JPH06113861A - グルタミン酸−１−セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼをコードするｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 プロピオン酸菌に属する微生物由来のグルタ
ミン酸−１−セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼ
をコードするＤＮＡ断片、当該ＤＮＡ断片を含有する組
換え体ＤＮＡ及び当該組換え体ＤＮＡを保有する形質転
換体細胞。 【効果】 この組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体細
胞を用いれば、活性の高いＧＳＡアミノトランスフェラ
ーゼを多量に製造することができ、ＡＬＡ、ビタミンＢ
₁₂等の工業的生産が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はグルタミン酸−１−セミ
アルデヒド（ＧＳＡ）から５−アミノレブリン酸（ＡＬ
Ａ）を生合成する酵素であるＧＳＡアミノトランスフェ
ラーゼをコードするＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を含む組
換え体ＤＮＡ及び該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換
体細胞に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＧＳＡアミノトランスフェラーゼは補酵
素ピリドキサールリン酸の存在下でＧＳＡからＡＬＡを
生合成する酵素であり、ビタミンＢ₁₂、ヘム、クロロフ
ィル、フィコビリン等の生物における必須因子の生合成
に重要な役割を果している。従って、より活性の高いＧ
ＳＡアミノトランスフェラーゼを見出し、この酵素を量
産することはＡＬＡ、ひいてはビタミンＢ₁₂、ヘム、ク
ロロフィル、フィコビリン等の量産化のために極めて重
要である。

【０００３】一方、酵素などのタンパク質の量産技術と
しての組換えＤＮＡ技術の発展は、近年めざましく、数
多くの酵素、生理活性タンパク等が組換えＤＮＡ技術を
利用した量産化に成功している。ＧＳＡアミノトランス
フェラーゼに関しては、プロピオン酸菌のＧＳＡアミノ
トランスフェラーゼ遺伝子は分離されておらず、大腸菌
（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）〔例えば、Ｉｌａ
ｇ Ｌ．Ｌ．，ｅｔｃ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ １７３，３４０８−３４１３（１９９１）〕、枯草
菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）〔例えば、
Ｐｅｒｔｒｉｃｅｋ Ｍ．，ｅｔｃ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ １７２，２２５０−２２５８（１９９
０）〕、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙ
ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）〔例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔ
Ｔ．，ｅｔｃ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７
２，７０７１−７０８４（１９９０）〕等から遺伝子が
単離され、これらの遺伝子の組換え及び微生物への導入
が報告されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
従来のＧＳＡアミノトランスフェラーゼは、ＡＬＡ生産
活性が充分でない等の問題がある。従って、本発明の目
的はよりＡＬＡ生産活性の高いＧＳＡアミノトランスフ
ェラーゼを遺伝子組換え技術により量産する方法を提供
することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者はビタ
ミンＢ₁₂を生産することが知られているプロピオン酸菌
に着目し、種々検討した結果、当該菌体よりＧＳＡアミ
ノトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｅｍＬ）を単離し、そ
の遺伝子の組換え及び形質転換細胞の採取に成功し、本
発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明はプロピオン酸菌に属す
る微生物由来のＧＳＡアミノトランスフェラーゼをコー
ドするＤＮＡ断片、当該断片を含有する組換え体ＤＮ
Ａ、及び当該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体細胞
を提供するものである。

【０００７】本発明のＤＮＡ断片は、例えば遺伝子組換
え技術を利用して次の如くして製造される。すなわち、
まず、ＤＮＡ供与体としてビタミンＢ₁₂生産菌であるプ
ロピオン酸菌を用い、当該プロピオン酸菌からゲノムＤ
ＮＡを抽出し、制限酵素などにより切断する。一方、フ
ァージ、プラスミド等のベクターを制限酵素等を用いて
リニヤーにする。これらのゲノムＤＮＡの断片とベクタ
ーとをＤＮＡリガーゼを用いて結合させて、組換えベク
ターを得る。得られた組換えベクターを複製可能な宿主
微生物に移入し、目的の組換えＤＮＡを保有する形質転
換体細胞を選択し、当該形質転換体細胞より目的の組換
えＤＮＡを分離し、次いで当該組換えＤＮＡから本発明
ＤＮＡ断片を採取することにより製造される。

