JP3489604B2 - ５−アミノレブリン酸合成酵素遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、５−アミノレブリ
ン酸合成酵素をコードするＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を
含有する組換え体ＤＮＡ、該ＤＮＡ断片又は該組換え体
ＤＮＡで形質転換した形質転換体細胞、該形質転換細胞
を用いた５−アミノレブリン酸合成酵素あるいは５−ア
ミノレブリン酸の製造法、ならびに該酵素を用いた５−
アミノレブリン酸の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】５−アミノレブリン酸合成酵素は、グリ
シンとスクシニルＣｏＡから５−アミノレブリン酸を生
合成する酵素であり、植物に対する生長促進作用など様
々な生理活性を有する５−アミノレブリン酸の生産に重
要な役割を果たしている。また、５−アミノレブリン酸
合成酵素遺伝子を見い出し、該遺伝子を形質転換した形
質転換体や該遺伝子にコードされる５−アミノレブリン
酸合成酵素を量産することは５−アミノレブリン酸の生
産に極めて重要である。

【０００３】従来、微生物の培養による５−アミノレブ
リン酸の製造にはメタン細菌、光合成細菌、クロレラな
どの利用が試みられており、特に光合成細菌やクロレラ
では５−アミノレブリン酸の生産性が高いことが知られ
ている。しかしながら、５−アミノレブリン酸の生産に
は培養中に光を照射する必要があり、光照射にコストが
かかる上、工業生産を目的としたスケールアップが困難
であるなど問題点を有している。

【０００４】一方、５−アミノレブリン酸合成酵素遺伝
子を分離した例として、ヒト（例えば、Ｂｉｓｈｏｐ
Ｄ． Ｆ． ａｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８， ７１８７−７１８８
（１９９０））、ニワトリ（例えば、Ｍａｇｕｉｒｅ
Ｄ． ｊ． ａｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４， １３７９−１３９１
（１９８６））、マウス（例えば、Ｓｃｈｏｅｎｈａｕ
ｔ， Ｄ． Ｓ． ａｎｄ Ｃｕｒｔｉｓ，Ｐ．
Ｊ．， Ｇｅｎｅ ４８， ５５−６３（１９８
６））、ラット（例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｍ．，
Ｋｕｒｅ， Ｓ．， Ｅｎｇｅｌ Ｊ． Ｄ．ａｎｄ
Ｈｉｒａｇａ Ｋ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．
２６３， １５９７３−１５９７９（１９８８））、Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（例
えば、Ｋｅｎｇ Ｔ． ａｎｄ Ｇｕａｒｅｎｔｅ
Ｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８４， ９１１３−９１１７（１
９８７））、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ
（例えば、Ｌｅｏｎｇ Ｓ． Ａ．， Ｗｉｌｌｉａｍ
ｓ Ｐ． Ｈ． ａｎｄ Ｄｉｔｔａ Ｇ． Ｓ．，
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３， ５９
６５−５９７６（１９８５））、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏ
ｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ（例えば、ＭｃＣｌｕｎ
ｇ Ｃ． Ｒ． ａｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ
５４， １３３−１３９（１９８７））、 Ｒｈｏｄｏ
ｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（Ｈｏｒｎｂｅｒ
ｇｅｒ Ｕ．， Ｌｉｅｂｅｔａｎｚ Ｒ．， Ｔｉｃ
ｈｙ Ｈ． Ｖ． ａｎｄ Ｄｒｅｗｓ Ｇ．， Ｍｏ
ｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２２１， ３７１−３
７８（１９９０））、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈ
ａｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｅｌｌｅｎ Ｌ． Ｎｅｉ
ｄｌｅａｎｄ Ｓａｍｕｅｌ Ｋａｐｌａｎ， Ｊ．
ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７５， ２２９２
−２３０３（１９９３））などが存在する。また、５−
アミノレブリン酸合成酵素遺伝子を形質転換した形質転
換体細胞を利用した５−アミノレブリン酸合成酵素の製
造も試みられている（特開平２−１６７０８３）。しか
しながら、暗所での培養において５−アミノレブリン酸
の生産能力が高い光合成細菌、例えばロドバクター ス
フェロイデス ＣＲ−００２株（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅ
ｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＣＲ−００２株）などか
らは、５−アミノレブリン酸合成酵素遺伝子を分離でき
ていなかった。また、上記形質転換体細胞を利用した方
法は、大腸菌を宿主とした形質転換体細胞を超音波破砕
処理することにより調製した粗酵素液を５−アミノレブ
リン酸合成酵素として製する方法であり、５−アミノレ
ブリン酸の工業的生産の観点からは、（１）培養菌体か
らの酵素の調製が必要である、（２）ピリドキサールリ
ン酸などの高価な製造原料が必要である、（３）５−ア
ミノレブリン酸合成酵素活性及び５−アミノレブリン酸
生産量が低いなどの問題点を有している。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、組換
えＤＮＡ技術により、５−アミノレブリン酸を著量蓄積
する微生物から５−アミノレブリン酸合成酵素遺伝子を
単離し、該遺伝子がコードする５−アミノレブリン酸合
成酵素を増強した形質転換体細胞を用いることにより、
５−アミノレブリン酸合成酵素ならびに５−アミノレブ
リン酸を量産する技術を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは５−アミノ
レブリン酸の微生物による生産について鋭意研究を行っ
た結果、組換えＤＮＡ技術を利用して暗所での培養にお
いて５−アミノレブリン酸を生産する能力が高い微生物
より５−アミノレブリン酸合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ
断片を単離し、その塩基配列を明らかにすることに成功
した。更に、該遺伝子の組換え体ＤＮＡおよび該組換え
体ＤＮＡの形質転換体細胞を作製し、該形質転換体細胞
により５−アミノレブリン酸合成酵素を製造すること、
また当該５−アミノレブリン酸合成酵素又は形質転換体
細胞を用いて５−アミノレブリン酸を効率よく製造する
ことに成功し、本発明を完成するに至った。

【０００７】即ち、本発明は配列番号１で示される５−
アミノレブリン酸合成酵素のアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡ断片を提供するものである。また、本発明はこの
５−アミノレブリン酸合成酵素遺伝子のＤＮＡ断片を含
有する組換え体ＤＮＡ、及び暗所での培養において、５
−アミノレブリン酸を生産する光合成細菌を宿主とし、
上記５−アミノレブリン酸合成酵素遺伝子で形質転換し
た形質転換体細胞を提供するものである。更に、本発明
は該形質転換体細胞を培養し、その培養物から採取する
５−アミノレブリン酸合成酵素の製造法を提供するもの
である。更にまた、本発明はこの形質転換体細胞又はそ
の培養により得られた５−アミノレブリン酸合成酵素を
グリシン及びスクシニルＣｏＡに作用させることを特徴
とする５−アミノレブリン酸の製造法を提供するもので
ある。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明のＤＮＡ断片の分離には、
微生物の宿主−ベクター系を用いることができる。該Ｄ
ＮＡ断片は、例えば組換えＤＮＡ技術を利用して次の如
くして製造される。即ち、まずＤＮＡ供与体として、例
えば暗所での培養において５−アミノレブリン酸を著量
蓄積する能力を有する微生物を用い、該微生物からゲノ
ムＤＮＡを抽出し、制限酵素などにより切断しＤＮＡ断
片とする。一方、ファージ、プラスミド等のベクターＤ
ＮＡを制限酵素等を用いて、ゲノムＤＮＡ断片が挿入可
能な制限酵素末端を作製する。これらゲノムＤＮＡ断片
と直鎖状にしたベクターＤＮＡをＤＮＡリガーゼを用い
て結合させて、組換え体ＤＮＡを得る。該組換え体ＤＮ
Ａを宿主細胞に移入し、目的の組換え体ＤＮＡを保有す
る形質転換体細胞を選択し、該形質転換体細胞より目的
の組換え体ＤＮＡを分離することにより製造される。次
いで、目的に応じて該組換え体ＤＮＡより新たなる組換
え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞へ移
入する。該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体細胞に
よって５−アミノレブリン酸合成酵素を生産でき、該形
質転換細胞又は該酵素の作用によって５−アミノレブリ
ン酸を製造できる。

