JPH06113861A - グルタミン酸−1−セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼをコードするdna断片 - Google Patents
グルタミン酸−1−セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼをコードするdna断片Info
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- JPH06113861A JPH06113861A JP26865592A JP26865592A JPH06113861A JP H06113861 A JPH06113861 A JP H06113861A JP 26865592 A JP26865592 A JP 26865592A JP 26865592 A JP26865592 A JP 26865592A JP H06113861 A JPH06113861 A JP H06113861A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 プロピオン酸菌に属する微生物由来のグルタ
ミン酸−1−セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼ
をコードするDNA断片、当該DNA断片を含有する組
換え体DNA及び当該組換え体DNAを保有する形質転
換体細胞。 【効果】 この組換え体DNAを保有する形質転換体細
胞を用いれば、活性の高いGSAアミノトランスフェラ
ーゼを多量に製造することができ、ALA、ビタミンB
12等の工業的生産が可能となる。
ミン酸−1−セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼ
をコードするDNA断片、当該DNA断片を含有する組
換え体DNA及び当該組換え体DNAを保有する形質転
換体細胞。 【効果】 この組換え体DNAを保有する形質転換体細
胞を用いれば、活性の高いGSAアミノトランスフェラ
ーゼを多量に製造することができ、ALA、ビタミンB
12等の工業的生産が可能となる。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明はグルタミン酸−1−セミ
アルデヒド(GSA)から5−アミノレブリン酸(AL
A)を生合成する酵素であるGSAアミノトランスフェ
ラーゼをコードするDNA断片、該DNA断片を含む組
換え体DNA及び該組換え体DNAを保有する形質転換
体細胞に関する。
アルデヒド(GSA)から5−アミノレブリン酸(AL
A)を生合成する酵素であるGSAアミノトランスフェ
ラーゼをコードするDNA断片、該DNA断片を含む組
換え体DNA及び該組換え体DNAを保有する形質転換
体細胞に関する。
【0002】
【従来の技術】GSAアミノトランスフェラーゼは補酵
素ピリドキサールリン酸の存在下でGSAからALAを
生合成する酵素であり、ビタミンB12、ヘム、クロロフ
ィル、フィコビリン等の生物における必須因子の生合成
に重要な役割を果している。従って、より活性の高いG
SAアミノトランスフェラーゼを見出し、この酵素を量
産することはALA、ひいてはビタミンB12、ヘム、ク
ロロフィル、フィコビリン等の量産化のために極めて重
要である。
素ピリドキサールリン酸の存在下でGSAからALAを
生合成する酵素であり、ビタミンB12、ヘム、クロロフ
ィル、フィコビリン等の生物における必須因子の生合成
に重要な役割を果している。従って、より活性の高いG
SAアミノトランスフェラーゼを見出し、この酵素を量
産することはALA、ひいてはビタミンB12、ヘム、ク
ロロフィル、フィコビリン等の量産化のために極めて重
要である。
【0003】一方、酵素などのタンパク質の量産技術と
しての組換えDNA技術の発展は、近年めざましく、数
多くの酵素、生理活性タンパク等が組換えDNA技術を
利用した量産化に成功している。GSAアミノトランス
フェラーゼに関しては、プロピオン酸菌のGSAアミノ
トランスフェラーゼ遺伝子は分離されておらず、大腸菌
(Esherichia coli)〔例えば、Ila
g L.L.,etc.,J.Bacteriolog
y 173,3408−3413(1991)〕、枯草
菌(Bacillus subtilis)〔例えば、
Pertricek M.,etc.,J.Bacte
riology 172,2250−2258(199
0)〕、ネズミチフス菌(Salmonella ty
phimurium)〔例えば、Elliott
T.,etc.,J.Bacteriology 17
2,7071−7084(1990)〕等から遺伝子が
単離され、これらの遺伝子の組換え及び微生物への導入
が報告されている。
しての組換えDNA技術の発展は、近年めざましく、数
多くの酵素、生理活性タンパク等が組換えDNA技術を
利用した量産化に成功している。GSAアミノトランス
フェラーゼに関しては、プロピオン酸菌のGSAアミノ
トランスフェラーゼ遺伝子は分離されておらず、大腸菌
(Esherichia coli)〔例えば、Ila
g L.L.,etc.,J.Bacteriolog
y 173,3408−3413(1991)〕、枯草
菌(Bacillus subtilis)〔例えば、
Pertricek M.,etc.,J.Bacte
riology 172,2250−2258(199
0)〕、ネズミチフス菌(Salmonella ty
phimurium)〔例えば、Elliott
T.,etc.,J.Bacteriology 17
2,7071−7084(1990)〕等から遺伝子が
単離され、これらの遺伝子の組換え及び微生物への導入
が報告されている。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
従来のGSAアミノトランスフェラーゼは、ALA生産
活性が充分でない等の問題がある。従って、本発明の目
的はよりALA生産活性の高いGSAアミノトランスフ
ェラーゼを遺伝子組換え技術により量産する方法を提供
することにある。
従来のGSAアミノトランスフェラーゼは、ALA生産
活性が充分でない等の問題がある。従って、本発明の目
的はよりALA生産活性の高いGSAアミノトランスフ
ェラーゼを遺伝子組換え技術により量産する方法を提供
することにある。
【0005】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者はビタ
ミンB12を生産することが知られているプロピオン酸菌
に着目し、種々検討した結果、当該菌体よりGSAアミ
ノトランスフェラーゼ遺伝子(hemL)を単離し、そ
の遺伝子の組換え及び形質転換細胞の採取に成功し、本
発明を完成するに至った。
ミンB12を生産することが知られているプロピオン酸菌
に着目し、種々検討した結果、当該菌体よりGSAアミ
ノトランスフェラーゼ遺伝子(hemL)を単離し、そ
の遺伝子の組換え及び形質転換細胞の採取に成功し、本
発明を完成するに至った。
【0006】すなわち、本発明はプロピオン酸菌に属す
る微生物由来のGSAアミノトランスフェラーゼをコー
ドするDNA断片、当該断片を含有する組換え体DN
A、及び当該組換え体DNAを保有する形質転換体細胞
を提供するものである。
る微生物由来のGSAアミノトランスフェラーゼをコー
ドするDNA断片、当該断片を含有する組換え体DN
A、及び当該組換え体DNAを保有する形質転換体細胞
を提供するものである。
【0007】本発明のDNA断片は、例えば遺伝子組換
え技術を利用して次の如くして製造される。すなわち、
まず、DNA供与体としてビタミンB12生産菌であるプ
ロピオン酸菌を用い、当該プロピオン酸菌からゲノムD
NAを抽出し、制限酵素などにより切断する。一方、フ
ァージ、プラスミド等のベクターを制限酵素等を用いて
リニヤーにする。これらのゲノムDNAの断片とベクタ
ーとをDNAリガーゼを用いて結合させて、組換えベク
ターを得る。得られた組換えベクターを複製可能な宿主
微生物に移入し、目的の組換えDNAを保有する形質転