【０００８】本発明ＤＮＡ断片の供与体であるプロピオ
ン酸菌に属する微生物としては、ビタミンＢ₁₂生産能を
有するものであれば特に制限されないが、例えばプロピ
オン酸菌フロイデンライヒ ＩＦＯ１２４２４（Ｐｒｏ
ｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉ
ｃｈｉｉ ＩＦＯ１２４２４）、プロピオン酸菌アクネ
ス ＡＴＣＣ６９１９（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ａｃｎｅｓＡＴＣＣ６９１９）、プロピオン酸
菌アシディプロピオニシ ＡＴＣＣ２５５６２（Ｐｒｏ
ｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉ
ｏｎｉｃｉＡＴＣＣ２５５６２）、プロピオン酸菌ジェ
ンシニ ＡＴＣＣ４８６８（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｊｅｎｓｅｎｉｉ ＡＴＣＣ４８６８）、
プロピオン酸菌グラナロサム ＡＴＣＣ２５５６４（Ｐ
ｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒａｎｕｌｏｓ
ｕｍ ＡＴＣＣ２５５６４）、プロピオン酸菌リンフォ
フィラム ＡＴＣＣ２７５２０（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｌｙｍｐｈｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ
２７５２０）、プロピオン酸菌トエニ ＡＴＣＣ４８７
４（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｏｅｎ
ｉｉ ＡＴＣＣ４８７４）、ユーバクテリウム アエロ
ファシエンス ＡＴＣＣ２５９８６（Ｅｕｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ２５９８
６）、ユーバクテリウム アラクトリチカム ＡＴＣＣ
２３２６３（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌａｃｔｏｌ
ｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ２３２６３）、ユーバクテリウ
ムアンガスタム ＡＴＣＣ４３７３７（Ｅｕｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ａｎｇｕｓｔｕｍ ＡＴＣＣ４３７３７）、
ユーバクテリウム レクタル ＡＴＣＣ３３６５６（Ｅ
ｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ ＡＴＣＣ３３
６５６）等が挙げられる。

【０００９】これらのプロピオン酸菌からのゲノムＤＮ
Ａの抽出は、プロピオン酸菌の培養菌体より、例えばＭ
ａｒｍｕｒの方法〔Ｍａｒｍｕｒ Ｊ．，Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．３，２０８−２１８（１９６１）〕に従い、
菌体を溶菌した後、フェノール抽出による除蛋白処理、
プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール
沈澱、遠心分離等の方法を適宜組み合せて行なうのが好
ましい。

【００１０】分離されたゲノムＤＮＡを切断するには、
制限酵素処理により行なわれるが、特にＳａｕ ３ＡＩ
等を用いた部分消化が好ましい。

【００１１】ベクターとしては、宿主微生物内で自律的
に増殖し得るファージ又はプラスミドから遺伝子組換え
用として構築されたものを用いるのが好ましい。プラス
ミドとしては、例えば大腸菌を宿主とするｐＢＲ３２
２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１
８、ｐＣＣ１９、ブルースクリプト等が好ましい。これ
らのベクターは、例えばＢａｍＨＩ等の制限酵素を用い
てリニヤーとし、必要に応じて脱リン酸処理をした後に
用いられる。

【００１２】ゲノムＤＮＡ断片とベクター断片との結合
は、公知のＤＮＡリガーゼ、例えばＴ４ ＤＮＡリガー
ゼ等を用いて行なうのが好ましい。

【００１３】得られた組換えベクターを移入させる宿主
微生物としては、組換えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖
可能で、かつ外来性ＤＮＡの形質が発現するものであれ
ばよいが、例えば大腸菌を用いることができる。また、
目的とする組換えＤＮＡを保有する形質転換体のスクリ
ーニングの容易性を考慮すると、ＡＬＡ要求性の大腸菌
を宿主として用いるのが好ましい。このようなＡＬＡ要
求性の大腸菌の一例としては、ＡＬＡ生合成経路の一つ
であるＣ５経路に関するＧＳＡアミノトランスフェラー
ゼ遺伝子欠損株がある。

【００１４】宿主微生物に組換えベクターを移入する方
法としては、例えば塩化カルシウム法、コンピテントセ
ル法、マイクロインジェクション法等のいずれの方法も
用いることができる。形質転換体の選択は、用いたベク
ターの薬剤耐性マーカーとＡＬＡ要求性の喪失とを指標
として行なうのが好ましい。