【０００９】以下、上記工程を詳細に説明する。本発明
のＤＮＡ供与体としては、特に制限されないが、暗所で
の培養において５−アミノレブリン酸を著量蓄積する能
力を有する微生物、例えばロドバクタースフェロイデス
ＣＲ−００２株（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａ
ｅｒｏｉｄｅｓ ＣＲ−００２株 ＦＥＲＭ Ｐ−１５
３１２）を用いるのが好ましい。

【００１０】該微生物からのゲノムＤＮＡの抽出は、該
微生物の培養菌体を集菌し、例えばプロテアーゼＫにて
菌体を溶菌した後、プロテアーゼ処理、リボヌクレアー
ゼ処理、フェノール抽出による除タンパク質処理、アル
コールによるゲノムＤＮＡの沈澱、遠心分離などの方法
を適宜組み合わせて行うのが好ましい。

【００１１】分離されたゲノムＤＮＡを断片化するに
は、例えば該ゲノムＤＮＡの制限酵素の消化により行わ
れる。

【００１２】ベクターとしては、組換えＤＮＡを目的と
して宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージ又はプ
ラスミドから構築されたものを用いるのが好ましい。プ
ラスミドとしては、例えば大腸菌を宿主とする場合には
ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１
８、ｐＵＣ１１９、ブルースクリプト、ｐＫＫ２２３−
３等、紅色非硫黄細菌を宿主とする場合にはｐＫＴ２３
０（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ Ｍ． ｅｔ ａｌ．，
Ｇｅｎｅ １６， ｐ２３７−（１９８１）、ＡＴＣＣ
３７２９４）、ｐＲＫ４１５、ＲＳＦ１０１０、ｐＶＫ
１００等が好ましい。これらのベクターは、例えば制限
酵素を用いてＤＮＡ断片が挿入可能な制限酵素末端を作
製し、必要に応じてその末端を脱リン酸処理した後に用
いられる。

【００１３】ゲノムＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片の
結合は、公知のＤＮＡリガーゼ、例えばＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼ等を用いて行うのが好ましい。

【００１４】得られた組換え体ＤＮＡを移入させる宿主
微生物としては、該組換え体ＤＮＡが安定にかつ自律的
に複製可能で、かつ外来性の遺伝子の形質が安定的に発
現するものであれば良いが、例えば大腸菌や紅色非硫黄
細菌を用いることができる。

【００１５】宿主微生物に組換え体ＤＮＡを移入する方
法としては、例えば接合法、エレクトロポレーション
法、コンピテントセル法、マイクロインジェクション
法、パーティクルガン法等のいづれの方法も用いること
ができる。

【００１６】形質転換体の選択は、用いたベクターの選
択マーカー、例えば形質転換体のＤＮＡ組換えにより獲
得する薬剤耐性を指標とすることができる。これら形質
転換体の中から目的の組換え体ＤＮＡを含有する形質転
換体の選択は、例えば５−アミノレブリン酸合成酵素遺
伝子の部分的なＤＮＡ断片をプローブとして用いたコロ
ニーハイブリダイゼーション法により行われるのが好ま
しい。このプローブの標識としては、例えば放射性同位
元素、ジゴキシゲニン、酵素等のいづれも用いることが
できる。

【００１７】このようにして選択された形質転換体細胞
から組換え体ＤＮＡを抽出するには、常法により抽出す
れば良く、例えば大腸菌のアルカリ溶菌法（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９））を用いる
ことができる。

【００１８】抽出される組換え体ＤＮＡは、必要に応じ
て再び組換えＤＮＡ技術を利用して組換えることができ
る。得られる組換え体ＤＮＡから、本発明のＤＮＡ断片
を切り出すには、制限酵素などを用いることができる。

【００１９】かくして得られる本発明のＤＮＡ断片の塩
基配列は、例えばダイデオキシ法で解読し、決定するこ
とができる。配列番号２に５−アミノレブリン酸合成酵
素をコードするＤＮＡ断片の塩基配列を、配列番号１に
当該ＤＮＡ塩基配列にコードされるアミノ酸配列を、配
列番号３に後記実施例で分離したＤＮＡ断片の塩基配列
とそこにコードされるアミノ酸配列を示す。

【００２０】本発明において、暗所での培養にて５−ア
ミノレブリン酸の生産性が高い光合成細菌、例えばロド
バクター スフェロイデスＣＲ−００２株を宿主とし、
５−アミノレブリン酸合成酵素遺伝子を形質転換した形
質転換体細胞を用いることが、５−アミノレブリン酸合
成酵素遺伝子を発現させ、５−アミノレブリン酸合成酵
素および５−アミノレブリン酸を効率よく生産すること
から好ましい。該形質転換体細胞へ導入する５−アミノ
レブリン酸合成酵素遺伝子としては、ヒト、マウス、ラ
ット、ニワトリ、酵母、根粒細菌、光合成細菌などから
分離された遺伝子を用いることができ、好ましくは、暗
所での培養において５−アミノレブリン酸を生産する光
合成細菌ロドバクター スフェロイデス ＣＲ−００２
株から単離した遺伝子、具体的には配列番号１で示され
る５−アミノレブリン酸合成酵素のアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡ断片又はそのＤＮＡ断片を含有する組換え
体ＤＮＡを用いることができる。該形質転換体細胞へ導
入する５−アミノレブリン酸合成酵素遺伝子の組換え体
ＤＮＡのベクターとしては、宿主細胞内で強力に発現す
るプロモーターを有するベクター、宿主細胞内でのコピ
ー数が高いベクター、または宿主細胞内で強力に発現す
るプロモーターを有するコピー数の高いベクターなどを
利用することができる。

【００２１】本発明の形質転換体細胞を用いれば５−ア
ミノレブリン酸合成酵素を多量に製造することができ
る。すなわち、該合成酵素は、適当な培地で該形質転換
体細胞を培養することによって培養細胞内あるいは培養
液内に得ることができる。この場合に使用する培地とし
ては、例えば炭素源としてグルコース、窒素源としてグ
ルタミン酸ナトリウム、その他酵母エキスなどの成分を
加えた培地が挙げられ、形質転換体細胞の性質に応じて
グリシン、レブリン酸、適当な抗生物質などを適宜添加
することができる。また、培養の温度は２０〜４０℃、
好ましくは２５〜３５℃、pHは５〜８、好ましくは６〜
７．５である。得られた培養細胞はそれ自身を酵素とし
て利用することもできるが、必要に応じて細胞に超音波
破砕処理などを施し、精製して利用することもできる。