換体細胞を選択し、当該形質転換体細胞より目的の組換
えDNAを分離し、次いで当該組換えDNAから本発明
DNA断片を採取することにより製造される。
え技術を利用して次の如くして製造される。すなわち、
まず、DNA供与体としてビタミンB12生産菌であるプ
ロピオン酸菌を用い、当該プロピオン酸菌からゲノムD
NAを抽出し、制限酵素などにより切断する。一方、フ
ァージ、プラスミド等のベクターを制限酵素等を用いて
リニヤーにする。これらのゲノムDNAの断片とベクタ
ーとをDNAリガーゼを用いて結合させて、組換えベク
ターを得る。得られた組換えベクターを複製可能な宿主
微生物に移入し、目的の組換えDNAを保有する形質転
換体細胞を選択し、当該形質転換体細胞より目的の組換
えDNAを分離し、次いで当該組換えDNAから本発明
DNA断片を採取することにより製造される。
【0008】本発明DNA断片の供与体であるプロピオ
ン酸菌に属する微生物としては、ビタミンB12生産能を
有するものであれば特に制限されないが、例えばプロピ
オン酸菌フロイデンライヒ IFO12424(Pro
pionibacterium freudenrei
chii IFO12424)、プロピオン酸菌アクネ
ス ATCC6919(Propionibacter
ium acnesATCC6919)、プロピオン酸
菌アシディプロピオニシ ATCC25562(Pro
pionibacterium acidipropi
oniciATCC25562)、プロピオン酸菌ジェ
ンシニ ATCC4868(Propionibact
erium jensenii ATCC4868)、
プロピオン酸菌グラナロサム ATCC25564(P
ropionibacterium granulos
um ATCC25564)、プロピオン酸菌リンフォ
フィラム ATCC27520(Propioniba
cterium lymphophilum ATCC
27520)、プロピオン酸菌トエニ ATCC487
4(Propionibacterium thoen
ii ATCC4874)、ユーバクテリウム アエロ
ファシエンス ATCC25986(Eubacter
ium aerofaciens ATCC2598
6)、ユーバクテリウム アラクトリチカム ATCC
23263(Eubacterium alactol
yticum ATCC23263)、ユーバクテリウ
ムアンガスタム ATCC43737(Eubacte
rium angustum ATCC43737)、
ユーバクテリウム レクタル ATCC33656(E
ubacterium rectale ATCC33
656)等が挙げられる。
ン酸菌に属する微生物としては、ビタミンB12生産能を
有するものであれば特に制限されないが、例えばプロピ
オン酸菌フロイデンライヒ IFO12424(Pro
pionibacterium freudenrei
chii IFO12424)、プロピオン酸菌アクネ
ス ATCC6919(Propionibacter
ium acnesATCC6919)、プロピオン酸
菌アシディプロピオニシ ATCC25562(Pro
pionibacterium acidipropi
oniciATCC25562)、プロピオン酸菌ジェ
ンシニ ATCC4868(Propionibact
erium jensenii ATCC4868)、
プロピオン酸菌グラナロサム ATCC25564(P
ropionibacterium granulos
um ATCC25564)、プロピオン酸菌リンフォ
フィラム ATCC27520(Propioniba
cterium lymphophilum ATCC
27520)、プロピオン酸菌トエニ ATCC487
4(Propionibacterium thoen
ii ATCC4874)、ユーバクテリウム アエロ
ファシエンス ATCC25986(Eubacter
ium aerofaciens ATCC2598
6)、ユーバクテリウム アラクトリチカム ATCC
23263(Eubacterium alactol
yticum ATCC23263)、ユーバクテリウ
ムアンガスタム ATCC43737(Eubacte
rium angustum ATCC43737)、
ユーバクテリウム レクタル ATCC33656(E
ubacterium rectale ATCC33
656)等が挙げられる。
【0009】これらのプロピオン酸菌からのゲノムDN
Aの抽出は、プロピオン酸菌の培養菌体より、例えばM
armurの方法〔Marmur J.,J.Mol.
Biol.3,208−218(1961)〕に従い、
菌体を溶菌した後、フェノール抽出による除蛋白処理、
プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール
沈澱、遠心分離等の方法を適宜組み合せて行なうのが好
ましい。
Aの抽出は、プロピオン酸菌の培養菌体より、例えばM
armurの方法〔Marmur J.,J.Mol.
Biol.3,208−218(1961)〕に従い、
菌体を溶菌した後、フェノール抽出による除蛋白処理、
プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール
沈澱、遠心分離等の方法を適宜組み合せて行なうのが好
ましい。
【0010】分離されたゲノムDNAを切断するには、
制限酵素処理により行なわれるが、特にSau 3AI
等を用いた部分消化が好ましい。
制限酵素処理により行なわれるが、特にSau 3AI
等を用いた部分消化が好ましい。
【0011】ベクターとしては、宿主微生物内で自律的
に増殖し得るファージ又はプラスミドから遺伝子組換え
用として構築されたものを用いるのが好ましい。プラス
ミドとしては、例えば大腸菌を宿主とするpBR32
2、pBR325、pUC12、pUC13、pUC1
8、pCC19、ブルースクリプト等が好ましい。これ
らのベクターは、例えばBamHI等の制限酵素を用い
てリニヤーとし、必要に応じて脱リン酸処理をした後に
用いられる。
に増殖し得るファージ又はプラスミドから遺伝子組換え
用として構築されたものを用いるのが好ましい。プラス
ミドとしては、例えば大腸菌を宿主とするpBR32
2、pBR325、pUC12、pUC13、pUC1
8、pCC19、ブルースクリプト等が好ましい。これ
らのベクターは、例えばBamHI等の制限酵素を用い
てリニヤーとし、必要に応じて脱リン酸処理をした後に
用いられる。
【0012】ゲノムDNA断片とベクター断片との結合
は、公知のDNAリガーゼ、例えばT4 DNAリガー
ゼ等を用いて行なうのが好ましい。
は、公知のDNAリガーゼ、例えばT4 DNAリガー
ゼ等を用いて行なうのが好ましい。
【0013】得られた組換えベクターを移入させる宿主
微生物としては、組換えDNAが安定かつ自律的に増殖
可能で、かつ外来性DNAの形質が発現するものであれ
ばよいが、例えば大腸菌を用いることができる。また、
目的とする組換えDNAを保有する形質転換体のスクリ
ーニングの容易性を考慮すると、ALA要求性の大腸菌
を宿主として用いるのが好ましい。このようなALA要
求性の大腸菌の一例としては、ALA生合成経路の一つ
であるC5経路に関するGSAアミノトランスフェラー
ゼ遺伝子欠損株がある。
微生物としては、組換えDNAが安定かつ自律的に増殖
可能で、かつ外来性DNAの形質が発現するものであれ
ばよいが、例えば大腸菌を用いることができる。また、
目的とする組換えDNAを保有する形質転換体のスクリ
ーニングの容易性を考慮すると、ALA要求性の大腸菌
を宿主として用いるのが好ましい。このようなALA要
求性の大腸菌の一例としては、ALA生合成経路の一つ
であるC5経路に関するGSAアミノトランスフェラー
ゼ遺伝子欠損株がある。
【0014】宿主微生物に組換えベクターを移入する方
法としては、例えば塩化カルシウム法、コンピテントセ
ル法、マイクロインジェクション法等のいずれの方法も
用いることができる。形質転換体の選択は、用いたベク
ターの薬剤耐性マーカーとALA要求性の喪失とを指標
として行なうのが好ましい。