【００１５】このようにして選択された形質転換体細胞
から組換えＤＮＡを採取するには、常法により抽出すれ
ばよく、得られた組換えＤＮＡから本発明のＤＮＡ断片
を切り出すには、制限酵素などを用いればよい。

【００１６】かくして得られる本発明ＤＮＡ断片の塩基
配列は、ジデオキシ法で解読し、決定することができ
る。配列番号１に本発明ＤＮＡ断片の塩基配列を、配列
番号２に当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を、
配列番号３に後記実施例で単離した１．６ｋｂｐの塩基
配列及び推定アミノ酸配列を示す。

【００１７】本発明ＤＮＡ断片を発現させ、ＧＳＡアミ
ノトランスフェラーゼを生産するには、上記の形質転換
体細胞又は当該ＤＮＡ断片をさらに強力なプロモータを
有するベクターに組み込んだ組換えプラスミドで形質転
換された細胞を栄養培地にて培養し、その培養物から採
取すればよい。この場合における培養は、用いる形質転
換体細胞の性質に応じて行なわれる。

【００１８】

【発明の効果】本発明の組換え体ＤＮＡを保有する形質
転換体細胞を用いれば、活性の高いＧＳＡアミノトラン
スフェラーゼを多量に製造することができ、ＡＬＡ、ビ
タミンＢ₁₂等の工業的生産が可能となる。

【００１９】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではな
い。

【００２０】実施例１ （１）プロピオン酸菌からのゲノムＤＮＡ抽出及び精製 グルコース完全培地（ポリペプトン１２．５ｇ／ｌ、ビ
タミンフリーカザミノ酸１１．０ｇ／ｌ、酵母エキス
２．５ｇ／ｌ、リン酸水素ナトリウム２水和物２．２５
ｇ／ｌ、リン酸カリウム１．７６ｇ／ｌ、Ｌ−システイ
ン０．５ｇ／ｌ、塩化マグネシウム６水和物０．４ｇ／
ｌ、硫酸鉄７水和物０．０１ｇ／ｌ、パントテン酸カル
シウム４mg／ｌ、ビオチン０．３mg／ｌ、グルコース１
０．０ｇ／ｌ、硝酸カリウム５．０ｇ／ｌ、塩化コバル
ト６水和物０．１８mg／ｌ、モリブデン酸ナトリウム１
mg／ｌ、pH７）にプロピオン酸菌Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ＩＦ
Ｏ１２４２４を植菌し２８℃にて３日間培養した。培養
液を遠心により集菌し、Ｍａｒｍｕｒの方法〔Ｍａｒｍ
ｕｒ Ｊ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３，２０８−２１
８（１９６１）〕に従いゲノムＤＮＡを抽出し、精製し
た。

【００２１】（２）プロピオン酸菌のゲノムＤＮＡの切
断 実施例１−（１）で取得したプロピオン酸菌の精製ゲノ
ムＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ ３ＡＩ（宝酒造社）により
部分消化した。１％アガロースゲルを用いて上記制限酵
素の部分消化反応液を電気泳動した。緩衝液としてＴＡ
Ｅ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８
９）〕を用いた。電気泳動後のアガロースゲルは１μｇ
／mlのエチジウムブロマイドに１５分間浸せきした後水
洗し、紫外線照射によりＤＮＡ断片の蛍光を確認した。
サイズマーカーとしてλファージＤＮＡのＨｉｎｄIII
消化物（宝酒造社）を同時に電気泳動し、ＤＮＡ断片の
泳動距離から分子量を求めた。４〜９ｋｂｐのゲノムＤ
ＮＡのＳａｕ３ＡＩ部分消化物を含むアガロースゲルを
切り出し、細かく切り刻みＤＮＡ回収用フィルター付き
遠心チューブＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造社）を用いて
ＤＮＡ断片の回収を行なった。上記反応液に１／１０倍
容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（pH７．０）と２倍容量のエ
タノールを添加し−８０℃にて２時間冷却し、９，００
０×ｇにて１０分間遠心し、ＤＮＡのペレットを得た。
７０％エタノールを適量加え遠心管の壁面を２回リンス
し、エタノールを簡単に除去した後減圧乾燥した。乾燥
ＤＮＡを水３０μｌに溶解した。

