JPH0731480A - Ｌ−グルタミルｔＲＮＡレダクターゼをコードするＤＮＡ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 キサントモナス属の微生物由来のＬ−グルタ
ミルｔＲＮＡレダクターゼをコードするＤＮＡ断片、当
該ＤＮＡ断片を含有する組換え体ＤＮＡ及び当該組換え
体ＤＮＡを保有する形質転換体細胞。 【効果】 この組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体細
胞を用いれば、活性の高いＬ−グルタミルｔＲＮＡレダ
クターゼを多量に製造することができ、グルタミン酸−
１−セミアルデヒド、ひいてはＡＬＡ、ビタミンＢ₁₂、
ヘム、クロロフィル、フィコビリン等の工業的生産が可
能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＬ−グルタミルｔＲＮＡ
からグルタミン酸−１−セミアルデヒドを生合成する酵
素であるＬ−グルタミルｔＲＮＡレダクターゼをコード
するＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を含む組換え体ＤＮＡ及
び該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体細胞に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】大腸菌において、５−アミノレブリン酸
（ＡＬＡ）要求性に関与する遺伝子としてｈｅｍＡ、ｈ
ｅｍＬ、ｈｅｍＭなどが知られており、ｈｅｍＡはＬ−
グルタミルｔＲＮＡレダクターゼをコードしているとい
われている。ｈｅｍＬ遺伝子欠損はｈｅｍＬ遺伝子のほ
かｈｅｍＡ遺伝子によっても相補でき、同様にｈｅｍＭ
遺伝子欠損はｈｅｍＭ遺伝子のほかｈｅｍＡ遺伝子によ
って相補できることが知られている。

【０００３】Ｌ−グルタミルｔＲＮＡレダクターゼは補
酵素ＮＡＤＰＨの存在下でＬ−グルタミルｔＲＮＡから
グルタミン酸−１−セミアルデヒドを生合成する酵素で
あり、ビタミンＢ₁₂、ヘム、クロロフィル、フィコビリ
ン等の生物における必須因子の生合成に重要な役割を果
している。従って、より活性の高いＬ−グルタミルｔＲ
ＮＡレダクターゼを見出し、この酵素を量産することは
グルタミン酸−１−セミアルデヒド、ひいてはＡＬＡ、
ビタミンＢ₁₂、ヘム、クロロフィル、フィコビリン等の
量産化のために極めて重要である。

【０００４】一方、酵素などのタンパク質の量産技術と
しての組換えＤＮＡ技術の発展は、近年めざましく、数
多くの酵素、生理活性タンパク等が組換えＤＮＡ技術を
利用した量産化に成功している。Ｌ−グルタミルｔＲＮ
Ａレダクターゼに関しては、キサントモナス属の微生物
のＬ−グルタミルｔＲＮＡレダクターゼ遺伝子は分離さ
れておらず、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）［例えば、Ｖｅｒｋａｍｐ Ｅ．，Ｃｈｅｌｍ
Ｂ．Ｋ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７１，４
７２８−４７３５（１９８９）］、ネズミチフス菌（Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）［例え
ば、Ｅｌｌｉｏｔｔ Ｔ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ １７１，３９４８−３９６０（１９８９）］、枯
草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）［例え
ば、Ｐｅｔｒｉｃｅｋ Ｍ．，ｅｔｃ．，Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ １７２，２２５０−２２５８（１９
９０）］、藍藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）［例え
ば、Ｖｅｒｋａｍｐ Ｅ．，ｅｔｃ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６７，８２７５−８２８０（１９９２）］
等から遺伝子が単離され、これら遺伝子の組換え及び微
生物への導入が報告されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
従来のＬ−グルタミルｔＲＮＡレダクターゼは、グルタ
ミン酸−１−セミアルデヒド生産活性が十分でない等の
問題がある。従って、本発明の目的はよりグルタミン酸
−１−セミアルデヒド生産活性の高いＬ−グルタミルｔ
ＲＮＡレダクターゼを遺伝子組換え技術により量産する
方法を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者は植物
病原菌であるキサントモナス属の微生物に着目し、種々
検討した結果、当該菌体よりＬ−グルタミルｔＲＮＡレ
ダクターゼ遺伝子（ｈｅｍＡ）を単離し、その遺伝子の
組換え及び形質転換体細胞の採取に成功し、本発明を完
成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明はキサントモナス属の微
生物由来のＬ−グルタミルｔＲＮＡレダクターゼをコー
ドするＤＮＡ断片、当該断片を含有する組換え体ＤＮ
Ａ、及び当該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体細胞
を提供するものである。

