ
ｌに接種し、３０℃で７２時間前培養した。本培養はＧ
ＧＰＫ培地（１．５％グルコース、１％グルタミン
酸ナトリウム、０．１％バクトイーストエキス、０．
５％Ｋ₂ＨＰＯ₄、０．５％ＫＨ₂ＰＯ₄、０．５
％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂ＯｐＨ７．２）（５０μｇ／
ｍｌカナマイシン含有）１００ｍｌで行い、前培養から
１％接種し、３０℃で９６時時間培養した。遠心分離に
より集菌し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）
で菌体を洗浄し、最後に少量の緩衝液に懸濁した。この
菌体液を使用し、アスパラギン酸生産反応に供した。反
応は１．０Ｍフマル酸アンモニウム（ｐＨ８．８、１
ｍＭＭｇＣｌ₂含有）１００ｍｌに菌体液を加え、３
０℃で２０時間撹拌した。なお、対象として、カナマイ
シン無添加で培養したATCC 12674株を用いた。アスパル
ターゼ活性は次のように測定した。１．０Ｍフマル酸
アンモニウム（ｐＨ８．８、１ｍＭ塩化マグネシウム
含有）と粗酵素液を接触させ、３０℃で２０時間に生成
するアスパラギン酸を、ＯＤＳカラムを使用したＨＰＬ
Ｃで定量した。その結果、プラスミドを導入した組換え
体でアスパルターゼ活性が増加していることが認められ
た。

【００２０】生成Ｌ−アスパラギン酸（ｍＭ） ATCC 17895／ｐＡＲ０１６９９０ ATCC 17895 ５ ATCC 19140／ｐＡＲ０１６９８５ ATCC 19140 8

【００２１】

【発明の効果】アスパルターゼ活性を有する新規なタン
パク質をコードする遺伝子が提供され、該遺伝子が菌体
内に多数存在する形質転換微生物の使用によりフマル酸
とアンモニアから効率的にＬ−アスパラギン酸を製造で
きる。

【００２２】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：４７７配列の型：アミノ酸配列の種類：タンパク質トポロジー：直鎖状起源生物名：ロドコッカス（Rhodococcus) 株名：ＥＡ４配列： Met Thr Met Arg Ile Glu His Asp Leu Leu Gly Asp Arg Glu Val 15 Pro Ala Glu Ala Tyr Tyr Gly Ile His Thr Leu Arg Ala Leu Glu 30 Asn Phe Pro Ile Thr Gly Ile Pro Leu Ser Val His Pro Asp Met 45 Val Ser Ala Leu Ala Ala Val Lys Gln Ala Ala Ala Arg Ala Asn 60 Ala Asp Leu Gly Ile Leu Ser Pro Glu His Ala Ala Ala Ile Glu 75 Gln Ala Cys Lys Glu Ile Arg Ala Gly Arg Phe Thr Asp Gln Phe 90 Val Val Asp Val Ile Gln Gly Gly Ala Gly Thr Ser Ser Asn Met 105 Asn Ala Asn Glu Val Val Ala Asn Arg Ala Leu Glu Ile Leu Gly 120 Gly Glu Arg Gly Gln Tyr Gln Phe Leu His Pro Leu Glu His Val 135 Asn Met Ser Gln Ser Thr Asn Asp Val Tyr Pro Thr Ala Ile Lys 150 Ile Gly Leu Gln Gly Ala Val Thr Arg Leu Arg Gly Ala Met Asp 165 Glu Leu Ala Gly Ala Phe Ala Glu Lys Ala Ala Glu Phe Ser His 180 Val Leu Lys Val Gly Arg Thr Gln Leu Gln Asp Ala Val Pro Met 195 Thr Leu Gly Gln Glu Ile Val Thr Phe Ala Val Met Ile Lys Glu 210 Asp Ser Gln Arg Leu Glu Glu Ala Ala Arg Leu Ile Ser Glu Ile 225 Asn Leu Gly Gly Thr Ala Ile Gly Thr Gly Leu Asn Ala His Pro 240 Glu Tyr Ala Arg Arg Val Arg Glu His Leu Val Ser Ile Thr Gly 255 Leu Asp Ile Ser Thr Ala Ser Asp Leu Ile Glu Ala Thr Gln Asp 270 Val Gly Ala Phe Val Gln Leu Ser Gly Val Leu Lys Arg Thr Ala 285 Val Lys Leu Ser Lys Ile Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu Ser Ser 300 Gly Pro Arg Ala Gly Leu Gly Glu Ile Asn Leu Pro Ala Val Gln 315 Ala Gly Ser Ser Ile Met Pro Gly Lys Val Asn Pro Val Ile Pro 330 Glu Val Val Asn Gln Ile Ala Tyr Arg Val Val Gly Asn Asp Leu 345 Thr Ile Thr Met Ala Ala Glu Ala Gly Gln Leu Gln Leu Asn Ala 360 Phe Glu Pro Val Ile Ala His Ser Leu Phe Glu Thr Ala Glu Leu 375 Leu Thr Arg Gly Cys Thr Val Leu Arg Glu Arg Cys Val Ile Gly 390 Ile Thr Ala Asn Val Glu His Leu Glu Arg Thr Val Ala Ala Ser 405 Ile Gly Val Val Thr Ala Leu Asn Pro Tyr Ile Gly Tyr Thr Ala 420 Ala Thr Glu Leu Ala Ala Asp Ala Leu Ala Ser Gly Arg Thr Val 435 Val Glu Leu Val Leu Glu Arg Gly Leu Leu Gly Lys Glu Asp Leu 450 Asp Ala Ile Met Glu Pro Ala Asn Leu Ala Arg Thr Ala Ile Val 465 Ser Ala Pro Asp Phe Asp Pro Leu Val Pro Ser Thr 477