【００２２】（３）プラスミドベクターｐＵＣ１８の調
製 ｐＵＣ１８を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社）により完
全消化した。同反応液にアルカリホスファターゼ（仔牛
腸由来，宝酒造社）を添加し、ベクターの開裂した末端
の脱リン酸化を行なった。上記反応液に１／１０倍容量
の３Ｍ酢酸ナトリウム（pH７．０）と２倍容量のエタノ
ールを添加し−８０℃にて２時間冷却し、９，０００×
ｇにて１０分間遠心し、ＤＮＡのペレットを得た。７０
％エタノールを適量加え遠心管の壁面を２回リンスし、
エタノールを簡単に除去した後減圧乾燥した。乾燥ＤＮ
Ａを水３０μｌに溶解した。

【００２３】（４）Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉの遺伝子バンク調製 実施例１−（２）で調製したプロピオン酸菌のゲノム由
来の４〜９ｋｂｐのＤＮＡ断片と、実施例１−（３）で
調製した大腸菌のプラスミドの開裂反応物をＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼ（宝酒造社）を用いて結合し、遺伝子バンク
を調製した。

【００２４】 （５）ＡＬＡ要求性大腸菌への遺伝子バンクの形質転換 最終濃度が５０μｇ／mlになるようにＡＬＡを添加した
ＬＢ（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／
ｌ、食塩５ｇ／ｌ、pH６．８）３mlにＡＬＡ要求性大腸
菌ＦＥＲＭ Ｐ−１２８２７（微工研菌寄第１２８２７
号，ＦＥＲＭＰ−１２８２７）を植菌し３７℃にて終夜
培養した。上記と同様のＡＬＡを添加したＬＢ ２０ml
を新しく用意し、上記の前培養液０．２mlを添加した後
３７℃にて２時間培養した。培養後、培養液を氷中で急
冷し４℃にて遠心集菌した。菌体を氷冷しておいた５０
mM塩化カルシウム１０mlに懸濁し氷中で３０分間放置し
た。再度４℃にて遠心集菌し、氷冷しておいた５０mM塩
化カルシウム１mlに懸濁しコンピテントセルを調製し
た。上記コンピテントセル１００μｌに実施例１−
（４）で調製した遺伝子バンク１０μｌを混合し氷中で
３０分間放置した。４２℃にて２分間熱処理を行ない、
ＬＢ １mlを添加し３７℃にて１時間放置した。放置
後、遠心集菌した菌体を、最終濃度が１００μｇ／mlに
なるようにアンピシリンを添加したＬＢ平板培地（ＬＢ
に寒天１５ｇ／ｌを添加して調製する）に塗布し３７℃
にて２日間培養した。

【００２５】（６）Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ由来のＧＳＡアミノ
トランスフェラーゼ遺伝子を含む形質転換体の分離と組
換えプラスミドの精製 実施例１−（５）に示した大腸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１２８
２７の形質転換実験において、アンピシリン耐性を示
し、かつＡＬＡ要求性を喪失した形質転換体によるコロ
ニーを取得した。最終濃度が１００μｇ／mlになるよう
にアンピシリンを添加したＬＢ １mlにて上記の形質転
換体を培養した。遠心により集菌し、溶液Ｉ（５０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌpH８．５、１５％ Ｓｕｃｒｏｓｅ、
５０mM ＥＤＴＡ、０．２％リゾチーム）１００μｌに
懸濁し、室温で１５分間放置した。溶液II（０．１％Ｓ
ＤＳ、０．２Ｎ ＮａＯＨ）２００μｌを添加し、氷中
にて５分間冷却した。さらに溶液III （３Ｍ酢酸ナトリ
ウムpH４．８）１５０μｌを添加し、氷中にて３０分間
冷却した。遠心を行ない、上清をデカンテーションによ
り分離し２倍容量のエタノールを添加し−８０℃にて２
時間冷却し、９，０００×ｇにて１０分間遠心し、ＤＮ
Ａのペレットを得た。７０％エタノールを適量加え遠心
管の壁面を２回リンスし、エタノールを簡単に除去した
後減圧乾燥し精製プラスミドｐＭＦＲ２を得た。ＡＬＡ
要求性を失った形質転換体から分離したプラスミドｐＭ
ＦＲ２は実施例１−（５）に示した方法で大腸菌ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１２８２７へ再度形質転換し、プラスミドに挿
入されたＤＮＡ断片により大腸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１２８
２７がＡＬＡ要求性を喪失することを確認した。すなわ
ち、ｐＭＦＲ２にＧＳＡアミノトランスフェラーゼ遺伝
子が含まれていることを確認した。