【０００８】本発明のＤＮＡ断片は、例えば遺伝子組換
え技術を利用して次の如くして製造される。すなわち、
まず、ＤＮＡ供与体としてキサントモナス属の微生物を
用い、当該微生物からゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素
などにより切断する。一方、ファージ、プラスミド等の
ベクターを制限酵素等を用いてＤＮＡ断片の挿入が可能
な制限酵素末端を作製する。これらゲノムＤＮＡの断片
及びベクターとをＤＮＡリガーゼを用いて結合させて、
組換えベクターを得る。得られた組換えベクターを複製
可能な宿主微生物に移入し、目的の組換えＤＮＡを保有
する形質転換体細胞を選択し、当該形質転換体細胞より
目的の組換えＤＮＡを分離し、次いで当該組換えＤＮＡ
から本発明ＤＮＡ断片を採取することにより製造され
る。

【０００９】本発明ＤＮＡ断片の供与体としてはキサン
トモナス属の微生物であれば特に制限されないが、例え
ばキサントモナス カンペストリス ファセオリＨＵＴ
８９２５（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒ
ｉｓ ｐｖ．ｐｈａｓｅｏｌｉ，広島大学菌寄第８９２
５号（ＨＵＴ８９２５））、キサントモナス アルビリ
ネンスＡＴＣＣ３３９１５（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
ａｌｂｉｌｉｎｅａｎｓ ＡＴＣＣ３３９１５）、キサ
ントモナス アクソノポディスＡＴＣＣ１９３１２（Ｘ
ａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ＡＴＣ
Ｃ１９３１２）、キサントモナス フラガリエＡＴＣＣ
３３２３９（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｆｒａｇａｒｉａ
ｅ ＡＴＣＣ３３２３９）、キサントモナス グラミニ
スＡＴＣＣ２９０９１（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｇｒ
ａｍｉｎｉｓ ＡＴＣＣ２９０９１）、キサントモナス
マルトフィリアＡＴＣＣ１３６３７（Ｘａｎｔｈｏｍ
ｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ＡＴＣＣ１３６３
７）等が挙げられる。

【００１０】これらのキサントモナス属の微生物からの
ゲノムＤＮＡの抽出は、該微生物の培養菌体より、例え
ばＭａｒｍｕｒの方法〔Ｍａｒｍｕｒ Ｊ．，Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．３，２０８−２１８（１９６１）〕に従
い、菌体を溶菌した後、フェノール抽出による除タンパ
ク処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、ア
ルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組合せて行な
うのが好ましい。

【００１１】分離されたゲノムＤＮＡを切断するには、
制限酵素処理により行なわれるが、特にＳａｕ３ＡＩ等
を用いた部分消化が好ましい。

【００１２】ベクターとしては、宿主微生物内で自律的
に増殖し得るファージ又はプラスミドから遺伝子組換え
用として構築されたものを用いるのが好ましい。プラス
ミドとしては、例えば大腸菌を宿主とするｐＢＲ３２
２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８、ブルースクリプト、Ｍ
１３ファージ、λファージ等が好ましい。これらのベク
ターは、例えばＢａｍＨＩ等の制限酵素を用いてＤＮＡ
断片の挿入が可能な制限酵素末端を作製し、必要に応じ
て脱リン酸処理した後に用いられる。

【００１３】ゲノムＤＮＡ断片とベクター断片との結合
は、公知のＤＮＡリガーゼ、例えばＴ４ ＤＮＡリガー
ゼ等を用いて行なうのが好ましい。

【００１４】得られた組換えベクターを移入させる宿主
微生物としては、組換えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖
可能で、かつ外来性ＤＮＡの形質が発現するものであれ
ばよいが、例えば大腸菌を用いることができる。また、
目的とする組換えＤＮＡを保有する形質転換体のスクリ
ーニングの容易性を考慮すると、ＡＬＡ要求性の大腸菌
を宿主として用いるのが好ましい。このようなＡＬＡ要
求性の大腸菌の１例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｍ９１２
６７（微工研菌寄第１２８２７号 ＦＥＲＭＰ−１２８
２７）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｉ１４などがある。

【００１５】宿主微生物に組換えベクターを移入する方
法としては、例えばコンピテントセル法、マイクロイン
ジェクション法、接合法等のいずれの方法も用いること
ができる。形質転換体の選択は、用いたベクターの薬剤
耐性マーカーとＡＬＡ要求性の喪失とを指標として行な
うのが好ましい。

