JPH10248578A - ロドコッカス属細菌用発現ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 ニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性
化する作用をもつ調節因子をコードするＤＮＡ領域、該
調節因子により活性化を受けるニトリラーゼ遺伝子プロ
モーターＤＮＡ領域、ロドコッカス属細菌細胞内で増殖
可能なＤＮＡ領域およびロドコッカス属細菌において機
能する薬剤耐性ＤＮＡ領域を含んでなるロドコッカス属
細菌用発現ベクター。 【効果】 ロドコッカス属細菌用発現ベクターに外来遺
伝子を組み込みロドコッカス属菌体内に共存させること
により、構成的に外来遺伝子の発現を可能にせしめる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は構成的に外来遺伝子
の発現を可能とするロドコッカス（Rhodococcus)属細菌
用発現ベクターに関する。詳しくは、ニトリラーゼ遺伝
子プロモーターを活性化する作用をもつ調節因子をコー
ドするＤＮＡ領域、調節因子により活性化を受けるニト
リラーゼ遺伝子プロモーターＤＮＡ領域、ロドコッカス
属細菌内で複製可能なＤＮＡ領域および薬剤耐性遺伝子
を含むＤＮＡ領域を含有する発現ベクター、ならびにこ
の発現ベクターにニトリルヒドラターゼ遺伝子を組み込
んだプラスミドにより形質転換されたロドコッカス属に
属する微生物に関する。

【０００２】

【従来の技術】ロドコッカス属に属する微生物は、その
物理的強度や酵素等を細胞内に多量蓄積する能力から、
産業的に有用な微生物触媒として知られ、例えば、ニト
リル類の酵素的水和または加水分解によるアミドまたは
酸の生産等に利用されている（特開平2-470 、特開平3-
251192参照）。また、これらの酵素を含む微生物触媒
を、遺伝子組換えの方法によりさらに有用なものに改良
する試みがなされている（特開平4-211379、特開平6-25
296 、特開平6-303971参照）。さらに、ロドコッカス属
に属する微生物の遺伝子操作を効率的に押し進めるため
に、宿主−ベクター系の開発が進められており、新規な
プラスミドの探索（特開平4-148685、特開平4-330287、
特開平7-255484、特開平 参照）やベクターの開発（特
開平5-64589 、特開平8-56669 、Journal of Bacteriol
ogy 170, 638-645 (1988) 、米国特許 4,920,054）など
が行われている。

【０００３】本発明者らは、すでにロドコッカス エリ
スロポリス（Rhodococcus erythropolis）ＳＫ９２株か
らニトリラーゼ遺伝子およびその調節遺伝子をクローン
化し、複合プラスミドベクターｐＫ４を用いてロドコッ
カス属体内での発現を可能とした（特開平8-173169参
照）。さらに、ニトリラーゼ発現の構成化した変異株Ｓ
Ｋ９２ーＢ１株の構成化に関わる変異調節因子をコード
する遺伝子を誘導型ニトリラーゼ産生細菌内に導入する
ことにより、誘導物質を添加することなくニトリラーゼ
を得ることを可能にした（特開平9-23832 号公報参
照）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これま
でロドコッカス属の汎用的な発現ベクターは知られてお
らず、遺伝子を高発現させるのための新しいベクターの
開発が望まれていた。

【０００５】

【課題を解決するための手段】かかる状況下、鋭意検討
を行った結果、本発明者らは、ニトリラーゼ遺伝子プロ
モーターを構成的に活性化する作用を有する変異型調節
因子を含む汎用的で且つ目的とする遺伝子を高発現させ
得るロドコッカス細菌用発現ベクターを見出し、本発明
を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、 １）下記 (1)〜(4) のＤＮＡ領域を含んでなるロドコッ
カス（Rhodococcus)属細菌用発現ベクター、 (1) ニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性化する作用
をもつ調節因子をコードするＤＮＡ領域 (2) (1) の調節因子により活性化を受けるニトリラーゼ
遺伝子プロモーターＤＮＡ領域 (3) ロドコッカス属細菌細胞内で増殖可能なＤＮＡ領域 (4) ロドコッカス属細菌において機能する薬剤耐性ＤＮ
Ａ領域 ２）上記発現ベクターにニトリルヒドラターゼ遺伝子を
組み込んだ組換え体プラスミド、ならびに、 ３）上記組換え体プラスミドにより形質転換されたロド
コッカス属に属する微生物、に関する。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳細に説明す
る。なお、本発明の調節因子はロドコッカスエリスロポ
リス（Rhodococcus erythropolis）ＳＫ９２株の変異株
ＳＫ９２−Ｂ１株由来のものであるが、ＳＫ９２株由来
の調節因子を用いることにより、誘導型の発現ベクター
にすることができる。