【００２２】次いで、当該酵素を利用して５−アミノレ
ブリン酸を生産することができる。尚、この場合におけ
る５−アミノレブリン酸の製造は、グリシン及びスクシ
ニルＣｏＡに上記酵素を作用させることによって行うこ
とができる。また、５−アミノレブリン酸は、例えば上
記の培養菌体を適当な培地で培養することによっても製
造することができる。この場合において使用する培地や
条件としては上記５−アミノレブリン酸合成酵素の製造
の場合と同様に適宜選択することができる。かくして得
られた培養液中の５−アミノレブリン酸は、必要に応じ
て遠心分離などで菌体等不溶成分をのぞいた後イオン交
換樹脂などを用いて分離することができる。

【００２３】

【発明の効果】本発明の５−アミノレブリン酸合成酵素
遺伝子を保有する形質転換体細胞を用いれば、光照射を
必要とせずに５−アミノレブリン酸合成酵素を多量に製
造することができ、５−アミノレブリン酸の工業的生産
が可能となる。

【００２４】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではな
い。

【００２５】実施例１ （１） ５−アミノレブリン酸合成酵素遺伝子プローブ
の作製 ロドバクター スフェロイデス ＣＲ−００２株を試験
管内のＬＢ培地（ポリペプトン５ｇ／ｌ、酵母エキス
０．５ｇ／ｌ、食塩２ｇ／ｌ、ｐＨ７．０）へ接種し３
０℃にて終夜培養し、前培養液を作製した。この前培養
液をフラスコ内の新しく用意した前記と同様の培地に接
種し３０℃にて再び終夜培養した。該培養液の遠心によ
り集菌した。

【００２６】該菌体をＴＥ（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で洗浄した後懸濁し、最終
濃度１００μｇ／ｍｌプロテアーゼＫにて３７℃、３０
分間処理した。１／２０容の１０％ ＳＤＳを加え溶菌
した後、等量のフェノール−クロロホルムにて核酸の抽
出を行った。この水層に含まれるゲノムＤＮＡをエタノ
ール沈殿にて取得し、減圧乾燥の後ＴＥを加え溶解し
た。

【００２７】ヒト、マウス、ラット、ニワトリ、サッカ
ロマイセス セレビシェ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌ
ｉｌｏｔｉ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏ
ｎｉｃｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａ
ｔｕｓの５−アミノレブリン酸合成酵素のアミノ酸配列
から高く保存されたアミノ酸配列を見い出し、該領域の
アミノ酸配列を塩基配列に逆翻訳した。これらの知見か
ら該遺伝子をＰＣＲにより部分的に増幅することを目的
として、配列番号４及び配列番号５に示す塩基配列を有
する合成ヌクレオチドを化学合成により作製し、１対の
ＰＣＲプライマーとした。上記にて取得したロドバクタ
ー スフェロイデス ＣＲ−００２株のゲノムＤＮＡを
鋳型ＤＮＡとして、上記プライマーを用いたＰＣＲにて
５−アミノレブリン酸合成酵素遺伝子の部分的なＤＮＡ
断片を増幅した。

【００２８】尚、このＰＣＲは次の如くして行った。ま
ず、１０ｍＭトリス塩酸ｐＨ８．３、５０ｍＭ塩化カリ
ウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％（Ｗ
／Ｖ）ゼラチン、２μＭ ｄＮＴＰ混合液、１ｎｇ／μ
ｌゲノムＤＮＡ（ロドバクター スフェロイデス ＣＲ
−００２株）、１μＭ ＰＣＲプライマー（配列番号４
および配列番号５に示す塩基配列を有する合成ヌクレオ
チド）を含む反応液を調製した。この反応液は９４℃に
て５分間熱処理した後、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（宝
酒造社、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を０．０５Ｕ
／μｌになるように加え、サイクル反応（熱変性反応９
４℃にて１分間、アニーリング反応３７℃にて５分間、
伸長反応７２℃にて３分間（以下、１サイクル毎に反応
時間を１０秒ずつ延長した））を２５回繰り返した。
１．２％アガロースゲル（宝酒造社、ＬＯ３）を用いて
上記ＰＣＲ産物を電気泳動した。緩衝液としてＴＡＥ
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８
９））を用いた。電気泳動後のアガロースゲルは１μｇ
／ｍｌエチジウムブロマイドに１５分間浸せきした後水
洗し、紫外線照射によりＤＮＡ断片の蛍光を確認した。
サイズマーカーとしてλファージＤＮＡのＢｓｔＰＩ消
化物（宝酒造社）を同時に電気泳動し、該ＤＮＡ断片の
泳動距離からＰＣＲ産物の分子量を求めた。

【００２９】目的のＰＣＲ産物を含むアガロースゲルを
切り出し細かく切り刻み、ＤＮＡ回収用フィルター付き
遠心チューブＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造社）を用いて
ＤＮＡ断片の回収を行った。該ＤＮＡ回収液に１／１０
倍容量の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ７．０と２倍容量のエ
タノールを添加し−８０℃にて２時間冷却し、１２，０
００×ｇにて１０分間遠心し、ＤＮＡのペレットを得
た。７０％エタノールを適量加え遠心管の壁面を２回リ
ンスし、このリンス液を簡単に除去した後減圧乾燥し
た。乾燥したＰＣＲ産物を水に溶解した。

【００３０】得られたＰＣＲ産物をプラスミドベクター
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＶサ
イトへクローニングし、部分的に塩基配列を解析した。
これら手順を図１に示す。このＰＣＲ産物の塩基配列及
びこれにコードされているアミノ酸配列を配列番号６に
示す。このアミノ酸配列が既に知られている５−アミノ
レブリン酸合成酵素のアミノ酸配列と相同性が高いこと
を確認した。該ＰＣＲ産物の塩基配列の解析は、Ｔ７シ
ークエンシングキット（ファルマシアバイオテク社）を
用いたＭ１３ダイデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ， Ｆ．
ｅｔａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．， ７４， ５４６３−５４６７（１９７
７））にてシークエンシング反応を行い、自動レーザー
蛍光シークエンシング装置（ファルマシアバイオテク
社、ＡＬＦII）を用いた。

【００３１】次いで、ジゴキシゲニンにて標識した５−
アミノレブリン酸合成酵素遺伝子プローブをＰＣＲにて
作製した。尚、このＰＣＲは次の如くして行った。ま
ず、１０ｍＭトリス塩酸ｐＨ８．３、５０ｍＭ塩化カリ
ウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％（Ｗ
／Ｖ）ゼラチン、２μＭ ｄＡＴＰ、２μＭ ｄＣＴ
Ｐ、２μＭ ｄＧＴＰ、１．３μＭ ｄＴＴＰ、０．７
μＭ ジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰ（ベーリンガー・マ
ンハイム社）、１ｎｇ／μｌゲノムＤＮＡ（ロドバクタ
ー スフェロイデス ＣＲ−００２株）、１μＭ ＰＣ
Ｒプライマー（配列番号４および配列番号５に示す塩基
配列を有する合成ヌクレオチド）を含む反応液を調製し
た。この反応液は９４℃にて５分間熱処理した後、耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅ）を０．０５Ｕ／μｌになるように加え、サ
イクル反応（熱変性反応９４℃にて１分間、アニーリン
グ反応３７℃にて５分間、伸長反応７２℃にて３分間
（以下、１サイクル毎に反応時間を１０秒ずつ延長し
た））を２５回繰り返した。１．２％アガロースゲルを
用いて該ＰＣＲ産物を電気泳動した。目的のＰＣＲ産物
を含むアガロースゲルを切り出し細かく切り刻み、ＤＮ
Ａ回収用フィルター付き遠心チューブＳＵＰＲＥＣ−０
１（宝酒造社）を用いてＰＣＲ産物の回収を行い、ジゴ
キシゲニン標識した５−アミノレブリン酸合成酵素遺伝
子のプローブとした。