法としては、例えば塩化カルシウム法、コンピテントセ
ル法、マイクロインジェクション法等のいずれの方法も
用いることができる。形質転換体の選択は、用いたベク
ターの薬剤耐性マーカーとALA要求性の喪失とを指標
として行なうのが好ましい。
【0015】このようにして選択された形質転換体細胞
から組換えDNAを採取するには、常法により抽出すれ
ばよく、得られた組換えDNAから本発明のDNA断片
を切り出すには、制限酵素などを用いればよい。
から組換えDNAを採取するには、常法により抽出すれ
ばよく、得られた組換えDNAから本発明のDNA断片
を切り出すには、制限酵素などを用いればよい。
【0016】かくして得られる本発明DNA断片の塩基
配列は、ジデオキシ法で解読し、決定することができ
る。配列番号1に本発明DNA断片の塩基配列を、配列
番号2に当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を、
配列番号3に後記実施例で単離した1.6kbpの塩基
配列及び推定アミノ酸配列を示す。
配列は、ジデオキシ法で解読し、決定することができ
る。配列番号1に本発明DNA断片の塩基配列を、配列
番号2に当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を、
配列番号3に後記実施例で単離した1.6kbpの塩基
配列及び推定アミノ酸配列を示す。
【0017】本発明DNA断片を発現させ、GSAアミ
ノトランスフェラーゼを生産するには、上記の形質転換
体細胞又は当該DNA断片をさらに強力なプロモータを
有するベクターに組み込んだ組換えプラスミドで形質転
換された細胞を栄養培地にて培養し、その培養物から採
取すればよい。この場合における培養は、用いる形質転
換体細胞の性質に応じて行なわれる。
ノトランスフェラーゼを生産するには、上記の形質転換
体細胞又は当該DNA断片をさらに強力なプロモータを
有するベクターに組み込んだ組換えプラスミドで形質転
換された細胞を栄養培地にて培養し、その培養物から採
取すればよい。この場合における培養は、用いる形質転
換体細胞の性質に応じて行なわれる。
【0018】
【発明の効果】本発明の組換え体DNAを保有する形質
転換体細胞を用いれば、活性の高いGSAアミノトラン
スフェラーゼを多量に製造することができ、ALA、ビ
タミンB12等の工業的生産が可能となる。
転換体細胞を用いれば、活性の高いGSAアミノトラン
スフェラーゼを多量に製造することができ、ALA、ビ
タミンB12等の工業的生産が可能となる。
【0019】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではな
い。
が、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではな
い。
【0020】実施例1 (1)プロピオン酸菌からのゲノムDNA抽出及び精製 グルコース完全培地(ポリペプトン12.5g/l、ビ
タミンフリーカザミノ酸11.0g/l、酵母エキス
2.5g/l、リン酸水素ナトリウム2水和物2.25
g/l、リン酸カリウム1.76g/l、L−システイ
ン0.5g/l、塩化マグネシウム6水和物0.4g/
l、硫酸鉄7水和物0.01g/l、パントテン酸カル
シウム4mg/l、ビオチン0.3mg/l、グルコース1
0.0g/l、硝酸カリウム5.0g/l、塩化コバル
ト6水和物0.18mg/l、モリブデン酸ナトリウム1
mg/l、pH7)にプロピオン酸菌Propioniba
cterium freudenreichii IF
O12424を植菌し28℃にて3日間培養した。培養
液を遠心により集菌し、Marmurの方法〔Marm
ur J.,J.Mol.Biol.3,208−21
8(1961)〕に従いゲノムDNAを抽出し、精製し
た。
タミンフリーカザミノ酸11.0g/l、酵母エキス
2.5g/l、リン酸水素ナトリウム2水和物2.25
g/l、リン酸カリウム1.76g/l、L−システイ
ン0.5g/l、塩化マグネシウム6水和物0.4g/
l、硫酸鉄7水和物0.01g/l、パントテン酸カル
シウム4mg/l、ビオチン0.3mg/l、グルコース1
0.0g/l、硝酸カリウム5.0g/l、塩化コバル
ト6水和物0.18mg/l、モリブデン酸ナトリウム1
mg/l、pH7)にプロピオン酸菌Propioniba
cterium freudenreichii IF
O12424を植菌し28℃にて3日間培養した。培養
液を遠心により集菌し、Marmurの方法〔Marm
ur J.,J.Mol.Biol.3,208−21
8(1961)〕に従いゲノムDNAを抽出し、精製し
た。
【0021】(2)プロピオン酸菌のゲノムDNAの切
断 実施例1−(1)で取得したプロピオン酸菌の精製ゲノ
ムDNAを制限酵素Sau 3AI(宝酒造社)により
部分消化した。1%アガロースゲルを用いて上記制限酵
素の部分消化反応液を電気泳動した。緩衝液としてTA
E(ColdSpring Harbor Labor
atory Press,Molecular Clo
ning Second Edition(198
9)〕を用いた。電気泳動後のアガロースゲルは1μg
/mlのエチジウムブロマイドに15分間浸せきした後水
洗し、紫外線照射によりDNA断片の蛍光を確認した。
サイズマーカーとしてλファージDNAのHindIII
消化物(宝酒造社)を同時に電気泳動し、DNA断片の
泳動距離から分子量を求めた。4〜9kbpのゲノムD
NAのSau3AI部分消化物を含むアガロースゲルを
切り出し、細かく切り刻みDNA回収用フィルター付き
遠心チューブSUPREC−01(宝酒造社)を用いて
DNA断片の回収を行なった。上記反応液に1/10倍
容量の3M酢酸ナトリウム(pH7.0)と2倍容量のエ
タノールを添加し−80℃にて2時間冷却し、9,00
0×gにて10分間遠心し、DNAのペレットを得た。
70%エタノールを適量加え遠心管の壁面を2回リンス
し、エタノールを簡単に除去した後減圧乾燥した。乾燥
DNAを水30μlに溶解した。
断 実施例1−(1)で取得したプロピオン酸菌の精製ゲノ
ムDNAを制限酵素Sau 3AI(宝酒造社)により
部分消化した。1%アガロースゲルを用いて上記制限酵
素の部分消化反応液を電気泳動した。緩衝液としてTA
E(ColdSpring Harbor Labor
atory Press,Molecular Clo
ning Second Edition(198
9)〕を用いた。電気泳動後のアガロースゲルは1μg
/mlのエチジウムブロマイドに15分間浸せきした後水
洗し、紫外線照射によりDNA断片の蛍光を確認した。
サイズマーカーとしてλファージDNAのHindIII
消化物(宝酒造社)を同時に電気泳動し、DNA断片の
泳動距離から分子量を求めた。4〜9kbpのゲノムD
NAのSau3AI部分消化物を含むアガロースゲルを
切り出し、細かく切り刻みDNA回収用フィルター付き
遠心チューブSUPREC−01(宝酒造社)を用いて
DNA断片の回収を行なった。上記反応液に1/10倍
容量の3M酢酸ナトリウム(pH7.0)と2倍容量のエ
タノールを添加し−80℃にて2時間冷却し、9,00
0×gにて10分間遠心し、DNAのペレットを得た。
70%エタノールを適量加え遠心管の壁面を2回リンス
し、エタノールを簡単に除去した後減圧乾燥した。乾燥
DNAを水30μlに溶解した。
【0022】(3)プラスミドベクターpUC18の調
製 pUC18を制限酵素BamHI(宝酒造社)により完
全消化した。同反応液にアルカリホスファターゼ(仔牛
腸由来,宝酒造社)を添加し、ベクターの開裂した末端
の脱リン酸化を行なった。上記反応液に1/10倍容量
の3M酢酸ナトリウム(pH7.0)と2倍容量のエタノ
ールを添加し−80℃にて2時間冷却し、9,000×
gにて10分間遠心し、DNAのペレットを得た。70
%エタノールを適量加え遠心管の壁面を2回リンスし、
エタノールを簡単に除去した後減圧乾燥した。乾燥DN
Aを水30μlに溶解した。
製 pUC18を制限酵素BamHI(宝酒造社)により完
全消化した。同反応液にアルカリホスファターゼ(仔牛