【０００８】ＳＫ９２−Ｂ１株は R. erythropolis SK9
2-B1（ＦＥＰＭ Ｐ−１４８５３）、ＳＫ９２株は Rho
dococcus sp. SK92 （ＦＥＰＭ ＢＰ−３３２４）とし
て、それぞれ工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託
されている。その他、以下に説明するプラスミド等は以
下のとおりである。すなわち、ＳＫ９２株由来ニトリラ
ーゼ遺伝子および調節遺伝子を含むプラスミドｐＳＫ１
０６はこれを含有する形質転換体 E. coli JM109/pSK10
6 （ＦＥＲＭ Ｐ−１４８５６）、ＳＫ９２−Ｂ１株由
来ニトリラーゼ遺伝子および調節遺伝子を含むプラスミ
ドｐＢＳＫ２０１はこれを含有する形質転換体 E. coli
JM109/pBSK201（ＦＥＲＭ Ｐ−１４８５５）、複合プ
ラスミドベクターｐＫ４はこれを含有する形質転換体
R. rhodochrous ATCC 12674/pK4（ＦＥＲＭ ＢＰ−３
７３１）、ロドコッカス ロドクロウス Ｊ−１株のＨ
型ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むプラスミドｐＮＨ
ＪＩ０Ｈはこれを含有する形質転換体 TG1/pNHJ10H（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−２７７７）、プラスミドｐＳＪ０２３は
形質転換体 R. rhodochrous ATCC12674/pSJ023（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１６１０８）として、同じく工業技術院生命工
学工業技術研究所に寄託されている。

【０００９】

【実施例】以下、実施例により詳細に説明する。ただ
し、本発明はこれらの実施例により限定されるものでは
ない。

【００１０】実施例１ 1) 調節遺伝子をコードする遺伝子を含むプラスミドの
作製 1-1) ＤＮＡ断片の作製 ＳＫ９２株由来のプラスミドｐＳＫ１０６の調節遺伝子
をコードする遺伝子を含む領域（約３ｋｂ ＥｃｏＲＶ
断片）（特開平8-173169参照）を、ＳＫ９２ーＢ１株由
来のプラスミドｐＢＳＫ２０１の調節遺伝子をコードす
る遺伝子を含む領域（約３ｋｂ ＥｃｏＲＶ断片）とを
置き換えたプラスミドｐＢＳＫ３０２（特開平9-23832
参照）を制限酵素ＳａｃＩで切断後、７．３ｋｂのＳａ
ｃＩ断片を０．７％アガロース電気泳動により分離し、
ゲルより切り出し回収した。１０μｌのｐＢＳＫ３０２
に対し、１０倍濃度制限酵素緩衝液１０μｌ、滅菌水７
８μｌ、制限酵素ＳａｃＩ２μｌを加え３７℃にて２時
間反応させた。ベクターに用いたｐＵＣ１１８断片は次
のように作製した。１０μｌのｐＵＣ１１８に対し１０
倍濃度制限酵素緩衝液１０μｌ、滅菌水７７μｌ、制限
酵素ＳａｃＩ２μｌを加え３７℃で２時間反応後、フェ
ノール処理、エタノール沈澱させた後乾燥して５０μｌ
の滅菌水に溶解した。さらに、アルカリフォスタファー
ゼ（宝酒造株式会社）１μｌ、１０倍濃度緩衝液１０μ
ｌ、滅菌水３９μｌを加え６５℃で反応後フェノール処
理、エタノール沈澱を行い乾燥して滅菌水に溶解した。
７．３ｋｂ断片を含むＤＮＡ断片画分１μｌを、上記の
ように調製したＳａｃＩ切断ｐＵＣ１１８とライゲーシ
ョンキット（宝酒造株式会社）を用いて４℃で一晩反応
させることによりｐＵＣ１１８への挿入を行った。