【００３２】（２） 遺伝子ライブラリーの調製 実施例１−（１）に記載する方法にて取得したロドバク
ター スフェロイデスＣＲ−００２株のゲノムＤＮＡを
制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社）により完全消化し、予
め作製しておいた遠心管中の２０％〜６０％の蔗糖密度
勾配液に加えた。超遠心機ベックマン社Ｌ７−５５（ス
イングローターＳＷ５５Ｔｉ）にて、４５，０００ｒｐ
ｍ、２０時間、１６℃にて遠心を行った。超遠心後、蔗
糖密度勾配にて分離されたゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ消
化物から約１２ｋｂｐの画分を回収し、等量のフェノー
ル−クロロホルムにて抽出を行った。２倍容量のエタノ
ールを添加し−２０℃にて１２時間冷却し、１２，００
０×ｇにて１０分間遠心し、ＤＮＡのペレットを得た。
７０％エタノールを適量加え遠心管の壁面を２回リンス
し、このリンス液を簡単に除去した後減圧乾燥した。乾
燥したゲノムＤＮＡ断片を水に溶解した。

【００３３】プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔII ＳＫ（＋）を制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社）に
より完全消化した。同反応液にホスファターゼ（Ｃａｌ
ｆＩｎｔｅｓｔｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（宝
酒造社）を添加し、制限酵素にて開裂したベクターの末
端を脱リン酸化処理した。この反応液に１／１０倍容量
の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ７．０と２倍容量のエタノー
ルを添加し−８０℃にて２時間冷却し、１２，０００×
ｇにて１０分間遠心し、ベクターＤＮＡのペレットを得
た。７０％エタノールを適量加え遠心管の壁面を２回リ
ンスし、このリンス液を簡単に除去した後減圧乾燥し
た。乾燥したベクターＤＮＡを水に溶解した。上記のロ
ドバクター スフェロイデス ＣＲ−００２株由来の約
１２ｋｂｐのＤＮＡ断片およびベクターＤＮＡのＤＮＡ
断片を、ライゲーションキット（宝酒造社）を用いて結
合した。

【００３４】大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセル（東
洋紡社）へ、上記反応液を形質転換した。該形質転換体
大腸菌は最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるようにアン
ピシリンを添加したＬＢ平板培地（ＬＢに寒天１５ｇ／
ｌを添加して調製する）に塗布し、３７℃にて終夜培養
した。出現したコロニーを、大腸菌ＪＭ１０９を宿主と
したロドバクター スフェロイデス ＣＲ−００２株の
遺伝子ライブラリーとした。

【００３５】（３） ５−アミノレブリン酸合成酵素遺
伝子を含む形質転換体細胞の選択 実施例１−（２）にて取得した大腸菌の形質転換体細胞
から成るコロニーから目的の５−アミノレブリン酸合成
酵素遺伝子を含む形質転換体細胞を選択するには、実施
例１−（１）にて作製した５−アミノレブリン酸合成酵
素遺伝子のプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼ
ーションを行った。尚、このコロニーハイブリダイゼー
ションは非ＲＩ−ＤＮＡ標識・検出キット（ベーリンガ
ー・マンハイム社、ＤＩＧ−ＥＬＩＳＡキット）を用
い、次の如くして行った。実施例１−（２）にて取得し
たＬＢ平板培地上の大腸菌の形質転換体細胞から成るコ
ロニーを、円形のナイロンメンブレン（アマシャム社）
へ転写した。このナイロンメンブレンをアルカリ変性液
（０．５Ｍ水酸化ナトリウム、１．５Ｍ食塩）を浸した
３ＭＭ濾紙（ワットマン）上に１５分間、室温にて静置
してアルカリ変性処理した。次いで、該ナイロンメンブ
レンを中和液（１．５Ｍ食塩、０．５Ｍトリス塩酸緩衝
液ｐＨ７．０）を浸した３ＭＭ濾紙（ワットマン）上に
３分間、室温にて静置して中和処理した。再び、新しい
中和液にて中和処理を行った。更に、該ナイロンメンブ
レンを２×ＳＳＣ（３００ｍＭ食塩、３０ｍＭクエン酸
ナトリウムｐＨ７．０）を浸した３ＭＭ濾紙（ワットマ
ン）上に５分間、室温にて静置した。該ナイロンメンブ
レンを新しい３ＭＭ濾紙（ワットマン）上に放置して水
分を取り除き、９０℃にて２時間放置した。

【００３６】該ナイロンメンブレンをハイブリダイゼー
ション液（５×ＳＳＣ、０．５％ブロッキング試薬（ベ
ーリンガー・マンハイム社）、０．１％ Ｎ−ラウリル
サルコシンナトリウム塩、０．２％ ＳＤＳ））に６５
℃にて３時間浸した。該ナイロンメンブレンを新しく用
意したハイブリダイゼーション液へ移し、最終濃度が５
０μｇ／ｍｌになるようにサケ精子ＤＮＡを加えた。更
に、実施例１−（１）にて作製した５−アミノレブリン
酸合成酵素遺伝子のプローブを１００℃にて５分間熱変
性した後これを加え、ナイロンバッグに密封し、６５℃
にて１２時間浸した。該ナイロンメンブレンは洗浄液１
（０．１％ ＳＤＳ、２×ＳＳＣ）にて室温で１０分間
洗浄した後、再度洗浄液１にて洗浄を繰り返した。更に
該メンブレンは、洗浄液２（０．１％ ＳＤＳ、０．１
×ＳＳＣ）にて６５℃で１５分間洗浄した後、再度洗浄
液２にて洗浄を繰り返した。

【００３７】次いで、上記ナイロンメンブレンは緩衝液
１（１００ｍＭトリス塩酸、１５０ｍＭ食塩ｐＨ７．
５）にて洗浄し、緩衝液２（０．５％ブロッキング試薬
（ベーリンガー・マンハイム社）、１００ｍＭトリス塩
酸、１５０ｍＭ食塩ｐＨ７．５）に室温で３０分間浸
し、緩衝液１にて再度洗浄した。緩衝液１にて１５０ｍ
Ｕ／ｍｌにアルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニ
ン抗体を希釈調製し、ナイロンメンブレンを３０分間浸
した。緩衝液１にて１５分間２回洗浄し、緩衝液３（１
００ｍＭトリス塩酸、１００ｍＭ食塩、５０ｍＭ塩化マ
グネシウム ｐＨ９．５）に浸した。更に、緩衝液３に
て希釈調製した発色溶液（０．３３７５ｍｇ／ｍｌ ４
−ニトロブルーテトラゾリウム塩酸塩、０．１７５ｍｇ
／ｍｌ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン
酸トルイジン塩）に浸し、暗所にて発色反応を行った。
該ナイロンメンブレン上に青く呈色した部分に相当する
コロニーを、５−アミノレブリン酸合成酵素遺伝子を保
有する形質転換体から成るコロニーとして選択した。
尚、発色反応の停止はＴＥに浸すことによって行った。