腸由来,宝酒造社)を添加し、ベクターの開裂した末端
の脱リン酸化を行なった。上記反応液に1/10倍容量
の3M酢酸ナトリウム(pH7.0)と2倍容量のエタノ
ールを添加し−80℃にて2時間冷却し、9,000×
gにて10分間遠心し、DNAのペレットを得た。70
%エタノールを適量加え遠心管の壁面を2回リンスし、
エタノールを簡単に除去した後減圧乾燥した。乾燥DN
Aを水30μlに溶解した。
【0023】(4)Propionibacteriu
m freudenreichiiの遺伝子バンク調製 実施例1−(2)で調製したプロピオン酸菌のゲノム由
来の4〜9kbpのDNA断片と、実施例1−(3)で
調製した大腸菌のプラスミドの開裂反応物をT4 DN
Aリガーゼ(宝酒造社)を用いて結合し、遺伝子バンク
を調製した。
m freudenreichiiの遺伝子バンク調製 実施例1−(2)で調製したプロピオン酸菌のゲノム由
来の4〜9kbpのDNA断片と、実施例1−(3)で
調製した大腸菌のプラスミドの開裂反応物をT4 DN
Aリガーゼ(宝酒造社)を用いて結合し、遺伝子バンク
を調製した。
【0024】 (5)ALA要求性大腸菌への遺伝子バンクの形質転換 最終濃度が50μg/mlになるようにALAを添加した
LB(バクトトリプトン10g/l、酵母エキス5g/
l、食塩5g/l、pH6.8)3mlにALA要求性大腸
菌FERM P−12827(微工研菌寄第12827
号,FERMP−12827)を植菌し37℃にて終夜
培養した。上記と同様のALAを添加したLB 20ml
を新しく用意し、上記の前培養液0.2mlを添加した後
37℃にて2時間培養した。培養後、培養液を氷中で急
冷し4℃にて遠心集菌した。菌体を氷冷しておいた50
mM塩化カルシウム10mlに懸濁し氷中で30分間放置し
た。再度4℃にて遠心集菌し、氷冷しておいた50mM塩
化カルシウム1mlに懸濁しコンピテントセルを調製し
た。上記コンピテントセル100μlに実施例1−
(4)で調製した遺伝子バンク10μlを混合し氷中で
30分間放置した。42℃にて2分間熱処理を行ない、
LB 1mlを添加し37℃にて1時間放置した。放置
後、遠心集菌した菌体を、最終濃度が100μg/mlに
なるようにアンピシリンを添加したLB平板培地(LB
に寒天15g/lを添加して調製する)に塗布し37℃
にて2日間培養した。
LB(バクトトリプトン10g/l、酵母エキス5g/
l、食塩5g/l、pH6.8)3mlにALA要求性大腸
菌FERM P−12827(微工研菌寄第12827
号,FERMP−12827)を植菌し37℃にて終夜
培養した。上記と同様のALAを添加したLB 20ml
を新しく用意し、上記の前培養液0.2mlを添加した後
37℃にて2時間培養した。培養後、培養液を氷中で急
冷し4℃にて遠心集菌した。菌体を氷冷しておいた50
mM塩化カルシウム10mlに懸濁し氷中で30分間放置し
た。再度4℃にて遠心集菌し、氷冷しておいた50mM塩
化カルシウム1mlに懸濁しコンピテントセルを調製し
た。上記コンピテントセル100μlに実施例1−
(4)で調製した遺伝子バンク10μlを混合し氷中で
30分間放置した。42℃にて2分間熱処理を行ない、
LB 1mlを添加し37℃にて1時間放置した。放置
後、遠心集菌した菌体を、最終濃度が100μg/mlに
なるようにアンピシリンを添加したLB平板培地(LB
に寒天15g/lを添加して調製する)に塗布し37℃
にて2日間培養した。
【0025】(6)Propionibacteriu
m freudenreichii由来のGSAアミノ
トランスフェラーゼ遺伝子を含む形質転換体の分離と組
換えプラスミドの精製 実施例1−(5)に示した大腸菌FERM P−128
27の形質転換実験において、アンピシリン耐性を示
し、かつALA要求性を喪失した形質転換体によるコロ
ニーを取得した。最終濃度が100μg/mlになるよう
にアンピシリンを添加したLB 1mlにて上記の形質転
換体を培養した。遠心により集菌し、溶液I(50mM
Tris−HClpH8.5、15% Sucrose、
50mM EDTA、0.2%リゾチーム)100μlに
懸濁し、室温で15分間放置した。溶液II(0.1%S
DS、0.2N NaOH)200μlを添加し、氷中
にて5分間冷却した。さらに溶液III (3M酢酸ナトリ
ウムpH4.8)150μlを添加し、氷中にて30分間
冷却した。遠心を行ない、上清をデカンテーションによ
り分離し2倍容量のエタノールを添加し−80℃にて2
時間冷却し、9,000×gにて10分間遠心し、DN
Aのペレットを得た。70%エタノールを適量加え遠心
管の壁面を2回リンスし、エタノールを簡単に除去した
後減圧乾燥し精製プラスミドpMFR2を得た。ALA
要求性を失った形質転換体から分離したプラスミドpM
FR2は実施例1−(5)に示した方法で大腸菌FER
M P−12827へ再度形質転換し、プラスミドに挿
入されたDNA断片により大腸菌FERM P−128
27がALA要求性を喪失することを確認した。すなわ
ち、pMFR2にGSAアミノトランスフェラーゼ遺伝
子が含まれていることを確認した。
m freudenreichii由来のGSAアミノ
トランスフェラーゼ遺伝子を含む形質転換体の分離と組
換えプラスミドの精製 実施例1−(5)に示した大腸菌FERM P−128
27の形質転換実験において、アンピシリン耐性を示
し、かつALA要求性を喪失した形質転換体によるコロ
ニーを取得した。最終濃度が100μg/mlになるよう
にアンピシリンを添加したLB 1mlにて上記の形質転
換体を培養した。遠心により集菌し、溶液I(50mM
Tris−HClpH8.5、15% Sucrose、
50mM EDTA、0.2%リゾチーム)100μlに
懸濁し、室温で15分間放置した。溶液II(0.1%S
DS、0.2N NaOH)200μlを添加し、氷中
にて5分間冷却した。さらに溶液III (3M酢酸ナトリ
ウムpH4.8)150μlを添加し、氷中にて30分間
冷却した。遠心を行ない、上清をデカンテーションによ
り分離し2倍容量のエタノールを添加し−80℃にて2
時間冷却し、9,000×gにて10分間遠心し、DN
Aのペレットを得た。70%エタノールを適量加え遠心
管の壁面を2回リンスし、エタノールを簡単に除去した
後減圧乾燥し精製プラスミドpMFR2を得た。ALA
要求性を失った形質転換体から分離したプラスミドpM
FR2は実施例1−(5)に示した方法で大腸菌FER
M P−12827へ再度形質転換し、プラスミドに挿
入されたDNA断片により大腸菌FERM P−128
27がALA要求性を喪失することを確認した。すなわ
ち、pMFR2にGSAアミノトランスフェラーゼ遺伝
子が含まれていることを確認した。
【0026】(7)pMFR2の解析 実施例1−(6)で精製したプラスミドpMFR2を適
当な緩衝液中で過剰量の制限酵素(BclI、Sph
I、PstI、SmaI、BamHI)で消化した。実
施例1−(2)に示した電気泳動を行ない、各DNA断
片の分子量を解析し、制限酵素地図を作成した。その結
果、pMFR2は図1に示される構造を有していた。す
なわち、ベクターpUC18のクローニングサイトにあ
るBamHI切断部位に、両端にSau3AI切断部位
を有するDNA断片が挿入されていた。
当な緩衝液中で過剰量の制限酵素(BclI、Sph
I、PstI、SmaI、BamHI)で消化した。実
施例1−(2)に示した電気泳動を行ない、各DNA断
片の分子量を解析し、制限酵素地図を作成した。その結
果、pMFR2は図1に示される構造を有していた。す
なわち、ベクターpUC18のクローニングサイトにあ
るBamHI切断部位に、両端にSau3AI切断部位
を有するDNA断片が挿入されていた。
【0027】(8)GSAアミノトランスフェラーゼ遺
伝子の領域限定 pMFR2を基に図1に示したDNA断片を挿入し、p
MFR222を作成した。すなわち、実施例1−(6)
で精製したプラスミドpMFR2をBclIとBamH
Iで消化した。実施例1−(2)の方法を用いて、電気
泳動法とSUPREC−01(宝酒造社)により約1.