【００１１】1-2) 形質転換体の作製および組換え体Ｄ
ＮＡの選別 大腸菌ＪＭ１０９株をＬＢ培地（１．０％バクトトリプ
トン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％ＮａＣ
ｌ）１ｍｌに接種し３７℃、５時間前培養し、この培養
物１００μｌをＳＯＢ培地５０ｍｌ（２％バクトトリプ
トン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭＮａＣ
ｌ、２．５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｇＳＯ₄ 、１ｍＭＭｇ
Ｃｌ₂ ）に加え、１８℃で２０時間培養した。遠心によ
り集菌した後、冷１３ｍｌＴＦ溶液（２０ｍＭＰＩＰＥ
Ｓ−ＫＯＨ（pH 6.0) 、２００ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＣ
ａＣｌ₂ 、４０ｍＭＭｎＣｌ₂ ）を１３ｍｌ加え、０℃
で１０分放置後、再度遠心した。上澄を除いた後、沈澱
した大腸菌に冷ＴＦ溶液３．２ｍｌに懸濁し０．２２ｍ
ｌのジメチルスルホキシドを加え０℃で１０分間放置し
た。こうして作製したコンピテントセル２００μｌに工
程 1-1) で作製した組換え体プラスミドを含有する溶液
（ＤＮＡライブラリー）を１０μｌ加え、０℃で３０分
放置後、４２℃で３０秒間ヒートショックを与え０℃で
２分間冷却後、ＳＯＣ培地（ＳＯＢ培地に２０ｍＭグル
コースを加えたもの）を０．８ｍｌ加え３７℃にて６０
分間振盪培養した。これを２００μｌずつアンピシリン
１００μｇ／ｍｌと１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−
β−チオガラクトシド）と０．３ｍＭのＸ−ｇａｌ（５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド）含有のＬＢ寒天培地にまき、３７℃で
培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コロニーに
ついて青色発色の有無により目的の組換え体の選択を行
った。

【００１２】1-3) 組換え体プラスミドの調製 工程 1-2) で選択した形質転換体を１００ｍｌのＬＢ培
地にて３７℃で一晩培養し、集菌後、滅菌水により洗浄
し、溶液I （２ｍＭグルコース、１０ｍＭＥＤＴＡ、２
５ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（pH 8.0) を５ｍｌ、リゾチー
ムを２５ｍｇ加え、０℃で３０分間放置した。溶液II
（１ＮＮａＯＨ、５％ＳＤＳ）を１０ｍｌ加え０℃で５
分間放置し、溶液III （３Ｍ酢酸ナトリウム（pH4.8)を
７．５ｍｌ加え０℃で３０分間放置した。これを遠心
し、その上澄みに５０ｍｌのエタノールを加えさらに遠
心し上清を取り除き５ｍｌの溶液IV（１０ｍＭ酢酸ナト
リウム、５０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（pH 8.0) とリボヌ
クレアーゼＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を２．５μｌ加え
室温で２０分間放置した。これに１２ｍｌのエタノール
を加え遠心後沈殿したプラスミドを乾燥し滅菌水で溶解
した。こうして得られたプラスミドをｐＢＳＫ３０５と
命名した。

【００１３】2) ニトリラーゼ遺伝子プロモーター下流
へニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む領域 が導入され
た、ロドコッカス属において複製可能な組換え体プラス
ミドの作製 工程 1) で作製したプラスミドｐＢＳＫ３０５のニトリ
ラーゼ遺伝子プロモーター下流にニトリルヒドラターゼ
遺伝子を含む領域を導入し、さらに、ベクターをｐＫ４
〔ＦＥＲＭ ＢＰ−３７３１：ロドコッカス属プラスミ
ドｐＲＣ００４と大腸菌ベクターｐＨＳＧ２９９（トラ
ンスポゾンＴＮ９０３由来のカナマイシン耐性遺伝子を
含む）を連結させたもの（特開平5-64589 、特開平5-68
566 参照）〕としたプラスミドを作製した。プラスミド
ｐＢＳＫ３０５を制限酵素ＸｂａＩとＥｃｏＲＩで切断
後、７．３ｋｂの断片を０．７％アガロース電気泳動に
より分離し、ゲルより切り出し回収した。１０μｌのｐ
ＢＳＫ３０５に対し、１０倍濃度制限酵素緩衝液１０μ
ｌ、滅菌水７６μｌ、制限酵素ＸｂａＩとＥｃｏＲＩを
それぞれ２μｌ加え３７℃にて２時間反応させた。

【００１４】ベクターに用いたｐＫ４断片は次のように
作製した。１０μｌのｐＫ４に対し１０倍濃度制限酵素
緩衝液１０μｌ、滅菌水７８μｌ、制限酵素ＥｃｏＲＩ
２μｌを加え３７℃で２時間反応後、フェノール処理、
エタノール沈澱させた後乾燥して５０μｌの滅菌水に溶
解した。さらに、アルカリフォスタファーゼ（宝酒造株
式会社）１μｌ、１０倍濃度緩衝液１０μｌ、滅菌水３
９μｌを加え６５℃で反応後フェノール処理、エタノー
ル沈澱を行い乾燥して滅菌水に溶解した。