【００３８】（４） ５−アミノレブリン酸合成酵素遺
伝子を含む組換え体ＤＮＡ、ｐＨＧ５１４の分離 実施例１−（３）記載のコロニーハイブリダイゼーショ
ンにて選択した５−アミノレブリン酸合成酵素遺伝子を
含む形質転換体を最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるよ
うにアンピシリンを添加したＬＢ液体培地１ｍｌへ接種
して３７℃で終夜培養した。遠心により集菌し、ＴＥ
１００μｌに懸濁した。溶液II（１％ＳＤＳ、０．２Ｍ
水酸化ナトリウム）２００μｌを添加し、氷中にて５分
間冷却した。更に溶液III （５Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ
４．８）１５０μｌを添加し、氷中にて５分間冷却し
た。遠心分離にて、上清をデカンテーションにより分離
した。次いで、フェノール−クロロホルム抽出を行い、
２倍容量のエタノールを添加し−８０℃にて２時間冷却
した。１２，０００×ｇにて１０分間遠心し、ＤＮＡの
ペレットを得た。７０％エタノールを適量加え遠心管の
壁面を２回リンスし、エタノールを簡単に除去した後減
圧乾燥し、精製プラスミドｐＨＧ５１４を得た。

【００３９】（５） ｐＨＧ５１４の解析 実施例１−（４）で取得したプラスミドｐＨＧ５１４を
適当な緩衝液中で過剰量の制限酵素（ＥｃｏＲＩ、Ｓａ
ｌＩ、ＮｏｔＩ）で完全消化した。実施例１−（１）に
記載する電気泳動を行い、制限酵素消化により生じた各
ＤＮＡ断片の分子量を解析し、制限酵素地図を作成し
た。その結果、ｐＨＧ５１４は図２及び図３に示される
構造を有していた。つまり、プラスミドベクターｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ（＋）のクローニングサイト
に、約１２ｋｂｐのＤＮＡ断片を挿入した構造を有して
いた。

【００４０】（６） ５−アミノレブリン酸合成酵素遺
伝子領域の検索と塩基配列の解析 ｐＨＧ５１４に挿入されている５−アミノレブリン酸合
成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片から欠失ＤＮＡ断片を作
製し、ｐＨＧ７２６、ｐＨＧ７３２、ｐＨＧ７７３およ
びｐＨＧ７８３を作製した。これらプラスミドの作製の
手順は図２に示す。最終濃度が５０μｇ／ｍｌになるよ
うに５−アミノレブリン酸を添加したＬＢ培地へ、５−
アミノレブリン酸要求性大腸菌ＦＥＲＭ Ｐ−１２８２
７を接種し、３７℃にて終夜培養した。新しく用意した
同培地３０ｍｌへ前培養液０．１ｍｌを接種した後、３
７℃にて３時間浸透培養した。培養後、氷中にて急冷し
た後遠心し培養菌体を回収した。予め氷中にて冷却して
おいた５０ｍＭ塩化カルシウム１０ｍｌに培養菌体を懸
濁し、氷中で３０分間放置した。再度遠心し５０ｍＭ塩
化カルシウム１ｍｌに菌体を懸濁しコンピテントセルと
した。

【００４１】上記コンピテントセルへ、ｐＨＧ７２６、
ｐＨＧ７３２、ｐＨＧ７７３およびｐＨＧ７８３を形質
転換し、ＬＢ平板培地にて静置培養した。これらプラス
ミドの形質転換による宿主大腸菌のもつ５−アミノレブ
リン酸要求性の相補性を観察し、５−アミノレブリン酸
合成酵素遺伝子の領域を検索した。結果、図３に示した
ように約１．９ｋｂｐのＤＮＡ断片に５−アミノレブリ
ン酸合成酵素遺伝子の領域を限定した。

【００４２】実施例１−（１）に記載する方法にて、５
−アミノレブリン酸合成酵素遺伝子が含まれる前記約
１．９ｋｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。解析
した全塩基配列を配列番号３、５−アミノレブリン酸合
成酵素のコード領域を配列番号２、配列番号２にコード
される５−アミノレブリン酸合成酵素のアミノ酸配列を
配列番号１に示す。

【００４３】（７） ５−アミノレブリン酸合成酵素遺
伝子を含む組換え体ＤＮＡ、ｐＨＥＭＡ０１及びｐＨＥ
ＭＡ０２の作製 広宿主域ベクターｐＫＴ２３０（Ｂａｇｄａｓａｒｉａ
ｎ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ １６， ｐ２３
７−（１９８１））へ、ｐＵＣ１１９のクローニングサ
イトを挿入し、ｐＫＴ２３０ＭＣを作製した。次いで、
ｐＫＴ２３０ＭＣの一部を削除し、ｐＫＴ２３０ＭＣＮ
を構築した。尚、これらプラスミド作製の手順を図４に
示す。実施例１−（４）で取得したプラスミドｐＨＧ５
１４に挿入されている５−アミノレブリン酸合成酵素遺
伝子を含むＤＮＡ断片約１２ｋｂｐをｐＫＴ２３０ＭＣ
ＮのＥｃｏＲＩサイトへ挿入し、ｐＨＥＭＡ０１および
ｐＨＥＭＡ０２を作製した。尚、これらプラスミド作製
の手順は図５に示す。

【００４４】（８） 光合成細菌の形質転換 大腸菌ＨＢ１０１（宝酒造社）へｐＫＴ２３０ＭＣＮ、
ｐＨＥＭＡ０１およびｐＨＥＭＡ０２をそれぞれ形質転
換した。光合成細菌の形質転換を行うにあたりＬＢ培地
を用い、ドナーとして上記のＨＢ１０１形質転換体、ヘ
ルパーとしてＨＢ１０１株／ｐＲＫ２０１３、レシピエ
ントとしてロドバクター スフェロイデス ＣＲ−００
２株あるいはＩＦＯ１２２０３株を前培養した。尚、こ
れら培養は、大腸菌は３７℃、ロドバクター スフェロ
イデスは３０℃にて行った。新しく用意したＬＢ培地へ
それぞれの前培養液を接種し、２時間振とう培養した。
これら培養液をドナー：ヘルパー：レシピエント＝１：
１：２０（ＯＤ_660nm）にて混合し、ＬＢ平板培地上で
３０℃にて終夜静置培養した。この培養菌体を、最終濃
度が２５ｍｇ／ｌになるようにカナマイシンを添加した
ＧＧＹ２平板培地にて希釈し、３０℃にて終夜静置培養
した。出現したコロニーを繰り返し上記平板培地にて希
釈し、ロドバクター スフェロイデスの形質転換体を単
離した。

【００４５】（９） ５−アミノレブリン酸合成酵素の
製造 実施例１−（８）にて取得した形質転換体ＣＲ−００２
株／ｐＫＴ２３０ＭＣＮ、ＣＲ−００２株／ｐＨＥＭＡ
０１、ＣＲ−００２株／ｐＨＥＭＡ０２、ＩＦＯ１２２
０３株／ｐＫＴ２３０ＭＣＮを、最終濃度が２５ｍｇ／
ｌになるようにカナマイシンを添加したＧＧＹ２培地
（３．８ｇ／ｌグルタミン酸ナトリウム、１．０７ｇ／
ｌリン酸２水素ナトリウム・２水和物、１．１３ｇ／ｌ
リン酸水素２ナトリウム・１２水和物、０．８ｇ／ｌリ
ン酸アンモニウム、０．２ｇ／ｌ硫酸マグネシウム・７
水和物、５３ｍｇ／ｌ塩化カルシウム、１ｇ／ｌ硫酸マ
ンガン・５水和物、１ｇ／ｌニコチン酸、１ｇ／ｌチア
ミン塩酸塩、１ｇ／ｌビオチン、２ｇ／ｌ酵母エキス、
９ｇ／ｌグルコース、ｐＨ７．０）１０ｍｌへ接種し、
３０℃にて暗所で終夜振とう培養した。カナマイシンを
添加したＧＧＹ２培地２００ｍｌを坂口フラスコ（５０
０ｍｌ容量）に新しく用意し、上記前培養液を接種し
た。３０℃にて７２時間振とう培養し、遠心により培養
菌体を得た。