6kbpのDNA断片を回収した。T4DNAリガーゼ
の結合反応により該DNA断片をpUC18のBamH
Iの切断部位に挿入しpMFR222を作成した。pM
FR222は実施例1−(5)に示した方法で大腸菌F
ERM P−12827へ形質転換し、プラスミドに挿
入されたDNA断片により大腸菌FERMP−1282
7がALA要求性を喪失することを確認した。すなわ
ち、pMFR222にGSAアミノトランスフェラーゼ
遺伝子が含まれていることを確認した。
伝子の領域限定 pMFR2を基に図1に示したDNA断片を挿入し、p
MFR222を作成した。すなわち、実施例1−(6)
で精製したプラスミドpMFR2をBclIとBamH
Iで消化した。実施例1−(2)の方法を用いて、電気
泳動法とSUPREC−01(宝酒造社)により約1.
6kbpのDNA断片を回収した。T4DNAリガーゼ
の結合反応により該DNA断片をpUC18のBamH
Iの切断部位に挿入しpMFR222を作成した。pM
FR222は実施例1−(5)に示した方法で大腸菌F
ERM P−12827へ形質転換し、プラスミドに挿
入されたDNA断片により大腸菌FERMP−1282
7がALA要求性を喪失することを確認した。すなわ
ち、pMFR222にGSAアミノトランスフェラーゼ
遺伝子が含まれていることを確認した。
【0028】(9)GSAアミノトランスフェラーゼ遺
伝子の塩基配列解析 GSAアミノトランスフェラーゼ遺伝子を含む約1.6
kbpの塩基配列を解析した。すなわち、T7シークエ
ンシングキット(ファルマシアLKBバイオテクノロジ
ー社)を用いたM13ダイデオキシ法〔Sanger,
F.,etc.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.,74,5463−5467(1977)〕にてシ
ークエンシング反応を行ない、自動レーザー蛍光シーク
エンシング装置(ファルマシアLKBバイオテクノロジ
ー社)を用いてDNA断片の塩基配列を決定した。その
結果、その全塩基配列は配列番号3、GSAアミノトラ
ンスフェラーゼのコード領域は配列番号2、当該配列番
号1より推定されるアミノ酸配列は配列番号1であるこ
とが判明した。
伝子の塩基配列解析 GSAアミノトランスフェラーゼ遺伝子を含む約1.6
kbpの塩基配列を解析した。すなわち、T7シークエ
ンシングキット(ファルマシアLKBバイオテクノロジ
ー社)を用いたM13ダイデオキシ法〔Sanger,
F.,etc.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.,74,5463−5467(1977)〕にてシ
ークエンシング反応を行ない、自動レーザー蛍光シーク
エンシング装置(ファルマシアLKBバイオテクノロジ
ー社)を用いてDNA断片の塩基配列を決定した。その
結果、その全塩基配列は配列番号3、GSAアミノトラ
ンスフェラーゼのコード領域は配列番号2、当該配列番
号1より推定されるアミノ酸配列は配列番号1であるこ
とが判明した。
【0029】
配列番号:1 配列の長さ:441 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列: Met Ser Val Ser Asp Glu Leu Phe Ala Glu Ala Leu Lys Val Met Pro Gly Gly Val Ser Ser Pro Val Arg Ala Tyr Arg Ser Val Gly Gly Thr Pro Arg Phe Val Lys Arg Ala Leu Gly Ser His Ile Val Asp Val Asp Asp Lys Arg Tyr Val Asp Leu Val Cys Ser Trp Gly Pro Met Ile Ala Gly His Ala His Pro Glu Val Val Ala Ala Val Leu Gln Ala Val Ala Asp Ser Thr Ser Phe Gly Ala Pro Ser Glu Val Glu Leu Arg Leu Ala Gln Ala Val Val Ala Arg Met Gly Gly Ala Ile Asp Lys Val Arg Phe Thr Cys Ser Gly Thr Glu Ala Val Met Thr Ala Ala Arg Leu Ala Arg Gly Ile Thr Lys Arg Pro Leu Leu Val Lys Phe Val Gly Cys Tyr His Gly His Ser Asp Ser Phe Leu Val Ser Ala Gly Ser Gly Val Ala Ser Leu Gly Leu Pro Asp Ser Pro Gly Val Pro Lys Glu Val Ala Gly Asp Thr Val Ala Leu Pro Tyr Gly Arg Ile Asp Met Val Glu Glu Leu Phe Ala Glu Arg Gly Asp Gln Val Ala Ala Ile Val Thr Glu Gly Val Pro Ala Asn Met Gly Val Ile Val Pro Pro Glu Gly Phe Asn Arg Arg Leu His Asp Ile Ala His Ala His Gly Ala Leu Leu Ile Gln Asp Glu Val Leu Thr Gly Phe Arg Leu Ser Pro Thr Gly Ala Trp Gly Leu Gln Gly Ala Lys Glu Gly Trp Thr Pro Asp Leu Phe Thr Phe Gly Lys Val Ile Gly Gly Gly Met Pro Leu Ala Ala Val Gly Gly Ser Ala Gln Leu Met Asp Tyr Leu Ala Pro Glu Gly Pro Val Tyr Gln Ala Gly Thr Leu Ser Gly Asn Pro Ala Ala Cys Ala Ala Gly Leu Ala Thr Leu Ala Leu Met Asp Asp Ala Ala Tyr Ser Arg Leu Asp Ala Thr Ala Asp Arg Val Ser Ala Met Ala Asp Ala Ala Leu Glu Ser Ala Gly Val Pro His Arg Ile Asn Lys Val Ser Asn Leu Phe Ser Val Phe Leu Thr Asp Ala Pro Val Thr Asp Phe Ala Ser Ala Ser Lys Gln Asp Thr Lys Ala Phe Ser Arg Phe Phe His Ala Ala Leu Asp Ala Gly Leu Trp Leu Ala Pro Ser Gly Phe Glu Ala Trp Phe Cys Ser Thr Ala Leu Asp Asp Asp Asp Leu Glu Val Ile Asp Ala Gly Leu His Lys Ala Ala Gln Ala Ala Ala Gln Gly Leu Ser Ser Leu Glu Asp Val Arg Arg
【0030】配列番号:2 配列の長さ:1323 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:genomic DNA 起源 生物名:プロピオン酸菌フロイデンライヒ(Propi
onibacterium freudenreich
ii) 株名:IFO12424 配列 ATGAGTGTCA GTGACGAATT GTTCGCAGAA GCCCTCAAGG TCATGCCCGG GGGCGTCTCC 60 TCGCCGGTGC GCGCCTACCG CAGTGTCGGG GGCACGCCAC GCTTCGTGAA GCGGGCGCTG 120 GGTTCCCACA TCGTCGACGT CGACGACAAG CGCTATGTCG ACCTGGTGTG CAGCTGGGGG 180 CCGATGATCG CCGGCCACGC CCACCCCGAG GTGGTGGCCG CCGTGCTGCA GGCCGTTGCC 240 GATTCCACCT CGTTCGGCGC GCCCAGTGAG GTGGAGCTGC GGCTCGCCCA GGCCGTCGTC 300 GCCCGCATGG GCGGCGCCAT CGACAAGGTG CGCTTCACCT GTTCGGGCAC CGAGGCCGTG 360 ATGACCGCGG CCCGACTGGC GCGCGGCATC ACGAAGCGAC CGCTGCTGGT CAAGTTCGTC 420 GGCTGCTACC ACGGCCATTC CGATTCCTTC CTGGTGTCGG CCGGCTCCGG GGTGGCAAGC 480 CTGGGCCTGC CCGATTCGCC CGGCGTGCCC