【００１５】Ｊ−１株Ｈ型ニトリルヒドラターゼ遺伝子
を含む６．０ｋｂＤＮＡ断片がｐＵＣ１９ベクターに組
み込まれたプラスミドｐＮＨＪ１０Ｈ〔特開平4-21137
9、Biochim. Biophys. Acta 1129, 23-33(1991)参照〕
を制限酵素ＢａｍＨＩで、切断後セルフライゲーション
してプラスミドｐＦＹ７０２を作製した。これを制限酵
素ＥｃｏＲＶで切断後、リンカーｐＸｂａＩ（宝酒造株
式会社）とライゲーションし、さらに制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉで切断後ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む２．１ｋ
ｂの断片を０．７％アガロース電気泳動により分離し、
ゲルより切り出し回収した。７．３ｋｂ断片１μｌと、
ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む２．１ｋｂ断片１μ
ｌおよび、上記のＸｂａＩとＥｃｏＲＩ切断ｐＫ４１μ
ｌとをライゲーションキット（宝酒造株式会社）を用い
て４℃で一晩反応させることによりプラスミドｐＳＪ０
０２を作製した（図１）。

【００１６】3) ロドコッカス属細菌の形質転換および
形質転換体のニトリルヒドラターゼ活性 ロドコッカス ロドクロウス ＡＴＣＣ１２６７４株の
対数増殖期の細胞を遠心分離により集菌し、氷冷した滅
菌水にて３回洗浄し、滅菌水に懸濁した。１μｌのプラ
スミドｐＳＪ００２と菌体懸濁液１０μｌを混合し、氷
冷した。チャンバーにＤＮＡと菌体の混合液を入れ、遺
伝子導入装置ＣＥＴ−２００型（日本分光）により電場
強度３．８ｋＶ／ｃｍ、パルス幅１ｍｓ、パルス回数２
０回で電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷
冷下１０分間静置し、３７℃で、１０分間ヒートショッ
クを行い、ＭＹＫ培地（０．５％ポリペプトン、０．３
％バクトモルトエキス、０．３％バクトイーストエキ
ス、０．２％ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、０．２％Ｋ₂ ＨＰＯ₄ (pH
7.0) ）５００μｌを加え、２６℃、３時間振盪培養し
た後、７５μｇ／ｍｌカナマイシン入りＭＹＫ寒天培地
に塗布し２６℃、３日間培養した。

【００１７】こうして作製したロドコッカス属細菌組換
え体（ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ００２）をＭＹＫ培
地（５０μg/mlカナマイシン含有）１０ｍｌに接種し、
３０℃で２４時間前培養した。この培養物１ｍｌを培地
１００ｍｌ（１．５％グルコース、０．１％バクトイー
ストエキス、１％グルタミン酸ナトリウム、０．０５％
ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、０．０５％Ｋ₂ ＨＰＯ₄ 、０．０５％硫
酸マグネシウム、０．０１％塩化コバルト、pH 7.2 、
５０μg/mlカナマイシン含有）に加え、３０℃で６０時
間培養した。集菌後、この菌体を５０ｍＭリン酸緩衝液
（pH 7.7）に懸濁し、その一部を２．５％アクリロニト
リルを含有する同緩衝液中で１０℃、１０分反応させ
た。１Ｎ塩酸の添加により反応を止め、反応液中の生成
アクリルアミドを高速液体クロマトグラフィーを用いて
測定した。その結果、ロドコッカス属細菌組換え体ＡＴ
ＣＣ１２６７４／ｐＳＪ００２において、４４ｍＭのア
クリルアミドの生成が認められた。

【００１８】4) プラスミドｐＳＪ０２３の作製 ｐＳＪ００２には、遺伝子発現に必要ない領域がまだ多
く残っているため、不要な領域を取り除いたプラスミド
ｐＳＪ０２３を作製した。ｐＳＪ００２を制限酵素Ｅｃ
ｏＲｌで部分分解後、さらにＥｃｏＲＶで切断し末端平
滑化処理をおこなった後、リンカーｐＥｃｏＲＩ（宝酒
造株式会社）とともにライゲーションを行い、プラスミ
ドｐＳＪ００８を作製した。１０μｌのｐＳＪ００２に
対し、１０倍濃度制限酵素緩衝液１０μｌ、滅菌水７
９．５μｌ、制限酵素ＥｃｏＲｌ０．５μｌを加え３７
℃にて１時間反応させ、エタノール沈澱させた後乾燥し
て１０μｌの滅菌水に溶解した。さらに Klenow Fragm
ent （宝酒造株式会社）２μｌ、１０倍濃度緩衝液１０
μｌ、滅菌水７８μｌを加え３７℃で反応後フェノール
処理、エタノール沈澱を行い乾燥して滅菌水１０μｌに
溶解した。１４．６ｋｂのＤＮＡ断片を０．７％アガロ
ース電気泳動により分離し、ゲルより切り出し回収し
た。回収したＤＮＡ断片１０μｌに対し１０倍濃度制限
酵素緩衝液１０μｌ、滅菌水７８μｌ、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＶ２μｌを加え、２時間反応させ、フェノール処理、
エタノール沈殿を行った。次に、ライゲーションキット
（宝酒造株式会社）を用いて、リンカーｐＥｃｏＲＩ
（宝酒造株式会社）と４℃で一晩反応させた。この溶液
で形質転換された大腸菌よりプラスミドｐＳＪ００８を
得た。