【００４６】該培養菌体をトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．１
で３回洗浄し、フレンチプレスにより破砕しタンパク質
濃度１０ｍｇ／ｍｌの粗酵素液を調製した。この場合の
タンパク質の定量は、牛血清アルブミンを標準としてプ
ロテインアッセイキット（バイオラッド社）を用いた。

【００４７】該粗酵素液に１ｍＭピリドキサールリン
酸、２ｍＭスクシニルＣｏＡ、５０ｍＭトリス塩酸緩衝
液、０．３ｇ／ｌグルタチオン、５０ｍＭグリシンを添
加し、３７℃にて３時間インキュベートした。インキュ
ベート後、生成した５−アミノレブリン酸の濃度を測定
し、比活性を算出した。尚、５−アミノレブリン酸濃度
は、岡山らの方法（Ａｋｉｒａ Ｏｋａｙａｍａ ｅｔ
ａｌ．， Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ． ３６， １４９４
−１４９７（１９９０））により定量した。表１に５−
アミノレブリン酸合成酵素の比活性の測定結果を示す。

【００４８】

【表１】

【００４９】（１０） ５−アミノレブリン酸の製造 実施例１−（８）にて取得した形質転換体ＣＲ−００２
株／ｐＫＴ２３０ＭＣＮ、ＣＲ−００２株／ｐＨＥＭＡ
０１、ＣＲ−００２株／ｐＨＥＭＡ０２、ＩＦＯ１２２
０３株／ｐＫＴ２３０ＭＣＮを、最終濃度が２５ｍｇ／
ｌになるようにカナマイシンを添加したＧＧＹ２培地１
０ｍｌへ接種し、３０℃にて暗所で終夜振とう培養し
た。カナマイシンを添加したＧＧＹ２培地２００ｍｌを
坂口フラスコ（５００ｍｌ容量）に新しく用意し、上記
前培養液を接種した。３０℃にて７２時間振とう培養
し、遠心により培養菌体を濃縮した。次いで、グリシン
およびレブリン酸を添加したＧＧＹ２培地１０ｍｌを用
いて前記濃縮菌体を懸濁し、３０ｇ−湿菌体重量／ｌ−
培地になるように調製した。尚、ＧＧＹ２培地に添加し
たグリシンおよびレブリン酸の最終濃度はそれぞれ３０
ｍＭあるいは６０ｍＭ、５ｍＭあるいは３０ｍＭとし
た。この菌体懸濁液を３０℃にて暗所で４８時間振とう
培養した。かくして製した菌体懸濁後２０時間における
培養液の５−アミノレブリン酸濃度は、岡山らの方法
（Ａｋｉｒａ Ｏｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌ
ｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３６， １４９４−１４９７（１
９９０））により定量した。表２及び表３に５−アミノ
レブリン酸の測定結果を示す。

【００５０】

【表２】

【００５１】

【表３】

【００５２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：４０７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Asp Tyr Asn Leu Ala Leu Asp Thr Ala Leu Asn Arg Leu His Thr 5 10 15 Glu Gly Arg Tyr Arg Thr Phe Ile Asp Ile Glu Arg Arg Lys Gly Ala 20 25 30 Phe Pro Lys Ala Met Trp Arg Lys Pro Asp Gly Ser Glu Lys Glu Ile 35 40 45 Thr Val Trp Cys Gly Asn Asp Tyr Leu Gly Met Gly Gln His Pro Ala 50 55 60 Val Leu Gly Ala Met His Glu Ala Leu Asp Ser Thr Gly Ala Gly Ser 65 70 75 80 Gly Gly Thr Arg Asn Ile Ser Gly Thr Thr Leu Tyr His Lys Arg Leu 85 90 95 Glu Ala Glu Leu Ala Asp Leu His Gly Lys Glu Ala Ala Leu Val Phe 100 105 110 Ser Ser Ala Tyr Ile Ala Asn Asp Ala Thr Leu Ser Thr Leu Pro Gln 115 120 125 Leu Ile Pro Gly Leu Val Ile Val Ser Asp Lys Leu Asn His Ala Ser 130 135 140 Met Ile Glu Gly Ile Arg Arg Ser Gly Thr Glu Lys His Ile Phe Lys 145 150 155 160 His Asn Asp Leu Asp Asp Leu Arg Arg Ile Leu Thr Ser Ile Gly Lys 165 170 175 Asp Arg Pro Ile Leu Val Ala Phe Glu Ser Val Tyr Ser Met Asp Gly 180 185 190 Asp Phe Gly Arg Ile Lys Glu Ile Cys Asp Ile Ala Asp Glu Phe Gly 195 200 205 Ala Leu Lys Tyr Ile Asp Glu Val His Ala Val Gly Met Tyr Gly Pro 210 215 220 Arg Gly Gly Gly Val Ala Glu Arg Asp Gly Leu Met Asp Arg Ile Asp 225 230 235 240 Ile Ile Asn Gly Thr Leu Gly Lys Ala Tyr Gly Val Phe Gly Gly Tyr 245 250 255 Ile Ala Ala Ser Ser Lys Met Cys Asp Ala Val Arg Ser Tyr Ala Pro 260 265 270 Gly Phe Ile Phe Ser Thr Ser Leu Pro Pro Val Val Ala Ala Gly Ala 275 280 285 Ala Ala Ser Val Arg His Leu Lys Gly Asp Val Glu Leu Arg Glu Lys 290 295 300 His Gln Thr Gln Ala Arg Ile Leu Lys Met Arg Leu Lys Gly Leu Gly 305 310 315 320 Leu Pro Ile Ile Asp His Gly Ser His Ile Val Pro Val His Val Gly 325 330 335 Asp Pro Val His Cys Lys Met Ile Ser Asp Met Leu Leu Glu His Phe 340 345 350 Gly Ile Tyr Val Gln Pro Ile Asn Phe Pro Thr Val Pro Arg Gly Thr 355 360 365 Glu Arg Leu Arg Phe Thr Pro Ser Pro Val His Asp Ser Gly Met Ile 370 375 380 Asp His Leu Val Lys Ala Met Asp Val Leu Trp Gln His Cys Ala Leu 385 390 395 400 Asn Arg Ala Glu Val Val Ala 405