【００２６】（７）ｐＭＦＲ２の解析 実施例１−（６）で精製したプラスミドｐＭＦＲ２を適
当な緩衝液中で過剰量の制限酵素（ＢｃｌＩ、Ｓｐｈ
Ｉ、ＰｓｔＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ）で消化した。実
施例１−（２）に示した電気泳動を行ない、各ＤＮＡ断
片の分子量を解析し、制限酵素地図を作成した。その結
果、ｐＭＦＲ２は図１に示される構造を有していた。す
なわち、ベクターｐＵＣ１８のクローニングサイトにあ
るＢａｍＨＩ切断部位に、両端にＳａｕ３ＡＩ切断部位
を有するＤＮＡ断片が挿入されていた。

【００２７】（８）ＧＳＡアミノトランスフェラーゼ遺
伝子の領域限定 ｐＭＦＲ２を基に図１に示したＤＮＡ断片を挿入し、ｐ
ＭＦＲ２２２を作成した。すなわち、実施例１−（６）
で精製したプラスミドｐＭＦＲ２をＢｃｌＩとＢａｍＨ
Ｉで消化した。実施例１−（２）の方法を用いて、電気
泳動法とＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造社）により約１．
６ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
の結合反応により該ＤＮＡ断片をｐＵＣ１８のＢａｍＨ
Ｉの切断部位に挿入しｐＭＦＲ２２２を作成した。ｐＭ
ＦＲ２２２は実施例１−（５）に示した方法で大腸菌Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１２８２７へ形質転換し、プラスミドに挿
入されたＤＮＡ断片により大腸菌ＦＥＲＭＰ−１２８２
７がＡＬＡ要求性を喪失することを確認した。すなわ
ち、ｐＭＦＲ２２２にＧＳＡアミノトランスフェラーゼ
遺伝子が含まれていることを確認した。

【００２８】（９）ＧＳＡアミノトランスフェラーゼ遺
伝子の塩基配列解析 ＧＳＡアミノトランスフェラーゼ遺伝子を含む約１．６
ｋｂｐの塩基配列を解析した。すなわち、Ｔ７シークエ
ンシングキット（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジ
ー社）を用いたＭ１３ダイデオキシ法〔Ｓａｎｇｅｒ，
Ｆ．，ｅｔｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．，７４，５４６３−５４６７（１９７７）〕にてシ
ークエンシング反応を行ない、自動レーザー蛍光シーク
エンシング装置（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジ
ー社）を用いてＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。その
結果、その全塩基配列は配列番号３、ＧＳＡアミノトラ
ンスフェラーゼのコード領域は配列番号２、当該配列番
号１より推定されるアミノ酸配列は配列番号１であるこ
とが判明した。