【００１９】また、プラスミドｐＢＳＫ３０２から調節
遺伝子をコードする遺伝子を含む領域、約３ｋｂ Ｅｃ
ｏＲＶ断片を、０．７％アガロース電気泳動により分離
し、ゲルより切り出し回収した。制限酵素による切断
は、１０μｌのｐＢＳＫ３０２に対し、１０倍濃度制限
酵素緩衝液１０μｌ、滅菌水７８μｌ、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＶ２μｌを加え３７℃にて２時間反応させることによ
り行った。この３ｋｂＥｃｏＲＶ断片１μｌを、Ｅｃｏ
ＲＩで切断したｐＵＣ１１８とライゲーションキット
（宝酒造株式会社）を用いて４℃で一晩反応させること
によりｐＵＣ１１８への挿入を行い、ｐＢＳＫ２０２を
作製した。プラスミドｐＢＳＫ２０２を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで切断後、３ｋｂ断片を０．７％アガロース電気泳
動により分離し、ゲルより切り出し回収した。

【００２０】次に、プラスミドｐＳＪ００８を制限酵素
ＥｃｏＲｌで部分分解後、さらにアルカリフォスタファ
ーゼ（宝酒造株式会社）でＢＡＰ処理を行い、８．７２
ｋｂ断片を０．７％アガロース電気泳動により分離し、
ゲルより切り出し回収した。これとｐＢＳＫ２０２由来
の３ｋｂＥｃｏＲＩ断片とをライゲーションキット（宝
酒造株式会社）を用いて４℃で一晩反応させることによ
り、プラスミドｐＳＪ０２３を作製した（図２）。

【００２１】5) プラスミドｐＳＪ０２３を含むロドコ
ッカス属細菌形質転換体のニトリルヒドラターゼ活性 工程 3) と同様にして、プラスミドｐＳＪ０２３のロド
コカッス ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４への導入を
行い組み換え体（ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ０２３）
を作製した。こうして作製したロドコッカス属細菌組換
え体をＭＹＫ培地（５０μg/mlカナマイシン含有）１０
ｍｌに接種し、３０℃で２４時間前培養した。この培養
物１ｍｌを培地１００ｍｌ（１．５％グルコース、０．
１％バクトイーストエキス、１％グルタミン酸ナトリウ
ム、０．０５％ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、０．０５％Ｋ₂ ＨＰ
Ｏ₄ 、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０１％塩化コ
バルト、pH 7.2、５０μg/mlカナマイシン含有）に加
え、３０℃で６０時間培養した。集菌後、この菌体を５
０ｍＭリン酸緩衝液（pH 7.7）に懸濁し、その一部を
２．５％アクリロニトリルを含有する同緩衝液中で１０
℃、１０分反応させた。１Ｎ塩酸の添加により反応を止
め、反応液中の生成アクリルアミドを高速液体クロマト
グラフィーを用いて測定したところ４０ｍＭのアクリル
アミドの生成が認められた。

【００２２】6) ロドコッカス属細菌用発現ベクターの
作製 工程 4) で作製したプラスミドｐＳＪ０２３からニトリ
ルヒドラターゼ遺伝子を含む領域を取り除くことにより
汎用的な発現ベクターを作製した。１０μｌのｐＳＪ０
２３に対し、１０倍濃度制限酵素緩衝液１０μｌ、滅菌
水７８μｌ、制限酵素ＸｂａＩ２μｌを加え３７℃にて
２時間反応させた。その後ライゲーションキット（宝酒
造株式会社）を用いて４℃で一晩反応させた。次に、工
程 1-2) 同様大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルを作
製し、この反応液を１０μｌ加え、０℃で３０分放置し
た。その後、４２℃で３０秒間ヒートショックを与え０
℃で２分間冷却後、ＳＯＣ培地を０．８ｍｌ加え３７℃
にて６０分間振盪培養した。これを２００μｌずつカナ
マイシン１００μｇ／ｍｌ含有のＬＢ寒天培地にまき、
３７℃で培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コ
ロニーについて工程 1-3) 同様プラスミドの調製を行っ
た。こうして得られたプラスミドをｐＲＹ０１と命名
し、ロドコッカス属発現ベクターとした。