【００５３】配列番号：２ 配列の長さ：１２２１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 起源 生物名：ロドバクター スフェロイデス （Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ） 株名 ：Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄ
ｅｓ ＣＲ−００２ （ＦＥＲＭ Ｐ−１５３１２） 配列： ATGGACTACA ATCTGGCACT CGATACCGCT CTGAACCGGC TCCATACCGA GGGCCGGTAC 60 CGGACCTTCA TCGACATCGA GCGGCGCAAG GGTGCCTTCC CGAAAGCCAT GTGGCGCAAG 120 CCCGACGGGA GCGAGAAGGA AATCACCGTC TGGTGCGGCA ACGACTATCT CGGCATGGGT 180 CAGCATCCGG CGGTGCTGGG GGCCATGCAC GAGGCGCTGG ATTCGACCGG CGCCGGGTCG 240 GGCGGCACGC GCAACATCTC GGGCACCACG CTCTATCACA AGCGCCTCGA GGCCGAGCTC 300 GCCGACCTGC ACGGCAAGGA AGCGGCGCTG GTCTTCTCGT CGGCCTATAT CGCCAACGAC 360 GCGACCCTCT CGACGCTGCC GCAGCTGATC CCGGGCCTCG TCATCGTCTC GGACAAGCTG 420 AACCACGCTT CGATGATCGA GGGCATCCGC CGCTCGGGCA CCGAGAAGCA CATCTTCAAG 480 CACAATGACC TCGACGACCT GCGCCGGATC CTGACCTCGA TCGGCAAGGA CCGTCCGATC 540 CTCGTGGCCT TCGAATCCGT CTATTCGATG GATGGCGACT TCGGCCGCAT CAAGGAGATC 600 TGCGACATCG CCGACGAGTT CGGCGCGCTG AAATACATCG ACGAGGTCCA TGCCGTCGGC 660 ATGTACGGCC CCCGCGGCGG CGGCGTGGCC GAGCGGGACG GGCTGATGGA CCGGATCGAC 720 ATCATCAACG GGACGCTGGG CAAGGCCTAT GGCGTGTTCG GCGGCTATAT CGCGGCCTCG 780 TCCAAGATGT GCGACGCGGT GCGCTCCTAC GCGCCGGGCT TCATCTTTTC GACCTCGCTG 840 CCGCCCGTCG TGGCGGCCGG TGCGGCGGCC TCGGTGCGCC ACCTCAAGGG CGATGTGGAG 900 CTGCGCGAGA AGCACCAGAC CCAGGCCCGC ATCCTGAAGA TGCGCCTCAA GGGGCTCGGC 960 CTGCCGATCA TCGACCACGG CTCGCACATC GTGCCGGTCC ATGTGGGCGA CCCCGTGCAC 1020 TGCAAGATGA TCTCGGACAT GCTGCTCGAG CATTTCGGCA TCTATGTCCA GCCGATCAAC 1080 TTCCCCACCG TGCCGCGCGG GACCGAGCGG CTGCGCTTCA CCCCGTCGCC CGTGCATGAT 1140 TCCGGCATGA TCGATCACCT CGTGAAGGCC ATGGACGTGC TCTGGCAGCA CTGTGCGCTG 1200 AATCGCGCCG AGGTCGTTGC C 1221

【００５４】配列番号：３ 配列の長さ：１９１１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 起源 生物名：ロドバクター スフェロイデス （Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ） 株名 ：Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄ
ｅｓ ＣＲ−００２ （ＦＥＲＭ Ｐ−１５３１２） 配列： ATCGATACCG TCGGCGATTG CGTGCTGGCG GTGGCCGATT GACGCAGGGA CCAATGAACG 60 GGTTTCAAAT TGGCCGGTTC CAGACTTAGG ATTTGATCCT TATCAAGGCC ATGTTGCGCC 120 GAAAATTGAT GATGACACCC AGCTTGCTCG GCAGCCCGAG CGTCAGGGAG ACGAAG 176 ATG GAC TAC AAT CTG GCA CTC GAT ACC GCT CTG AAC CGG CTC CAT ACC 224 Met Asp Tyr Asn Leu Ala Leu Asp Thr Ala Leu Asn Arg Leu His Thr 5 10 15 GAG GGC CGG TAC CGG ACC TTC ATC GAC ATC GAG CGG CGC AAG GGT GCC 272 Glu Gly Arg Tyr Arg Thr Phe Ile Asp Ile Glu Arg Arg Lys Gly Ala 20 25 30 TTC CCG AAA GCC ATG TGG CGC AAG CCC GAC GGG AGC GAG AAG GAA ATC 320 Phe Pro Lys Ala Met Trp Arg Lys Pro Asp Gly Ser Glu Lys Glu Ile 35 40 45 ACC GTC TGG TGC GGC AAC GAC TAT CTC GGC ATG GGT CAG CAT CCG GCG 368 Thr Val Trp Cys Gly Asn Asp Tyr Leu Gly Met Gly Gln His Pro Ala 50 55 60 GTG CTG GGG GCC ATG CAC GAG GCG CTG GAT TCG ACC GGC GCC GGG TCG 416 Val Leu Gly Ala Met His Glu Ala Leu Asp Ser Thr Gly Ala Gly Ser 65 70 75 80 GGC GGC ACG CGC AAC ATC TCG GGC ACC ACG CTC TAT CAC AAG CGC CTC 464 Gly Gly Thr Arg Asn Ile Ser Gly Thr Thr Leu Tyr His Lys Arg Leu 85 90 95 GAG GCC GAG CTC GCC GAC CTG CAC GGC AAG GAA GCG GCG CTG GTC TTC 512 Glu Ala Glu Leu Ala Asp Leu His Gly Lys Glu Ala Ala Leu Val Phe 100 105 110 TCG TCG GCC TAT ATC GCC AAC GAC GCG ACC CTC TCG ACG CTG CCG CAG 560 Ser Ser Ala Tyr Ile Ala Asn Asp Ala Thr Leu Ser Thr Leu Pro Gln 115 120 125 CTG ATC CCG GGC CTC GTC ATC GTC TCG GAC AAG CTG AAC CAC GCT TCG 608 Leu Ile Pro Gly Leu Val Ile Val Ser Asp Lys Leu Asn His Ala Ser 130 135 140 ATG ATC GAG GGC ATC CGC CGC TCG GGC ACC GAG AAG CAC ATC TTC AAG 656 Met Ile Glu Gly Ile Arg Arg Ser Gly Thr Glu Lys His Ile Phe Lys 145 150 155 160 CAC AAT GAC CTC GAC GAC CTG CGC CGG ATC CTG ACC TCG ATC GGC AAG 704 His Asn Asp Leu Asp Asp Leu Arg Arg Ile Leu Thr Ser Ile Gly Lys 165 170 175 GAC CGT CCG ATC CTC GTG GCC TTC GAA TCC GTC TAT TCG ATG GAT GGC 752 Asp Arg Pro Ile Leu Val Ala Phe Glu Ser Val Tyr Ser Met Asp Gly 180 185 190 GAC TTC GGC CGC ATC AAG GAG ATC TGC GAC ATC GCC GAC GAG TTC GGC 800 Asp Phe Gly Arg Ile Lys Glu Ile Cys Asp Ile Ala Asp Glu Phe Gly 195 200 205 GCG CTG AAA TAC ATC GAC GAG GTC CAT GCC GTC GGC ATG TAC GGC CCC 848 Ala Leu Lys Tyr Ile Asp Glu Val His Ala Val Gly Met Tyr Gly Pro 210 215 220 CGC GGC GGC GGC GTG GCC GAG CGG GAC GGG CTG ATG GAC CGG ATC GAC 896 Arg Gly Gly Gly Val Ala Glu Arg Asp Gly Leu Met Asp Arg Ile Asp 225 230 235 240 ATC ATC AAC GGG ACG CTG GGC AAG GCC TAT GGC GTG TTC GGC GGC TAT 944 Ile Ile Asn Gly Thr Leu Gly Lys Ala Tyr Gly Val Phe Gly Gly Tyr 245 250 255 ATC GCG GCC TCG TCC AAG ATG TGC GAC GCG GTG CGC TCC TAC GCG CCG 992 Ile Ala Ala Ser Ser Lys Met Cys Asp Ala Val Arg Ser Tyr Ala Pro 260 265 270 GGC TTC ATC TTT TCG ACC TCG CTG CCG CCC GTC GTG GCG GCC GGT GCG 1040 Gly Phe Ile Phe Ser Thr Ser Leu Pro Pro Val Val Ala Ala Gly Ala 275 280 285 GCG GCC TCG GTG CGC CAC CTC AAG GGC GAT GTG GAG CTG CGC GAG AAG 1088 Ala Ala Ser Val Arg His Leu Lys Gly Asp Val Glu Leu Arg Glu Lys 290 295 300 CAC CAG ACC CAG GCC CGC ATC CTG AAG ATG CGC CTC AAG GGG CTC GGC 1136 His Gln Thr Gln Ala Arg Ile Leu Lys Met Arg Leu Lys Gly Leu Gly 305 310 315 320 CTG CCG ATC ATC GAC CAC GGC TCG CAC ATC GTG CCG GTC CAT GTG GGC 1184 Leu Pro Ile Ile Asp His Gly Ser His Ile Val Pro Val His Val Gly 325 330 335 GAC CCC GTG CAC TGC AAG ATG ATC TCG GAC ATG CTG CTC GAG CAT TTC 1232 Asp Pro Val His Cys Lys Met Ile Ser Asp Met Leu Leu Glu His Phe 340 345 350 GGC ATC TAT GTC CAG CCG ATC AAC TTC CCC ACC GTG CCG CGC GGG ACC 1280 Gly Ile Tyr Val Gln Pro Ile Asn Phe Pro Thr Val Pro Arg Gly Thr 355 360 365 GAG CGG CTG CGC TTC ACC CCG TCG CCC GTG CAT GAT TCC GGC ATG ATC 1328 Glu Arg Leu Arg Phe Thr Pro Ser Pro Val His Asp Ser Gly Met Ile 370 375 380 GAT CAC CTC GTG AAG GCC ATG GAC GTG CTC TGG CAG CAC TGT GCG CTG 1376 Asp His Leu Val Lys Ala Met Asp Val Leu Trp Gln His Cys Ala Leu 385 390 395 400 AAT CGC GCC GAG GTC GTT GCC TGACAGCTTC TGCGGATGCA AAGGCCCCTG 1427 Asn Arg Ala Glu Val Val Ala 405 CCCTGTGCTA CTTCTTTCGG GACAGGGCAC CCCTGAGTCG GAAGCAACCG GCCGGGGTAA 1487 ATCGGGGCAG GACGGGCACA CGCATGATCT GGCGGAGGAC ACAACCTTCG ACGGCCGAAG 1547 TCGATAAACC CAAAGGGTTC GACGATTTCG AGTTGCGGTT GGGCGACCTG ATGCGCGGTG 1607 AGCGGGCGAC GCTCGGCAAG TCGCTGCTCG ATGTCCAGCG CGAGCTGAAG ATCAAGGCCA 1667 CCTATATCGC CGCCATCGAG AATGCCGACG TGTCGGCCTT CGAGACGCAG GGCTTCGTGG 1727 CGGGATATGT GCGCTCCTAT GCGCGCTATC TCGGCATGGA CCCGGACGAG GCCTTCGCGC 1787 GCTTCTGCCA TGAGGCGAAC TTCACCACGA TGCACGGGAT GGCGATCTCG GTGACCGGCG 1847 CGCGCCGCGA TACCGGTCCG CGGTCCCGGC CGCAGGGCGA GGGGCGCGAT CCGCTGGCGG 1907 ATCC 1911