AAGGAGGTCG CCGGCGACAC GGTCGCCCTG 540 CCCTATGGGC GCATCGACAT GGTCGAGGAG CTGTTCGCCG AGCGTGGCGA CCAGGTGGCG 600 GCCATCGTCA CCGAGGGCGT CCCGGCGAAC ATGGGCGTCA TCGTGCCGCC CGAGGGCTTC 660 AACCGTCGCC TGCATGACAT CGCCCACGCC CACGGCGCCC TTCTCATCCA GGACGAGGTG 720 CTCACCGGTT TCCGGCTGAG CCCCACCGGC GCCTGGGGAC TGCAGGGGGC GAAGGAGGGG 780 TGGACTCCCG ACCTGTTCAC CTTCGGCAAG GTGATCGGTG GCGGCATGCC ACTGGCGGCC 840 GTGGGTGGTT CGGCGCAGCT GATGGACTAC CTGGCCCCCG AGGGGCCCGT CTACCAGGCG 900 GGCACCCTGT CGGGTAACCC GGCTGCCTGC GCGGCGGGGC TGGCCACGCT TGCCCTCATG 960 GACGACGCCG CCTACTCCCG ACTGGACGCC ACCGCCGACC GGGTCTCGGC GATGGCCGAT 1020 GCGGCGCTGG AGTCCGCCGG GGTGCCCCAC CGGATCAACA AGGTCTCCAA CCTGTTCAGC 1080 GTCTTCCTCA CCGACGCCCC GGTGACTGAC TTCGCCTCGG CGTCCAAGCA GGACACCAAG 1140 GCGTTCTCGC GCTTCTTCCA CGCGGCACTC GATGCCGGCC TGTGGCTGGC CCCCAGCGGC 1200 TTCGAGGCCT GGTTCTGCTC CACCGCCCTG GATGACGACG ACCTTGAGGT CATCGACGCC 1260 GGCCTGCACA AGGCTGCACA GGCGGCCGCC CAGGGCCTTT CCTCGTTGGA GGATGTGCGC 1320 CGC 1323
onibacterium freudenreich
ii) 株名:IFO12424 配列 ATGAGTGTCA GTGACGAATT GTTCGCAGAA GCCCTCAAGG TCATGCCCGG GGGCGTCTCC 60 TCGCCGGTGC GCGCCTACCG CAGTGTCGGG GGCACGCCAC GCTTCGTGAA GCGGGCGCTG 120 GGTTCCCACA TCGTCGACGT CGACGACAAG CGCTATGTCG ACCTGGTGTG CAGCTGGGGG 180 CCGATGATCG CCGGCCACGC CCACCCCGAG GTGGTGGCCG CCGTGCTGCA GGCCGTTGCC 240 GATTCCACCT CGTTCGGCGC GCCCAGTGAG GTGGAGCTGC GGCTCGCCCA GGCCGTCGTC 300 GCCCGCATGG GCGGCGCCAT CGACAAGGTG CGCTTCACCT GTTCGGGCAC CGAGGCCGTG 360 ATGACCGCGG CCCGACTGGC GCGCGGCATC ACGAAGCGAC CGCTGCTGGT CAAGTTCGTC 420 GGCTGCTACC ACGGCCATTC CGATTCCTTC CTGGTGTCGG CCGGCTCCGG GGTGGCAAGC 480 CTGGGCCTGC CCGATTCGCC CGGCGTGCCC AAGGAGGTCG CCGGCGACAC GGTCGCCCTG 540 CCCTATGGGC GCATCGACAT GGTCGAGGAG CTGTTCGCCG AGCGTGGCGA CCAGGTGGCG 600 GCCATCGTCA CCGAGGGCGT CCCGGCGAAC ATGGGCGTCA TCGTGCCGCC CGAGGGCTTC 660 AACCGTCGCC TGCATGACAT CGCCCACGCC CACGGCGCCC TTCTCATCCA GGACGAGGTG 720 CTCACCGGTT TCCGGCTGAG CCCCACCGGC GCCTGGGGAC TGCAGGGGGC GAAGGAGGGG 780 TGGACTCCCG ACCTGTTCAC CTTCGGCAAG GTGATCGGTG GCGGCATGCC ACTGGCGGCC 840 GTGGGTGGTT CGGCGCAGCT GATGGACTAC CTGGCCCCCG AGGGGCCCGT CTACCAGGCG 900 GGCACCCTGT CGGGTAACCC GGCTGCCTGC GCGGCGGGGC TGGCCACGCT TGCCCTCATG 960 GACGACGCCG CCTACTCCCG ACTGGACGCC ACCGCCGACC GGGTCTCGGC GATGGCCGAT 1020 GCGGCGCTGG AGTCCGCCGG GGTGCCCCAC CGGATCAACA AGGTCTCCAA CCTGTTCAGC 1080 GTCTTCCTCA CCGACGCCCC GGTGACTGAC TTCGCCTCGG CGTCCAAGCA GGACACCAAG 1140 GCGTTCTCGC GCTTCTTCCA CGCGGCACTC GATGCCGGCC TGTGGCTGGC CCCCAGCGGC 1200 TTCGAGGCCT GGTTCTGCTC CACCGCCCTG GATGACGACG ACCTTGAGGT CATCGACGCC 1260 GGCCTGCACA AGGCTGCACA GGCGGCCGCC CAGGGCCTTT CCTCGTTGGA GGATGTGCGC 1320 CGC 1323
【0031】配列番号:3 配列の長さ:1549 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:genomic DNA 起源 生物名:プロピオン酸菌フロイデンライヒ(Propi
enibacterium freudenreich
ii) 株名:IFO12424 配列 GGATCCGGCC CGCGCCTGGG CGACCGGTCG TCGGGCCGGC CCCGCTGCGG GCAGACCCTG AGAATGCGAG GGGCAAGGCC ATGCCCGCTG CCGGAATGCC CGGCCCGACA AGGAAGAACC C ATG AGT GTC AGT GAC GAA TTG TTC GCA GAA GCC CTC AAG GTC ATG CCC Met Ser Val Ser Asp Glu Leu Phe Ala Glu Ala Leu Lys Val Met Pro GGG GGC GTC TCC TCG CCG GTG CGC GCC TAC CGC AGT GTC GGG GGC ACG Gly Gly Val Ser Ser Pro Val Arg Ala Tyr Arg Ser Val Gly Gly Thr CCA CGC TTC GTG AAG CGG GCG CTG GGT TCC CAC ATC GTC GAC GTC GAC Pro Arg Phe Val Lys Arg Ala Leu Gly Ser His Ile Val Asp Val Asp GAC AAG CGC TAT GTC GAC CTG GTG TGC AGC TGG GGG CCG ATG ATC GCC Asp Lys Arg Tyr Val Asp Leu Val Cys Ser Trp Gly Pro Met Ile Ala GGC CAC GCC CAC CCC GAG GTG GTG GCC GCC GTG CTG CAG GCC GTT GCC Gly His Ala His Pro Glu Val Val Ala Ala Val Leu Gln Ala Val Ala GAT TCC ACC TCG TTC GGC GCG CCC AGT GAG GTG GAG CTG CGG CTC GCC Asp Ser Thr Ser Phe Gly Ala Pro Ser Glu Val Glu Leu Arg Ler Ala CAG GCC GTC GTC GCC CGC ATG GGC GGC GCC ATC GAC AAG GTG CGC TTC Gln Ala Val Val Ala Arg Met Gly Gly Ala Ile Asp Lys Val Arg Phe ACC TGT TCG GGC ACC GAG GCC GTG ATG ACC GCG GCC CGA CTG GCG CGC Thr Cys Ser Gly Thr Glu Ala Val Met Thr Ala Ala Arg Leu Ala Arg GGC ATC ACG AAG CGA CCG CTG CTG GTC AAG TTC GTC GGC TGC TAC