【００２３】

【発明の効果】ロドコッカス属細菌用発現ベクターに外
来遺伝子を組み込みロドコッカス属菌体内に共存させる
ことにより、構成的に外来遺伝子の発現を可能にせしめ
る。

【００２４】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２４４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus
erythropolis） 株名：ＳＫ９２−Ｂ１ 配列： MetAlaGlyAlaAspValHisAlaGlnGlyGlyThrAsnArgArg 15 AlaArgIleLeuValValAspAspGluLysHisValArgThrMet 30 ValThrTrpGlnLeuGluSerGluAsnPheAspValValAlaAla 45 AlaAspGlyAspAlaAlaLeuArgGlnValThrGluSerAlaPro 60 AspLeuMetValLeuAspLeuSerLeuProGlyLysGlyGlyLeu 75 GluValLeuAlaThrValArgArgThrAspAlaLeuProIleVal 90 ValLeuThrAlaArgArgAspGluThrGluArgIleValAlaLeu 105 AspLeuGlyAlaAspAspTyrValIleLysProPheSerProArg 120 GluLeuAlaAlaArgIleArgAlaValLeuArgArgThrThrAla 135 GluProProHisGluAlaAlaValGlnArgPheGlyAspLeuGlu 150 IleAspThrAlaAlaArgGluValArgLeuHisGlyIleProLeu 165 GluPheThrThrLysGluPheAspLeuLeuAlaTyrMetAlaAla 180 SerProMetGlnValPheSerArgArgArgLeuLeuLeuGluVal 195 TrpArgSerSerProAspTrpGlnGlnAspAlaThrValThrGlu 210 HisValHisArgIleArgArgLysIleGluGluAspProThrLys 225 ProThrIleLeuGlnThrValArgGlyAlaGlyTyrArgPheAsp 240 GlyGluArgAla 244

【００２５】配列番号：２ 配列の長さ：５３４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus
erythropolis） 株名：ＳＫ９２−Ｂ１ 配列： MetMetThrAspThrLeuProSerSerSerArgTrpThrLeuGlu 15 GlyProHisLeuGlnProLeuGlnGlyGluAlaLeuAlaAspLeu 30 HisAlaArgThrLeuGluMetIleThrSerGlyArgGluLeuHis 45 GluThrLeuGluValValAlaArgGlyIleGluGluLeuMetPro 60 GlyLysArgCysAlaIleLeuLeuLeuAspAsnThrGlyProVal 75 LeuArgCysGlyAlaAlaProThrMetSerAlaProTrpArgArg 90 TrpIleAspSerLeuValProGlyProMetSerGlyGlyCysGly 105 ThrAlaValHisLeuGlyGluProValIleSerTyrAspValAla 120 AspAspProLysPheArgGlyProPheArgAlaAlaAlaLeuHis 135 GluGlyIleArgAlaCysTrpSerThrProValThrSerGlyAsp 150 GlyThrIleLeuGlyThrPheAlaIleTyrGlySerValProAla 165 PheProAlaGlnGlnAspValAlaLeuValThrGlnCysThrAsp 180 LeuThrAlaAlaValIleThrThrHisLysLeuHisGlnAspLeu 195 SerMetSerGluGluArgPheArgArgThrPheAspSerAsnVal 210 ValGlyMetAlaLeuLeuAspGluSerGlySerSerIleArgVal 225 AsnAspThrLeuCysAlaLeuThrAlaAlaProProArgArgLeu 240 LeuGlyHisProMetGlnGluIleLeuThrAlaAspSerArgGlu 255 ProPheAlaAsnGlnLeuSerSerIleArgGluGlyLeuThrAsp 270 GlyGlyGlnLeuAspGlyArgIleGlnThrThrGlyGlyArgTrp 285 IleProValHisLeuSerIleSerGlyMetTrpThrThrGluArg 300 GluPheMetGlyPheSerValHisValLeuAspIleSerGluArg 315 LeuAlaAlaGluArgAlaArgGluGluGlnLeuGluAlaGluVal 330 AlaArgHisThrAlaGluGluAlaSerArgAlaLysSerThrPhe 345 LeuSerGlyMetThrHisGluValGlnThrProMetAlaValIle 360 ValGlyPheSerGluLeuLeuGluThrLeuAspLeuAspGluGlu 375 ArgArgGlnCysAlaTyrArgLysIleGlyGluAlaAlaLysHis 390 ValIleSerLeuValAspAspValLeuAspIleAlaLysIleGlu 405 AlaGlyAlaIleThrLeuGlnAspGluAspIleAspLeuSerGlu 420 GluValAlaThrIleValGluMetLeuGluProIleAlaArgAsp 435 ArgAspArgAspValCysLeuArgTyrValProProGlnThrPro 450 ValHisValCysSerAspArgArgArgValArgGluValLeuLeu 465 AsnIleValSerAsnGlyIleLysTyrAsnArgLeuGlyGlyVal 480 ValAspProProThrGlySerGlyAlaAlaArgProArgGlnThr 495 ArgAlaProAspTyrProAlaThrProThrThrAsnSerSerSer 510 ProSerThrGlyTrpGluSerArgProArgGlyCysLysGlyArg 525 GlySerValLeuArgSerProAlaArg 534