【００２３】配列番号：２配列の長さ：１４０４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状起源生物名：ロドコッカスス（Rhodococcus) 株名：ＥＡ４配列： ATG ACG ATG CGC ATC GAG CAC GAC CTG CTC GGT GAT CGC GAA GTG 45 CCT GCG GAG GCC TAC TAC GGC ATC CAC ACG CTG AGA GCA CTG GAG 90 AAC TTC CCG ATC ACC GGT ATT CCT CTC TCG GTC CAC CCG GAC ATG 135 GTA TCG GCG TTG GCT GCG GTC AAG CAG GCC GCT GCT CGG GCG AAC 180 GCC GAC CTC GGA ATC CTC TCG CCC GAG CAT GCA GCG GCG ATC GAG 225 CAA GCT TGC AAG GAG ATT CGT GCG GGC AGG TTC ACC GAC CAG TTC 270 GTC GTC GAC GTC ATT CAG GGT GGT GCC GGC ACG TCA TCG AAC ATG 315 AAC GCC AAC GAA GTG GTC GCG AAC CGC GCG CTC GAA ATT CTC GGC 360 GGC GAA CGG GGG CAG TAC CAA TTC CTC CAT CCG CTC GAA CAC GTC 405 AAC ATG AGT CAG AGC ACC AAC GAC GTC TAC CCC ACC GCG ATC AAA 450 ATC GGC TTG CAA GGT GCC GTC ACC AGG CTT CGA GGT GCG ATG GAC 495 GAA CTT GCA GGC GCA TTC GCG GAG AAA GCA GCC GAG TTC TCC CAC 540 GTG CTC AAG GTC GGG CGG ACT CAG TTG CAA GAC GCG GTC CCG ATG 585 ACT CTC GGT CAA GAG ATT GTC ACG TTC GCC GTG ATG ATC AAG GAG 630 GAC TCT CAG AGA CTG GAA GAG GCC GCT CGG TTG ATC TCG GAG ATC 675 AAC CTG GGA GGG ACG GCG ATA GGT ACC GGT CTC AAT GCG CAC CCG 720 GAG TAC GCC AGA CGT GTG CGT GAG CAT CTG GTG TCG ATC ACC GGT 765 CTC GAC ATC TCG ACG GCA TCG GAT CTC ATC GAA GCA ACC CAG GAC 810 GTC GGG GCC TTC GTT CAG CTG TCG GGA GTG CTC AAG CGT ACC GCG 855 GTC AAA CTG TCC AAG ATC TGC AAC GAT CTG AGA TTG CTG TCC TCA 900 GGC CCA CGA GCA GGT CTG GGT GAG ATC AAT TTA CCT GCG GTG CAG 945 GCA GGT TCG TCG ATC ATG CCC GGA AAG GTC AAT CCG GTC ATT CCG 990 GAA GTG GTC AAT CAG ATT GCC TAC CGG GTG GTG GGA AAC GAT CTG 1035 ACC ATC ACC ATG GCT GCC GAG GCG GGT CAA CTG CAG CTC AAC GCA 1080 TTC GAA CCG GTC ATT GCA CAC AGC TTG TTC GAG ACT GCA GAA CTC 1125 CTC ACG CGG GGC TGC ACT GTG TTG CGC GAG CGA TGC GTG ATC GGC 1170 ATT ACC GCC AAC GTC GAG CAT CTC GAA CGA ACG GTC GCG GCT TCG 1215 ATC GGT GTC GTG ACC GCG CTC AAT CCC TAC ATC GGC TAC ACA GCC 1260 GCG ACG GAA TTG GCG GCG GAC GCG CTT GCT TCC GGT CGT ACC GTC 1305 GTG GAG TTG GTG CTC GAA CGC GGG TTG TTG GGC AAG GAG GAT TTG 1350 GAC GCG ATC ATG GAG CCT GCG AAT TTG GCA CGA ACT GCG ATC GTG 1395 TCG GCT CCC GAT TTC GAT CCA CTC GTC CCG TCG ACC TGA 1404