【００１６】このようにして選択された形質転換体細胞
から組換えＤＮＡを採取するには、常法により抽出すれ
ばよく、得られた組換えＤＮＡから本発明のＤＮＡ断片
を切り出すには、制限酵素などを用いればよい。

【００１７】かくして得られる本発明ＤＮＡ断片の塩基
配列は、ジデオキシ法で解読し、決定することができ
る。配列番号２に本発明ＤＮＡ断片の塩基配列を、配列
番号１に当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を、
配列番号３に後記実施例で単離した約１．６ｋｂｐの塩
基配列及び推定アミノ酸配列を示す。

【００１８】本発明ＤＮＡ断片を発現させ、Ｌ−グルタ
ミルｔＲＮＡレダクターゼを生産するには、上記の形質
転換体細胞又は当該ＤＮＡ断片をさらに強力なプロモー
タを有するベクターに組込んだ組換えプラスミドで形質
転換された細胞を栄養培地にて培養し、その培養物から
採取すればよい。この場合における培養は、用いる形質
転換体細胞の性質に応じて行なわれる。

【００１９】

【発明の効果】本発明の組換え体ＤＮＡを保有する形質
転換体細胞を用いれば、活性の高いＬ−グルタミルｔＲ
ＮＡレダクターゼを多量に生産することができ、ＡＬ
Ａ、ビタミンＢ₁₂、ヘム、クロロフィル、フィコビリン
等の工業的生産が可能となる。

【００２０】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではな
い。

【００２１】実施例１ （１）キサントモナス属の微生物からのゲノムＤＮＡ抽
出及び精製 ２×ＴＹ（バクトトリプトン１６ｇ／ｌ、酵母エキス１
０ｇ／ｌ、食塩５ｇ／ｌ、pH６．８）にキサントモナス
カンペストリス ファセオリＨＵＴ８９２５（Ｘａｎ
ｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｐｈ
ａｓｅｏｌｉＨＵＴ８９２５）を植菌し２８℃にて３日
間培養した。培養液を遠心により集菌し、Ｍａｒｍｕｒ
の方法［Ｍａｒｍｕｒ Ｊ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
３，２０８−２１８（１９６１）］に従いゲノムＤＮＡ
を抽出し、精製した。

【００２２】（２）キサントモナス属の微生物のゲノム
ＤＮＡの消化 実施例１−（１）で取得したキサントモナス属の微生物
の精製ゲノムＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（宝酒造
社）により部分消化した。１％アガロースゲルを用いて
上記制限酵素の部分消化反応液を電気泳動した。緩衝液
としてＴＡＥ［Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ
（１９８９）］を用いた。電気泳動後のアガロースゲル
は１μｇ／mlのエチジウムブロマイドに１５分間浸せき
した後水洗し、紫外線照射によりＤＮＡ断片の蛍光を確
認した。サイズマーカーとしてλファージＤＮＡのＨｉ
ｎｄIII 消化物（宝酒造社）を同時に電気泳動し、ＤＮ
Ａ断片の泳動距離から分子量を求めた。２〜９ｋｂｐの
ゲノムＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ部分消化物を含むアガロー
スゲルを切り出し、細かく切り刻みＤＮＡ回収用フィル
ター付き遠心チューブＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造社）
を用いてＤＮＡ断片の回収を行なった。上記ＤＮＡ回収
液に１／１０倍容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（pH７．０）
と２倍容量のエタノールを添加し−８０℃にて２時間冷
却し、９，０００×ｇにて１０分間遠心し、ＤＮＡのペ
レットを得た。７０％エタノールを適量加え遠心管の壁
面を２回リンスし、エタノールを簡単に除去した後減圧
乾燥した。乾燥ＤＮＡを水３０μｌに溶解した。

【００２３】（３）プラスミドベクターｐＵＣ１８の調
製 ｐＵＣ１８を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社）により完
全消化した。同反応液にアルカリホスファターゼ（仔牛
腸由来）、（宝酒造社）を添加し、ベクターの開裂した
末端を脱リン酸化した。上記反応液に１／１０倍容量の
３Ｍ酢酸ナトリウム（pH７．０）と２倍容量のエタノー
ルを添加し−８０℃にて２時間冷却し、９，０００×ｇ
にて１０分間遠心し、ＤＮＡのペレットを得た。７０％
エタノールを適量加え遠心管の壁面を２回リンスし、エ
タノールを簡単に除去した後減圧乾燥した。乾燥ＤＮＡ
を水３０μｌに溶解した。