【００２６】配列番号：３ 配列の長さ：７３５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus
erythropolis） 株名：ＳＫ９２−Ｂ１ 配列： ATG GCC GGA GCG GAC GTC CAC GCC CAG GGT GGC ACG AAT CGA CGT 45 GCA CGC ATC CTC GTC GTC GAC GAC GAA AAA CAC GTG CGC ACG ATG 90 GTG ACG TGG CAA CTC GAA TCG GAG AAT TTC GAT GTT GTC GCT GCG 135 GCA GAC GGA GAT GCG GCA CTG CGT CAG GTC ACT GAG AGC GCA CCC 180 GAT TTG ATG GTG CTC GAT CTG TCG CTC CCG GGG AAA GGT GGG TTG 225 GAA GTG CTC GCT ACG GTC CGC AGA ACC GAT GCA CTG CCT ATC GTC 270 GTG CTC ACA GCA CGC CGC GAT GAA ACC GAA CGG ATC GTC GCG CTG 315 GAT CTC GGC GCC GAT GAC TAC GTC ATC AAA CCG TTC TCC CCG CGG 360 GAA TTG GCC GCC CGT ATC CGG GCA GTG CTT CGT CGA ACC ACA GCT 405 GAA CCC CCA CAC GAG GCG GCG GTT CAG CGA TTC GGT GAC CTA GAG 450 ATC GAC ACC GCT GCG CGC GAG GTT CGG CTC CAC GGG ATA CCG CTC 495 GAG TTC ACC ACC AAG GAG TTC GAT CTG CTG GCC TAT ATG GCC GCA 540 TCA CCG ATG CAG GTC TTC AGC CGA CGC AGA TTG TTG CTC GAG GTG 585 TGG CGA TCG TCG CCC GAC TGG CAG CAG GAC GCC ACC GTG ACC GAG 630 CAC GTG CAC CGC ATT CGC CGC AAG ATC GAA GAA GAT CCC ACC AAA 675 CCG ACG ATC CTG CAG ACA GTG CGG GGA GCC GGT TAC CGT TTC GAC 720 GGA GAG CGT GCA TGA 735