【００２４】配列番号：３配列の長さ：１９１２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状起源生物名：ロドコッカス（Rhodococcus) 株名：ＥＡ４配列： TTCGAAGCCA CGCCCGTTCA GGTGACCTGC GTGCGGCGAA GTTCGGTGGA 50 GCCGAACTAC CGTGGGGCGA GATCCCGGTG GCGGCAAACC TCAAATGACG 100 ATGCGCATCG AGCACGACCT GCTCGGTGAT CGCGAAGTGC CTGCGGAGGC 150 CTACTACGGC ATCCACACGC TGAGAGCACT GGAGAACTTC CCGATCACCG 200 GTATTCCTCT CTCGGTCCAC CCGGACATGG TATCGGCGTT GGCTGCGGTC 250 AAGCAGGCCG CTGCTCGGGC GAACGCCGAC CTCGGAATCC TCTCGCCCGA 300 GCATGCAGCG GCGATCGAGC AAGCTTGCAA GGAGATTCGT GCGGGCAGGT 350 TCACCGACCA GTTCGTCGTC GACGTCATTC AGGGTGGTGC CGGCACGTCA 400 TCGAACATGA ACGCCAACGA AGTGGTCGCG AACCGCGCGC TCGAAATTCT 450 CGGCGGCGAA CGGGGGCAGT ACCAATTCCT CCATCCGCTC GAACACGTCA 500 ACATGAGTCA GAGCACCAAC GACGTCTACC CCACCGCGAT CAAAATCGGC 550 TTGCAAGGTG CCGTCACCAG GCTTCGAGGT GCGATGGACG AACTTGCAGG 600 CGCATTCGCG GAGAAAGCAG CCGAGTTCTC CCACGTGCTC AAGGTCGGGC 650 GGACTCAGTT GCAAGACGCG GTCCCGATGA CTCTCGGTCA AGAGATTGTC 700 ACGTTCGCCG TGATGATCAA GGAGGACTCT CAGAGACTGG AAGAGGCCGC 750 TCGGTTGATC TCGGAGATCA ACCTGGGAGG GACGGCGATA GGTACCGGTC 800 TCAATGCGCA CCCGGAGTAC GCCAGACGTG TGCGTGAGCA TCTGGTGTCG 850 ATCACCGGTC TCGACATCTC GACGGCATCG GATCTCATCG AAGCAACCCA 900 GGACGTCGGG GCCTTCGTTC AGCTGTCGGG AGTGCTCAAG CGTACCGCGG 950 TCAAACTGTC CAAGATCTGC AACGATCTGA GATTGCTGTC CTCAGGCCCA 1000 CGAGCAGGTC TGGGTGAGAT CAATTTACCT GCGGTGCAGG CAGGTTCGTC 1050 GATCATGCCC GGAAAGGTCA ATCCGGTCAT TCCGGAAGTG GTCAATCAGA 1100 TTGCCTACCG GGTGGTGGGA AACGATCTGA CCATCACCAT GGCTGCCGAG 1150 GCGGGTCAAC TGCAGCTCAA CGCATTCGAA CCGGTCATTG CACACAGCTT 1200 GTTCGAGACT GCAGAACTCC TCACGCGGGG CTGCACTGTG TTGCGCGAGC 1250 GATGCGTGAT CGGCATTACC GCCAACGTCG AGCATCTCGA ACGAACGGTC 1300 GCGGCTTCGA TCGGTGTCGT GACCGCGCTC AATCCCTACA TCGGCTACAC 1350 AGCCGCGACG GAATTGGCGG CGGACGCGCT TGCTTCCGGT CGTACCGTCG 1400 TGGAGTTGGT GCTCGAACGC GGGTTGTTGG GCAAGGAGGA TTTGGACGCG 1450 ATCATGGAGC CTGCGAATTT GGCACGAACT GCGATCGTGT CGGCTCCCGA 1500 TTTCGATCCA CTCGTCCCGT CGACCTGACC AGGTCTTCAG GGCGGTTGAC 1550 ACCGCACATG TGGGCGGTAT CGTTTAGTGA TACGTATAAC TACTTGCAGT 1600 CCTGTTGTGT CAGGATTGAC AGAAGCTGAG TCGGCACGGT TCAAGGACGT 1650 ACCGCGCCAA GCCAGCCAGG AGACGGAAAC CATGTTCGAA AAGACACGAA 1700 TGGACAGTCA TCCCCCCTGT AAGAGCAACT ACGACGTCAT CGTCGTGGGA 1750 AGCGGAATGG GGGGTGGAAC GATGGCATAC GCTCTCAAGG ATTCCGGCCT 1800 CGATGTGCTC TTGATCGAGA GGGGAGACTT CCTTCCACAG GAACGTCAGA 1850 ATTGGGACCC CCGAGCGGTG TTCGAGAAAG ATCGGTACAA GAACGCCGAA 1900 AAATGGGTCG AC 1912