【００２９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：４４１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Ser Val Ser Asp Glu Leu Phe Ala Glu Ala Leu Lys Val Met Pro Gly Gly Val Ser Ser Pro Val Arg Ala Tyr Arg Ser Val Gly Gly Thr Pro Arg Phe Val Lys Arg Ala Leu Gly Ser His Ile Val Asp Val Asp Asp Lys Arg Tyr Val Asp Leu Val Cys Ser Trp Gly Pro Met Ile Ala Gly His Ala His Pro Glu Val Val Ala Ala Val Leu Gln Ala Val Ala Asp Ser Thr Ser Phe Gly Ala Pro Ser Glu Val Glu Leu Arg Leu Ala Gln Ala Val Val Ala Arg Met Gly Gly Ala Ile Asp Lys Val Arg Phe Thr Cys Ser Gly Thr Glu Ala Val Met Thr Ala Ala Arg Leu Ala Arg Gly Ile Thr Lys Arg Pro Leu Leu Val Lys Phe Val Gly Cys Tyr His Gly His Ser Asp Ser Phe Leu Val Ser Ala Gly Ser Gly Val Ala Ser Leu Gly Leu Pro Asp Ser Pro Gly Val Pro Lys Glu Val Ala Gly Asp Thr Val Ala Leu Pro Tyr Gly Arg Ile Asp Met Val Glu Glu Leu Phe Ala Glu Arg Gly Asp Gln Val Ala Ala Ile Val Thr Glu Gly Val Pro Ala Asn Met Gly Val Ile Val Pro Pro Glu Gly Phe Asn Arg Arg Leu His Asp Ile Ala His Ala His Gly Ala Leu Leu Ile Gln Asp Glu Val Leu Thr Gly Phe Arg Leu Ser Pro Thr Gly Ala Trp Gly Leu Gln Gly Ala Lys Glu Gly Trp Thr Pro Asp Leu Phe Thr Phe Gly Lys Val Ile Gly Gly Gly Met Pro Leu Ala Ala Val Gly Gly Ser Ala Gln Leu Met Asp Tyr Leu Ala Pro Glu Gly Pro Val Tyr Gln Ala Gly Thr Leu Ser Gly Asn Pro Ala Ala Cys Ala Ala Gly Leu Ala Thr Leu Ala Leu Met Asp Asp Ala Ala Tyr Ser Arg Leu Asp Ala Thr Ala Asp Arg Val Ser Ala Met Ala Asp Ala Ala Leu Glu Ser Ala Gly Val Pro His Arg Ile Asn Lys Val Ser Asn Leu Phe Ser Val Phe Leu Thr Asp Ala Pro Val Thr Asp Phe Ala Ser Ala Ser Lys Gln Asp Thr Lys Ala Phe Ser Arg Phe Phe His Ala Ala Leu Asp Ala Gly Leu Trp Leu Ala Pro Ser Gly Phe Glu Ala Trp Phe Cys Ser Thr Ala Leu Asp Asp Asp Asp Leu Glu Val Ile Asp Ala Gly Leu His Lys Ala Ala Gln Ala Ala Ala Gln Gly Leu Ser Ser Leu Glu Asp Val Arg Arg

【００３０】配列番号：２ 配列の長さ：１３２３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：プロピオン酸菌フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉ
ｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈ
ｉｉ） 株名：ＩＦＯ１２４２４ 配列 ATGAGTGTCA GTGACGAATT GTTCGCAGAA GCCCTCAAGG TCATGCCCGG GGGCGTCTCC 60 TCGCCGGTGC GCGCCTACCG CAGTGTCGGG GGCACGCCAC GCTTCGTGAA GCGGGCGCTG 120 GGTTCCCACA TCGTCGACGT CGACGACAAG CGCTATGTCG ACCTGGTGTG CAGCTGGGGG 180 CCGATGATCG CCGGCCACGC CCACCCCGAG GTGGTGGCCG CCGTGCTGCA GGCCGTTGCC 240 GATTCCACCT CGTTCGGCGC GCCCAGTGAG GTGGAGCTGC GGCTCGCCCA GGCCGTCGTC 300 GCCCGCATGG GCGGCGCCAT CGACAAGGTG CGCTTCACCT GTTCGGGCAC CGAGGCCGTG 360 ATGACCGCGG CCCGACTGGC GCGCGGCATC ACGAAGCGAC CGCTGCTGGT CAAGTTCGTC 420 GGCTGCTACC ACGGCCATTC CGATTCCTTC CTGGTGTCGG CCGGCTCCGG GGTGGCAAGC 480 CTGGGCCTGC CCGATTCGCC CGGCGTGCCC AAGGAGGTCG CCGGCGACAC GGTCGCCCTG 540 CCCTATGGGC GCATCGACAT GGTCGAGGAG CTGTTCGCCG AGCGTGGCGA CCAGGTGGCG 600 GCCATCGTCA CCGAGGGCGT CCCGGCGAAC ATGGGCGTCA TCGTGCCGCC CGAGGGCTTC 660 AACCGTCGCC TGCATGACAT CGCCCACGCC CACGGCGCCC TTCTCATCCA GGACGAGGTG 720 CTCACCGGTT TCCGGCTGAG CCCCACCGGC GCCTGGGGAC TGCAGGGGGC GAAGGAGGGG 780 TGGACTCCCG ACCTGTTCAC CTTCGGCAAG GTGATCGGTG GCGGCATGCC ACTGGCGGCC 840 GTGGGTGGTT CGGCGCAGCT GATGGACTAC CTGGCCCCCG AGGGGCCCGT CTACCAGGCG 900 GGCACCCTGT CGGGTAACCC GGCTGCCTGC GCGGCGGGGC TGGCCACGCT TGCCCTCATG 960 GACGACGCCG CCTACTCCCG ACTGGACGCC ACCGCCGACC GGGTCTCGGC GATGGCCGAT 1020 GCGGCGCTGG AGTCCGCCGG GGTGCCCCAC CGGATCAACA AGGTCTCCAA CCTGTTCAGC 1080 GTCTTCCTCA CCGACGCCCC GGTGACTGAC TTCGCCTCGG CGTCCAAGCA GGACACCAAG 1140 GCGTTCTCGC GCTTCTTCCA CGCGGCACTC GATGCCGGCC TGTGGCTGGC CCCCAGCGGC 1200 TTCGAGGCCT GGTTCTGCTC CACCGCCCTG GATGACGACG ACCTTGAGGT CATCGACGCC 1260 GGCCTGCACA AGGCTGCACA GGCGGCCGCC CAGGGCCTTT CCTCGTTGGA GGATGTGCGC 1320 CGC 1323