CAC Gly Ile Thr Lys Arg Pro Leu Leu Val Lys Phe Val Gly Cys Tyr His GGC CAT TCC GAT TCC TTC CTG GTG TCG GCC GGC TCC GGG GTG GCA AGC Gly His Ser Asp Ser Phe Leu Val Ser Ala Gly Ser Gly Val Ala Ser CTG GGC CTG CCC GAT TCG CCC GGC GTG CCC AAG GAG GTC GCC GGC GAC Leu Gly Leu Pro Asp Ser Pro Gly Val Pro Lys Glu Val Ala Gly Asp ACG GTC GCC CTG CCC TAT GGG CGC ATC GAC ATG GTC GAG GAG CTG TTC Thr Val Ala Leu Pro Tyr Gly Arg Ile Asp Met Val Glu Glu Leu Phe GCC GAG CGT GGC GAC CAG GTG GCG GCC ATC GTC ACC GAG GGC GTC CCG Ala Glu Arg Gly Asp Gln Val Ala Ala Ile Val Thr Glu Gly Val Pro GCG AAC ATG GGC GTC ATC GTG CCG CCC GAG GGC TTC AAC CGT CGC CTG Ala Asn Met Gly Val Ile Val Pro Pro Glu Gly Phe Asn Arg Arg Leu CAT GAC ATC GCC CAC GCC CAC GGC GCC CTT CTC ATC CAG GAC GAG GTG His Asp Ile Ala His Ala His Gly Ala Leu Leu Ile Gln Asp Glu Val CTC ACC GGT TTC CGG CTG AGC CCC ACC GGC GCC TGG GGA CTG CAG GGG Leu Thr Gly Phe Arg Leu Ser Pro Thr Gly Ala Trp Gly Leu Gln Gly GCG AAG GAG GGG TGG ACT CCC GAC CTG TTC ACC TTC GGC AAG GTG ATC Ala Lys Glu Gly Trp Thr Pro Asp Leu Phe Thr Phe Gly Lys Val Ile GGT GGC GGC ATG CCA CTG GCG GCC GTG GGT GGT TCG GCG CAG CTG ATG Gly Gly Gly Met Pro Leu Ala Ala Val Gly Gly Ser Ala Gln Leu Met GAC TAC CTG GCC CCC GAG GGG CCC GTC TAC CAG GCG GGC ACC CTG TCG Asp Tyr Leu Ala Pro Glu Gly Pro Val Tyr Gln Ala Gly Thr Leu Ser GGT AAC CCG GCT GCC TGC GCG GCG GGG CTG GCC ACG CTT GCC CTC ATG Gly Asn Pro Ala Ala Cys Ala Ala Gly Leu Ala Thr Leu Ala Leu Met GAC GAC GCC GCC TAC TCC CGA CTG GAC GCC ACC GCC GAC CGG GTC TCG Asp Asp Ala Ala Tyr Ser Arg Leu Asp Ala Thr Ala Asp Arg Val Ser GCG ATG GCC GAT GCG GCG CTG GAG TCC GCC GGG GTG CCC CAC CGG ATC Ala Met Ala Asp Ala Ala Leu Glu Ser Ala Gly Val Pro His Arg Ile AAC AAG GTC TCC AAC CTG TTC AGC GTC TTC CTC ACC GAC GCC CCG GTG Asn Lys Val Ser Asn Leu Phe Ser Val Phe Leu Thr Asp Ala Pro Val ACT GAC TTC GCC TCG GCG TCC AAG CAG GAC ACC AAG GCG TTC TCG CGC Thr Asp Phe Ala Ser Ala Ser Lys Gln Asp Thr Lys Ala Phe Ser Arg TTC TTC CAC GCG GCA CTC GAT GCC GGC CTG TGG CTG GCC CCC AGC GGC Phe Phe His Ala Ala Leu Asp Ala Gly Leu Trp Leu Ala Pro Ser Gly TTC GAG GCC TGG TTC TGC TCC ACC GCC CTG GAT GAC GAC GAC CTT GAG Phe Glu Ala Trp Phe Cys Ser Thr Ala Leu Asp Asp Asp Asp Leu Glu GTC ATC GAC GCC GGC CTG CAC AAG GCT GCA CAG GCG GCC GCC CAG GGC Val Ile Asp Ala Gly Leu His Lys Ala Ala Gln Ala Ala Ala Gln Gly CTT TCC TCG TTG GAG GAT GTG CGC CGC TGA TCGGTGTCTC GCCAGGCGGT Leu Ser Ser Leu Glu Asp Val Arg Arg *** GGCAATTGCG GAGTGGGCGC GTTTCCGGCT TGTTCGCCGG ACGCGCCCAC TGCCATGTCC GAAACTGTTC AAATGGTGAT CA
enibacterium freudenreich
ii) 株名:IFO12424 配列 GGATCCGGCC CGCGCCTGGG CGACCGGTCG TCGGGCCGGC CCCGCTGCGG GCAGACCCTG AGAATGCGAG GGGCAAGGCC ATGCCCGCTG CCGGAATGCC CGGCCCGACA AGGAAGAACC C ATG AGT GTC AGT GAC GAA TTG TTC GCA GAA GCC CTC AAG GTC ATG CCC Met Ser Val Ser Asp Glu Leu Phe Ala Glu Ala Leu Lys Val Met Pro GGG GGC GTC TCC TCG CCG GTG CGC GCC TAC CGC AGT GTC GGG GGC ACG Gly Gly Val Ser Ser Pro Val Arg Ala Tyr Arg Ser Val Gly Gly Thr CCA CGC TTC GTG AAG CGG GCG CTG GGT TCC CAC ATC GTC GAC GTC GAC Pro Arg Phe Val Lys Arg Ala Leu Gly Ser His Ile Val Asp Val Asp GAC AAG CGC TAT GTC GAC CTG GTG TGC AGC TGG GGG CCG ATG ATC GCC Asp Lys Arg Tyr Val Asp Leu Val Cys Ser Trp Gly Pro Met Ile Ala GGC CAC GCC CAC CCC GAG GTG GTG GCC GCC GTG CTG CAG GCC GTT GCC Gly His Ala His Pro Glu Val Val Ala Ala Val Leu Gln Ala Val Ala GAT TCC ACC TCG TTC GGC GCG CCC AGT GAG GTG GAG CTG CGG CTC GCC Asp Ser Thr Ser Phe Gly Ala Pro Ser Glu Val Glu Leu Arg Ler Ala CAG GCC GTC GTC GCC CGC ATG GGC GGC GCC ATC GAC AAG GTG CGC TTC Gln Ala Val Val Ala Arg Met Gly Gly Ala Ile Asp Lys Val Arg Phe ACC TGT TCG GGC ACC GAG GCC GTG ATG ACC GCG GCC CGA CTG GCG CGC Thr Cys Ser Gly Thr Glu Ala Val Met Thr Ala Ala Arg Leu Ala Arg GGC ATC ACG AAG CGA CCG CTG CTG GTC AAG TTC GTC GGC TGC TAC CAC Gly Ile Thr Lys Arg Pro Leu Leu Val Lys Phe Val Gly Cys Tyr His GGC CAT TCC GAT TCC TTC CTG GTG TCG GCC GGC TCC