【００２５】配列番号：４配列の長さ：２０配列の型：核酸配列： AACATGAACACTAACGAGGT

【００２６】配列番号：５配列の長さ：２０配列の型：核酸配列： AGGTCGTTGCAGATCTTGGA

【００２７】配列番号：６配列の長さ：３３配列の型：核酸配列： AATCTAGAATGACGATGCGCATCGAGCACGACC

【００２８】配列番号：７配列の長さ：２７配列の型：核酸配列： CTCTAGACCTGCGTACGGCGAAGTTCG

【００２９】

【図面の簡単な説明】

【図１】組換え体プラスミドｐＡＲ００２の制限酵素地
図。太い線はベクターｐＵＣ１１８を示し、細い線はＥ
Ａ４株ＤＮＡ領域を示す。ＥＡ４株ＤＮＡ領域内におけ
る矢印は、本発明によって見いだされたアスパルターゼ
遺伝子の位置と方向を示す。

【図２】組換え体プラスミドｐＡＲ０１６の制限酵素地
図。太い線はプラスミドｐＳＪ０３４由来の領域を示
し、細い線はＥＡ４株ＤＮＡ領域を示す。ＥＡ４株ＤＮ
Ａ領域内における矢印は、本発明によって見いだされた
アスパルターゼ遺伝子の位置と方向を示す。

【図３】プラスミドｐＳＪ０３４の説明図。

【図４】プラスミドｐＳＪ０３４の作成工程図。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/20 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アスパルターゼ活性を有し、配列番号１
に示すアミノ酸配列または該アミノ酸配列においてアミ
ノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から
なることを特徴とするタンパク質。
【請求項２】請求項１記載のタンパク質をコードする
遺伝子ＤＮＡ。
【請求項３】請求項２記載の遺伝子ＤＮＡが配列番号
２に示す塩基配列を有する遺伝子ＤＮＡ。
【請求項４】請求項２記載の遺伝子ＤＮＡがロドコッ
カス(Rhodococcus) 属細菌由来である遺伝子ＤＮＡ。
【請求項５】ロドコッカス属細菌がロドコッカス(Rho
dococcus) sp. ＥＡ４株である請求項４記載の遺伝子Ｄ
ＮＡ。
【請求項６】配列番号４および５で示される合成ＤＮ
Ａで増幅されることを特徴とするサイズが約６００ｂｐ
のＤＮＡ断片。
【請求項７】請求項２記載の遺伝子ＤＮＡをベクター
プラスミドに連結した組換え体プラスミド。
【請求項８】請求項２記載の遺伝子ＤＮＡとロドコッ
カス属細菌内で複製増殖可能なＤＮＡ領域をベクタープ
ラスミドに連結した組換え体プラスミド。
【請求項９】請求項７または８記載の組換え体プラス
ミドを宿主微生物に導入した形質転換体。
【請求項１０】宿主微生物がロドコッカス属に属する
細菌である請求項９記載の形質転換体。
【請求項１１】請求項１０記載の形質転換体を培養し
て請求項１記載のタンパク質を産生させる方法。
【請求項１２】請求項１０記載の形質転換体または請
求項１記載のタンパク質の存在下にフマル酸またはその
塩とアンモニアまたはアンモニウム塩を反応させてＬ−
アスパラギン酸を得ることを特徴とするＬ−アスパラギ
ン酸の製造法。