【００３１】配列番号：３ 配列の長さ：１５４９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：プロピオン酸菌フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉ
ｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈ
ｉｉ） 株名：ＩＦＯ１２４２４ 配列 GGATCCGGCC CGCGCCTGGG CGACCGGTCG TCGGGCCGGC CCCGCTGCGG GCAGACCCTG AGAATGCGAG GGGCAAGGCC ATGCCCGCTG CCGGAATGCC CGGCCCGACA AGGAAGAACC C ATG AGT GTC AGT GAC GAA TTG TTC GCA GAA GCC CTC AAG GTC ATG CCC Met Ser Val Ser Asp Glu Leu Phe Ala Glu Ala Leu Lys Val Met Pro GGG GGC GTC TCC TCG CCG GTG CGC GCC TAC CGC AGT GTC GGG GGC ACG Gly Gly Val Ser Ser Pro Val Arg Ala Tyr Arg Ser Val Gly Gly Thr CCA CGC TTC GTG AAG CGG GCG CTG GGT TCC CAC ATC GTC GAC GTC GAC Pro Arg Phe Val Lys Arg Ala Leu Gly Ser His Ile Val Asp Val Asp GAC AAG CGC TAT GTC GAC CTG GTG TGC AGC TGG GGG CCG ATG ATC GCC Asp Lys Arg Tyr Val Asp Leu Val Cys Ser Trp Gly Pro Met Ile Ala GGC CAC GCC CAC CCC GAG GTG GTG GCC GCC GTG CTG CAG GCC GTT GCC Gly His Ala His Pro Glu Val Val Ala Ala Val Leu Gln Ala Val Ala GAT TCC ACC TCG TTC GGC GCG CCC AGT GAG GTG GAG CTG CGG CTC GCC Asp Ser Thr Ser Phe Gly Ala Pro Ser Glu Val Glu Leu Arg Ler Ala CAG GCC GTC GTC GCC CGC ATG GGC GGC GCC ATC GAC AAG GTG CGC TTC Gln Ala Val Val Ala Arg Met Gly Gly Ala Ile Asp Lys Val Arg Phe ACC TGT TCG GGC ACC GAG GCC GTG ATG ACC GCG GCC CGA CTG GCG CGC Thr Cys Ser Gly Thr Glu Ala Val Met Thr Ala Ala Arg Leu Ala Arg GGC ATC ACG AAG CGA CCG CTG CTG GTC AAG TTC GTC GGC TGC TAC CAC Gly Ile Thr Lys Arg Pro Leu Leu Val Lys Phe Val Gly Cys Tyr His GGC CAT TCC GAT TCC TTC CTG GTG TCG GCC GGC TCC GGG GTG GCA AGC Gly His Ser Asp Ser Phe Leu Val Ser Ala Gly Ser Gly Val Ala Ser CTG GGC CTG CCC GAT TCG CCC GGC GTG CCC AAG GAG GTC GCC GGC GAC Leu Gly Leu Pro Asp Ser Pro Gly Val Pro Lys Glu Val Ala Gly Asp ACG GTC GCC CTG CCC TAT GGG CGC ATC GAC ATG GTC GAG GAG CTG TTC Thr Val Ala Leu Pro Tyr Gly Arg Ile Asp Met Val Glu Glu Leu Phe GCC GAG CGT GGC GAC CAG GTG GCG GCC ATC GTC ACC GAG GGC GTC CCG Ala Glu Arg Gly Asp Gln Val Ala Ala Ile Val Thr Glu Gly Val Pro GCG AAC ATG GGC GTC ATC GTG CCG CCC GAG GGC TTC AAC CGT CGC CTG Ala Asn Met Gly Val Ile Val Pro Pro Glu Gly Phe Asn Arg Arg Leu CAT GAC ATC GCC CAC GCC CAC GGC GCC CTT CTC ATC CAG GAC GAG GTG His Asp Ile Ala His Ala His Gly Ala Leu Leu Ile Gln Asp Glu Val CTC ACC GGT TTC CGG CTG AGC CCC ACC GGC GCC TGG