【００２４】（４）キサントモナス属の微生物の遺伝子
バンク調製 実施例１−（２）で調製したキサントモナス属の微生物
のゲノム由来の２〜９ｋｂｐのＤＮＡ断片と、実施例１
−（３）で調製した大腸菌のプラスミドの開裂反応物を
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社）を用いて結合し、遺
伝子バンクを調製した。

【００２５】（５）ＡＬＡ要求性大腸菌への遺伝子バン
クの形質転換 最終濃度が５０μｇ／mlになるようにＡＬＡを添加した
ＬＢ（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／
ｌ、食塩５ｇ／ｌ、pH６．８）３mlにＡＬＡ要求性大腸
菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｉ１４を植菌し３７℃にて終夜培養し
た。上記と同様のＡＬＡを添加したＬＢ ２０mlを新し
く用意し、上記の前培養液０．２mlを添加した後３７℃
にて２時間培養した。培養後、培養液を氷中で急冷し４
℃にて遠心集菌した。菌体を氷冷しておいた５０mM塩化
カルシウム１０mlに懸濁し氷中で３０分間放置した。再
度４℃にて遠心集菌し、予め氷冷しておいた５０mM塩化
カルシウム１mlに懸濁しコンピテントセルを調製した。
上記コンピテントセル１００μｌに実施例１−（４）で
調製した遺伝子バンク１０μｌを混合し氷中で３０分間
放置した。４２℃にて２分間熱処理を行ない、ＬＢ １
mlを添加し３７℃にて１時間放置した。放置後、遠心集
菌した菌体を、最終濃度が１００μｇ／mlになるように
アンピシリンを添加したＬＢ平板培地（ＬＢに寒天１５
ｇ／ｌを添加して調製する）に塗布し３７℃にて３日間
培養した。なお、この形質転換は、宿主としてＥ．ｃｏ
ｌｉ Ｍ９１２６７（ＦＥＲＭＰ１２８２７）を使用す
ることも可能である。

【００２６】（６）キサントモナス属の微生物由来のＬ
−グルタミルｔＲＮＡレダクターゼ遺伝子を含む形質転
換体の分離とプラスミドの精製 実施例１−（５）に示したＡＬＡ要求性大腸菌の形質転
換実験において、アンピシリン耐性を示し、かつＡＬＡ
要求性を喪失した形質転換体によるコロニーを取得し
た。最終濃度が１００μｇ／mlになるようにアンピシリ
ンを添加したＬＢ １mlにて上記の形質転換体を培養し
た。遠心により集菌し、溶液Ｉ（５０mM Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣｌpH８．５、１５％ Ｓｕｃｒｏｓｅ、５０mM ＥＤ
ＴＡ、０．２％リゾチーム）１００μｌに懸濁し、室温
で１５分間放置した。溶液II（０．１％ＳＤＳ、０．２
Ｎ ＮａＯＨ）２００μｌを添加し、氷中にて５分間冷
却した。さらに溶液III （３Ｍ酢酸ナトリウムpH４．
８）１５０μｌを添加し、氷中にて３０分間冷却した。
遠心を行ない、上清をデカンテーションにより分離し２
倍容量のエタノールを添加し−８０℃にて２時間冷却
し、９，０００×ｇにて１０分間遠心し、ＤＮＡのペレ
ットを得た。７０％エタノールを適量加え遠心管の壁面
を２回リンスし、エタノールを簡単に除去した後減圧乾
燥し精製プラスミドｐＸＣ００８を得た。ＡＬＡ要求性
を失った形質転換体から分離したｐＸＣ００８は実施例
１−（５）に示した方法でＡＬＡ要求性大腸菌へ再度形
質転換し、プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片によりＡ
ＬＡ要求性大腸菌がＡＬＡ要求性を喪失することを確認
した。すなわち、ｐＸＣ００８にＡＬＡ要求性を相補す
る遺伝子が含まれていることを確認した。

【００２７】（７）ｐＸＣ００８の解析 実施例１−（６）の方法で精製したプラスミドｐＸＣ０
０８を適当な緩衝液中で過剰量の制限酵素（ＳｐｈＩ、
ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ）で消化した。実施
例１−（２）に示した電気泳動を行ない、各ＤＮＡ断片
の分子量を解析し、制限酵素地図を作成した。その結
果、ｐＸＣ００８は図１に示される構造を有していた。
すなわち、ベクターｐＵＣ１８のクローニングサイトに
あるＢａｍＨＩ切断部位に、両端にＳａｕ３ＡＩ切断部
位を有するＤＮＡ断片が挿入されていた。