【００５５】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状、混合物（２通り） 配列の種類：化学合成ＤＮＡ 配列： 5'-AACGACTATCT(C/G)GGCATGGG-3'

【００５６】配列番号：５ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状、混合物（４通り） 配列の種類：化学合成ＤＮＡ 配列： 5'-TACATGCCGAC(C/G)GC(A/G)TGGACTTCGTC-3'

【００５７】配列番号：６ 配列の長さ：１３４（部分的に塩基配列を解析した結
果） 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＰＣＲにて作製したＤＮＡ 配列： CGT CCG ATC CTC GTG GCC TTC GAA TCC GTC TAT TCG ATG GAT GGC GAC 48 Arg Pro Ile Leu Val Ala Phe Glu Ser Val Tyr Ser Met Asp Gly Asp 5 10 15 TTC GGC CGC ATC AAG GAG ATC TGC GAC ATC GCC GAC GAG TTC GGC GCG 96 Phe Gly Arg Ile Lys Glu Ile Cys Asp Ile Ala Asp Glu Phe Gly Ala 20 25 30 CTG AAA TAC ATC GAC GAG GTC CAT GCC GTC GGC ATG TA 134 Leu Lys Tyr Ile Asp Glu Val His Ala Val Gly Met 35 40

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１−（１）にて作製したＰＣＲ産物のク
ローニング手順と、該ＰＣＲ産物の部分的な塩基配列の
解析方向を示す説明図である。

【図２】実施例１−（４）で取得したプラスミドｐＨＧ
５１４および実施例１−（６）で作製したプラスミドの
制限酵素地図を示す説明図である。

【図３】実施例１−（６）で行った、５−アミノレブリ
ン酸要求性大腸菌を用いた相補性試験の結果を示す説明
図である。

【図４】ｐＫＴ２３０ＭＣとｐＫＴ２３０ＭＣＮの作製
手順を示す説明図である。

【図５】ｐＫＴ２３０ＭＣＮへ、５−アミノレブリン酸
合成酵素遺伝子を導入したｐＨＥＭＡ０１とｐＨＥＭＡ
０２の作製手順を示す説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:19 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 岡田 秀樹 埼玉県幸手市権現堂1134−２ 株式会社 コスモ総合研究所研究開発センター内 (72)発明者 西川 誠司 埼玉県幸手市権現堂1134−２ 株式会社 コスモ総合研究所研究開発センター内 (72)発明者 田中 享 埼玉県幸手市権現堂1134−２ 株式会社 コスモ総合研究所研究開発センター内 (72)発明者 堀田 康司 埼玉県幸手市権現堂1134−２ 株式会社 コスモ総合研究所研究開発センター内 (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．175，Ｎｏ．８ （1993）Ｐ．2292−2303 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．177，Ｎｏ．10 （1995）Ｐ．2760−2768 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で示される５−アミノレブリ
   ン酸合成酵素のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】 配列番号２で示される塩基配列を有する
   ものである請求項１記載のＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 請求項１又は２記載のＤＮＡ断片を含有
   する組換え体ＤＮＡ。
4. 【請求項４】 暗所での培養において５−アミノレブリ
   ン酸を生産する光合成細菌を宿主とし、請求項１若しく
   は２記載のＤＮＡ断片である５−アミノレブリン酸合成
   酵素遺伝子で形質転換した形質転換体細胞。
5. 【請求項５】 暗所での培養において５−アミノレブリ
   ン酸を生産する光合成細菌を宿主とし、請求項３記載の
   組換え体ＤＮＡである５−アミノレブリン酸合成酵素遺
   伝子で形質転換した形質転換体細胞。
6. 【請求項６】 請求項４又は５記載の形質転換体細胞を
   培養し、該培養物から採取することを特徴とする５−ア
   ミノレブリン酸合成酵素の製造法。
7. 【請求項７】 請求項４又は５記載の形質転換体細胞又
   は当該細胞が産生する５−アミノレブリン酸合成酵素を
   グリシン及びスクシニルＣｏＡに作用させることを特徴
   とする５−アミノレブリン酸の製造法。