GGA CTG CAG GGG Leu Thr Gly Phe Arg Leu Ser Pro Thr Gly Ala Trp Gly Leu Gln Gly GCG AAG GAG GGG TGG ACT CCC GAC CTG TTC ACC TTC GGC AAG GTG ATC Ala Lys Glu Gly Trp Thr Pro Asp Leu Phe Thr Phe Gly Lys Val Ile GGT GGC GGC ATG CCA CTG GCG GCC GTG GGT GGT TCG GCG CAG CTG ATG Gly Gly Gly Met Pro Leu Ala Ala Val Gly Gly Ser Ala Gln Leu Met GAC TAC CTG GCC CCC GAG GGG CCC GTC TAC CAG GCG GGC ACC CTG TCG Asp Tyr Leu Ala Pro Glu Gly Pro Val Tyr Gln Ala Gly Thr Leu Ser GGT AAC CCG GCT GCC TGC GCG GCG GGG CTG GCC ACG CTT GCC CTC ATG Gly Asn Pro Ala Ala Cys Ala Ala Gly Leu Ala Thr Leu Ala Leu Met GAC GAC GCC GCC TAC TCC CGA CTG GAC GCC ACC GCC GAC CGG GTC TCG Asp Asp Ala Ala Tyr Ser Arg Leu Asp Ala Thr Ala Asp Arg Val Ser GCG ATG GCC GAT GCG GCG CTG GAG TCC GCC GGG GTG CCC CAC CGG ATC Ala Met Ala Asp Ala Ala Leu Glu Ser Ala Gly Val Pro His Arg Ile AAC AAG GTC TCC AAC CTG TTC AGC GTC TTC CTC ACC GAC GCC CCG GTG Asn Lys Val Ser Asn Leu Phe Ser Val Phe Leu Thr Asp Ala Pro Val ACT GAC TTC GCC TCG GCG TCC AAG CAG GAC ACC AAG GCG TTC TCG CGC Thr Asp Phe Ala Ser Ala Ser Lys Gln Asp Thr Lys Ala Phe Ser Arg TTC TTC CAC GCG GCA CTC GAT GCC GGC CTG TGG CTG GCC CCC AGC GGC Phe Phe His Ala Ala Leu Asp Ala Gly Leu Trp Leu Ala Pro Ser Gly TTC GAG GCC TGG TTC TGC TCC ACC GCC CTG GAT GAC GAC GAC CTT GAG Phe Glu Ala Trp Phe Cys Ser Thr Ala Leu Asp Asp Asp Asp Leu Glu GTC ATC GAC GCC GGC CTG CAC AAG GCT GCA CAG GCG GCC GCC CAG GGC Val Ile Asp Ala Gly Leu His Lys Ala Ala Gln Ala Ala Ala Gln Gly CTT TCC TCG TTG GAG GAT GTG CGC CGC TGA TCGGTGTCTC GCCAGGCGGT Leu Ser Ser Leu Glu Asp Val Arg Arg *** GGCAATTGCG GAGTGGGCGC GTTTCCGGCT TGTTCGCCGG ACGCGCCCAC TGCCATGTCC GAAACTGTTC AAATGGTGAT CA

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅ
ｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ由来のＧＳＡアミノトランスフ
ェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素地図及びｐ
ＭＦＲ２２２調製手順を示す説明図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 プロピオン酸菌に属する微生物由来のグ
   ルタミン酸−１−セミアルデヒドアミノトランスフェラ
   ーゼをコードするＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】 配列番号１で示されるアミノ酸配列をコ
   ードするものである請求項１記載のＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 配列番号２で示される塩基配列を有する
   ものである請求項１記載のＤＮＡ断片。
4. 【請求項４】 請求項１記載のＤＮＡ断片を含有する組
   換え体ＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項１記載のＤＮＡ断片を含有する組
   換え体ＤＮＡを保有する形質転換体細胞。