【００２８】（８）ＡＬＡ要求性を相補するＤＮＡ断片
の機能領域の限定 実施例１−（６）で精製したｐＸＣ００８をＥｃｏＲＩ
とＰｓｔＩで消化し、実施例１−（２）の方法を用い
て、電気泳動法とＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造社）によ
り１．６ｋｂｐ付近のＤＮＡ断片を回収した。Ｔ４ Ｄ
ＮＡリガーゼの結合反応により該ＤＮＡ断片をｐＵＣ１
８のＥｃｏＲＩとＰｓｔＩの切断部位に挿入しｐＸＣ８
１０を作成した。ｐＸＣ８１０は実施例１−（５）に示
した方法でＡＬＡ要求性大腸菌へ形質転換し、プラスミ
ドに挿入されたＤＮＡ断片によりＡＬＡ要求性大腸菌が
ＡＬＡ要求性を喪失することを確認した。すなわち、ｐ
ＸＣ８１０にｈｅｍＭ遺伝子の欠損を相補する遺伝子が
含まれていることを確認した。

【００２９】（９）ＡＬＡ要求性を相補するＤＮＡ断片
の塩基配列解析 ＡＬＡ要求性を相補するＤＮＡ断片を含む約１．６ｋｂ
ｐの塩基配列を解析した。すなわち、Ｔ７ シークエン
シングキット（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー
社）を用いたＭ１３ダイデオキシ法［Ｓａｎｇｅｒ，
Ｆ．ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．，７４，５４６３−５４６７（１９７７）］にてシ
ークエンシング反応を行ない、自動レーザー蛍光シーク
エンシング装置（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジ
ー社）を用いてＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。その
結果、その全塩基配列は配列番号３、遺伝子産物のコー
ド領域は配列番号２、当該配列番号２より推定されるア
ミノ酸配列は配列番号１であることが判明した。

【００３０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：４２６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Thr Leu Trp Val Leu Gly Leu Asn His Gln Thr Ala Pro Val Asp 5 10 15 Leu Arg Glu Arg Ala Ala Phe Ala Gly Asp Ala Leu Pro Arg Ala Leu 20 25 30 Glu Ser Leu Arg Ala Leu Pro Gln Val Ser Glu Ala Ala Leu Leu Ser 35 40 45 Thr Cys Asn Arg Thr Glu Leu Tyr Ala Met Ala Glu Glu Ala His Ser 50 55 60 Leu Val Thr Trp Leu Glu Thr His Ala Pro Ala Leu Ser Gly Tyr Leu 65 70 75 80 Tyr Gln His Gln Glu Ala Glu Ala Val Arg His Leu Phe Arg Val Ala 85 90 95 Thr Gly Leu Asp Ser Met Val Leu Gly Glu Pro Gln Ile Leu Gly Gln 100 105 110 Val Lys Asp Ala Trp Ala Val Ala Arg Ala His Gly Thr Leu Gly Ser 115 120 125 Gly Leu Asp Arg Leu Phe Gln Gln Thr Phe Ser Val Ala Lys Arg Ala 130 135 140 Arg Thr Asp Thr Arg Val Gly Ala Asn Pro Val Ser Val Ala Ser Thr 145 150 155 160 Ala Val Arg Leu Ala Gln Asp Ser Phe Ala Arg Leu Asn Glu Ser Thr 165 170 175 Val Leu Leu Ile Gly Ala Gly Glu Thr Ile Glu Leu Ala Ala Lys His 180 185 190 Leu Ser Glu Gly Arg Val Arg Arg Leu Leu Ile Ala Asn Arg Thr Leu 195 200 205 Ala His Ala Gln Thr Leu Ala Ser Gln His Gly Gly Phe Ala Leu Pro 210 215 220 Leu Thr Asp Leu Glu Arg His Leu Ala Glu Ala Asp Val Val Phe Ser 225 230 235 240 Ala Thr Ala Ala Arg Glu Pro Leu Val Thr Arg Ala Gln Val Glu Gln 245 250 255 Ala Leu Arg Ala Arg Lys Arg Lys Pro Met Leu Leu Phe Asp Leu Ala 260 265 270 Val Pro Arg Asp Ile Glu Ala Ser Val Gly Glu Leu Ser Asp Ala Tyr 275 280 285 Leu Tyr Thr Val Asp Asp Leu Glu Arg Ala Val Glu Asp Asn Arg Arg 290 295 300 Gly Arg Arg Glu Ala Ala Asp Gln Ala Glu Ala Ile Ile Asp Leu Gln 305 310 315 320 Val Ala Arg Tyr Val Glu Thr Leu Gln Ala Asn Ala Arg Gln Ala Pro 325 330 335 Leu Lys Arg Leu Arg Ala Phe Gly Asp Ser Thr Arg Asp Glu Leu Leu 340 345 350 Ala Lys Ala Arg Gln Gln Leu His Asn Gly Lys Pro Ala Asp Glu Val 355 360 365 Leu Glu Gln Leu Ala His Ala Leu Thr Asn Arg Leu Leu His Pro Pro 370 375 380 Thr Ala Ala Leu Arg Asp Ala Ala Leu Asn Asn Asp Leu Glu Leu Thr 385 390 395 400 Thr Ala Ala Asp Arg Leu Phe Pro Glu Lys Pro Gly Leu Pro Thr Ser 405 410 415 Pro His Ser Tyr Pro Asp Arg Glu Asp Arg 420 425