GGG GTG GCA AGC Gly His Ser Asp Ser Phe Leu Val Ser Ala Gly Ser Gly Val Ala Ser CTG GGC CTG CCC GAT TCG CCC GGC GTG CCC AAG GAG GTC GCC GGC GAC Leu Gly Leu Pro Asp Ser Pro Gly Val Pro Lys Glu Val Ala Gly Asp ACG GTC GCC CTG CCC TAT GGG CGC ATC GAC ATG GTC GAG GAG CTG TTC Thr Val Ala Leu Pro Tyr Gly Arg Ile Asp Met Val Glu Glu Leu Phe GCC GAG CGT GGC GAC CAG GTG GCG GCC ATC GTC ACC GAG GGC GTC CCG Ala Glu Arg Gly Asp Gln Val Ala Ala Ile Val Thr Glu Gly Val Pro GCG AAC ATG GGC GTC ATC GTG CCG CCC GAG GGC TTC AAC CGT CGC CTG Ala Asn Met Gly Val Ile Val Pro Pro Glu Gly Phe Asn Arg Arg Leu CAT GAC ATC GCC CAC GCC CAC GGC GCC CTT CTC ATC CAG GAC GAG GTG His Asp Ile Ala His Ala His Gly Ala Leu Leu Ile Gln Asp Glu Val CTC ACC GGT TTC CGG CTG AGC CCC ACC GGC GCC TGG GGA CTG CAG GGG Leu Thr Gly Phe Arg Leu Ser Pro Thr Gly Ala Trp Gly Leu Gln Gly GCG AAG GAG GGG TGG ACT CCC GAC CTG TTC ACC TTC GGC AAG GTG ATC Ala Lys Glu Gly Trp Thr Pro Asp Leu Phe Thr Phe Gly Lys Val Ile GGT GGC GGC ATG CCA CTG GCG GCC GTG GGT GGT TCG GCG CAG CTG ATG Gly Gly Gly Met Pro Leu Ala Ala Val Gly Gly Ser Ala Gln Leu Met GAC TAC CTG GCC CCC GAG GGG CCC GTC TAC CAG GCG GGC ACC CTG TCG Asp Tyr Leu Ala Pro Glu Gly Pro Val Tyr Gln Ala Gly Thr Leu Ser GGT AAC CCG GCT GCC TGC GCG GCG GGG CTG GCC ACG CTT GCC CTC ATG Gly Asn Pro Ala Ala Cys Ala Ala Gly Leu Ala Thr Leu Ala Leu Met GAC GAC GCC GCC TAC TCC CGA CTG GAC GCC ACC GCC GAC CGG GTC TCG Asp Asp Ala Ala Tyr Ser Arg Leu Asp Ala Thr Ala Asp Arg Val Ser GCG ATG GCC GAT GCG GCG CTG GAG TCC GCC GGG GTG CCC CAC CGG ATC Ala Met Ala Asp Ala Ala Leu Glu Ser Ala Gly Val Pro His Arg Ile AAC AAG GTC TCC AAC CTG TTC AGC GTC TTC CTC ACC GAC GCC CCG GTG Asn Lys Val Ser Asn Leu Phe Ser Val Phe Leu Thr Asp Ala Pro Val ACT GAC TTC GCC TCG GCG TCC AAG CAG GAC ACC AAG GCG TTC TCG CGC Thr Asp Phe Ala Ser Ala Ser Lys Gln Asp Thr Lys Ala Phe Ser Arg TTC TTC CAC GCG GCA CTC GAT GCC GGC CTG TGG CTG GCC CCC AGC GGC Phe Phe His Ala Ala Leu Asp Ala Gly Leu Trp Leu Ala Pro Ser Gly TTC GAG GCC TGG TTC TGC TCC ACC GCC CTG GAT GAC GAC GAC CTT GAG Phe Glu Ala Trp Phe Cys Ser Thr Ala Leu Asp Asp Asp Asp Leu Glu GTC ATC GAC GCC GGC CTG CAC AAG GCT GCA CAG GCG GCC GCC CAG GGC Val Ile Asp Ala Gly Leu His Lys Ala Ala Gln Ala Ala Ala Gln Gly CTT TCC TCG TTG GAG GAT GTG CGC CGC TGA TCGGTGTCTC GCCAGGCGGT Leu Ser Ser Leu Glu Asp Val Arg Arg *** GGCAATTGCG GAGTGGGCGC GTTTCCGGCT TGTTCGCCGG ACGCGCCCAC TGCCATGTCC GAAACTGTTC AAATGGTGAT CA
【図1】Propionibacterium fre
udenreichii由来のGSAアミノトランスフ
ェラーゼ遺伝子を含むDNA断片の制限酵素地図及びp
MFR222調製手順を示す説明図である。
udenreichii由来のGSAアミノトランスフ
ェラーゼ遺伝子を含むDNA断片の制限酵素地図及びp
MFR222調製手順を示す説明図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:01) (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12N 9/10 C12R 1:19)
Claims (5)
- 【請求項1】 プロピオン酸菌に属する微生物由来のグ
ルタミン酸−1−セミアルデヒドアミノトランスフェラ
ーゼをコードするDNA断片。 - 【請求項2】 配列番号1で示されるアミノ酸配列をコ
ードするものである請求項1記載のDNA断片。 - 【請求項3】 配列番号2で示される塩基配列を有する
ものである請求項1記載のDNA断片。 - 【請求項4】 請求項1記載のDNA断片を含有する組
換え体DNA。 - 【請求項5】 請求項1記載のDNA断片を含有する組
換え体DNAを保有する形質転換体細胞。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP26865592A JPH06113861A (ja) | 1992-10-07 | 1992-10-07 | グルタミン酸−1−セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼをコードするdna断片 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP26865592A JPH06113861A (ja) | 1992-10-07 | 1992-10-07 | グルタミン酸−1−セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼをコードするdna断片 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH06113861A true JPH06113861A (ja) | 1994-04-26 |
Family
ID=17461572
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP26865592A Pending JPH06113861A (ja) | 1992-10-07 | 1992-10-07 | グルタミン酸−1−セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼをコードするdna断片 |
Country Status (1)
Country | Link |
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JP (1) | JPH06113861A (ja) |
-
1992
- 1992-10-07 JP JP26865592A patent/JPH06113861A/ja active Pending
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