【００２７】配列番号：４ 配列の長さ：１６０５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus
erythropolis） 株名：ＳＫ９２−Ｂ１ 配列： ATG ATG ACC GAC ACA CTG CCC TCC TCG TCC CGT TGG ACC CTT GAA 45 GGC CCG CAT CTC CAG CCG CTG CAG GGT GAG GCC CTG GCG GAT CTC 90 CAC GCC CGT ACG CTC GAG ATG ATC ACT TCC GGG AGA GAA TTG CAC 135 GAG ACA CTC GAG GTG GTC GCC CGC GGC ATC GAG GAA CTG ATG CCG 180 GGC AAA CGT TGC GCA ATT CTG TTG CTC GAC AAC ACC GGA CCG GTA 225 TTG CGC TGC GGC GCG GCC CCA ACA ATG AGC GCG CCG TGG CGC CGG 270 TGG ATC GAC AGC CTC GTC CCT GGT CCG ATG TCG GGT GGC TGC GGC 315 ACA GCG GTT CAC CTC GGC GAG CCG GTT ATT TCC TAT GAC GTG GCC 360 GAT GAC CCG AAA TTC CGC GGC CCC TTC CGC GCC GCA GCC CTC CAC 405 GAG GGC ATA CGT GCC TGC TGG TCC ACC CCC GTC ACA AGC GGA GAC 450 GGC ACG ATC CTC GGC ACT TTC GCG ATC TAC GGA TCC GTG CCG GCG 495 TTC CCC GCA CAA CAG GAC GTT GCC CTG GTC ACC CAA TGC ACC GAC 540 CTG ACC GCT GCC GTC ATC ACC ACC CAC AAA CTT CAT CAA GAT CTG 585 AGC ATG AGC GAG GAG CGG TTC CGA CGC ACC TTC GAT TCC AAT GTC 630 GTC GGC ATG GCA CTT CTC GAC GAA TCC GGC TCC AGC ATC CGC GTC 675 AAC GAC ACC CTG TGC GCG TTG ACC GCA GCT CCG CCA CGG CGC CTC 720 CTC GGC CAC CCC ATG CAG GAG ATA CTC ACC GCC GAC TCC CGG GAA 765 CCG TTC GCC AAT CAG TTG TCC TCC ATC CGT GAG GGA TTG ACC GAC 810 GGC GGA CAG CTC GAC GGA CGA ATC CAA ACC ACC GGA GGT CGG TGG 855 ATT CCG GTG CAC CTG TCC ATC AGC GGT ATG TGG ACC ACG GAG CGG 900 GAG TTC ATG GGA TTC AGC GTC CAT GTC CTG GAC ATC TCC GAG CGC 945 CTG GCC GCC GAA CGC GCC CGC GAG GAA CAA CTC GAG GCC GAG GTT 990 GCC CGC CAT ACC GCG GAG GAA GCC AGT CGC GCC AAG TCC ACG TTC 1035 CTG TCC GGC ATG ACG CAC GAG GTC CAA ACG CCC ATG GCC GTT ATC 1080 GTC GGA TTC AGT GAG CTA CTC GAG ACG CTG GAC CTG GAT GAA GAA 1125 CGT CGT CAG TGC GCC TAC CGC AAG ATC GGC GAA GCC GCG AAA CAC 1170 GTG ATC TCC CTG GTC GAC GAC GTT CTC GAT ATA GCC AAG ATC GAA 1215 GCC GGC GCT ATC ACT CTG CAG GAC GAA GAC ATC GAC CTG TCC GAA 1260 GAA GTT GCC ACC ATC GTG GAG ATG CTC GAG CCC ATC GCC CGT GAC 1305 CGT GAC CGT GAC GTC TGC CTG CGG TAC GTC CCG CCG CAG ACA CCG 1350 GTG CAC GTG TGC TCG GAC CGG CGG CGG GTG CGG GAA GTG CTG CTC 1395 AAC ATC GTC TCC AAC GGG ATC AAG TAC AAT CGG CTC GGT GGT GTC 1440 GTC GAC CCC CCA ACA GGA TCA GGG GCT GCT CGT CCG CGT CAG ACG 1485 AGG GCC CCG GAC TAC CCA GCG ACG CCG ACG ACG AAC TCT TCG AGC 1530 CCT TCA ACC GGC TGG GAG TCG AGG CCA CGG GGG TGC AAG GGT CGG 1575 GGC TCG GTC TTG CGC TCT CCC GCG CGC TGA 1605

【００２８】

【図面の簡単な説明】

【図１】組換え体ｐＳＪ００２の作製図

【図２】組換え体ｐＳＪ０２３の作製図

【図３】発現ベクターｐＲＹ０１の制限酵素地図

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記 (1)〜(4) のＤＮＡ領域を含んでな
   るロドコッカス（Rhodococcus)属細菌用発現ベクター。 (1) ニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性化する作用
   をもつ調節因子をコードするＤＮＡ領域 (2) (1) の調節因子により活性化を受けるニトリラーゼ
   遺伝子プロモーターＤＮＡ領域 (3) ロドコッカス属細菌細胞内で増殖可能なＤＮＡ領域 (4) ロドコッカス属細菌において機能する薬剤耐性ＤＮ
   Ａ領域
2. 【請求項２】 調節因子が配列番号１のアミノ酸配列を
   有するポリペプチドおよび配列番号２のアミノ酸配列を
   有するポリペプチドの２成分より構成される請求項１記
   載の発現ベクター。
3. 【請求項３】 ポリペプチドをコードする遺伝子が配列
   番号３および配列番号４の塩基配列を有する請求項２記
   載の発現ベクター。
4. 【請求項４】 ロドコッカス属細菌細胞内で複製増殖可
   能なＤＮＡ領域がプラスミドｐＲＣ００１、ｐＲＣ００
   ２、ｐＲＣ００３およびｐＲＣ００４からなる群から選
   ばれる少なくとも１種のプラスミド由来である請求項１
   記載の発現ベクター。
5. 【請求項５】 薬剤耐性ＤＮＡ領域がトランスポゾンＴ
   Ｎ９０３由来のカナマイシン耐性遺伝子からなる請求項
   １記載の発現ベクター。
6. 【請求項６】 請求項１〜５に記載の発現ベクターにニ
   トリルヒドラターゼ遺伝子を組み込んだ組換え体プラス
   ミド。
7. 【請求項７】 請求項６記載の組換え体プラスミドによ
   り形質転換されたロドコッカス属に属する微生物。