【００３１】

【配列表】

配列番号：２ 配列の長さ：１２７８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：キサントモナス カンペストリス ファセオリ
（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐ
ｖ．ｐｈａｓｅｏｌｉ） 株名：ＨＵＴ８９２５ 配列： ATGACGTTGT GGGTGCTCGG ACTGAATCAC CAGACCGCAC CTGTGGACCT GCGCGAACGC 60 GCGGCGTTCG CAGGTGATGC GCTGCCGCGC GCGCTCGAAT CGCTGCGTGC GCTGCCCCAG 120 GTAAGCGAGG CCGCGCTGCT GTCCACCTGC AACCGTACCG AGTTGTATGC GATGGCCGAG 180 GAGGCGCACA GCCTGGTCAC CTGGCTGGAA ACCCACGCGC CCGCTCTGAG CGGTTATCTG 240 TACCAGCACC AGGAAGCCGA GGCGGTGCGT CATCTGTTCC GTGTCGCCAC CGGGCTGGAT 300 TCGATGGTAT TGGGAGAACC CCAGATCCTC GGCCAGGTGA AGGACGCCTG GGCAGTGGCG 360 CGGGCGCACG GCACGCTGGG CAGCGGGTTG GACCGGCTGT TCCAACAGAC CTTTTCGGTG 420 GCCAAGCGCG CGCGTACCGA CACCCGTGTC GGCGCAAATC CGGTGTCGGT CGCATCCACG 480 GCGGTGCGGC TGGCACAAGA CTCGTTTGCC CGGCTCAACG AATCGACGGT GTTGCTGATC 540 GGTGCCGGCG AAACCATCGA ACTGGCGGCC AAGCATCTGA GCGAAGGCCG CGTGCGCCGC 600 CTGCTGATCG CCAACCGCAC CCTGGCCCAC GCGCAGACGC TCGCCAGCCA GCATGGCGGC 660 TTCGCCTTGC CGCTGACCGA TCTGGAACGC CACCTGGCCG AGGCGGATGT GGTGTTCTCG 720 GCCACCGCTG CACGTGAGCC GCTGGTGACC CGCGCACAGG TGGAACAGGC ATTGCGCGCA 780 CGCAAGCGCA AGCCGATGCT GCTGTTCGAC CTCGCGGTGC CGCGCGATAT CGAGGCCTCG 840 GTGGGCGAAT TGAGCAACGC CTACCTGTAC ACGGTGGACG ACCTGGAACG CGCGGTCGAA 900 GACAACCGCC GTGGCCGCCG CGAAGCGGCC GACCAGGCCG AAGCCATCAT CGACCTGCAA 960 GTGGCGCGCT ATGTCGAAAC CTTGCAGGCC AACGCGCGCC AGGCACCGCT CAAGCGGCTG 1020 CGCGCCTTTG GCGATAGCAC CCGCGACGAG CTGCTGGCCA AGGCGCGCCA GCAGTTGCAC 1080 AACGGCAAAC CGGCCGACGA AGTGCTGGAG CAGCTGGCGC ATGCGCTGAC CAACCGCCTG 1140 CTGCATCCGC CCACCGCCGC ACTACGCGAT GCCGCGCTCA ACAACGACCT GGAATTGACC 1200 ACCGCGGCCG ACCGGCTGTT TCCGGAAAAA CCGGGGTTAC CAACATCCCC CCATAGCTAC 1260 CCCGATCGTG AGGACCGA 1278

【００３２】

【配列表】

配列番号：３ 配列の長さ：１５４９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：キサントモナス カンペストリス ファセオリ
（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐ
ｖ．ｐｈａｓｅｏｌｉ） 株名：ＨＵＴ８９２５ 配列： GAATTCGCCG GCCAGCACCG GCTCCAGCGA CGAAGTACCG GCACTGCTTG GGAGCGGAGC 60 GGCGGTGCTT TCTTGGGTGC TGCGGTGGCA CTGGCGGAGA CTGCGACCAG CAGAAGAACA 120 CACAGGATGC GAATCGGTAC AGGCATCGGG GGCAACCGGG CCGTAAAATG GGGCCCTGAA 180 TGGCCGCCAG CTTATCGCAA GCAACTGAAC A ATG ACG TTG TGG GTG CTC GGA 232 Met Thr Leu Trp Val Leu Gly 5 CTG AAT CAC CAG ACC GCA CCT GTG GAC CTG CGC GAA CGC GCG GCG TTC 280 Leu Asn His Gln Thr Ala Pro Val Asp Leu Arg Glu Arg Ala Ala Phe 10 15 20 GCA GGT GAT GCG CTG CCG CGC GCG CTC GAA TCG CTG CGT GCG CTG CCC 328 Ala Gly Asp Ala Leu Pro Arg Ala Leu Glu Ser Leu Arg Ala Leu Pro 25 30 35 CAG GTA AGC GAG GCC GCG CTG CTG TCC ACC TGC AAC CGT ACC GAG TTG 376 Gln Val Ser Glu Ala Ala Leu Leu Ser Thr Cys Asn Arg Thr Glu Leu 40 45 50 55 TAT GCG ATG GCC GAG GAG GCG CAC AGC CTG GTC ACC TGG CTG GAA ACC 424 Tyr Ala Met Ala Glu Glu Ala His Ser Leu Val Thr Trp Leu Glu Thr 60 65 70 CAC GCG CCC GCT CTG AGC GGT TAT CTG TAC CAG CAC CAG GAA GCC GAG 472 His Ala Pro Ala Leu Ser Gly Tyr Leu Thr Gln His Gln Glu Ala Glu 75 80 85 GCG GTG CGT CAT CTG TTC CGT GTC GCC ACC GGG CTG GAT TCG ATG GTA 520 Ala Val Arg His Leu Phe Arg Val Ala Thr Gly Leu Asp Ser Met Val 90 95 100 TTG GGA GAA CCC CAG ATC CTC GGC CAG GTG AAG GAC GCC TGG GCA GTG 568 Leu Gly Glu Pro Gln Ile Leu Gly Gln Val Lys Asp Ala Trp Ala Val 105 110 115 GCG CGG GCG CAC GGC ACG CTG GGC AGC GGG TTG GAC CGG CTG TTC CAA 616 Ala Arg Ala His Gly Thr Leu Gly Ser Gly Leu Asp Arg Leu Phe Gln 120 125 130 135 CAG ACC TTT TCG GTG GCC AAG CGC GCG CGT ACC GAC ACC CGT GTC GGC 664 Gln Thr Phe Ser Val Ala Lys Arg Ala Arg Thr Asp Thr Arg Val Gly 140 145 150 GCA AAT CCG GTG TCG GTC GCA TCC ACG GCG GTG CGG CTG GCA CAA GAC 712 Ala Asn Pro Val Ser Val Ala Ser Thr Ala Val Arg Leu Ala Gln Asp 155 160 165 TCG TTT GCC CGG CTC AAC GAA TCG ACG GTG TTG CTG ATC GGT GCC GGC 760 Ser Phe Ala Arg Leu Asn Glu Ser Thr Val Leu Leu Ile Gly Ala Gly 170 175 180 GAA ACC ATC GAA CTG GCG GCC AAG CAT CTG AGC GAA GGC CGC GTG CGC 808 Glu Thr Ile Glu Leu Ala Ala Lys His Leu Ser Glu Gly Arg Val Arg 185 190 195 CGC CTG CTG ATC GCC AAC CGC ACC CTG GCC CAC GCG CAG ACG CTC GCC 856 Arg Leu Leu Ile Ala Asn Arg Thr Leu Ala His Ala Gln Thr Leu Ala 200 205 210 215 AGC CAG CAT GGC GGC TTC GCC TTG CCG CTG ACC GAT CTG GAA CGC CAC 904 Ser Gln His Gly Gly Phe Ala Leu Pro Leu Thr Asp Leu Glu Arg His 220 225 230 CTG GCC GAG GCG GAT GTG GTG TTC TCG GCC ACC GCT GCA CGT GAG CCG 952 Leu Ala Glu Ala Asp Val Val Phe Ser Ala Thr Ala Ala Arg Glu Pro 235 240 245 CTG GTG ACC CGC GCA CAG GTG GAA CAG GCA TTG CGC GCA CGC AAG CGC 1000 Leu Val Thr Arg Ala Gln Val Glu Gln Ala Leu Arg Ala Arg Lys Arg 250 255 260 AAG CCG ATG CTG CTG TTC GAC CTG GCG GTG CCG CGC GAT ATC GAG GCC 1048 Lys Pro Met Leu Leu Phe Asp Leu Ala Val Pro Arg Asp Ile Glu Ala 265 270 275 TCG GTG GGC GAA TTG AGC GAC GCC TAC CTG TAC ACG GTG GAC GAC CTG 1096 Ser Val Gly Glu Leu Ser Asp Ala Tyr Leu Tyr Thr Val Asp Asp Leu 280 285 290 295 GAA CGC GCG GTC GAA GAC AAC CGC CGT GGC CGC CGC GAA GCG GCC GAC 1144 Glu Arg Ala Val Glu Asp Asn Arg Arg Gly Arg Arg Glu Ala Ala Asp 300 305 310 CAG GCC GAA GCC ATC ATC GAC CTG CAA GTG GCG CGC TAT GTC GAA ACC 1192 Gln Ala Glu Ala Ile Ile Asp Leu Gln Val Ala Arg Tyr Val Glu Thr 315 320 325 TTG CAG GCC AAC GCG CGC CAG GCA CCG CTC AAG CGG CTG CGC GCC TTT 1240 Leu Gln Ala Asn Ala Arg Gln Ala Pro Leu Lys Arg Leu Arg Ala Phe 330 335 340 GGC GAT AGC ACC CGC GAC GAG CTG CTG GCC AAG GCG CGC CAG CAG TTG 1288 Gly Asp Ser Thr Arg Asp Glu Leu Leu Ala Lys Ala Arg Gln Gln Leu 345 350 355 CAC AAC GGC AAA CCG GCC GAC GAA GTG CTG GAG CAG CTG GCG CAT GCG 1336 His Asn Gly Lys Pro Ala Asp Glu Val Leu Glu Gln Leu Ala His Ala 360 365 370 375 CTG ACC AAC CGC CTG CTG CAT CCG CCC ACC GCC GCA CTA CGC GAT GCC 1384 Leu Thr Asn Arg Leu Leu His Pro Pro Thr Ala Ala Leu Arg Asp Ala 380 385 390 GCG CTC AAC AAC GAC CTG GAA TTG ACC ACC GCG GCC GAC CGG CTG TTT 1432 Ala Leu Asn Asn Asp Leu Glu Leu Thr Thr Ala Ala Asp Arg Leu Phe 395 400 405 CCG GAA AAA CCG GGG TTA CCA ACA TCC CCC CAT AGC TAC CCC GAT CGT 1480 Pro Glu Lys Pro Gly Leu Pro Thr Ser Pro His Ser Tyr Pro Asp Arg 410 415 420 GAG GAC CGA TGA CGCCGACCCT GCGCCGTAAG CTCGAAGCGC TGGCCGAGCG 1532 Glu Asp Arg 425 CCGCGAAAGA ACTGCAG 1549

【図面の簡単な説明】

【図１】キサントモナス カンペストリス ファセオリ
由来のＬ−グルタミルｔＲＮＡレダクターゼ遺伝子を含
むＤＮＡ断片の制限酵素地図及びｐＸＣ８１０調製手順
を示す説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:64） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:64）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 キサントモナス属の微生物由来のＬ−グ
   ルタミルｔＲＮＡレダクターゼをコードするＤＮＡ断
   片。
2. 【請求項２】 配列番号１で示されるアミノ酸配列をコ
   ードするものである請求項１記載のＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 配列番号２で示される塩基配列を有する
   ものである請求項１記載のＤＮＡ断片。
4. 【請求項４】 請求項１記載のＤＮＡ断片を含有する組
   換え体ＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項１記載のＤＮＡ断片を含有する組
   換え体ＤＮＡを保有する形質転換体細胞。